Nghiên cứu tuyển chọn và Đánh giá hoạt tính sinh học của chủng nấm dược liệu cordyceps militaris mang gen giới tính Đơn

Nghiên cứu tuyển chọn và Đánh giá hoạt tính sinh học của chủng nấm dược liệu cordyceps militaris mang gen giới tính Đơn

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

- Các mẫu quả thể nấm C militaris thu thập tại các đơn vị nuôi trồng nấm C militaris tại Hà Nội, Bắc Ninh, Thái Nguyên và Quảng Ngãi (10 mẫu quả thể được kí hiệu: QN6, SH03, HL11, HL12, HL13, TN01, TN02, HN01, HL6 và HL8) Các mẫu được giữ nguyên trạng và đựng trong các túi nilon sạch Sau khi thu thập, mẫu được đưa ngay về phòng thí nghiệm để phân lập các chủng nấm Các chủng nấm sau phân lập đang được lưu giữ tại Phòng Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, Bộ Khoa học và Công nghệ

- Các dòng tế bào ung thư sử dụng trong nghiên cứu: LNCaP (Ung thư tiền liệt), MCF-7 (Ung thư vú), SK-LU-1 (Ung thư phổi), HT-29 (Ung thư ruột kết), HepG2 (Ung thư gan), HL-60 (Ung thư bạch cầu cấp), được cung cấp bởi Phòng Thử nghiệm Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Các cặp mồi đặc hiệu dùng cho phản ứng PCR sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê tại Bảng 2.1 Các cặp mồi được tổng hợp bởi công ty IDT (Singapore) Các mồi được pha trong nước khử ion vô trùng đến nồng độ sử dụng là 10 pmol

Bảng 2.1 Các mồi đặc hiệu sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự (5’-3’) Kích thước sản phẩm (bp)

Thiết bị, hóa chất và môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Các hóa chất và trang thiết bị được sử dụng thuộc Phòng Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, Bộ Khoa học và Công nghệ Các hóa chất dùng trong nuôi cấy như glucose, sucrose, cao nấm men, MgSO4, … và các hóa chất dùng trong sinh học phân tử như Tris-HCl, Tris-base, isopropanol, SDS, PCR Master Mix,… được cung cấp bởi các hãng hóa chất uy tín như Biobasic (Canada), Himedia (Ấn Độ), Sigma (Mỹ), Promega (Mỹ), Thermo Scientific (Mỹ) Các hóa chất được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Tên thiết bị Xuất xứ

Bể điện di Bio-Rad Mỹ

Cân phân tích Mettler Tolodo AB204 Thụy Sỹ

Kính hiển vi quang học Olympus Nhật Bản

Lò vi sóng Panasonic Nhật Bản

Máy cô quay chân không Thermo Mỹ

Máy đo pH Thụy Sỹ

Máy lắc tròn Trung Quốc

Tủ ấm lắc ổn nhiệt Labtech LSI-3016 A Hàn Quốc

Máy ly tâm lạnh Eppendorf Đức

Máy ly tâm thường Eppendorf Đức

Máy PCR prime Thermal Cycler 5PRIMER/02 Anh

Máy soi gel Bio-Rad Mỹ

Nồi khử trùng ALP Nhật Bản

Thiết bị khuấy từ IKA RET basic Đức

Tủ âm Sanyo Nhật Bản

Tủ cấy vi sinh Labtech LCB-1121VE Hàn Quốc

Máy cất nước Aquatron A4000D R001003346 Nhật Bản

Tủ lạnh Hitachi Nhật Bản

Tủ ổn nhiệt Memmert Đức

Các môi trường nuôi cấy nấm sử dụng trong nghiên cứu:

Glucose : 20 g/L Dịch chiết từ 200g khoai tây tươi bỏ vỏ

Thêm nước cất đến 1 L Đối với môi trường PDB thì không cho agar

Môi trường nuôi cấy quả thể nấm trong 1 hộp nuôi (hộp nhựa trong hình trụ có thể tích 650 ml):

Gạo lứt huyết rồng : 30 g/hộp Dịch dinh dưỡng : 60 mL/hộp Dịch dinh dưỡng:

Dịch chiết từ 200g khoai tây tươi bỏ vỏ

KH2PO4 : 1 g/L Nhộng tằm : 100 g/L Các môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút

Phương pháp nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu chính được thể hiện trong Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.4.1 Phân lập các chủng nấm từ các mẫu quả thể thu thập

Tách 1 phần quả thể nấm, làm sạch sơ bộ bằng nước cất và khử trùng bề mặt quả thể bằng cồn Sau đó phần quả thể được cắt bỏ ở hai đầu, phần giữa được cắt thành các lát nhỏ và đặt lên môi trường PDA (potatose dextrose agar) chứa kháng sinh chloramphenicol (100 μg/ml) Kháng sinh chloramphenicol có tác dụng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn Đĩa được ủ ở 22 - 25 o C trong tối 5 ngày Hệ sợi nấm màu trắng xuất hiện từ các lát quả thể được cấy chuyển sang đĩa môi trường PDA mới để thuần khiết [10]

2.4.2 Thu bào tử và xác định đặc điểm hình thái các chủng nấm đã phân lập

Các chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường thạch PDA sau 5 - 7 ngày ở 25ºC Bổ sung nước cất vô trùng lên bề mặt đĩa nuôi, sau đó dùng que gạt vô trùng gạt tách bào tử ra khỏi hệ sợi nấm Lọc dịch trên đĩa bằng màng lọc Miracloth

(Calbiochem, Đức) và thu vào ống falcon Ly tâm dịch sau lọc ở tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, đổ bỏ dịch Lặp lại bước kể trên 2 lần Dịch bào tử nấm được tiến hành xác định nồng độ bằng buồng đếm Thoma, sau đó pha loãng đến nồng độ thích hợp để sử dụng Bảo quản dịch bào tử ở 4ºC để sử dụng trong thời gian ngắn hoặc trong glycerol 80% ở -30ºC trong thời gian dài [57]

Bào tử mỗi chủng nấm được nuôi cấy trực tiếp trên tiêu bản hiển vi vô trùng có chứa môi trường PDA để quan sát hình thái của hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử dưới kính hiển vi quang học [59]

2.4.3 Phương pháp tách DNA tổng số

Các chủng nấm được tiến hành nuôi cấy thu hệ sợi nấm: Nuôi lắc 1mL dịch bào tử nồng độ 10 6 bào tử/mL trong 50mL môi trường PDB, lắc 200 vòng/phút trong

3 ngày ở 22 - 25°C Lọc dịch nuôi qua màng Miracloth để thu hệ sợi, dùng giấy thấm để loại hết nước; chia 0,2g hệ sợi nấm vào các ống eppendorf 2mL vô trùng [57]

Tiến hành cân 0,2g sợi nấm vào ống eppendorf, giã mẫu bằng đũa thủy tinh vụ trựng đến khi hệ sợi nỏt và sử dụng ngay cho việc tỏch chiết Bổ sung 600àL đệm chiết Cenis (2,5% SDS; 200mM Tris-HCl pH 8; 250mM NaCl; 25mM EDTA; 0,2% β-mercaptoethanol), vortex đều Ủ mẫu ở 60°C trong 30 phút Sau đú, bổ sung 300àL natri acetate 3M pH 5,2; đảo đều ống, ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 1,5mL mới và bổ sung 1 thể tích isopropanol lạnh để kết tủa DNA, đảo ống, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C Thu tủa, rửa tủa trong 700àL ethanol 70%, ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 5 phỳt Bỏ dịch nổi, thu lấy tủa Làm khụ mẫu bằng mỏy cụ quay SpeedVac Thờm 30àL TE (Tris-EDTA pH 8) và 3àL RNase (10mg/mL) Ủ mẫu ở 60°C trong 30 phỳt Mẫu DNA được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,7% (0,7g agarose/100mL đệm TAE 1x) ở 90V trong 30 phút Bảo quản DNA ở 4°C cho các thí nghiệm tiếp theo [57]

2.4.4 Phương pháp PCR và giải trình tự vùng ITS của rDNA dùng cho định danh nấm Để phân loại chính xác các chủng nấm, DNA tổng số được tiến hành tách chiết từ hệ sợi nấm dùng cho phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS của rDNA bằng cặp mồi

26 đa năng ITS1/ITS4 [63] Đoạn DNA được PCR từ DNA tổng số sử dụng enzyme Phusion® high-fidelity DNA polymerase Thành phần phản ứng PCR:

5X HF buffer : 5 àl dNTPs (40 àM mỗi thành phần) : 1 àl Mồi ITS1 (10 pmol) : 1 àl Mồi ITS4 (10 pmol) : 1 àl Phusion polymerase : 1 àl Khuụn DNA (50-100 ng/àl) : 1 àl Nước khử ion vụ trựng : 15 àl Tổng thể tớch : 25 àl

Chu trình nhiệt như sau: 94ºC (3 phút); 35 chu kỳ của 94ºC (30 giây), 58ºC

(30 giây), 72ºC (40 giây); 72ºC (10 phút) Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8 % sau đó được tinh sạch bằng kit tinh sạch DNA của hãng Promega theo hướng dẫn của nhà sản xuất Mẫu DNA tinh sạch được giải trình tự bởi công ty 1st BASE (Singapore) Trình tự ITS được kiểm tra bằng phần mềm BioEdit 7.2 (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) và phân tích so sánh với dữ liệu của GenBank sử dụng công cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA6 [56]

2.4.5 Xác định gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 ở các chủng nấm bằng PCR Để kiểm tra xác nhận gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1, DNA tổng số của các chủng nấm được dùng cho phản ứng PCR khuếch đại gen MAT1-1-1 và MAT1-

2-1 với các cặp mồi đặc hiệu Cặp mồi đặc hiệu cho gen MAT1-1-1 là MAT1-1-1-

F/MAT1-1-1-R Cặp mồi đặc hiệu cho gen MAT1-2-1 là MAT1-2-1-F/MAT1-2-1-R

[30] Đoạn DNA được PCR từ DNA tổng số sử dụng Master Mix của hãng Promega Thành phần phản ứng PCR:

2X Master Mix : 12,5 àl Mồi xuụi (10 pmol) : 1 àl

Mồi ngược (10 pmol) : 1 àl Khuụn DNA (50-100 ng/àl) : 1 àl Nước khử ion vụ trựng : 9,5 àl Tổng thể tớch : 25 àl

Chu trình nhiệt như sau: 94ºC (3 phút); 30 chu kỳ của 94ºC (30 giây), 58ºC

(30 giây), 72ºC (40 giây); 72ºC (10 phút) Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8 %

2.4.6 Đánh giá năng suất quả thể của các chủng nấm C militaris Để đánh giá khả năng hình thành quả thể và năng suất quả thể của các chủng nấm C militaris phân lập được, các chủng nấm được nuôi trồng dựa theo quy trình của Kang và cộng sự (2017) [30] có cải tiến Các chủng giống được nuôi trên môi trường PDA ở 25°C sau 5 - 7 ngày để hệ sợi nấm phát triển Cắt 2 - 3 cm 2 hệ sợi nấm trên môi trường PDA chuyển vào bình nuôi giống lỏng chứa 500 ml môi trường PDB có bổ sung 0,1% pepton Giống lỏng được nuôi lắc 150 vòng/phút trong 3 ngày trong tối ở 22 - 25°C Dịch giống (4 - 5 ml) được cấy đều lên bề mặt giá thể đựng trong hộp nhựa hình trụ có thể tích 650ml Thành phần giá thể trong 1 hộp nuôi (hộp nhựa trong hình trụ có thể tích 650 ml) gồm: 28 g gạo lứt huyết rồng và 60 ml dịch dinh dưỡng Thành phần 1 lít dịch dinh dưỡng: dịch chiết 200 g khoai tây, 15 g glucose, 15 g succrose, 1 g MgSO4, 1 g KH2PO4, 1 g pepton, 100 g nhộng tằm Giá thể sau khi cấy giống được đặt trong tối 5 - 7 ngày, ở 22 - 25°C để hệ sợi nấm phát triển toàn bộ bề mặt giá thể Sau đó, hộp nuôi nấm được chuyển ra nuôi ở điều kiện chiếu sáng 12 giờ/ngày (500 - 700 lux) ở 22 - 23°C, độ ẩm 85 - 90% trong 60 ngày Chỉ tiêu theo dõi gồm: khối lượng quả thể tươi/hộp nuôi thể tích 650 ml và năng suất sinh học (Biological Efficiency - BE) Năng suất sinh học được xác định theo Shrestha và cộng sự (2012) [52]: BE (%) = (khối lượng quả thể khô/khối lượng cơ chất) x 100

2.4.7 Định lượng cordycepin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Mẫu quả thể tươi sau khi nuôi cấy 65 ngày được thu và sấy khô bằng máy sấy thăng hoa ở nhiệt độ -40°C tới khi độ ẩm đạt 5 - 7% Hàm lượng cordycepin được

28 xác định theo Huang và cộng sự (2009) [24] Cân chính xác 0,2 g mẫu quả thể (đã xay nhỏ) hoặc 0,1 g cao chiết, chuyển vào bình nón (50 mL), thêm 10 mL methanol 80%, cân xác định khối lượng ban đầu, tiến hành chiết hồi lưu trong 30 phút, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng, bổ sung khối lượng đã mất bằng methanol 80% Dịch chiết được lọc qua màng cellulose acetat 0,45 m để thu được dung dịch mẫu dùng cho phân tích HPLC Chất chuẩn cordycepin được hòa tan trong methanol 80% để thu được dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ chính xác là 1 mg/mL Pha loãng dung dịch mẫu chuẩn bằng methanol 80% theo tỷ lệ khác nhau để thu được các dung dịch chuẩn cordycepin có nồng độ thấp hơn Các dung dịch chuẩn này cũng được lọc qua màng cellulose acetat 0,45 m trước khi tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC Sử dụng hệ thống thống HPLC (hãng Shimadzu, Nhật Bản) gồm: bơm LC 20AD, Detector SPD 20A, bộ tiêm mẫu tự động SIL-20A HT Sử dụng cột C18 của hãng Agillent, kích thước cột là 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 m Tốc độ rửa giải là 0,5 mL/phút Detector UV được đặt quan sát tại bước sóng 260 nm Thể tích tiêm mẫu vào cột là

10 l Pha động gồm hai dụng môi là nước và acetonitril

2.4.8 Đánh giá tính ổn định về năng suất quả thể và hàm lượng cordycepin của chủng nấm C militaris mang gen giới tính đơn Để đánh giá tính ổn định về năng suất quả thể, hàm lượng cordycepin qua 5 thế hệ của chủng nấm C militaris mang gen giới tính đơn, bào tử chủng nấm C militaris mang gen giới tính đơn được dùng để cấy chuyển liên tiếp trên môi trường thạch PDA để thu bào tử liên tục 5 thế hệ (Bào tử chủng ban đầu được nuôi cấy và thu bào tử (F1), bào tử F1 tiếp tục được nuôi cấy và thu bào tử (F2), bào tử F2 được nuôi cấy và thu bào tử (F3), bào tử F3 được nuôi cấy và thu bào tử (F4), bào tử F4 được nuôi cấy và thu bào tử (F5)) Bào tử các chủng nấm ở các thế hệ được tiến hành nuôi cấy trên môi trường PDA để sử dụng cho nhân giống dịch thể, nuôi cấy quả thể và xác định năng suất quả thể và hàm lượng cordycepin trong quả thể

2.4.9 Đánh giá hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư ở người của cao chiết nấm C militaris

Quả thể chủng nấm C militaris mang gen giới tính đơn (quả thể dạng khô) được tiến hành chiết với ethanol để tạo cao chiết giàu cordycepin theo Choi và cộng

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Phân lập và định danh các chủng nấm phân lập từ các mẫu quả thể nấm C

militaris nuôi trồng tại Việt Nam

Trong nghiên cứu này, 10 mẫu quả thể nấm đã được thu thâp từ các xưởng nuôi trồng nấm tại Hà Nội, Bắc Ninh, Thái Nguyên và Quảng Ngãi bao gồm các mẫu quả thể được kí hiệu là QN6, SH03, HL11, HL12, HL13, TN01, TN02, HN01, HL6 và HL8 Các chủng nấm được phân lập từ một phần quả thể Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA có bổ sung kháng sinh chloramphenicol ở điều kiện nhiệt độ 22 - 25°C trong tối hoàn toàn, các chủng nấm đã sinh trưởng tạo hệ sợi màu trắng (Hình 3.1)

Hình 3.1 Phân lập các chủng nấm từ các mẫu quả thể C militaris đang được nuôi trồng tại Việt Nam

Hệ sợi nấm tiếp tục được cấy chuyển sang đĩa môi trường PDA mới để thuần khiết và thu bào tử Bào tử mỗi chủng nấm được nuôi cấy trực tiếp trên tiêu bản hiển vi vô trùng có chứa môi trường PDA để quan sát hình thái của hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử dưới kính hiển vi quang học Kết quả quan sát hệ sợi dưới kính hiển vi cho thấy, hệ sợi nấm phát triển kéo dài, trên hệ sợi hình thành cấu trúc cuống sinh bảo tử, bào tử hình thành tách ra có dạng hình trứng (Hình 3.2) Dựa trên hình thái mẫu quả thể thu thập, các đặc điểm về hệ sợi và cấu trúc sinh bào tử cho thấy đây là những đặc điểm điển hình của loài nấm C militaris [78]

Hình 3.2 Hình thái hệ sợi các chủng nấm trên môi trường PDA Để đảm bảo độ chính xác của các chủng nấm đã phân lập dùng cho các nghiên cứu tiếp theo, 10 chủng nấm được tiến hành định danh dựa trên trình tự vùng ITS Trong phân loại nấm, trình tự vùng ITS thường được sử dụng hơn so với các gen 18S rRNA và 28S rRNA do vùng trình tự này (gồm ITS1; 5,8S rRNA; ITS2) có sự biến đổi cao hơn giữa các loài nấm có quan hệ gần gũi [17] DNA tổng số của 10 chủng nấm được sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS sử dụng cặp mồi đặc hiệu

ITS1/ITS4 (Bảng 2.1) Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR cho một băng DNA duy nhất có kích thước khoảng 550 bp (Hình 3.3A) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit tinh sạch của hãng Promega và được giải trình tự bởi công ty 1st BASE (Singapore) Sử dụng chương trình BLAST so sánh trình tự ITS của 10 chủng nấm nghiên cứu cho thấy, các trình tự thu được tương đồng 99,8 - 100% với các trình tự ITS của nấm C militaris có trong cơ sở dữ liệu GenBank Phân tích và xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự ITS với phần mềm MEGA7 xác nhận cả 10 chủng nấm đã phân lập đều thuộc loài C militaris (Hình 3.3B)

Hình 3.3 Định danh các chủng nấm dựa trên trình tự vùng ITS của rDNA

(A) Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR vùng ITS; (B) Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự vùng ITS của rDNA; (-) đối chứng âm; M: DNA marker 1 kb

Xác định gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 ở các chủng nấm C militaris 35 3.3 Xác định khả năng hình thành quả thể, năng suất và hàm lượng cordycepin của các chủng nấm C militaris

Hai gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 được xác định giữ vai trò quan trọng đối với sự hình thành quả thể và thoái hóa giống ở nấm C militaris [62, 78] Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào xác định 2 gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 của các chủng nấm C militaris đang được nuôi trồng tại Việt Nam Trong nghiên cứu này, 10 chủng nấm C militaris được xác định gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho 2 gen trên (Bảng 2.1) Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, 6 chủng nấm C militaris (QN6, HL11, HL12, TN01, TN02 và HL6) mang cả 2 gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 Trong khi đó, 4 chủng nấm

C militaris bao gồm SH03, HL13, HN01 và HL8 chỉ mang gen giới tính MAT1-1-1

(Hình 3.4) Như vậy có thể thấy, các chủng nấm C militaris nghiên cứu mang cả 2 gen giới tính hoặc chỉ mang gen giới tính MAT1-1-1, không ghi nhận chủng nấm nào chỉ mang gen MAT1-2-1 Đây là nghiên cứu đầu tiên xác định gen giới tính MAT1-1-

1 và MAT1-2-1 của các chủng nấm C militaris đang được nuôi trồng tại Việt Nam

Hình 3.4 Xác định gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 ở 10 chủng nấm C militaris (A) Kết quả điện di sản phẩm PCR gen MAT1-1-1; (B) Kết quả điện di sản phẩm PCR gen MAT1-2-1; M: DNA marker 1 kb; (-) đối chứng âm; (+) đối chứng dương

3.3 Xác định khả năng hình thành quả thể, năng suất và hàm lượng cordycepin của các chủng nấm C militaris

Trong nghiên cứu này, các mẫu quả thể nấm được thu thập tại các xưởng nuôi trồng nấm khác nhau, nấm ở các độ tuổi khác nhau Hơn nữa, mỗi đơn vị nuôi trồng lại công nghệ nuôi trồng riêng biệt (chủng giống, môi trường nuôi, điều kiện nuôi,

…), do vậy mà các mẫu quả thể nấm thu thập không được đánh giá về mặt năng suất và chất lượng tại thời điểm thu mẫu

Sau khi xác định gen giới tính MAT của 10 chủng nấm C militaris QN6, SH03, HL11, HL12, HL13, TN01, TN02, HN01, HL6 và HL8, cả 10 chủng nấm được đánh giá khả năng hình thành quả thể, năng suất và hàm lượng cordycepin trong cùng điều kiện nuôi trồng Kết quả cho thấy, cả 10 chủng nấm nghiên cứu đều hình thành quả thể (Hình 3.5) Hình thành quả thể là hình thức sinh sản hữu tính ở nấm C militaris khi có sự phối hợp theo kiểu dị tản lưỡng cực (bipolar heterothallism) của các gen giới tính MAT khác nhau [20] Như vậy, 5 chủng nấm C militaris QN6, HL11, HL12, TN01, TN02 và HL6 mang cả 2 gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 hình thành quả thể theo cách sinh sản hữu tính thông thường Năm 2005, nghiên cứu của Yue và cộng sự cho thấy, khi chỉ mang gen giới tính đơn, hầu hết các chủng C militaris không có khả năng tạo quả thể, một số ít các chủng tạo ra những dạng quả thể bất thường [75]

Hình 3.5 Quả thể các chủng nấm C militaris sau 65 ngày nuôi trồng

Như vậy, điểm mới của nghiên cứu này là cung cấp thêm dữ liệu về 4 chủng nấm C militaris SH03, HL13, HN01 và HL8 chỉ mang gen giới tính MAT1-1-1 có khả năng hình thành quả thể Quả thể của 4 chủng nấm SH03, HL13, HN01 và HL8 có hình thái hoàn toàn bình thường (Hình 3.5)

Hình 3.6 Năng suất quả thể các chủng nấm C militaris

(A) Khối lượng quả thể tươi/hộp nuôi thể tích 650 ml; (B) Năng suất sinh học Đồng thời, trong nghiên cứu này, năng suất quả thể của 10 chủng nấm C militaris đã được xác định thông qua chỉ tiêu khối lượng quả thể tươi/hộp nuôi và chỉ tiêu năng suất sinh học (Hình 3.6) Trong 10 chủng nấm C militaris nghiên cứu, chủng SH03 và HL8 là 2 chủng nấm mang gen giới tính đơn MAT1-1-1 cho năng suất quả thể vượt trội Chủng C militaris SH03 cho khối lượng quả thể đạt trung bình 31,3 g quả thể tươi/hộp nuôi ứng với năng suất sinh học đạt 13,78% Trong khi đó, chủng C militaris HL8 cho năng suất quả thể cao nhất với khối lượng quả thể đạt

38 trung bình 38,67 g quả thể tươi/hộp nuôi ứng với năng suất sinh học đạt 17% Năng suất quả thể là một trong số các yếu tố quan trọng hàng đầu của việc nuôi trồng sản xuất nấm C militaris Nhiều nhóm nghiên cứu tại Việt Nam đã tiến hành tối ưu các điều kiện nuôi trồng đối với nhiều chủng nấm C militaris khác nhau cho năng suất sinh học đạt 11,6 - 11,9% [1, 11]

Hàm lượng hoạt chất cordycepin trong quả thể nấm C militaris là chỉ tiêu luôn được các nhà nghiên cứu quan tâm Trong nghiên cứu này, quả thể của 10 chủng nấm

C militaris QN6, SH03, HL11, HL12, HL13, TN01, TN02, HN01, HL6 và HL8 được tiến hành phân tích xác định hàm lượng cordycepin Sau 65 ngày nuôi cấy, các mẫu quả thể nấm C militaris được thu và sấy khô bằng máy sấy thăng hoa ở nhiệt độ - 40°C tới khi độ ẩm đạt 5 -7% Hàm lượng cordycepin được xác định trên hệ thống HPLC Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở Hình 3.7

Hình 3.7 Hàm lượng cordycepin trong quả thể các chủng nấm C militaris

(A) Hàm lượng cordycepin trong quả thể các chủng nấm; (B) Sắc ký đồ phân tích codycepin của mẫu quả thể chủng HL8 và (C) chủng SH03

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng cordycepin trong quả thể 10 chủng nấm C militaris có sự khác biệt Trong số 10 chủng nấm nghiên cứu, chủng nấm

SH03 và HL8 là 2 chủng nấm cho hàm lượng cordycepin trong quả thể cao nhất Chủng C militaris SH03 cho hàm lượng cordycepin trong quả thể đạt trung bình

12,56 mg/g Chủng C militaris HL8 cho hàm lượng cordycepin trong quả thể khô cao nhất đạt trung bình 14,43 mg/g SH03 và HL8 là 2 chủng nấm C militaris mang gen giới tính đơn MAT1-1-1

Cordycepin được coi là chỉ tiêu chính để đánh giá chất lượng nấm C militaris Nghiên cứu của Huang và cộng sự (2009) cho thấy, hàm lượng cordycepin trong quả thể nấm C militaris khô nuôi cấy trên giá thể gạo đạt 2,654 mg/g, trong sinh khối sợi nấm nuôi cấy theo phương pháp lên men chìm đạt 0,9040 mg/g [24] Nghiên cứu của Chen và cộng sự (2011) cho thấy với điều kiện nuôi cấy tối ưu, hàm lượng cordycepin trong quả thể nấm C militaris đạt 2,3 mg/g quả thể khô [14] Lee và cộng sự (2017) cũng đã cho thấy hàm lượng cordycepin trong một số chủng nấm C militaris lưu giữ tại KACC có hàm lượng cordycepin trung bình khoảng 2,13 mg/g quả thể khô Ngoài ra, một số chủng nấm C militaris khác như SPNU1001, SPNU1002, SPNU1005, SPNU1002 cho hàm lượng cordycepin trong quả thể khô đạt 5,64 mg/g [36]

Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Đỗ Tuấn Bách và cộng sự (2017), hàm lượng cordycepin trong quả thể khô nấm C militaris nuôi trồng ở điều kiện tối ưu đạt 4,33 mg/g [1] Nghiên cứu của Phạm Thị Lan và cộng sự (2016) cho thấy hàm lượng cordycepin trong quả thể khô chủng nấm C militaris NBRC100741 đạt 4,54 mg/g

Như vậy với kết quả nghiên cứu về năng suất quả thể và hàm lượng cordycepin trong nghiên cứu này cho thấy, chủng C militaris SH03 và HL8 là 2 chủng nấm mang đơn gen giới tính tiềm năng cho nuôi trồng ở quy mô công nghiệp.

Đánh giá sự ổn định về năng suất quả thể và hàm lượng cordycepin của chủng nấm C militaris mang gen giới tính đơn

Việc nuôi trồng nấm C militaris ở quy mô công nghiệp đang phải đối mặt với sự thoái hóa nhanh của các chủng giống, biểu hiện là sự giảm mạnh về năng suất quả thể và hàm lượng hoạt chất cordycepin [13, 70], gây ra khá nhiều khó khăn cho doanh

40 nghiệp Các doanh nghiệp sản xuất nấm C militaris muốn duy trì được mô hình kinh doanh hiệu quả, điều kiện tiên quyết là phải nắm trong tay công nghệ cùng với các chủng giống có năng suất cao ổn định và hàm lượng hoạt chất cordycepin vượt trội

Chủng C militaris SH03 và HL8 là 2 chủng nấm mang gen giới tính đơn (chỉ mang gen MAT1-1-1) có năng suất quả thể và hàm lượng cordycepin cao Tính ổn định về năng suất quả thể và hàm lượng cordycepin của các chủng nấm C militaris mang đơn gen giới tính chưa có báo cáo nào đề cập Hơn nữa, việc đánh giá tính ổn định về năng suất và hàm lượng cordycepin của 2 chủng nấm SH03 và HL8 là cần thiết để đưa 2 chủng nấm này vào sản xuất thực tế Trong nghiên cứu này, năng suất quả thể của 2 chủng nấm C militaris SH03 và HL8 được đánh giá qua 5 thế hệ liên tiếp và so sánh với năng suất quả thể của 2 chủng nấm QN6 và HL6 QN6 và HL6 là

2 chủng nấm C militaris mang cả 2 gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở Hình 3.8 và 3.9

Hình 3.8 Quả thể của các chủng nấm C militaris tại 5 thế hệ liên tiếp

F1-F5: thế hệ thứ 1 tới thế hệ thứ 5

Kết quả tại Hình 3.8 cho thấy, khả năng hình thành quả thể và hình dạng quả thể của 2 chủng nấm C militaris SH03 và HL8 mang gen giới tính đơn MAT1-1-1 không có sự khác biệt tại 5 thế hệ Trong khi đó, khả năng hình thành quả thể và hình dạng quả thể của 2 chủng nấm C militaris QN6 và HL6 mang cả 2 gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 có sự khác biệt lớn tại 5 thế hệ Từ thế hệ thứ 2 (chủng QN6) và thế hệ thứ 3 (HL6) hình dạng quả thể đã biến đổi bất thường so với quả thể ở thế hệ thứ 1 Đặc biệt tại thế hệ thứ 5, cả 2 chủng nấm C militaris QN6 và HL6 đã mất khả năng hình thành quả thể

Năng suất quả thể (khối lượng quả thể tươi/hộp nuôi) của cả 4 chủng nấm C militaris SH03, HL8, QN6 và HL6 đã được xác định (Hình 3.9) Kết quả nghiên cứu cho thấy, năng suất quả thể của 2 chủng nấm C militaris SH03 và HL8 tương ứng giảm 9 và 10,7% tại thế hệ thứ 4 và giảm 14,3 và 12,9% tại thế hệ thứ 5 so với thế hệ thứ 1 Trong khi đó, năng suất quả thể 2 chủng nấm C militaris QN6 và HL6 giảm mạnh sau 4 thế hệ, cụ thể tương ứng giảm 43,2 và 24,3% Quả thể hình thành tại thế hệ thứ 4 có hình dạng các cục ngắn bất thường (Hình 3.8)

Hình 3.9 Năng suất quả thể của các chủng nấm C militaris tại 5 thế hệ liên tiếp

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, nấm C militaris bắt đầu có hiện tượng thoái hóa khi cấy chuyển đến thế hệ thứ ba, sự thoái hóa nghiêm trọng xuất hiện ở thế hệ thứ tư và thế hệ thứ năm có thể dẫn tới chủng nấm mất khả năng tạo quả thể

[70] Đặc điểm thoái hóa này phù hợp với kết quả nghiên cứu về năng suất quả thể qua 5 thế hệ của 2 chủng nấm C militaris QN6 và HL6 mang cả 2 gen giới tính

MAT1-1-1 và MAT1-2-1 Trong khi đó, năng suất quả thể của 2 chủng nấm C militaris SH03 và HL8 mang gen giới tính đơn MAT1-1-1 ổn định không khác biệt nhiều qua 5 thế hệ Đây là nghiên cứu đầu tiên chỉ ra sự khác nhau về tính ổn định năng suất quả thể giữa các chủng nấm C militaris mang 2 gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 và chủng nấm C militaris mang gen giới tính đơn MAT1-1-1

Hình 3.10 Hàm lượng cordycepin trong quả thể của các chủng nấm C militaris tại 5 thế hệ liên tiếp

Các nghiên cứu về thoái hóa ở nấm C militaris thường quan tâm nhiều tới khả năng hình thành quả thể và năng suất quả thể Hàm lượng hoạt chất cordycepin ở các thế hệ thoái hóa không có nhiều các nghiên cứu đề cập Trong khi đó, cordycepin là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng nấm C militaris [24] Do vậy, nghiên cứu này tiến hành xác định hàm lượng cordycepin trong quả thể của cả 4 chủng nấm C militaris SH03, HL8, QN6 và HL6 tại 5 thế hệ (Hình 3.10) Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng cordycepin trong quả thể của 2 chủng nấm C militaris QN6 và HL6 giảm mạnh sau 4 thế hệ, cụ thể tương ứng giảm 61,4 và 64,9% so với thế hệ đầu tiên Tại thế hệ thứ 4, hàm lượng cordycepin trong quả thể của 2 chủng QN6 và HL6 đạt

2 - 2,1 mg/g Trong khi đó, hàm lượng cordycepin trong quả thể của 2 chủng nấm C militaris SH03 và HL8 không có sự thay đổi nhiều Cụ thể tại thế hệ thứ 4, hàm lượng cordycepin trong quả thể của 2 chủng nấm SH03 và HL8 tương ứng giảm 6,5 và

4,1%, giảm 8,6 và 10,3% tại thế hệ thứ 5 Tại thế hệ thứ 4 và thứ 5, hàm lượng cordycepin trong quả thể của 2 chủng SH03 và HL8 đạt 11,5 - 13,8 mg/g

Như vậy, nghiên cứu này đã tuyển chọn được 2 chủng nấm C militaris SH03 và HL8 mang gen giới tính đơn MAT1-1-1 cho năng suất quả thể và hàm lượng cordycepin cao và ổn định Đây là 2 chủng nấm C militaris có tiềm năng cao để đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp.

Khả năng gây độc một số dòng tế bào ung thư ở người của cao chiết chủng nấm C militaris HL8 mang gen giới tính đơn

Chủng C militaris HL8 cho hàm lượng cordycepin trong quả thể cao nhất đạt trung bình 14,43 mg/g Do vậy, quả thể chủng nấm C militaris HL8 mang gen giới tính đơn (quả thể dạng khô) được tiến hành chiết với ethanol để tạo cao chiết giàu cordycepin theo Choi và cộng sự (2021) [16] Mẫu cao thu được được tiến hành xác định hàm lượng cordycepin trên hệ thống sắc ký HPLC (Hình 3.11) Kết quả định lượng cho thấy, hàm lượng cordycepin trong mẫu cao chiết ethanol đạt 69 mg/g

Hình 3.11 Sắc ký đồ phân tích codycepin của cao chiết quả thể chủng nấm C militaris HL8

Khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư ở người của nấm C militaris luôn được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới quan tâm Das và cộng sự (2010) nghiên cứu cho thấy, dịch chiết nấm C militaris có khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư

44 đại tràng [18] Protein CMP được tiết ra từ nấm C militaris có khả năng gây độc đối với tế bào ung thư bàng quang [49] Các kết quả nghiên cứu về khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư khác nhau ở người của cao chiết nấm C militaris là căn cứ khoa học quan trọng để định hướng ứng dụng nguồn cao chiết dược liệu này vào việc phát triển các sản phẩm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư Do vậy trong nghiên cứu này, mẫu cao chiết ethanol giàu hoạt chất cordycepin (69 mg/g) từ quả thể chủng nấm HL8 được đánh giá khả năng ức chế đối với 6 dòng tế bào ung thư phổ biến ở người bao gồm các dòng tế bào: LNCaP (Ung thư tiền liệt), MCF-7 (Ung thư vú), SK-LU-1 (Ung thư phổi), HT-29 (Ung thư ruột kết), HepG2 (Ung thư gan) và HL-60 (Ung thư bạch cầu cấp) Kết quả xác định khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư của mẫu cao chiết ethanol chủng nấm HL8 ở các nồng độ cao chiết khác nhau được thể hiện ở Hình 3.12

Hình 3.12 Khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư ở các nồng độ cao chiết khác nhau

Nồng độ cao chiết: (A) 100 àg/mL, (B) 20 àg/mL, (C) 4 àg/mL, (D) 0,8 àg/mL

Kết quả nghiờn cứu ở nồng độ cao chiết 100 àg/mL cho thấy, mẫu cao chiết ethanol quả thể chủng nấm C militaris HL8 có khả năng ức chế mạnh cả 6 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (khả năng ức chế đạt từ 93,38 - 100%) Cụ thể ở nồng độ 100

45 àg/mL, mẫu cao chiết cú khả năng ức chế 93,38% tế bào ung thư tiền liệt, 100% tế bào ung thư vú), 94,76% tế bào ung thư phổi, 93,42% tế bào ung thư ruột kết, 97,28% tế bào ung thư gan và 97,87% tế bào ung thư bạch cầu cấp Khi nồng độ cao chiết giảm xuống 20 àg/mL, mẫu cao chiết thể hiện khả năng ức chế mạnh cả 6 dũng tế bào ung thư thử nghiệm với hiệu quả ức chế đạt từ 64,56 - 89,14% Đặc biệt, khi nồng độ cao chiết giảm cũn 0,8 àg/mL, mẫu cao chiết thể hiện khả năng ức chế 4/6 dũng tế bào ung thư thử nghiệm bao gồm LNCaP (Ung thư tiền liệt), MCF-7 (Ung thư vú), SK-LU-1 (Ung thư phổi), HepG2 (Ung thư gan)

Bảng 3.1 Giá trị IC50 của mẫu cao chiết chủng nấm C militaris HL8 đối với các dòng tế bào ung thư

Giỏ trị IC 50 đối với cỏc dũng tế bào ung thư (àg/mL) LNCaP MCF-7 SK-LU-1 HT-29 HepG2 HL-60

Giá trị IC50 là nồng độ cao chiết tại đó 50% tế bào ung thư bị ức chế (bị diệt) Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cao chiết được coi có hoạt tính diệt tế bào ung thư tốt với IC50  20 μg/ml [26] Như vậy với kết quả xác định giá trị IC50 của mẫu cao chiết ethanol quả thể chủng nấm C militaris HL8 cho thấy, mẫu cao chiết có khả năng ức chế tốt cả 6 dòng tế bào ung thư nghiên cứu Trong đó, mẫu cao chiết thể hiện hoạt tính ức chế tốt nhất với 2 dòng tế bào ung thư phổi và ung thư gan với giỏ trị IC50 tương ứng là 7,33 và 7,39 àg/mL (Bảng 3.1)

Lee và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng tế bào ung thư vú MCF-7 của cao chiết ethanol quả thể nấm C militaris Kết quả nghiên cứu đã xác định được giá trị IC50 của mẫu cao chiết 73,48 àg/mL) [35] Jing và cộng sự đó xỏc định khả năng ức chế một số dòng tế bào ung thư của polysaccharide chiết từ quả thể chủng nấm C militaris (mã số 2012010013) Mẫu polysaccharide thể hiện hoạt tính ức chế các dòng tế bào ung thư HT-29, HepG2 và K562 cells với giá trị IC50 tương ứng đạt 137,66, 176,29 và 364,01 μg/mL [28] Cùng nghiên cứu trên 3 dòng tế bào ung thư là MCF-

7 (Ung thư vú), HepG2 (Ung thư gan) và HL-60 (Ung thư bạch cầu cấp), Wu và cộng sự (2007) cho thấy cao chiết ethanol sợi nấm C sinensis có hoạt tính ức chế 3 dòng tế bào trờn với IC50 lần lượt 79,5, 84,2 và 87,5 àg/mL Mẫu cao chiết với ethyl acetate cho hoạt tính ức chế tế bào ung thư tốt nhất với giá trị IC50 đối với 3 dòng tế bào ung thư MCF-7, HepG2 và HL-60 lần lượt 44,7, 16,2 và 21,7 àg/mL [65] Như vậy, nghiên cứu này cho thấy cao chiết ethanol quả thể chủng nấm C militaris HL8 có khả năng ức chế mạnh 6 dòng tế bào ung thư nghiên cứu Cao chiết từ chủng nấm HL8 có tiềm năng trong phát triển các loại thuốc hỗ trợ điều trị ung thư