Phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp camptothecin từ cây mẫu Đơn Đỏ (ixora coccinea l) tại việt nam

Phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp camptothecin từ cây mẫu Đơn Đỏ (ixora coccinea l) tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Bùi Thị Trang

PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH CÓ KHẢ

NĂNG SINH TỔNG HỢP CAMPTOTHECIN TỪ CÂY

MẪU ĐƠN ĐỎ (Ixora coccinea L) TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội- năm 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Bùi Thị Trang

PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH CÓ KHẢ

NĂNG SINH TỔNG HỢP CAMPTOTHECIN TỪ CÂY

MẪU ĐƠN ĐỎ (Ixora coccinea L) TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Đại diện tập thể cán bộ hướng dẫn:

PGS.TS BÙI THỊ VIỆT HÀ

Hà Nội- năm 2022

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến GS.TS Chu Hoàng

Hà và PGS.TS Bùi Thị Việt Hà- hai người thầy đã luôn tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này Thầy và cô đã không ngừng động viên em vượt qua khó khăn trong công việc, truyền đạt kiến thức quý báu giúp em được mở mang tri thức

Xin cảm ơn các thầy cô công tác tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô trong Khoa Sinh học đã trang bị kiến thức và giúp em rèn giũa bản thân trong suốt quá trình học tập

Xin cảm ơn các anh chị đang công tác tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cung cấp điều kiện cơ sở vật chất tốt nhất cũng như đã hỗ trợ em trong thời gian thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn các anh chị học viên khoá K28 Công nghệ sinh học những người

đã hết lòng giúp đỡ và cổ vũ tinh thần mỗi khi em gặp khó khăn, thiếu thốn

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, các anh chị em đồng nghiệp và bạn

bè thân thiết đã kề vai sát cánh hỗ trợ em trong mọi phương diện để em có thể thuận lợi hoàn thành quá trình học tập, nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2022

Học viên

Bùi Thị Trang

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

CCNSC Cancer Chemotherapy National Service Center

Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Camptothecin và các hợp chất có cấu trúc tương tự Camptothecin 3

1.1.1 Cấu trúc của Camptothecin (CPT), lịch sử phát hiện 3

1.1.2 Lịch sử phát hiện Camptothecin 3

1.2 Các nguồn sản xuất Camptothecin và các hợp chất có cấu trúc tương tự Camptothecin: các nguồn thực vật, các nguồn vi nấm 9

1.2.1 Con đường tổng hợp Camptothecin 10

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp Camptothecin 11

1.3 Vi nấm nội sinh và tiềm năng tổng hợp Camptothecin và các hợp chất có cấu trúc tương tự Camptothecin 12

1.3.1 Khái niệm vi nấm nội sinh 13

1.3.2 Vai trò của vi nấm nội sinh trong khoa học và đời sống con người 14

1.3.3 Tiềm năng tổng hợp Camptothecin và các chất có cấu trúc tương tự Camptothecin của vi nấm nội sinh 16

1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu thực vật 23

2.2.2 Phương pháp khử trùng bề mặt mẫu vật 24

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi nấm nội sinh 25

2.2.4 Phương pháp định danh các chủng vi nấm nội sinh bằng giải trình tự gen 5,8S rRNA-ITS2 25

ITS1-2.2.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC 34

2.2.7 Phương pháp khối phổ phân giải cao 36

2.2.8 Phương pháp phân tích đặc điểm các chủng vi nấm tuyển chọn bằng kính hiển vi 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1.Phân lập các chủng vi nấm nội sinh từ cây mẫu đơn đỏ Ixora Coccinea L bản địa 383.1.1 Thu thập mẫu cây mẫu đơn đỏ 38

3.1.2 Phân lập các chủng vi nấm nội sinh từ cây mẫu đơn đỏ 40

3.2 Định danh các chủng vi nấm nội sinh trên cây mẫu đơn đỏ Ixora Coccinea L bằng marker phân tử 46

3.2.1 Tách DNA tổng số các chủng vi nấm nội sinh 46

3.2.2 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số các chủng nấm nội sinh bằng máy đo nanodrop 47

3.2.3 Khuếch đại đoạn trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 bằng cặp mồi ITS4- ITS5 48

3.2.4 Kết quả định danh các chủng vi nấm nội sinh phân lập từ cây mẫu đơn đỏ Ixora coccinea L 49

3.3 Sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp Camptothecin từ cây mẫu đơn đỏ (Ixora coccinea L) 51

3.3.1.Phát hiện CPT trong cao chiết dịch nuôi lỏng và cao chiết sinh khối tế bào các chủng vi nấm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC 51

3.3.2 Phát hiện và định lượng CPT trong dịch chiết từ dịch nuôi lỏng và sinh khối hệ sợi các chủng vi nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 52

3.3.3 Kết quả khối phổ phân giải cao 57

3.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học các chủng tuyển chọn 60

3.4.1 Kết quả đánh giá đặc điểm sinh học loài Colletotrichum siamense I3L1 60

3.4.2 Kết quả đánh giá đặc điểm sinh học loài Diaporthe cf heveae I8T3 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Cấu trúc hoá học của CPT(1) và CPT dạng muối hoá với natri (2) 3

Hình 1 2 Cấu trúc bậc 1 của enzyme topoisomerase I 7

Hình 1 3 Cơ chế hoạt tính ức chế enzyme Topo1 của CPT 8

Hình 1 4 Con đường tổng hợp monoterpene indole alkaloids (MIA) thông qua strictosidine or strictosidinic acid có nguồn gốc từ tryptamine và secoiridoids [85] 12

Hình 1 5 Hệ sợi và bào tử của vi nấm nội sinh trong mô thực vật khỏe mạnh [36] 14

Hình 1 6 Sương muối phủ trắng Vườn Quốc Gia Hoàng Liên 22

Hình 2 1 Cành mẫu đơn đỏ Ixora coccinea L thu thập tại VQG Hoàng Liên 24

Hình 2 2 Cấu trúc vùng SSU-ITS-LSU và trình tự các mồi [59] 27

Hình 2 3 Quy trình định danh các chủng vi nấm nội sinh trong cây mẫu đơn đỏ 27

Hình 2 4 Sơ đồ thu cao chiết dịch nuôi cấy và cao chiết sinh khối tế bào 33

Hình 3 1 Sáu cây mẫu đơn đỏ được thu thập tại Vườn quốc gia Hoàng Liên, Việt Nam 38

Hình 3 2 Các bộ phận của cây mẫu đơn đỏ I.coccinea L được thu thập 39

Hình 3 3 Các chủng vi nấm nội sinh phân lập từ sáu cây mẫu đơn đỏ 44

Hình 3 4 Kết quả điện di DNA tổng số các chủng vi nấm 46

Hình 3 5 Kết quả PCR đoạn ITS1-5,8S rRNA-ITS2 bằng cặp mồi ITS4-ITS5 49

Hình 3 6 Cây chủng loại phát sinh 48 chủng nấm nội sinh 50

Hình 3 7.Ảnh TLC chủng I3L1 và I3L3 51

Hình 3 8 Phổ HPLC của chất chuẩn CPT 53

Hình 3 9 Ảnh chạy HPLC của mẫu I3L1 55

Hình 3 10 Ảnh chạy HPLC của mẫu I4H2 55

Hình 3 11 Ảnh chạy HPLC của mẫu I5T3 56

Hình 3 12 Ảnh chạy HPLC của mẫu I6T5 56

Hình 3 13 Ảnh chạy HPLC của mẫu I8T3 57

Hình 3 14 Kết quả khối phổ mẫu CPT chuẩn 57

Hình 3 15 Kết quả khối phổ chủng I8T3 59

Hình 3 16 Kết quả đo khối phổ chủng I3L1 59

Hình 3 17 Hình ảnh hiển vi Colletotrichum siamense I3L1 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Các mốc chấp thuận điều trị trong lâm sàng của ba dẫn xuất CPT 9

Bảng 1 2 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học được tổng hợp từ nấm nội sinh 15

Bảng 1 3 Một số vi nấm nội sinh có khả năng tổng hợp CPT và các 18

Bảng 2 1 Thành phần dung dịch CTAB 28

Bảng 2 2 Thành phần phản ứng PCR 31

Bảng 2 3 Trình tự cặp mồi ITS4-ITS5 31

Bảng 3 1 Ký hiệu các mẫu vật được sưu tầm và bộ phận thu hái 39

Bảng 3 2 Phân chia một số chủng có hình thái giống nhau 45

Bảng 3 3 Kết quả đo nanodrop của các mẫu DNA tổng số các chủng vi nấm 47

Bảng 3 4 Kết quả phát hiện CPT bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC 52

Bảng 3 5 Kết quả sắc ký HPLC định lượng CPT trong cao chiết dịch lỏng nuôi cấy và cao chiết sinh khối tế bào các chủng nấm nội sinh trong I.coccinea L 54

MỞ ĐẦU

Trong lịch sử phát triển, con người đã biết sử dụng thực vật và sáng tạo các bài thuốc từ thực vật để nâng cao sức khoẻ, đẩy lùi bệnh tật Trong số các hợp chất thực vật có hoạt tính sinh học đã được các nhà khoa học phát hiện và nghiên cứu, alkaloid được xem là nhóm chất đóng vai trò chính Một số alkaloid có giá trị y học cao trong điều trị ung thư như taxol, podophyllotoxin, vinblastine, vincristine, camptothecin Trong số đó, camptothecin được xem là một hợp chất chữa ung thư tiềm năng đã được nghiên cứu và ứng dụng sâu rộng hơn nửa thế kỷ qua

Camptothecin (CPT) có nguồn gốc từ cây Hỷ thụ- một loài cây đặc hữu của Trung Quốc Người Trung Quốc xưa đã sử dụng các bộ phận của loài cây này để chữa ung thư CPT được chứng minh có khả năng ức chế sự tăng trưởng và tái phát

ở một số bệnh ung thư như ung thư vú, dạ dày, buồng trứng và khối u ác tính ở mô hình chuột xenograft [24] Cây Hỷ thụ (Camptotheca acuminata) phân bố chủ yếu ở phía nam Trung Quốc, vỏ cây và lá non là nguồn cung cấp CPT chủ yếu tuy nhiên

số lượng cây ngoài tự nhiên ước tính chỉ còn khoảng bốn nghìn cây trong khi nhu cầu thị trường lên đến một trăm triệu cây [45] Ngoài tăng cường nuôi cấy ngoài tự

nhiên, các nhà khoa học cũng đã tiến hành vi nhân giống C.acuminata trong phòng

thí nghiệm bằng các kĩ thuật hiện đại như nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy rễ tơ hay nhân giống phôi vô tính tuy nhiên hiệu suất sản xuất CPT thấp, thời gian kéo dài (tính theo tháng); vì vậy việc tìm ra nguồn sản xuất CPT thay thế cây Hỷ thụ là rất quan trọng

Giới khoa học đã chú ý tới sản xuất CPT bằng vi sinh vật, đặc biệt là các vi sinh vật nội sinh Trong đó vi nấm nội sinh là một nguồn cung cấp các dẫn xuất tự nhiên quan trọng của nhiều chất, hợp chất được dùng trong Y học hiện đại (penicillin, cyclosporine, statin,…) Với ưu điểm thời gian sinh trưởng nhanh và có khả năng nhân sinh khối lớn, việc sử dụng vi nấm thay cho nuôi trồng và khai thác các loài thực vật khác nói riêng và cho các hợp chất tự nhiên nói chung sẽ giúp làm giảm gánh nặng lên môi trường trước nhu cầu ngày càng lớn của con người CPT và các

chất có cấu trúc tương tự CPT được tìm thấy ở nhiều họ thực vật với vị trí địa lý cách biệt trong các điều kiện khí hậu khác so với cây Hỷ thụ khiến nhiều nhóm nghiên cứu đặt giả thuyết rằng CPT có nguồn gốc từ các loài vi nấm nội sinh đã xâm nhập vào các cây ở vùng nhiệt đới Giới khoa học đã phát hiện được nhiều loài

vi nấm nội sinh có khả năng sản xuất camptothecin trên nhiều đối tượng ký chủ thực vật khác nhau vì vậy cần có nghiên cứu mới sàng lọc nhằm tìm ra CPT và các dẫn xuất của nó từ vi nấm sống trong các hệ thực vật sẵn có ở Việt Nam

Năm 1998, Latha PG và Panikkar KR đã báo cáo khả năng kháng u và gây độc

khối u của dịch chiết hoa mẫu đơn đỏ Ixora coccinea L khi tiêm màng bụng chuột

mang Dalton's lymphoma và chuột mang khối u biểu mô cổ trướng Ehrlich Từ đó

đã có nhiều nghiên cứu với nỗ lực xác định sự có mặt của CPT trong loài cây này Năm 2011, Saravanan và cộng sự đã công bố thành phần CPT trong mẫu lá non và

lá trưởng thành của Ixora coccinea L là 2,8% [68]

Nhận định Vườn Quốc gia Hoàng Liên (Lào Cai, Việt Nam) có thảm thực vật phong phú và đa dạng là điều kiện tốt để hệ vi nấm phát triển, đồng thời khí hậu và thời tiết nơi đây có sự chênh khác biệt lớn trong năm và có xuất hiện các kiểu thời tiết cực đoan như sương muối, băng tuyết, phù hợp với cơ chế sản sinh các hợp chất thứ cấp Chúng tôi quyết định tiến hành thu thập mẫu cây mẫu đơn đỏ tại đây

để thực hiện đề tài “Phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp Camptothecin từ cây mẫu đơn đỏ (Ixora coccinea L) tại Việt Nam”

với những mục tiêu nghiên cứu sau:

1 Phân lập các chủng vi nấm nội sinh trong cây Mẫu đơn đỏ Ixora coccinea L

2 Định danh các chủng vi nấm nội sinh phân lập được bằng giải trình tự đoạn ITS1-5,8S rRNA-ITS2

3 Sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp Camptothecin trong môi trường lên men

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Camptothecin và các hợp chất có cấu trúc tương tự Camptothecin

1.1.1 Cấu trúc của Camptothecin (CPT), lịch sử phát hiện

CPT có công thức hoá học là C20H10N2O4, khối lượng phân tử 348.352 g/mol, tên IUPAC là : (S)-4- ethyl-4-hydroxy-1H-pyrano[3′,4′:6,7] indolizino[1,2-b]quinoline-3,14-(4H,12H)- dione] CPT là một monoterpenoid indole alkaloid

Hình 1 1 Cấu trúc hoá học của CPT(1) và CPT dạng muối hoá với natri (2)

CPT có một đặc tính là khó tan trong nước, có độc tính cao và nhanh bị mất hoạt tính do bị thuỷ phân vòng lactone ở ngay điều kiện pH sinh lý Để khắc phục tính khó tan, CPT được muối hoá với natri (Hình 1) tuy nhiên muối này có hiệu quả kém hơn so với CPT ban đầu [27]

1.1.2 Lịch sử phát hiện Camptothecin

Vào những năm 50, số ca tử vong do các bệnh truyền nhiễm đặc biệt là viêm phổi có chiều hướng giảm nhờ thành tựu phát hiện ra thuốc kháng sinh, từ đó bệnh tim và ung thư chính thức trở thành hai mối nguy cơ sức khỏe lớn nhất đối với con người Bệnh ung thư phổ biến và có thể gặp ở nhiều bộ phận khác nhau của cơ thể, chúng cũng không phân biệt tuổi tác, giới tính do đó giới khoa học đã thúc đẩy nghiên cứu ung thư, đặc biệt là hoá trị liệu Trong khi đó, Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) do Monroe Wall đứng đầu đang sàng lọc thực vật để tìm phytosteroid dùng

để làm tiền chất sản xuất cortisone- hợp chất đang có nhu cầu thị trường lớn lúc bấy giờ nhưng nguồn cung hạn chế Trong quá trình thử nghiệm khả năng chống ung thư trên quy mô hàng nghìn chiết xuất từ thực vật tại Viện ung thư quốc gia (NCI),

chiết xuất từ Taxus baccata và Camptotheca acuminata thể hiện hoạt tính đáng kể

Từ đó chúng được nghiên cứu rộng rãi, ngày nay hợp chất CPT đã được ứng dụng trong điều trị ung thư buồng trứng và ung thư vú

Trong số hàng nghìn dịch chiết bằng dung môi Ethanol, dịch chiết của

C.acuminata đã thể hiện khả năng gây độc tế bào tuyệt vời khi thử nghiệm trên tế

bào L.1210 leukemia chuột Wall đã rất kỳ vọng có thể xác định được hợp chất có

hoạt tính kháng khối u có mặt trong dịch chiết C.acuminata Dịch chiết thô của C.acuminata đã được phân đoạn bằng nhiều dung môi khác nhau và CPT đã được

tìm thấy vào năm 1966 Nhóm nghiên cứu phát hiện ra rằng CPT không chỉ có khả năng kháng lại các tế bào L1210 leukemia mà còn có hiệu quả đối với các tế bào p338 leukemia

CPT và các dẫn xuất của nó đã được chứng minh có hoạt tính kháng virus, hoạt tính trừ sâu, hoạt tính chống ký sinh trùng, hoạt tính chữa vảy nến và khả năng kháng nấm

Hoạt tính kháng virus

CPT và các dẫn xuất của nó thể hiện hoạt tính kháng virus khá tốt Hoạt động của enzyme Topoisomerase 1 liên quan đến các retrovirus như HIV [55] Horwitz [25], Priel [55] đã báo cáo rằng liều không độc của CPT có thể ức chế sự nhân lên của virus HIV trong các tế bào H9 được lây nhiễm virus HIV cấp tính (với hiệu suất cao >90%) Ngoài ra các chất có cấu trúc tương tự CPT cũng đã được đánh giá là có hoạt tính kháng virus Topotecan đã được chứng minh mang lại hiệu quả khi điều trị bệnh não đa ổ tiến triển liên quan đến AIDS [71] Nghiên cứu của Sadaie và cộng

sự công bố năm 1999 cho thấy 9-nitrocamptothecin ức chế sự nhân bản của virus HIV-1 các tế bào monocytoid U937 mới lây nhiễm [64]

Hoạt tính trừ sâu

Thời Trung Quốc cổ đại, dịch chiết thô của C.acuminata có chứa CPT đã được

dân gian sử dụng để kiểm soát côn trùng gây hại trong suốt nhiều thế kỉ, các nghiên cứu về sau đã báo cáo rằng CPT là một loại thuốc trừ sâu mạnh đối với ruồi nhà và sâu bướm bắp cải [10,28] Nó cũng thể hiện hoạt động ức chế đáng kể đối với một

số loài gây hại nông nghiệp như Empoasca vitis, Mythimna separata, Brevicoryne brassicae, Nilaparvata lugens, Chilo suppressalis [10,16,74] Một nghiên cứu năm

2010 đã chỉ ra CPT có thể gây ra những biến đổi trong cấu trúc ruột giữa của côn trùng lepidopteran như mất lớp tế bào đơn trong tế bào biểu bì và phá vỡ màng phúc mạc [46]

Ngoài ra một số hợp chất bao gồm 7-CH2C6H5-CPT, CHO-CPT,

7-CH2OCOC6H5-CPT, 10-O-CH2OCOC6H5-CPT, 20-CH2OCOC6H5-CPT và

20-F-CPT có khả năng diệt tuyến trùng Bursaphelenchus xylophilus mạnh hơn 20-F-CPT

Hoạt tính chống ký sinh trùng

African trypanosomes (thuộc loài Trypanosoma brucei) là một động vật nguyên

sinh ký sinh gây chết đối với người và gia súc Các nghiên cứu đã chỉ ra CPT gây độc

tế bào đối với African trypanosomes và các sinh vật ký sinh đường máu gây bệnh liên

quan [19]

Hoạt tính chống vảy nến

Vảy nến là một bệnh viêm da mãn tính do các tế bào sừng biểu bì tăng sinh và biệt hoá bất thường Từ đầu những năm 1970, một số nghiên cứu đã công bố các chế phẩm bôi ngoài da chứa CPT để điều trị vảy nến [15] Những nghiên cứu ban đầu này cho thấy CPT trong vai trò là một chất ức chế topoisomerase có hiệu quả trong điều trị bệnh vẩy nến Năm 2001, nhóm nghiên cứu của Wang báo cáo rằng 10-hydroxy-CPT cũng thể hiện hiệu quả chữa vảy nến đáng kể [77] Sau đó nhóm nghiên cứu của Lin [42,43] tiết lộ rằng CPT và iso-CPT ức chế sự phát triển của tế bào sừng trưởng thành ở người được nuôi cấy trong ống nghiệm bằng cách gây ra quá trình apoptosis Đến năm 2006,2008, các nghiên cứu của Lin đã chứng minh rằng cơ chế điều trị vẩy nến của CPT liên quan đến khả năng chống tăng sinh và cảm ứng quá trình apoptosis các tế bào sừng thông qua việc điều hoà hoạt động của telomerase [41]

Hoạt tính kháng nấm

Từ năm 1999, Del Poeta et al đã đánh giá hoạt tính kháng nấm của CPT và các

analog của nó đối với các chủng Saccharomyces cerevisiae, bao gồm cả chủng dại,

chủng đột biến erg6, chủng đột biến erg6 top 1 biểu hiện topoisomerase 1 của

Cryptococcus neoformans [18] Họ phát hiện ra rằng một số dẫn xuất thể hiện khả

năng kháng nấm mạnh khi các chủng biểu hiện quá mức Topo-1 đặc biệt là cấu trúc vòng A có 10,11-methylenedioxy có khả năng tăng tương tác với enzyme Topo-1 của nấm Những phát hiện này cho thấy CPT và một số dẫn xuất nhất định có thể

nhắm mục tiêu hiệu quả đến enzyme topoisomerase 1 của C.neoformans để hình

thành tính kháng Để tiếp tục đánh giá hoạt tính kháng nấm, nhóm nghiên cứu của

Li và cộng sự [40] đã thử nghiệm CPT trên các loài nấm mốc Alternaria alternata, Epicoccum nigrum, Pestalotia guepinii, Drechslera sp., và Fusarium avenaceum

[47] CPT ức chế 50% sự sinh trưởng (EC50%) ở nồng độ 10-30µg/mL và ức chế hoàn toàn ở nồng độ 75-125µg/mL Năm 2008, Zhang và cộng sự cũng ghi nhận

khả năng kháng các chủng Rhizoctonia solani, Sphaerotheca fuliginea và Pseudoperonospora cubensis trong điều kiện nhà kính và đồng ruộng [39] Vai trò

của CPT và các dẫn xuất của CPT trong phát triển thuốc chữa ung thư

Mặc dù được phát hiện từ năm 1966 và đã có nhiều thử nghiệm lâm sàng chống ung thư nhưng các thử nghiệm của CPT đã bị ngừng do một số hạn chế như khả năng hoà tan trong nước kém, độc tính gây tác dụng phụ không mong muốn như suy tuỷ, tiêu chảy và viêm bàng quang xuất huyết [50] Quá trình phát triển CPT làm thuốc xảy ra ba vấn đề lớn như sau:

Do đặc điểm cấu trúc mà CPT cần phải được sửa đổi để có thể hoà tan trong nước bằng cách sửa đổi một số vị trí nhất định trên xương sống cấu trúc năm vòng của CPT như vòng A, B, E Trong đó các vị trí sửa đổi được nghiên cứu nhiều nhất

là 7, 9, 10 Sự cải biến cấu trúc dẫn đến khả năng giải phóng thuốc nhanh chóng, nồng độ thuốc trong máu quá cao gây ra các tác dụng phụ như tiêu chảy, ức chế tuỷ xương; việc thay đổi cấu trúc cần xem xét tốc độ giải phóng và độ ổn định của thuốc để đảm bảo hiệu quả với độ an toàn cao

Năm 1985, nhóm nghiên cứu của Hsiang khám phá ra rằng CPT và các dẫn xuất của nó nhắm vào enzyme Topoisomerase I (Topo1) trong nhân tế bào, chúng tạo liên kết thuận nghịch với phức hợp DNA-Topo1 và tạo thành phức hợp bậc ba CPT-

DNA-Topo1 [26] (hình 1.3) Phức hợp này ức chế sự sao chép DNA và sự phiên mã RNA và cảm ứng gây chết tế bào Topoisomerase là enzyme tham gia vào quá trình loại bỏ các mạch siêu xoắn của DNA trong các quá trình sao chép, phiên mã; chúng làm giãn xoắn các mạch DNA, làm đứt gãy sợi đơn trong quá trình tái tổ hợp và tham gia vào quá trình cô đặc nhiễm sắc thể

Sự phân cắt DNA bởi enzyme topoisomerase đi kèm với sự hình thành liên kết phosphodiester tạm thời giữa chuỗi bên tyrosine trong enzyme và một trong số các đầu của sợi DNA đứt gãy Enzyme topoisomerase chỉ phân cắt một sợi của DNA được xác định là loại I, trong loại I có hai phân loại thấp hơn là phân loại IA (Nếu enzyme liên kết với nhóm phosphate ở đầu 5’ DNA) và phân loại IB (nếu enzyme liên kết với nhóm phosphate đầu 3’) Loại topoisomerase phân cắt cả hai sợi để tạo

ra đứt gãy so le được xếp vào loại II [14]

Hình 1 2 Cấu trúc bậc 1 của enzyme topoisomerase I

Enzyme topoisomerase I ở người là cấu trúc monomer có kích thước phân tử 91kDa được chia thành bốn domain Amino acid 214 ở đầu N đóng vai trò quan trọng cho hoạt động dãn xoắn và tạo vùng ưa nước, không cấu trúc [72] Trong vùng đầu N có chứa 4 trình tự là các tín hiệu định vị trong nhân tế bào và các vị trí tương tác với một số protein như nucleolin, SV40 T-antigen, certain transcription factors, p53, và protein WRN Domain lõi bao gồm trình tự 421 amino acid có tính bảo thủ cao Domain lõi và domain đầu C được liên kết với nhau bởi một vùng bao gồm 77 amino acid có tính bảo thủ kém [14]

Hình 1 3 Cơ chế hoạt tính ức chế enzyme Topo1 của CPT

So với các chất ức chế Topo2, các chất ức chế Topo1 có hiệu lực cao và có phổ kháng khối u rộng, vì vậy phát hiện CPT ức chế đặc hiệu enzyme Topo1 đã tạo nên một làn sóng quan tâm mới trên khắp thế giới

Dẫn xuất đầu tiên của CPT là 10-Hydroxycamptothecin (HCPT) được phát triển vào những năm 1970 Nhờ những kết quả thử nghiệm lâm sàng đáng tin cậy, HCPT nhận được sự chú ý rộng rãi Các nhà khoa học trên khắp thế giới tiếp tục nỗ lực khám phá, đến những năm 1990, thế hệ thuốc mới có nguồn gốc từ CPT ra đời với sự xuất hiện của Topotecan (TPT) và Irinotecan (CPT-11) Từ đó trở đi, hàng loạt các dẫn xuất khác của CPT được tổng hợp, nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng Hiện nay, có ba dẫn xuất của CPT đã được FDA chấp thuận sử dụng để điều trị ung thư ở người (bảng 1.1) Ngoài 3 dẫn xuất trên, một loạt các dẫn xuất khác của CPT cũng đang được thử nghiệm lâm sàng bao gồm exatecan (DX-8951f), IDEC-132 (9-aminocamptothecin), rubitecan (9- nitrocamptothecin), lurtotecan (GI-147211C), gần đây nhất là homocamptothecins (HCPTs), diflomotecan (BN-80915) và BN-80927

Bảng 1 1 Các mốc chấp thuận điều trị trong lâm sàng của ba dẫn xuất CPT

Irinotecan 14/6/1996 (FDA)

Đối với bệnh nhân ung thư biểu mô ruột kết hoặc trực tràng di căn: dùng trong lượt hoá trị đầu tiên, kết hợp với 5-fluorouracil

Cây Hỷ thụ (Camptotheca acuminate) là loài thực vật đầu tiên được phát hiện có

chứa CPT, có nguồn gốc và phân bố ở phía Nam Trung Quốc và Tây Tạng Trong

20 năm tiếp theo (1977-1996), CPT được tìm thấy trong bảy loài thực vật khác

nhau, bao gồm cây Xà Căn đậu Ophiorrhiza mungos L [26], các cây thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae) như Ervatamia heyneana (Wall.) T Cooke, các loài cây thuộc

họ Thụ đào (Icacinaceae) như Merrilliodendron megacarpum (Hemsl.) Sleumer, 4 loài Nothapodytes và loài thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) như Ophiorrhiza filistipula Miq

Từ năm 1997-2018, các loài thực vật có khả năng sản sinh CPT và các chất có cấu trúc tương tự CPT tiếp tục được khám phá 34 loài thực vật thuộc các họ Trúc

đào (Apocynaceae), họ Bạch Dương (Betulaceae), họ Hoàng đằng (Gelsemiaceae),

họ Thụ đào (Icacinaceae), họ Xoan (Meliaceae), họ Lam quả (Nyssaceae), họ Cà

phê (Rubiaceae) và họ Hoa tím (Violaceae) được báo cáo là có thể tách chiết và xác

định được CPT đáp ứng cho nhu cầu của thị trường Hiện nay, đã có 43 loài thực vật thuộc 8 họ khác nhau đã được chứng minh về khả năng sản xuất CPT: 49% các

loài có khả năng sản sinh CPT được báo cáo thuộc họ Thụ đào (Icacinaceae); 28% các loài có khả năng sản sinh CPT thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) Có thể thấy là các

loài thực vật được báo cáo chủ yếu phân bố ở các nước Tây Nam Á, đặc biệt là phía Nam Trung Quốc và Tây Ấn Độ 7 loài trong số các loài thực vật này, bao gồm

Miquelia dentata Bedd., N obscura, N obtusifolia, N tomentosa, N pittosporoides, Pyrenacantha volubilis Hook., Dysoxylum binectariferum (Roxb.) Hook.f ex Bedd được báo cáo là có thành phần CPT cao hơn cây Hỷ thụ (C acuminata)

1.2.1 Con đường tổng hợp Camptothecin

Hơn 2000 monoterpene indole alkaloid (MIA) được cho là có nguồn gốc từ chất trung gian thông thường, có tác dụng phân tách con đường sinh tổng hợp MIA thành các bước prestrictosidine và poststrictosidine [17,52] Ở thực vật con đường methylerythritol 4-phosphate (MEP) và axit mevalonic (MVA) cung cấp các tiền chất terpene cơ bản như isopentenyl pyrophosphate (IPP) để tạo thành secologanin thông qua con đường iridoid [34] Trong con đường shikimate, một số enzyme tham gia vào các phản ứng nhiều bước từ axit chorismic đến tryptamine, là một tiền chất khác cho quá trình sinh tổng hợp CPT Các enzyme này bao gồm anthranilate synthase (ASA), phosphoribosyl diphosphate anthranilate transferase (PRT), tryptophan synthase α (TSA), tryptophan synthase β (TSB) và tryptophan decarboxylase (TDC) Sau đó, tryptamine và secologanin được cô đặc thành cleosidine nhờ tổng hợp nghiêm ngặt (STR) Tuy nhiên, chúng ta vẫn chưa thật sự hiểu biết hết về một số bước enzyme trong con đường poststrictosidine, và mới chỉ xác định được một số chất trung gian chuyển hóa trong con đường sinh tổng hợp CPT như pumiloside và deoxypumiloside đã được xác định [4,15] Dựa trên hiểu biết hiện tại về quá trình sinh tổng hợp CPT, strictosidine được coi là chất trung gian quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các MIA như vinblastine và

vincristine Tuy nhiên, mặc dù CPT thuộc họ MIA nhưng các nhà khoa học chưa

phát hiện được strictosidine có trong C acuminata [65]

Ở C.acuminata, secologanin (hoặc axit secologanic) được tạo thành nhờ phản

ứng xúc tác của enzyme secologanin synthase (SLS) [83] Tuy nhiên enzyme chuyển hóa secologanic acid và tryptamine thành strictosidinic acid vẫn chưa được

xác định ở C acuminata, N nimmoniana, hoặc O pumila

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp Camptothecin

Một số nghiên cứu đã cho thấy, hàm lượng CPT và các chất có cấu trúc tương tự

CPT trong các loài thực vật là rất thấp Các loài Hỷ thụ (C acuminate) có thành

phần CPT dao động trong khoảng: 0,012–0,236% [44,45] và cây thuộc họ Xà căn

(N nimmoniana) có thành phần CPT: 0,81–0,775% [35,60] Nguồn cung CPT chủ yếu từ vỏ và lá non C.acuminata Khả năng tổng hợp CPT ở thực vật bị ảnh hưởng

bởi nhiều yếu tố Sản lượng CPT thay đổi đáng kể theo mùa vụ, kiểu gen, nhiệt độ

và điều kiện sinh lý Các cây bị bệnh và các cây mọc ở những vùng khô hơn, chịu nhiều áp lực môi trường gây ra bởi tác động của con người thường có nồng độ CPT lớn hơn Tuy nhiên những cây mọc trong các đồn điền cà phê thì lại có hàm lượng ít hơn Nguyên nhân đưa ra đó là các cây trong đồn điền được trồng với mục đích tạo bóng mát cho cây cà phê và được chăm bón, bảo vệ tốt Hàm lượng CPT cao nhất trong mẫu rễ và vỏ cây, điều này có thể do sự tích tụ các chất chuyển hoá thứ cấp độc hại trong các mô chết, đây là hiện tượng phổ biến ở thực vật

Cho dù cây được trồng từ phương pháp thông thường hay vi nhân giống thì hàm lượng CPT có thay đổi theo mùa, theo thời điểm thu hoạch và các yếu tố môi trường khi chuyển ra đồng ruộng Sự khác nhau về hàm lượng không chỉ ở các loài mà còn khác nhau ở các bộ phận khác nhau của cây Một số nghiên cứu cho thấy CPT được tích luỹ ở trụ lá mầm, lá sơ cấp và chồi ngọn nhiều hơn trong rễ và lá mầm [67] Nghiên cứu khác lại cho thấy nồng độ CPT giảm trong rễ nhưng lại tăng trong trụ lá mầm khi cây con lớn lên Lượng CPT có trong lá non nhiều hơn trong lá trưởng thành là 0,4%, cao hơn 1,5 lần CPT trong hạt và cao hơn 2,5 lần trong vỏ của

C.acuminata Lượng CPT trong rễ trưởng thành giảm có thể do thoái hoá CPT hoặc

CPT được vận chuyển đến các cơ quan khác như lá non, các ống tiết hoặc các glandular trichomes (glandular trichomes là bộ phận có chức năng tiết các hợp chất thứ cấp của thực vật và chỉ được tìm thấy ở khoảng 30% thực vật trên thế giới) [80]

Hình 1 4 Con đường tổng hợp monoterpene indole alkaloids (MIA) thông qua strictosidine or strictosidinic acid có nguồn gốc từ tryptamine và secoiridoids

[85]

STR, strictosidine synthase; STRAS, strictosidinic acid synthase

1.3 Vi nấm nội sinh và tiềm năng tổng hợp Camptothecin và các hợp chất có cấu trúc tương tự Camptothecin

Trong tự nhiên, CPT được tổng hợp chủ yếu bởi C.acuminata và N.foetida, bản

thân CPT là nguyên liệu ban đầu cho các thuốc có nguồn gốc từ CPT dùng trong lâm sàng tuy nhiên hàm lượng CPT từ thực vật không thể đáp ứng nhu cầu lớn cho thị trường toàn cầu Các nhà khoa học trên thế giới đã nỗ lực tìm kiếm các nguồn sản xuất CPT khác thay thế cho CPT thực vật trong đó có vi nấm nội sinh

1.3.1 Khái niệm vi nấm nội sinh

Thực vật là nơi sinh sống của nhiều vi sinh vật, giữa thực vật và vi sinh vật tồn tại nhiều dạng quan hệ phụ thuộc vào loài, kiểu dinh dưỡng và điều kiện môi trường sống Một loài thực vật có thể mang trên mình hàng nghìn loại vi sinh vật, dựa vào

vị trí trú ngụ trên mô thực vật người ta chia thành hai loại bao gồm vi sinh vật ngoại sinh (loại vi sinh vật trong sinh quyển, sống gần hoặc trên mô thực vật) và vi sinh vật nội sinh (gồm những loài cư trú bên trong các mô thực vật) [6,53,75] Debary là người đầu tiên phát hiện ra các sinh vật (không gây bệnh) bên trong thực vật đầu tiên (1986) nhờ sử dụng kính hiển vi Ông cũng đã đưa ra định nghĩa đầu tiên về vi sinh vật nội sinh (endophyte) như sau: “bất kỳ sinh vật nào phát triển trong các mô thực vật đều được gọi là endophyte”

Sinh vật nội sinh có thể là vi nấm hoặc vi khuẩn (bao gồm xạ khuẩn và mycoplasma) Vi khuẩn nội sinh rất đa dạng, có thể là vi khuẩn gram âm hoặc gram

dương, chẳng hạn như Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Brevibacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, [29] Các vi khuẩn

nội sinh được biết đến với vai trò sản xuất các chất chuyển hoá thứ sinh có hoạt tính sinh học như các hợp chất kháng khuẩn và chống ung thư, đặc biệt 76% trong số

chúng được phát hiện thuộc cùng một chi Streptomyces [7] Các nhà vi sinh vật đã tách chiết được một số hợp chất quan trọng từ các loài Streptomyces nội sinh như

munumbicins (A và B), naphthomycin (A and K), clethramycin, coronamycin, cedarmycin (A và B), saadamycin, and kakadumycins Ngoài ra các nhà khoa học cũng đã phân lập được hợp chất palitaxel có tác dụng chống ung thư từ xạ khuẩn

Kitasatospora sp sống nội sinh với cây Taxus baccata, hợp chất tyrosol từ Emblica

Nấm là sinh vật dị dưỡng có nhiều chu kỳ sống khác nhau, dựa vào đặc điểm phát sinh loài và lịch sử phát triển mà người ta chia nấm nội sinh thành hai nhóm lớn bao gồm nấm nội sinh clavicipitaceous (sống trong một số loài cỏ vùng có khí hậu mát)

và nấm nội sinh non-clavicipitaceous (có trong các mô của thực vật không mạch, dương xỉ,

cây lá kim, thực vật hạt kín và chỉ giới hạn ở nhóm Ascomycota hoặc Basidiomycota)

Hình 1 5 Hệ sợi và bào tử của vi nấm nội sinh trong mô thực vật khỏe mạnh

[36]

1.3.2 Vai trò của vi nấm nội sinh trong khoa học và đời sống con người

Một số thuốc kháng sinh và thuốc chống ung thư sử dụng rộng rãi ngày nay

được sản xuất từ nấm nội sinh phải kể đến Penicillenols (chiết xuất từ Penicillium sp.), Taxol được phân lập từ Taxomyces andreanae là loại thuốc chữa ung thư hiệu

quả và thành công nhất được tách chiết từ nấm nội sinh Pestacin được phân lập từ

P microspora có đặc tính chống oxy hoá rất tốt Ngoài ra còn có clavatol (Torreya mairei), sordaricin (Fusarium sp.), jesterone (Pestalotiopsis jesteri), và javanicin

(Chloridium sp.) cũng là những chất có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh

chống lại nhiều tác nhân lây nhiễm thực phẩm [32]

Bảng 1 2 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học được tổng hợp từ nấm nội sinh

Vi nấm nội

sinh

Hợp chất có hoạt tính sinh học được phân lập

Mầm bệnh bị ức chế

Phương thức lây truyền của mầm bệnh

Tài liệu tham khảo

Fusarium

proliferatum Beauvericin

Clostridium botulinum

Thực phẩm đóng hộp, thực phẩm chế biến không đúng cách

[48]

Fusarium

proliferatum

Kakadumycins, beauvericin

Listeria monocytogenes

Sữa tươi nguyên chất hoặc sữa tiệt trùng, cá xông khói [23,48]

Thịt, trứng và các loại hạt chưa qua xử lý

[33,71]

Nigrospora sp Saadamycin Fusarium

oxysporum

Ngô, ngũ cốc, lạc và cây quả hạch [21,22]

Phomopsis sp Munumbicins Aspergillus niger Ngô, ngũ cốc, lạc và cây

quả hạch [32]

Fusarium

proliferatum

methylcoumarin , Beauvericin

amino-4-Yersinia enterocolitica

Thịt lợn và các sản phẩm từ thịt, sữa [48]

Xylaria sp

Ginkgo biloba Sordaricin 7

Yersinia enterocolitica

Thịt lợn và các sản phẩm từ thịt, sữa [33]

Một số hợp chất có hoạt tính sinh học như camptothecin, diosgenin, hypericin, paclitaxel, podophyllotoxin, vinblastine từ các nấm nội sinh đã được sản xuất thương mại [33,86] Các hợp chất này có cấu trúc tương tự nhiều loại phytohormone, tinh dầu, có vai trò hữu ích đối với sức khoẻ con người

1.3.3 Tiềm năng tổng hợp Camptothecin và các chất có cấu trúc tương tự Camptothecin của vi nấm nội sinh

Hai nguồn thực vật tổng hợp CPT chủ yếu là cây Hỷ thụ (Camptotheca acuminata- phân bố chủ yếu ở Tây nam Trung Quốc) và cây thuộc chi Nothapodytes foetida phân bố chủ yếu ở Ấn Độ Nhờ tiềm năng to lớn của CPT, người ta ước tính rằng cần ít nhất 100 triệu cây C acuminata non để đáp ứng nhu

cầu [45] Thị trường irinotecan và topotecan trên toàn thế giới ước tính đạt 1000 triệu đô la Mỹ, tương ứng với khoảng 1 tấn nguyên liệu CPT [79] Phương pháp khai thác truyền thống là đốn cây, sấy khô và xuất khẩu, hoạt động kinh doanh sản xuất này hoàn toàn được quản lý bởi tư nhân Một kilogam thân cây khô được xuất khẩu với giá 1500 đô la Mỹ Để sản xuất CPT, người Ấn Độ phụ thuộc vào gỗ và vỏ

của loài N nimmoniana phân bố ở vùng Tây Ghats, nhu cầu của Ấn Độ đối với sinh

khối của loài cây này khoảng 500-700 tấn mỗi năm Tuy nhiên đây là hai loài cây phát triển chậm và có thời kỳ cây non kéo dài Mặc dù con người có thể đưa ra giải pháp mở rộng trồng trọt nhưng khai thác CPT từ nguồn thực vật gặp nhiều khó khăn như biến đổi khí hậu, thời tiết, sâu bệnh, sự khai thác hợp chất từ thực vật có thể dẫn đến những lo ngại về môi trường Vì vậy để có một giải pháp bền vững và hợp

lý, chúng ta cần áp dụng những kĩ thuật công nghệ sinh học tiên tiến để mở rộng quy mô sản xuất ngày càng lớn mà không phá huỷ quần thể hoang dã Hai giải pháp tiềm năng được đưa ra đó là nuôi cấy mô thực vật và nuôi cấy vi nấm nội sinh trên quy mô công nghiệp

Nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô thực vật là phương pháp nuôi cấy và duy trì mô tế bào trong điều kiện vô trùng Quá trình nuôi cấy có thể tạo ra sinh khối mô thực vật lớn

và rút ngắn thời gian so với nuôi trồng ngoài tự nhiên mà chỉ cần rất ít lượng mô

nuôi cấy ban đầu Một số kỹ thuật đã được áp dụng để nuôi cấy mô các cây có khả

năng tổng hợp CPT (C.acuminata, Nothapodytes nimmoniana, Ophiorrhiza sp.), như nuôi cấy tạo mô sẹo, nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy rễ tơ, nhân giống

phôi vô tính Nghiên cứu của Wiedenfeld và cộng sự 1997 báo cáo hàm lượng CPT

là 2,04-2,36 mg/g sinh khối khô và hàm lượng HCPT 80–100 µg/g trong mô sẹo

C.acuminata nuôi cấy [82] Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào để sản xuất các chất

chuyển hoá thứ cấp được thực hiện trong các bể bioreactor Báo cáo được công bố năm 2017 của Yang và cộng sự cho thấy CPT có trong dịch nuôi huyền phù tế bào

C.acuminata nhưng khi nuôi cấy liên tục, hàm lượng CPT suy giảm Trong số đó,

sorbitol- một chất gây tăng áp lực thẩm thấu được ghi nhận kích thích tổng hợp CPT gấp 500 lần [84] Nuôi cấy rễ tơ trong môi trường in vitro sử dụng vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes được coi là một phương pháp thay thế để tạo ra các chất

chuyển hoá thứ cấp có giá trị cao Trong báo cáo của Lorence năm 2004, rễ tơ

C.acuminata được cảm ứng từ hypocotyl và lá thật, hai chủng vi khuẩn được sử dụng để cảm ứng tạo rễ tơ bao gồm Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 và R-

1000 Rễ tơ thu được từ hypocotyl được chuyển vào môi trường B5 có bổ sung đường sucrose nồng độ 3% Sau hai tuần cấy chuyển, nhóm nghiên cứu thu được CPT và HCPT được rễ tơ tiết vào môi trường nuôi cấy với nồng độ lần lượt là 0.85-1,15 mg/g và 0,14-0,16 mg/g sinh khối khô Nhóm nghiên cứu đồng thời không phát hiện CPT trong mẫu rễ tơ [66] Mặc dù đã đạt được nhiều thành tựu trong nuôi cấy, nhân bản và cảm ứng tổng hợp CPT và các chất có cấu trúc tương tự CPT nhưng phương pháp nuôi cấy mô thực vật vẫn tồn tại một số nhược điểm như giai đoạn vào mẫu khó khăn, hiệu suất tổng hợp CPT không cao thậm chí thấp hơn ngoài tự nhiên và thời gian nuôi cấy chưa đủ ngắn (tính theo tháng) Vì vậy các nhà công nghệ sinh học đã chú ý đến đối tượng vi nấm nội sinh bởi ưu điểm lớn nhất phải kể đến thời gian sinh trưởng nhanh hơn thực vật, tối ưu đơn giản, bền vững và

dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất lớn

Nuôi cấy vi nấm nội sinh

Trong quá trình nuôi cấy, nhiều loài vi sinh vật nội sinh có khả năng tạo ra một

số chất chuyển hoá thứ cấp quan trọng bao gồm các hợp chất chống ung thư, điều trị đái tháo đường, kháng nấm và ức chế miễn dịch Nhiều hợp chất trong số này bắt chước gần giống các hợp chất được cây ký chủ tương ứng tạo ra cho thấy các vi sinh vật có thể đóng vai trò là nguồn sản xuất chất chuyển hoá thứ cấp của thực vật Một số hợp chất quan trọng được tổng hợp từ vi nấm nội sinh phải kể đến taxol (palitaxel), camptothecin, vinblastine, enniatin, trichodermin Các nhà khoa học đã phát hiện được một số chủng nấm nội sinh có khả năng tổng hợp CPT và các hợp chất tương tự CPT, được liệt kê trong bảng 1.3:

Bảng 1 3 Một số vi nấm nội sinh có khả năng tổng hợp CPT và các

hợp chất tương tự CPT

Vi nấm nội sinh Cây ký chủ Hình thức

nuôi cấy

Hoạt chất đƣợc tổng hợp

Hàm lƣợng Tài

liệu

Aspergillus sp LY341 C.acuminata Lên men CPT 7,93µg/L [57]

Aspergillus sp LY355 C.acuminata Lên men CPT 42,92µg/L [57]

T.atroviride 357 C.acuminata Lên men CPT 197,82µg/L [57]

B.dothidea X4 C.acuminata Thu hệ sợi 9-MCPT - [20]

C.fructicola F1 N.nimmoniana Lên men

A.alternata XSQZ04 C.acuminata Thu hệ sợi CPT 29µg/g [73]

P.vaccinii XSCY02 C.acuminata Thu hệ sợi CPT 24µ/g [73]

Neurospora crassa N.nimmoniana Lên men CPT - [61]

Nodulisporium sp N.nimmoniana Bioreactor CPT 45µg/g [72]

Paenibacillus

polymyxa LY214 C.acuminata Lên men CPT 2,8µg/L [56]

Xylaria sp C.acuminata Nuôi cấy

ngập chìm 10-HCPT 5,4mg/L [56]

Entrophospora

ỉnfrequens N.nimmoniana Bioreactor CPT

4,96 0,73mg/100g [5]

Nấm nội sinh Fusarium solani được phân lập từ cây C.acuminata có khả năng

tổng hợp CPT nhưng khi tiến hành cấy chuyển thì khả năng sinh tổng hợp giảm đáng kể Kusari và cộng sự ( năm 2011) đã nghiên cứu sự tương tác giữa vi nấm nội sinh-vật chủ và giải thích nguyên suy giảm khả năng tổng hợp CPT Nhóm nghiên cứu đã thiết kế thí nghiệm như sau: nấm nội sinh được tái tương tác với cây ký chủ một cách nhân tạo sau đó được phân lập trở lại Mặc dù tương tác giữa nấm nội

sinh-cây ký chủ có thể được phục hồi nhưng không thể phục hồi khả năng sinh tổng hợp CPT Sử dụng phương pháp tiếp cận dựa trên sự tương đồng và khối phổ tỷ lệ đồng vị có độ chính xác cao, nhóm nghiên cứu đã đề xuất rằng nấm nội sinh sử dụng geraniol 10-hydroxylase, secologanin synthase, tryptophan decarboxylase có sẵn để tổng hợp tiền chất của CPT Tuy nhiên chúng lại cần enzyme của cây ký chủ

có tên là strictosidine synthase để kết hợp tryptamine và secologanin để tạo thành strictosidine từ đó tổng hợp CPT Các gen sinh tổng hợp CPT của nấm nội sinh đã xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên ở thế hệ cấy chuyển thứ bảy, sự thay thế base này dẫn đến rối loạn chức năng cấp độ acid amin trong khi các gen kiểm soát, gen Topo1 và rDNA vẫn nguyên vẹn qua các thế hệ cấy chuyển Điều này cho thấy khi

so với gen giữ nhà, các gen chịu trách nhiệm tổng hợp CPT không ổn định và không được thể hiện trong quá trình trao đổi chất Nghiên cứu của Kusari và cộng sự đã tiết lộ nguyên nhân giảm sản xuất CPT qua các thế hệ cấy chuyển nấm nội sinh và chúng ta không thể đảo ngược quá trình này bằng cách cho nấm nội sinh và cây ký chủ tái tương tác [37]

1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào về thành phần và hoạt tính sinh học của CPT hoặc các chất có cấu trúc tương tự CPT trong việc điều trị ung thư từ các loài thực vật bản địa và vi nấm nội sinh trên cây Dựa vào các công bố khoa học trên các tạp chí ở trong và ngoài nước, các loài thực vật có chứa CPT ở Việt Nam chủ yếu tập trung ở Vườn quốc gia Hoàng Liên, Vườn quốc gia Ba Vì, Vườn quốc gia Cúc Phương, Vườn quốc gia Cát Tiên

Việc nghiên cứu phân lập các chủng vi nấm nội sinh trên các cây dược liệu khác

ở Việt Nam đã được các nhà khoa học quan tâm Nhóm nghiên cứu của PGS.TS Lê Mai Hương tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập được 6 chủng nấm, trong đó một chủng

thuộc loài Mucor circinelloides var Tieghem từ cây Thông đỏ Chất tách chiết từ

dịch lên men của chủng nấm nội sinh có đặc điểm gần giống với 10-DAB từ cây thông đỏ Từ kết quả đó, có thể khẳng định những sản phẩm trao đổi chất có hoạt

tính sinh học không chỉ được tạo ra từ cây chủ mà còn có thể tạo ra bởi vi sinh vật nội sinh [2] Năm 2010, nhóm nghiên cứu này đưa ra biểu đồ về quy luật phân bố

của các chủng nấm nội sinh trên các bộ phận của cây thông đỏ (Taxus wallichiana)

Trong 68 dịch chiết của các chủng nấm nội sinh, có 17 mẫu (25%) có hoạt tính gây độc với cả 3 dòng tế bào ung thư như mẫu chiết của các chủng SHT4, SHT6, SHT9… Bằng phương pháp phân loại hình thái và sinh học phân tử đã định tên

được 4 chủng nấm là Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101 và Gongronella butleri SHT106 Năm 2009, Trần Thị Như Hằng và cộng sự nghiên cứu về vi nấm nội sinh trên cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gagnep.) và bùm bụp (Mallotus paella Lour.) thu được chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất ergosterol, ergosterol peroxide,

sorbicillin cho hoạt tính kháng vi sinh vật, độc tế bào, chống oxy hóa và hoạt tính enzyme ngoại bào [1]

Năm 1998, Latha PG và Panikkar KR đã báo cáo khả năng kháng u và gây độc

khối u của dịch chiết hoa mẫu đơn đỏ Ixora coccinea L khi tiêm màng bụng chuột

mang Dalton's lymphoma và chuột mang khối u biểu mô cổ trướng Ehrlich Từ đó

đã có nhiều nghiên cứu với nỗ lực xác định sự có mặt của CPT trong loài cây này Năm 2011, Saravanan và cộng sự đã công bố thành phần CPT trong mẫu lá non và

lá trưởng thành của Ixora coccinea L là 2,8% [68]

Trong dân gian, rễ, lá và hoa mẫu đơn đỏ được dùng như một loại thuốc, trong

đó rễ dùng để trị sốt, lậu, ăn không ngon, ỉa chảy và kiết lị, thậm chị còn được dùng

để giảm đau và chữa các chỗ loét mãn tính

Nghiên cứu đầu tiên tiến hành phân tích hệ vi nấm nội sinh trên Ixora coccinea

L được thực hiện tại Brazil, xác nhận 530 loài thuộc 6 chi:

Curvularia, Fusarium, Guignardia, Pestalotiopsis, Phoma, và Xylaria [76]

Nhưng dữ liệu về khả năng sản xuất của các loài vi nấm trong cây mẫu đơn đỏ Ixora coccinea L vẫn còn nhiều bỏ ngỏ, cần được các nhà nghiên cứu tiếp tục tìm hiểu

Mẫu cây mẫu đơn đỏ được thu thập tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên Với tính chất đặc biệt của địa hình và khí hậu, thảm thực vật và hệ thực vật rất phong phú, đa dạng, mang nhiều nét đặc thù riêng Khí hậu nơi đây thuộc kiểu á nhiệt đới và ôn đới núi cao có 2 mùa rõ rệt (mùa mưa, mùa khô) Nền nhiệt cao vào mùa hè, thấp vào mùa đông, biên độ dao động ngày đêm của nhiệt độ lớn Khu vực này có độ ẩm lớn, ổn định, trung bình năm đạt từ 80-90%, nhiều mưa phùn và sương mù, chỉ số

ẩm ướt cao nên cây cối phát triển xanh tốt nhưng cũng khiến cho nấm mốc và sâu bệnh phát triển

Hình 1 6 Sương muối phủ trắng Vườn Quốc Gia Hoàng Liên

Ngoài ra nơi đây còn có các hiện tượng thời tiết đặc biệt như sương muối, mưa

đá, giông, băng tuyết Những điều kiện này tạo điều kiện cho sự sinh tổng hợp các hoạt chất thứ cấp trong cây

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu vật được sử dụng để phân lập các chủng vi nấm nội sinh là các bộ phận của

sáu cây mẫu đơn đỏ đã được định danh thuộc loài Ixora coccinea L tại Phòng thí

nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Với đề tài luận văn này, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị và dụng cụ tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

Thiết bị

Hệ thống máy điện di EPS 300 (Thụy Điển), lò vi sóng (Sharp, Nhật Bản), cân

kỹ thuật (Thụy Sỹ), Máy đo quang phổ Nanodrop 2000/2000c (Thermofisher, Mỹ),

Hệ thống buồng chụp UV ECX-F15.M (Pháp), Veriti ™ 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, Mỹ), Máy ly tâm (Eppendorf, Đức), Máy ProFlex ™ PCR system (Thermo Fisher Scientific, Mỹ), Kính hiển vi Olympus, Hệ máy HPLC Agilent 1100, cột phân tích ODS (5 µm; Inertsil), ); Bể ổn nhiệt (Lauda, Đức)

Dụng cụ

Chai thủy tinh Simax (Cộng hòa Czech); Bộ Pipetteman 10µL, 200 µL, 1000 µL (Eppendorf, Đức ), Đầu côn 0,2ml (Mỹ), Đầu côn 0,01ml (Mỹ); Găng tay cao su không bột (Việt Nam); Khẩu trang y tế (Việt Nam); màng lọc 0,2µm (Merch, Đức); que chang, đĩa petri thủy tinh 70mm, lamen, lam kính; tủ cấy vi sinh, panh và kẹp inox, và một số thiết bị dụng cụ khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu thực vật

Mẫu cây mẫu đơn đỏ được thu thập tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, Lào Cai,Việt Nam Các bộ phận thu hái bao gồm rễ, thân, lá, hoa để không bỏ sót bất kỳ một loài nấm nội sinh nào có trong cây

Mẫu thực vật dùng để phân lập nấm nội sinh cần đảm bảo 2 tiêu chí: không bị khô héo và sạch nấm biểu sinh (các loài nấm bám vào mặt ngoài mẫu vật) Vì vậy mẫu thực vật khi thu hái cần được bảo quản trong túi kín (để không nhiễm các tác nhân lây nhiễm như vi khuẩn hay virus) trong quá trình đi thu mẫu và quá trình vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm Quá trình vận chuyển được thực hiện trong điều kiện lạnh để khi về đến nơi phân lập mẫu vần giữ được trạng thái tươi Các mẫu có kích thước lớn như thân có thể được chia thành các mẫu nhỏ hơn để dễ dàng bảo quản

và vận chuyển

Hình 2 1 Cành mẫu đơn đỏ Ixora coccinea L thu thập tại VQG Hoàng Liên

2.2.2 Phương pháp khử trùng bề mặt mẫu vật

Quy trình khử trùng bề mặt được tham khảo theo quy trình của Larran khi

nghiên cứu nấm nội sinh trong cây lúa mì (Triticum aestivum L.) [38], nghiên cứu của Ding thực hiện trên cây C.acuminata [20], nghiên cứu của Sharon Pelo thực hiện trên cây Solanum mauritianum [54] và nghiên cứu của Mohinudeen thực hiện trên cây Nothapodytes nimmoniana [49] Tuy nhiên để phù hợp từng bộ phận thu

hái, nhóm nghiên cứu đã thực hiện một số thay đổi

Bước 1: Rửa mẫu vật dưới vòi nước chảy trong vòng 20 phút Thao tác rửa cần

nhẹ nhàng cẩn thận bởi các bộ phận mềm như hoa và lá có thể bị dập, nát

Bước 2 Ngâm các mẫu vật trong dung dịch Ethanol 70◦ trong 1 phút

Bước 3 Ngâm các mẫu vật trong dung dịch Sodium hypochlorite trong vòng 5

phút Đối với mẫu vật có trạng thái mềm và dễ dập như hoa và lá, nồng độ dung dịch Sodium hypochlorite được sử dụng là 1%, còn các mẫu thực vật cứng như thân

và rễ, sử dụng dung dịch Sodium hypochlorite 5%

Bước 4 Rửa các mẫu thực vật trong nước cất vô trùng 6 lần Phần dung dịch rửa

cuối cùng đem cấy trải trên đĩa thạch PDA, ủ tối ở 28℃ trong 7 ngày để đảm bảo mẫu vật đã sạch khuẩn và sạch nấm biểu sinh

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi nấm nội sinh

Bước 1 Chuẩn bị đĩa môi trường thạch PDA

Bước 2 Cắt mẫu thực vật đã khử trùng bề mặt thành các mảnh có độ dài

0.5cmx0.5cm và đặt vào các đĩa môi trường PDA đã chuẩn bị

Bước 3: Ủ tối ở 28℃ trong vòng 5- 7 ngày Khi đó các vi nấm nội sinh trong

mẫu cây sẽ phát triển hệ sợi lan ra môi trường thạch và có thể nhìn bằng mắt thường

Bước 4: Phân lập sử dụng theo phương pháp pha loãng [3] với môi trường PDA

có bổ sung kháng sinh penicillin (0,05%) và streptomycin (0,1%) Sau đó làm thuần bằng cách tiếp tục cấy truyền các tản nấm trên bề mặt môi trường PDA có bổ sung penicillin, streptomycin từ 2 - 3 lần Các chủng nấm mốc sau khi đã làm thuần được cấy trên môi trường giữ giống PDA theo phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng [3]

2.2.4 Phương pháp định danh các chủng vi nấm nội sinh bằng giải trình tự gen ITS1-5,8S rRNA-ITS2

Nấm là nhóm sinh vật dị dưỡng có vai trò quan trọng trong mọi hệ sinh thái, chúng liên quan mật thiết đến các quá trình quan trọng như phân giải, tái chế và vận chuyển các chất dinh dưỡng trong các môi trường khác nhau Để định danh các chủng vi nấm thu được, ta có thể sử dụng các phương pháp truyền thống như dựa vào đặc điểm giải phẫu, hình thái học tuy nhiên phương pháp này tồn tại một số

như cấu trúc sinh bào tử [31] tuy nhiên trong một số nấm bậc cao, một số đặc điểm cấu tạo gây tranh cãi ngay cả đối với các nhà nấm học được đào tạo chuyên sâu vì chúng không phải lúc nào cũng cung cấp thông tin chính xác trong khuôn khổ tiến hoá, chủ yếu ở cấp độ loài Một số chủng nấm nội sinh thường được sử dụng để phân lập các chất chuyển hoá thứ cấp không phải lúc nào cũng tạo bào tử trong môi trường nuôi cấy do đó không cung cấp đầy đủ các đặc điểm kiểu hình để phân loại dựa trên hình thái [30]

Ngày nay nhờ sự tiến bộ của các kĩ thuật sinh học phân tử, ta có thể định danh các loài nấm dựa trên một số trình tự nucleotide trong hệ gen của sinh vật Phương pháp này gọi là mã vạch DNA (DNA barcode) Như đã đề cập ở trên, phương pháp này sử dụng các trình tự DNA ngắn có sự khác biệt giữa các loài để phân biệt các loài sinh vật với nhau, nguyên lý này giống như máy quét trong siêu thị khi đọc mã vạch của hai sản phẩm mặc dù chúng có thể rất giống nhau

Việc định danh các loài nấm sử dụng dữ liệu phân tử đã được White và cộng sự

đề cập từ năm 1990 [81] Trình tự mã hoá cho tiểu đơn vị nhỏ (nrSSU-18S rRNA)

và toàn bộ vùng đệm phiên mã (ITS1, 5,8S rRNA, ITS2; có kích thước khoảng 0,45-0,8kb) đã mở ra một kỉ nguyên mới cho công cuộc xác định trình tự phát sinh loài phân tử ở giới nấm [11,70] Tốc độ tiến hoá của 3 vùng này khác nhau dẫn đến các mức độ biến đổi di truyền khác nhau: SSU tiến hoá chậm nhất, ITS tiến hoá nhanh nhất Năm 2007, một nhóm các nhà nghiên cứu nấm đã tham dự hội thảo ở Virginia, Hoa Kỳ để thảo luận và chọn lựa trình tự làm mã vạch cho nấm Hội nghị này đã tạo tiền đề cho một tổ chức đa quốc gia quy tụ các nhà nấm học tại Amsterdam vào năm 2011 để đánh giá tiềm năng của 6 trình tự bao gồm SSU, LSU, ITS, RPB1, RPB2, MCM7 và đã thống nhất sử dụng trình tự ITS làm mã vạch cho nấm

Hình 2 2 Cấu trúc vùng SSU-ITS-LSU và trình tự các mồi [59]

Quy trình định danh các chủng nấm nội sinh được thể hiện trong hình dưới đây:

Hình 2 3 Quy trình định danh các chủng vi nấm nội sinh trong cây mẫu đơn đỏ

Phương pháp tách chiết DNA tổng số các chủng vi nấm

Với số lượng mẫu trong đề tài lớn, chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp tách chiết DNA tổng số bằng CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) CTAB là một chất tẩy rửa có thể liên kết và phân huỷ thành polysaccharide của tế bào thực

phần ưa nước có trên thành tế bào và màng nhân Dung dịch CTAB dùng để phá vỡ

tế bào được bổ sung thêm một số thành phần như bảng dưới đây:

Để hỗ trợ quá trình phá vỡ tế bào, mẫu nấm được xử lý với nitơ lỏng sau đó nghiền bằng máy nghiền bi Quy trình tách chiết DNA tổng số cụ thể như sau:

Bước 1: Lấy trực tiếp mẫu nấm trên đĩa nuôi cấy bằng dao và kéo sạch, đã khử

trùng và đưa vào ống 2ml đã bổ sung bi sắt

Bước 2: Nghiền mẫu với dung dịch nito lỏng

Bước 3: Bổ sung 800µl dung dịch CTAB, ủ mẫu ở 65℃ trong 1 giờ

Bước 4: Bổ sung 800µl dung dịch Cloroform: Ispamylalcohol (tỉ lệ 24:1), đảo nhẹ

trong vòng 5 phút sau đó ly tâm 12000rpm trong 15 phút

Bước 5: Nhẹ nhàng hút thu dịch nổi chứa DNA bằng pipet và chuyển sang ống

1.5ml

Bước 6: Bổ sung lượng tương đương dung dịch isopropanol đã làm lạnh Đặt ống

vào tủ -20℃ trong 30 phút để tủa DNA

Bước 7: Ly tâm ở điều kiện 12000rpm, 15 phút, 4℃

Bước 8: Loại bỏ dịch nổi, thu ống cặn

Bước 9: Bổ sung 500µl ethanol 80%

Bước 10: Ly tâm 12000 rpm trong 4 phút Lặp lại hai bước 9 và 10 hai lần để đảm

bảo loại bỏ hoàn toàn được các chất không mong muốn Sau đó loại bỏ hoàn toàn dung dịch nổi và làm khô ống ở nhiệt độ phòng cho đến khi tủa DNA khô hoàn toàn

Bước 11: Thêm 30µl nước khử ion + 1µl RNase (10 mg/ml) (tỷ lệ H2O: RNase

=100:3) vào mỗi ống Ủ ở 37˚C trong 30 phút đến 1 giờ

Sau khi tách DNA tổng số, tiến hành kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose và phương pháp đo nanodrop

Phương pháp điện di trên gel agarose

Điện di trên gel agarose là phương pháp phân tách các đoạn ADN dựa vào khối lượng phân tử của chúng Các phân tử DNA tích điện âm trên toàn bộ phân tử do mang nhóm phosphate trong cấu trúc của mỗi nucleotide Trong điện trường, chúng

sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương

Quy trình điện di DNA tổng số trên gel agarose như sau: chuẩn bị dung dịch đệm TAE 1X, chuẩn bị bản gel agarose 0,8%, tra mẫu Mẫu được mix với Loading Dye theo tỉ lệ: 1 uL Loading Dye: 5uL Mẫu Tra mẫu lần lượt vào các giếng Điện

di ở 120V trong 30 phút Sau khi quá trình điện di kết thúc, bản gel được soi dưới đèn UV để kiểm tra các băng

Phương pháp đo huỳnh quang bằng máy nanodrop

Phương pháp kiểm tra sản phẩm DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose mặc

dù có tính chất định lượng nhưng chỉ mang tính tương đối Sau khi đã xác định quá trình tách chiết thành công thông qua các băng đúng kích thước, mẫu DNA tổng số được đem nồng độ bằng máy nanodrop

Các axit nucleic hấp thụ ánh sáng cực tím (UV) trong dải từ 210nm đến 300nm với độ hấp thụ cực đại 260nm, vì vậy nồng độ DNA tỉ lệ thuận với lượng ánh sáng được hấp thụ Máy đo quang phổ sẽ đo cường độ ánh sáng trước và sau khi đi qua mẫu DNA từ đó tính được hàm lượng DNA có trong dung dịch

Phương pháp đo huỳnh quang bằng máy nanodrop dựa trên định luật Lambert về mối quan hệ giữa lượng ánh sáng được hấp thụ với nồng độ của phân tử hấp thụ

CÔNG THỨC: A= ε.b.c

Trong đó A là hệ số hấp thụ với 1 bước sóng cụ thể; ε là hệ số hấp thụ trung bình, trong trường hợp của DNA sợi kép ε có giá trị là 0.020 (μg/mL)−1 cm−1; b là chiều dài đường đi của quang phổ và c là nồng độ mẫu

Sau khi thu được mẫu DNA sạch (giá trị OD260/280 nằm trong khoảng 1,8-2,0 ), tiến hành khuếch đại trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 có kích thước khoảng 600bp,

sử dụng cặp mồi ITS4-ITS5 theo hướng dẫn của White và cộng sự81] bằng phản ứng chuỗi Polymerase (PCR)

Phản ứng chuỗi khuếch đại polymerase (PCR)

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, gồm 3 giai đoạn chính: biến tính, ủ bắt cặp và kéo dài Trong khuếch đại DNA, chu kỳ này sẽ được lặp lại nhiều lần để đảm bảo thu đủ lượng DNA cần thiết

Chu trình nhiệt của phản ứng: 95℃- 5 phút; 95℃-30 giây; 56℃- 30 giây; 72℃-

60 giây; 72℃- 5 phút; 4℃- ∞ Phản ứng chạy 30 chu kỳ

Sau khi quá trình PCR hoàn tất, sản phẩm PCR được đem điện di trên gel agarose 1%, 120V, 25 phút

Thành phần của phản ứng PCR được chuẩn bị theo bảng dưới đây:

Kích thước (bp)

600

Phương pháp tinh sạch DNA

Các sản phẩm PCR được tinh sạch bằng QIAquick PCR Purification Kit trước

khi đem đi giải trình tự

Nguyên tắc hoạt động của bộ kit tinh sạch: QIAquick Kit chứa cụm màng silica

để liên kết DNA trong dung dịch đệm nhiều muối và rửa giải với dung dịch đệm ít muối hoặc nước Quy trình tinh chế loại bỏ mồi, nucleotide, enzyme, dầu khoáng, muối, agarose, ethidium bromide, và các tạp chất khác khỏi mẫu DNA Bộ đệm liên kết chuyên biệt được tối ưu hóa cho các ứng dụng cụ thể và thúc đẩy sự hấp phụ có chọn lọc của các phân tử DNA trong các phạm vi kích thước cụ thể

Quá trình tinh sạch bao gồm các bước sau: Ly giải, gắn DNA vào cột, rửa DNA, loại ethanol bằng cồn khô, rửa giải DNA gắn trên cột

Phương pháp giải trình tự Sanger Sequencing

Phương pháp giải trình tự Sanger Sequencing dựa trên kỹ thuật phổ biến là

“chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi

Các trình tự thu được được so sánh dữ liệu trên NCBI và sử dụng để xây dựng cây chủng loại phát sinh bằng phần mềm MEGA X

Để kiểm tra các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sản xuất CPT, chúng tôi thực hiện nuôi cấy các chủng vi nấm riêng biệt trong môi trường lỏng sau đó chiết tách

để thu được cao chiết từ dịch nuôi cấy đồng thời thu cao chiết từ sinh khối tế bào Đây là một điểm mới bởi trong một số nghiên cứu đã công bố, các nhóm nghiên cứu chỉ thu cao chiết từ dịch nuôi hoặc cao chiết từ sinh khối Việc thu đồng thời cả hai loại cao chiết đảm bảo nghiên cứu không bỏ sót thành phần nào có chứa CPT

2.2.5 Tách chiết CPT từ dịch nuôi lỏng và sinh khối hệ sợi các chủng vi nấm nội sinh