Phân lập nấm nội sinh Ở rong biển và Đánh giá hoạt tính Ức chế tyrosinase, chống oxi hóa của các nấm

Phân lập nấm nội sinh Ở rong biển và Đánh giá hoạt tính Ức chế tyrosinase, chống oxi hóa của các nấm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Trần Thị Hồng Thắm

PHÂN LẬP NẤM NỘI SINH Ở RONG BIỂN VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TYROSINASE,

CHỐNG OXI HÓA CỦA CÁC NẤM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHỐNG OXI HÓA CỦA CÁC NẤM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS Lê Hữu Cường PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2022

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Hữu Cường và PGS TS Nguyễn Quang Huy, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo em trong quá trình hoàn thành đề tài luận văn

Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong Bộ môn Hoá sinh và Sinh học phân tử, Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã giảng dạy, tạo điều kiện giúp đỡ và truyền đạt kiến thức cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Khoa và Trường

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên,Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã ủng hộ và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng em muốn gửi lời cảm ơn bố mẹ và gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh ủng hộ và động viên em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2022

Học viên

Trần Thị Hồng Thắm

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Melanin và con đường tổng hợp sắc tố trong da 3

1.1.2 Sắc tố melanin, vai trò và sự tổng hợp trong tế bào 4

1.1.2.1 Sắc tố melanin và vai trò trong cơ thể 4

1.1.2.2 Sự tổng hợp melanin trong cơ thể 4

1.1.2.3 Sự tăng sắc tố melanin và ảnh hưởng lên làn da 6

1.2.3 Nguồn gốc chất ức chế TYR từ thiên nhiên 11

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.2 Phương pháp lên men và thu cao chiết vi sinh vật 21 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 21

2.2.3.1 Phương pháp ức chế enzyme TYR 23

2.2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa trên hệ DPPH 24

2.2.5 Phương pháp chạy sắc ký bản mỏng (TLC) 24

2.2.7 Phương pháp PCR và giải trình tự vùng ITS của rDNA dùng cho định

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2 Nhân nuôi sinh khối các nấm và chiết chất trao đổi thứ cấp 30

3.3.1 Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase 31

3.4 Vị trí phân loại của các chủng vi sinh vật 37

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm phân lập 28

Bảng 3.2 Khối lượng khô của cao chiết từ các chủng nấm phân lập 31

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của cao chiết nấm ức chế hoạt tính enzyme TYR lên cơ chất

Bảng 3.4 Hoạt tính chống oxi hóa (bao vây gốc DPPH) của cao chiết nấm 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo da người 3

Hình 1.2 Tổng hợp sắc tố xảy ra trong bào quan melanosome, dẫn đến sản xuất eumelanin (nâu và đen) và/hoặc pheomelanin (vàng và đỏ) 5

Hình 1.3 Một số triệu chứng ở da do tích tụ quá nhiều melanin 6

Hình 1.4 Cấu trúc tinh thể tyrosinase tách từ cây Junglan regia 7

Hình 1.5 Sự phân bố rộng rãi của tyrosinase 9

Hình 1.6 Cấu trúc các chất ức chế TYR đã biết và được sử dụng trong mỹ phẩm 10 Hình 1.7 Ảnh minh họa sự đa dạng vi sinh vật trên bề mặt rong biển 16

Hình 1.8 Vi khuẩn, nấm trên rong biển và khả năng sản xuất chất trao đổi thứ cấp 17

Hình 2.1 Ảnh 9 loài rong thu thập được 20

Hình 2.2 Một số máy móc thiết bị tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 21

Hình 3.1 Hình ảnh một số khuẩn lạc chủng nấm phân lập ở loài rong 27

Hình 3.2 Ảnh khuẩn lạc các chủng nấm phân lập 29

Hình 3.3 Ảnh lên men các chủng nấm trong chai 500ml (a) Chiết dịch trao đổi thứ cấp (b) 30

Hình 3.4 Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme TYR lên tyrosine 32

Hình 3.5 Tỷ lệ ảnh hưởng của cao chiết nấm lên hoạt tính enzyme TYR 33

Hình 3.6 Hoạt tính chống oxi hóa lên DPPH 35

Hình 3.7 Sắc ký TLC mẫu cao chiết nấm (a); vị trí của vincristinen (b) 36

Hình 3.8 Điện di sản phẩm PCR nhân gen ITS, sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4 37

Hình 3.9 Cây phát sinh loài của nấm HT15 và HT12 dựa trên trình tự gen ITS và phương pháp Neighbor Joining tree, bootstrap 1000, phần mềm MEGA7 39

Hình 3.10 Đặc điểm hình thái Aspergillus chevalieri 40

Hình 3.11 Đặc điểm hình thái Penicillium levitum 42

ITS Internal transcribed spacer Vùng đệm phiên mã trong PCR Polymerase chain reaction Phản ứng kéo dài chuỗi PDA Potato dextrose agar Thạch đường và khoai tây PDB Potato dextrose broth Môi trường lỏng đường và

khoai tây ROS Reactive oxygen species Gốc oxi tự do

Do melanin là sắc tố tạo nên màu da, tóc, màu mắt ở người và được tạo ra trong các

tế bào biểu bì tạo hắc tố (melanocyte) Tuy nhiên, việc tổng hợp và tích tụ nhiều melanin sẽ gây các rối loạn da như da đổi màu (tại nách, bẹn, cổ), sạm da mặt, thâm mắt, tàn nhang, suy giảm thần kinh liên quan tới Parkinson’s và nguy cơ ung thư da

Sự tăng hàm lượng melanin chủ yếu do hoạt động của enzyme tyrosinase trong tế bào

Hiện nay, các hoạt chất ức chế enzyme tyrosinase được sử dụng trong mỹ phẩm làm kem bôi, thuốc uống như kojic acid, hydroquinon, arbutin… Các chất nàythường được tổng hợp nhân tạo nên nếu sử dụng lâu dài có thể gây ra tác dụng phụ Vì vậy, việc tìm kiếm các hoạt chất từ thiên nhiên làm đẹp da, nâng cao sức khỏe làn da, an toàn và hiệu quả vẫn đang tiếp tục và ngày càng trở nên cần thiết hơn

Rong biển là nơi cư trú của nhiều loài sinh vật như vi khuẩn, nấm, vi tảo, ấu trùng giáp xác Rong biển sống trong điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, tia cực tím

và bề mặt rong là nơi có tính cạnh tranh cao giữa các vi sinh vật Các hoạt chất từ rong biển có hoạt tính tốt như polyphenol, fucoidan, phlorotanin, carotenoid… Trong lĩnh vực mỹ phẩm, các hoạt tính như chống oxi hóa, ức chế tyrosinase, ức chế MMP (matrix metalloprotease), giảm yếu tố ROS gây bởi tia tử ngoại cũng như làm chậm quá trình lão hóa da đã được ghi nhận Rong biển là một trong những đối tượng thường được sử dụng để phân lập vi sinh vật sống trên rong nhằm tìm các loài vi sinh mới, các hoạt chất mới và hoạt tính sinh học quý phục vụ cho nhiều lĩnh vực khác nhau như dược phẩm, thực phẩm, nông nghiệp

Xuất phát từ ý nghĩa khoa học và thực tiễn chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập nấm nội sinh ở rong biển và đánh giá hoạt tính ức chế tyrosinase, chống oxi hóa của các nấm’’ với mục đích nghiên cứu như sau:

MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI

Tìm kiếm các chủng nấm nội sinh sống ở rong có các hoạt tính có thể ứng dụng trong ngành mỹ phẩm đó là ức chế tạo melanin và chống oxi hóa

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Ý nghĩa khoa học: Phát hiện và đánh giá được hoạt tính ức chế enzyme

tyrosinase và chống oxi hóa của nấm nội sinh trên rong biển sẽ đặt nền móng cho

việc tách chiết, tinh chế các chất có hoạt tính

Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu thu được làm cơ sở khoa học để ứng dụng trong ngành mỹ phẩm, tạo chế phẩm làm trắng da an toàn, hiệu quả

Mục tiêu của luận văn gồm:

- Phân lập các chủng nấm nội sinh từ rong biển

- Tạo cao chiết các hợp chất thứ cấp từ các chủng nấm nội sinh

- Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase và khả năng chống oxi hóa

từ cao chiết từ các chủng nấm nội sinh

- Xây dựng cây phát sinh loài của chủng nấm nội sinh từ rong biển có hoạt tính cao dựa trên trình tự gene ITS và các đặc điểm về hình thái

Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Melanin và con đường tổng hợp sắc tố trong da

lạ không mong muốn vào da Điều kiện của biểu bì sẽ quyết định sự tươi và trẻ của lớp da Lớp giữa của da là chân bì, trong đó collagen và elastin là thành phần chính chiếm 90% của chân bì và liên kết chéo nhau để làm vững chắc da Vì vậy, lớp chân

bì có nhiệm vụ củng cố về cấu trúc và độ dẻo dai của da Ngoài collagen và elastin, chất hyaluronic acid cũng là thành phần của lớp chân bì, và đóng vai trò giữ độ ẩm Lớp dưới cùng của da là các mô liên kết và mỡ Sự mất đi của lớp dưới da này do tuổi tác và dẫn đến sự võng và nếp nhăn của da

1.1.2 Sắc tố melanin, vai trò và sự tổng hợp trong tế bào

1.1.2.1 Sắc tố melanin và vai trò trong cơ thể

Melanin là sắc tố phổ biến ở vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật Màu da và lông của động vật được quyết định bởi hàm lượng và sự phân bố của melanin trong

cơ thể Ở động vật, melanin được tạo ra trong các tế bào biểu bì hắc tố (melanocyte) Sắc tố melanin là yếu tố quan trọng bảo vệ cơ thể khỏi tia UV từ mặt trời, chống oxi hóa và chống ung thư da Đối với người có da sáng màu, khả năng bị ung thư da cao gấp 30-40 lần so với người da tối màu

Sự mất đi melanin bất thường dẫn đến mất thẩm mỹ và vấn đề da liễu ở người Ngược lại, tổng hợp và tích tụ nhiều melanin gây rối loạn da như hiện tượng

da đổi màu (tại nách, bẹnvà cổ), sạm da mặt, thâm mắt, tàn nhang, suy giảm thần kinh liên quan tới Parkinson’s và nguy cơ ung thư da [14]

1.1.2.2 Sự tổng hợp melanin trong cơ thể

Tổng hợp melanin là con đường phức tạp có liên quan đến các phản ứng enzyme và phản ứng hóa học Tế bào biểu bì tạo hắc tố tổng hợp 2 loại melanin: eumelanin (nâu và đen) và pheomelanin (đỏ và vàng)

Quá trình tổng hợp melanin được khởi đầu bằng việc oxi hóa L-tyrosine thành dopaquinone (DQ) bởi enzyme tyrosinase (TYR) và DQ sau đó được tự động chuyển hóa thành chất trung gian có màu cam là Dopa-chrome (Hình 1.2)

Dopa-chrome phân giải thành dihydroxyindole (DHI) và 2carboxylicacid (DHICA), bởi TRP-2 (tautomerase, DCT).Cuối cùng, các DHI và DHICA được oxi hóa tạo thành eumelanin TRP-1 được cho là oxi hóa DHICA thành eumelanin Song song với quá trình đó, DQ được chuyển hóa thành 5 - S-cysteinyl dopa hoặc glutothionyldopa với sự có mặt của cystein hoặc glutathione

dihydroxyidole-Sự oxi hóa tiếp theo tạo nên chất trung gian benzothiazine và cuối cùng thành pheomelanin Mặc dù cả 3 enzyme TYR, TRP-1 và TRP-2 đều liên quan đến hình thành melanin nhưng TYR là enzym đặc biệt cần thiết cho quá trình này

Hình 1.2 Tổng hợp sắc tố xảy ra trong bào quan melanosome, dẫn đến sản xuất eumelanin (nâu và đen) và/hoặc pheomelanin (vàng và đỏ) [15]

Các tế bào biểu bì melanocyte, ước tính chiếm tỉ lệ nhỏ 1/36 so với tế bào tạo keratin (keratinocyte) Bào quan melanosome trong melanocyte là nơi tổng hợp melanin và được vận chuyển tới tế bào keratinocyte ở lớp biểu bì Trong điều kiện sinh lý bình thường, melanin là có lợi để bảo vệ da khỏi ánh sáng mặt trời (tia UV

có hại)

Quá trình điều khiển tổng hợp melanin ở động vật ở nhiều mức độ khác nhau, từ mức độ gen trong quá trình phát triển phôi, mức độ tế bào thông qua tạo

bào quan melanosome, mức độ dưới tế bào biểu hiện gen TYR, TRP-1, TRP-2 và khi

vận chuyển sắc tố melanin từ tế bào melanocyte đến keratinocyte, nơi tạo màu [29]

Sự giảm sắc tố có thể đạt được thông qua các cơ chế khác, nhưng một đích chính là điều hòa hoạt tính enzyme TYR để hạn chế tốc độ tổng hợp melanin [18]

Ảnh hưởng tia cực tím UV làm hư hại da

Tia cực tím (UV) gồm các tia: UVC có bước sóng từ 100 đến 290 nm chủ yếu được lọc bởi khí quyển; tia UVA có bước sóng từ 320 đến 400 nm và UVB với bước sóng từ 290 đến 320 nm sẽ gây sạm da và vết nhăn… tia UV sẽ dẫn đến cảm ứng các gốc tự do hoạt động (reactive oxygen species, ROS) và làm mất các enzyme chống oxi hóa Hậu quả, các áp lực oxi hóa này dẫn đến rối loạn ở da như

tăng sắc tố (điểm tối ở da), già sớm và khô Sự tích tụ ROS dẫn đến kích thích sự hoạt động enzyme TYR và tổng hợp bất thường melanin Yếu tố ROS đóng vai trò quan trọng để điều hòa tổng hợp melanin và việc bao vây gốc ROS sẽ giúp giảm tổng hợp melanin cảm ứng bởi tia UV [32]

1.1.2.3 Sự tăng sắc tố melanin và ảnh hưởng lên làn da

Việc tổng hợp và tích tụ quá nhiều melanin dẫn đến các rối loạn về màu sắc

da, bao gồm các đốm nâu, nám da, tàn nhang và tăng sắc tố sau viêm, hoặc ung thư

da (Hình 1.3) Enzyme TYR là enzyme quan trọng xúc tác cho hầu hết các phản ứng trong quá trình tổng hợp melanin Do đó việc tìm ra các chất ức chế enzyme TYR là cần thiết để làm giảm tổng hợp nên melanin

Hình 1.3 Một số triệu chứng ở da do tích tụ quá nhiều melanin [52]

Điều này đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tập trung vào xác định, phân lập, tổng hợp cũng như đặc tính hóa các chất ức chế enzyme mới, hoạt tính tốt cho các ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và y học [18] Tuy nhiên, rất ít chất ức chế đạt chất lượng dùng cho thử nghiệm lâm sàng

1.2 Tyrosinase và chất ức chế enzyme

1.2.1 Enzyme tyrosinase

TYR là enzyme có cấu trúc chứa 2 ion Cu++, bao quanh bởi 3 histidine và chịu trách nhiệm hoạt động xúc tác cho các phản ứng sinh hóa (Hình 1.4)

Hình 1.4 Cấu trúc tinh thể tyrosinase tách từ cây Junglan regia [33]

Enzyme TYR đầu tiên được phân tách từ nấm lớn Sau đó, enzyme TYR được tách và tinh sạch từ nhiều nguồn như vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật Phân tử lượng trung bình khoảng từ 13,4 kDa tới 128 kDa tùy nguồn gốc Về cấu trúc, enzyme TYR chứa 3 domain: domain trung tâm, domain đuôi N và domain đuôi C Domain trung tâm chứa 6 axit amin,và phối hợp với 2 ion Cu++ (CuA và CuB) [3]

Về chức năng, enzyme TYR xúc tác phản ứng o-hydroxylation các monophenols thành o-diphenol (hoạt tính monophenolase) và sau đó oxi hóa thành

o-quinone (hoạt tính diphenolase) sử dụng nguyên tử oxi Sau đó, o-quinone được polyme hóa thành các sắc tố nâu-đen thông qua các phản ứng enzyme và không enzyme Hai phản ứng này của enzyme TYR là cơ sở để phát triển và ứng dụng enzyme TYR trong công nghệ sinh học, ví dụ như cảm biến sinh học để kiểm soát hàm lượng phenolic trong chất thải, nước, đất và thức ăn; trong công nghệ dược để chuyển hóa L-tyrosine thành L-DOPA, làm thuốc chữa bệnh Parkinson’s, sản xuất melanin, lignin, flavonoid hoặc tanin [14]

Hiện nay, nguồn enzyme TYR thương mại chủ yếu được cung cấp từ vi sinh

vật như nấm Agaricus bisporus và xạ khuẩn Streptomyces

Vai trò khác của TYR

TYR trong phản ứng làm nâu hoa quả: Là kết quả của phản ứng oxi hóa các chất phenolic thành quinone và sau đó chất này tiếp tục bị oxi hóa và polymer hóa

tự động dẫn đến tạo chất phân tử lượng cao, melanin Sự nâu hóa hoa quả, rau là không mong muốn

TYR để đáp ứng lại với stress và chống lại bệnh truyền nhiễm: Vì đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn, virus nên melanin và các chất trung gian là thành phần chữa vết thương và đáp ứng miễn dịch của một số ngành không xương, chân khớp, thực vật và nấm Ở thực vật, melanin để bảo vệ thực vật khỏi côn trùng và vật gây bệnh Ở côn trùng, TYR có tác dụng làm cứng bộ khung sau khi lột xác, thay lông hoặc bị thương

TYR trong xử lý môi trường: Sự có mặt của phenol và chất màu trong môi trường có thể gây nên các vấn đề môi trường và sức khỏe nghiêm trọng Vì vậy, sử dụng các enzyme có hoạt tính oxi hóa từ nấm được cho là giải pháp sinh học thân thiện để xử lý hợp chất phenol như chlorophenol, fluorophenol và catechol [19] TYR còn làm chất cảm biến để đo hàm lượng phenol, chlorophenol và fluorophenol trong nước thải công nghiệp, sản phẩm thực phẩm và mỹ phẩm

TYR trong phản ứng sinh tổng hợp: Dùng sản xuất sinh học các polymer như lignin, flavonoids, melanin và tannin, L-DOPA, là thuốc hiệu quả trong điều trị Parkinson’s và các tổn thương thần kinh [14]

Phân bố của TYR trong tự nhiên

TYR phổ biến ở các loài, từ vi khuẩn đến động vật, đóng vai trò quan trọng như tạo màu da, lông ở động vật, phản ứng miễn dịch và lành vết thương ở thực vật cũng như nấm, tạo nâu ở hoa quả và rau, hệ thống bảo vệ ở động vật chân khớp, biệt

hóa cơ quan và tạo bào tử ở nấm… Vi khuẩn Pseudomonas, Bacillus, Myrothecium, Miriococcum, Streptomyces cũng tổng hợp TYR Các nấm như Neurosporacrassa, A.bisporus, Lentinulaedodes, Ascovaginospora, Trametes, A oryzae, A.niger sản

xuất TYR và đã được nghiên cứu [17], [23]

Hình 1.5 Sự phân bố rộng rãi của tyrosinase [1]

1.2.2 Các chất ức chế enzym TYR

Phần lớn các mỹ phẩm hoặc tác nhân trắng da sử dụng hoạt chất ức chế enzymeTYR (Hình 1.6) Nhiều chất ức chế enzyme TYR hiện nay đang sử dụng như hydroquinon (HQ), arbutin, kojic acid, azelaic acid, L-ascobic acid, ellgalic acid, tranexamic acid đã và đang được sử dụng để làm trắng da nhưng lại có những hạn chế nhất định như các phản ứng phụ [40], [50]

Hình 1.6 Cấu trúc các chất ức chế TYR đã biết, được sử dụng trong mỹ phẩm

[33]

Chất HQ là chất từ VSV, mặc dù có công dụng ức chế enzyme TYR nhưng tiềm ẩn rủi ro đột biến lên tế bào và liên quan đến các phản ứng như viêm da, dị ứng, ban đỏ, cháy da, bạch bì, đốm nâu móng, nhược sắc, rối loạn sắc tố…

Arbutin là sản phẩm thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật,có hoạt tính chống oxy hóa, tuy nhiên cấu trúc không bền vững dẫn đến giải phóng hydroquinone và bị chuyển hóa thành benzen gây độc đến tủy xương

Kojic acid từ VSV làm giảm sự tăng sắc tố bằng cách ức chế sản xuất tyrosinase, nhưng đã bị hạn chế sử dụng do nguy cơ gây ung thư, khả năng kích ứng của nó cũng khá cao và không bền vững khi bảo quản

L-ascobic từ thực vật là một trong những thành phần chống oxy hóa mạnh

mẽ nhất nhờ khả năng ngăn chặn sự xâm nhập của các gốc tự do từ đó ngăn ngừa lão hóa da hiệu quả, tuy nhiên nó rất nhạy cảm nhiệt độ và dễ phân hủy

Ellagic acid là polyphenol tự nhiên được chiết xuất từ thực vật thông qua quá trình thủy phân tannin, hoạt động như một chất chống oxy hóa, nhược điểm là chất không tan và tính sinh khả dụng kém [2], [11], [33]

Chính vì vậy, việc phát triển các chất ức chế mới là rất cần thiết với các hoạt tính giống như thuốc

Sự ức chế TYR có thể trong số các trường hợp:

- Tác nhân có tính khử dopaquinone, ví dụ như trường hợp ascorbic acid

- Chất bao vây o-dopaquinone, phản ứng với dopaquinone tạo chất không màu

- Cơ chất thay thế có ái lực với enzyme và tạo nên sản phẩm khác như các hợp chất phenolic

- Chất bất hoạt không đặc hiệu như acid hay kiềm gây bất hoạt enzyme

- Chất hoạt hóa đặc hiệu hoặc cơ chất kiểu ức chế cạnh tranh

- Chất ức chế bám vào enzyme và ức chế hoạt động enzyme [50]

1.2.3 Nguồn gốc chất ức chế TYR từ thiên nhiên

Chất ức chế tyrosinase từ thực vật, vi khuẩn và nấm ngày càng được quan tâm mạnh mẽ Nhiều nhà nghiên cứu đã ưu tiên tìm kiếm, xác định chất ức chế từ thiên nhiên bởi chúng ít độc, và tương thích sinh học tốt, đặc biệt cho thực phẩm,

mỹ phẩm và y học [45]

Từ thực vật

Hoạt tính ức chế TYR đã được nghiên cứu từ dịch chiết các loài thực vật như

Asphodelus microcarpus (lan nhật quang), Morus nigra (dâu tằm đen), limonium tetragonum(thiên sâm), Greyia radlkoferi, Momordica charantia (khổ qua, mướp đắng), sả chanh (Cymbopogon citrates), Vitis vinifera (nho), Inula britannica… Ngoài ra, nhiều thực vật khác cũng thể hiện hoạt ức chế TYR như Ardisia elliptica

(anh thảo), Phyllanthus acidus (tầm ruộc), Arbutus andrachne (dương mai), Withania somnifera (nhân sâm Ấn Độ), Centarium umbellatum, Bauhinia vahlii

(chi móng bò)… với hoạt tính IC50 từ 0,271-1mg/ml [50]

Cây mít (Artocarpus heterophyllus, jackfruit) là cây ăn quả phổ biến ở Việt

Nam Gỗ mít có hoạt tính dược học trong đó bao gồm cả hoạt tính ức chế TYR Nguyen và cộng sự (2016) công bố flavonoid (từ cao chiết MeOH) của mít có hoạt tính ức chế TYR tốt, và đã tách được 7 chất bao gồm: artocaepin E, F, norartocarpetin, artocarpanone, liquiritigenin, steppogenin và dihydromorin với IC50

thấp từ 2,0 M (chất artocarpanone), so với kojic acid là 44,6 M [31] Khoảng 900 dịch chiết thực vật được Chaita và cộng sự năm 2017 đã nghiên cứu tìm ra hoạt tính

ức chế TYR, trong số đó loại tốt nhất là từ gỗ cây dâu tằm trắng (Morus alba) ức

chế enzyme TYR nội bào và melanin ở tế bào B16F10 Từ cây này, có 2 chất có hoạt tính tốt, với IC50 là 0,8 và 0,3 M, so với kojic acid là 16,1 M [6] Hoạt chất tannin cô đặc cũng là lớp chất quan trọng nguồn gốc thực vật, có tiềm năng trở thành thuốc bởi vì hoạt tính tốt như chống oxi hóa, chống ung thư, kháng vi sinh

vật, chữa bệnh về tim mạch Tannin cô đặc từ lá, quả và vỏ cây sung xanh (Ficus virens) là hỗn hợp homo, heteropolyme procyanidin và prodel-phinidin với các mức

polymer khác nhau

Cây đậu tương (Glycin max) chứa isoflavone có nhiều hoạt tính có lợi như

chống ung thư, chống oxi hóa, ức chế TYR và đã được nghiên cứu bào chế tạo kem

trắng da [25] Hoa và lá cây sen đa lộc, sen đất (Etlingera elatitor), được sử dụng

làm trắng da và chống lão hóa bởi chứa các hoạt chất tốt cho mỹ phẩm như chống oxi hóa, ức chế collagenase và tyrosinase, nhiều axit amin và các hợp chất phenolic

Mỹ phẩm làm trắng da đã được phát triển từ cây sen này [46]

Chen và cộng sự đã sàng lọc một số lượng các chất từ thực vật và đã tách

chiết được hợp chất từ củ cây thiên ma (Gastrodia elata), đặc biệt chất bis

(4-hydroxybenzyl) sulfide có hoạt tính rất mạnh, với IC50 là 0,5M [9] Chất này làm giảm 20% melanin ở tế bào melanocyte người mà không gây độc tính lên chuột [7]

Chất ức chế TYR từ rong biển

Rong biển từ lâu đã được sử dụng như thực phẩm và dược liệu chữa bệnh ở các nước châu Á như Nhật, Trung Quốc, Hàn Quốc Hiện nay, nhiều loại rong biển

sử dụng để làm trắng da trong mỹ phẩm như rong biển nâu Turbinaria conoideshay

hợp chất tảo biển, …[34], [42] Ở Việt Nam, gần đây tác giả Diễm Hồng và cộng sự

năm 2018 đã nghiên cứu sử dụng dịch chiết rong mơ Sargassum sp để làm mặt nạ

dưỡng da bởi dịch chiết có các hoạt tính ức chế enzyme TYR và hoạt tính chống oxi hóa tốt [16]

Tác giả Namjooyan và cộng sự năm 2019 đã nghiên cứu tác động của dịch

chiết của 3 loài rong đỏ là Digenea simplex, Laurencia papilosa và L paniculata

lên enzyme TYR cũng như sự hình thành melanin Cả 3 loài rong đều có hoạt tính

ức chế enzyme TYR, trong đó, đáng kể là rong D.simplex làm giảm lượng melanin

gần tương đương với chất thử dương là axit kojic (giảm tương ứng 47,27 và 50,21%) [30]

Một số chất thuộc nhóm phlorotannin được phân lập từ rong Ecklonia cava có

hoạt tính tốt hơn cả các chất đối chứng như 7-phloroeckol với IC50 là 0,85M, mạnh hơn kojic acid (IC50 40,28 M) và arbutin (IC50 243,16 M) [48] Chất này còn giảm melanin ở tế bào melanocyte và được cho rằng rất có tiềm năng ứng dụng trong mỹ phẩm [20]

Tác giả Cha và cộng sự (2011) đã sàng lọc 43 loài rong bản địa tại đảo Jeju (Hàn Quốc) để tìm kiếm chất ức chế enzyme TYR Một số dịch chiết từ rong

Endarachne binghamiae, Schizymenia dubyui, Ecklonia cava (EC) và Sargassum silquastrum (SS) có hoạt tính ức chế enzyme TYR tương tự giống với đối chứng

dương kojic acid Hai loài EC và SS có hoạt tính làm giảm sắc tố melanin ở loài cá ngựa Tác giả cho rằng đây là kết quả ức chế enzyme TYR Đặc biệt, các đối chứng dương như arbumin hay phenyl - 2-thiourea làm chết hoàn toàn hoặc quá nửa cá ngựa sau 3 ngày, trong khi rong EC và SS không gây độc lên cá [5]

Chất ức chế TYR từ nấm và vi khuẩn

Nấm đã được chứng minh có hoạt tính ức chế TYR Kojic acid là chất ức chế

được nghiên cứu kỹ được phân lập từ nấm A albus, A niger và Penicillium sp., là

chất có khả năng bẫy kim loại hiệu quả và cũng là chất bao vây gốc tự do [12],[21]

Các nấm A.albus và A.niger sinh tổng hợp kojic acid, có khả năng ức chế 80% đến

84% hoạt tính TYR với giá trị IC50 là 61,9 M Ngoài kojic acid, chi Aspergillus

cũng tổng hợp nhiều hợp chất khác ức chế TYR, như metallothioneins, có hoạt tính bẫy ion kim loại tại trung tâm hoạt động [13] Chất decumbenone A, ức chế tạo

melanin, được tách chiết từ P.decumbens và A.sulphureus; hơn nữa, chi Aspergillus

cũng sản xuất dẫn xuất mới của decaline, là decumbenone C, có hoạt tính gây độc lên melanoma của người, với IC50 là 0,9 M Đối với nấm A.tereus, chất terrein lần đầu được phân lập và ức chế tạo melanin thông qua làm giảm gen MITF Chang và

cộng sự năm 2007 đã báo cáo có 7 chất thuộc nhóm isoflavone chiết từ nấm

A.oryzae khi lên men mầm đậu tươngvới 2 chất có khả năng ức chế hoạt tính

enzyme TYR [8]

Su và cộng sự năm 2017 đã phân lập nấm nội sinh ở các 3 loài cây thuộc chi

Fritillariae và thu được 15 chủng nấm nội sinh, trong đó một số mẫu chiết nấm ức

chế TYR mạnh hơn hoặc tương đương với mẫu đối chứng là ascobic acid [38]

Chi Trichoderma cũng tổng hợp đa dạng nhóm chất có hoạt tính ức chế TYR Chất isocyanide được tổng hợp từ nấm T.harzianum Trichoderma sp H1-7

có nguồn gốc biển có hoạt tính 1000-2500 U/ml Nấm T.viridae nguồn gốc từ bùn

biển, ức chế enzyme theo cơ chế bám vào ion Cu++ ở trung tâm hoạt động Nấm này cũng tổng hợp 7 chất ức chế quá trình tạo melanin, tuy nhiên không phải tất cả đều

ức chế enzyme TYR [43]

Chất melanocin A được sản xuất bởi dịch lên men và khuẩn ti nấm

Eupenicillium shearii, có hoạt tính ức chế enzyme TYR (IC50 là 0,009 M) và tế bào melanoma B16 (MIC là 0,9 M) bởi sự xuất hiện của nhóm isocyanide trong hợp chất [22]

Nấm biển sống trong điều kiện khắc nghiệt về pH, nhiệt độ, độ mặn, dinh dưỡng, oxi và ánh sáng, vì vậy được coi là ứng cử viên hứa hẹn nhằm tìm kiếm hoạt chất mới Một số chất ức chế TYR đã được công bố ở nấm biển Hai dẫn xuất của kojic acid là kojic acid dimethyl ether và kojic acid monomethyl ether, cũng như

chất phomaligol A, đã được xác định ở nấm Alternaria sp từ rong xanh, có hoạt

tính ức chế TYR [26] Tương tự như vậy, 2 chất là 6-n-pentyl--pyrone và

myrothenone A, từ nấm Myrothecium sp MFA58 trên tảo biển, có hoạt tính mạnh

hơn kojic acid (IC50= 7,7 M), với giá trị IC50 là 0,8 và 6,6 M [27] Các chất dẫn xuất của pyrone có hoạt tính ức chế TYR với IC50 = 4,5 M, từ nấm Botrytis sp Hai chất sesquiterpene được phân lập từ nấm biển Pestalotiopsis sp Z233 liên kết trên rong mơ Sargassum horneri [48] Nấm Diaporthe sp phân lập từ rong biển Halopteris scoparia có hoạt tính ức chế TYR với IC50 39,8 g/ml, so với kojic acid

là 18,3 g/ml, và nấm cũng đồng thời có hoạt tính ức chế collagenase (IC50= 98,6

g/ml) [4] Ngoài nấm Diaporthe sp nhóm tác giả cũng đã phân lập được 9 nấm biển nội sinh khác, trong đó nấm Aspergillus chevalieri có hoạt tính ức chế

collagenase và elastase với IC50 tương ứng 51,7 g/mlvà 26,1 g/ml, hơn nữa nấm

A chevalieri cũng có hoạt tính chống oxi hóa tốt nhất trong số 10 nấm phân lập

được [4]

Một vài nghiên cứu về chất trao đổi bậc 2 từ nấm đảm Bacidiomycetes có

hoạt tính ức chế TYR và làm giảm màu của da Hai chất ức chế được phân lập, tinh

sạch và nêu đặc tính từ nấm Agaricus hortensis với sự ức chế cạnh tranh và không

cạnh tranh [39] Tương tự, hai chất ức chế được chiết từ phân đoạn mỡ của nấm

Albatrellus confluens và xác định là chất neogrifollin (IC50=25 M), và grifolin (IC50=760 M) Chất neogrifolin cũng được chiết xuất từ nấm Polyporus confluens,

với ức chế 100% TYR tại 50 ppm [29]

Với vi khuẩn, xạ khuẩn Streptomyces TI-C3 phân lập từ đất, S swartbergensis, S reseolilacinus NBRC có hoạt tính ức chế enzyme này Vi khuẩn gram âm như Thalassotalea và cyanobacterium, hoặc vi khuẩn gram dương

phenolic, steroid và alkaloid, trong khi đó từ vi khuẩn thường là các nhóm

macrolites, polyphenol và alkaloid Chất melanostatin tách từ dịch lên men của S claviver N924-2 ức chế sự tạo thành melanin trong tế bào B16 Đáng chú ý, vi khuẩn Streptomyces sp OH-3984 tổng hợp 3 chất ức chế tế bào melanoma B16 tại

các giá trị tương ứng 7,5 g/ml, 3,8 g/ml và 15 g/ml [7], [18]

Một số vi khuẩn Gram âm như Enterobacter sp B20 đã sản xuất chất mới,

có hoạt tính ức chế TYR mạnh lac yankacin, với giá trị IC50 là 0,0021 M và quá trình ức chế thông qua sự bám nhóm isocyanide vào vùng hoạt động chứa đồng [41] Chất này cũng ức chế tạo melanin từ tế bào B16-2D2 [7] Đáng chú ý một số

lợi khuẩn đường ruột như Lactobacillus sp., và Bifidobacterium sp., trong thực phẩm lên men cũng ức chế hoạt tính TYR và quá trình tạo melanin Lactobacillus helveticus sản xuất tetra peptide, cyclo peptide còn Lactobacillus plantarum M23 từ

sữa ức chế 52,1% TYR và 32% tổng hợp melanin trong tế bào [2]

1.3 Nấm liên kết với rong biển

Rong biển và quần thể vi sinh tạo nên một hệ sinh thái phức tạp và luôn biến động, gồm các loại vi sinh vật đa dạng (Hình 1.7) Một số hình thức sống của vi sinh vật trên rong:

Vi sinh vật sống bám (epiphyte): vi sinh vật cố định và sống trên bề mặt của rong Dạng sống này thường tạo màng sinh học (biofilm) trên rong và đôi khi gây hại cho rong, hạn chế sự sống và tính đàn hồi của mô Màng cũng có thể hạn chế sự trao đổi khí và giảm cường độ ánh sáng, giảm hoạt động quang hợp

Vi sinh vật sống nội sinh (endophyte): vi sinh vật sống bên trong mô của rong và chúng không gây triệu chứng nhiễm bệnh hay tác hại cho rong Chúng có thể sống nội sinh bắt buộc hoặc tùy tiện

Về vai trò, vi sinh vật có thể là sống cộng sinh, hỗ sinh, hoại sinh, gây bệnh hoặc ôn hòa đối với rong Các vi sinh vật bám hoặc nội sinh ở rong biển đa dạng hơn so với các động thực vật đa bào khác

Hình 1.7 Ảnh minh họa sự đa dạng vi sinh vật trên bề mặt rong biển [37]

Tập hợp vi sinh vật trên rong biển có thể gồm các nhóm sinh thái khác nhau như gây bệnh tiềm tàng, nội sinh thật sự hay nội sinh ngẫu nhiên Khả năng sản xuất chất trao đổi thứ cấp của các nấm này là đáng phải để ý đến Chúng có thể tổng hợp các chất mới với nhiều hoạt tính có tầm quan trọng trong y dược (Hình 1.8)

Hình 1.8 Vi khuẩn, nấm trên rong biển và khả năng sản xuất chất trao đổi thứ cấp [36]

Việc sàng lọc các chủng nấm nội sinh ở rong để tìm chất có hoạt tính sinh học đã chứng tỏ đây là nguồn vật liệu quan trọng Hơn 300 chất tự nhiên được phân

lập từ 32 loài nấm nội sinh với 22% số loài nấm nghiên cứu thuộc về Aspergillus

Đặc biệt, 43% (139/327) chất được công bố là hợp chất tự nhiên mới

Các sinh vật nội sinh rong biển sản sinh các chất có hoạt tính, chống oxi hóa

mạnh Nấm Epicoccum từ rong Fucus vesiculosus sản xuất epicoccone chống oxi hóa mới Ngoài ra, nấm Wardomyces anomalus nội sinh ở rong lục, sản xuất chất

xanthone có hoạt tính chống oxi hóa cao Việc sản xuất chất chống oxi hóa được cho là chiến lược của vi sinh vật nội sinh để đối phó với các đáp ứng của rong chủ [37]

Các sinh vật nội sinh rong biển sản sinh các chất có hoạt tính, chống oxi hóa

mạnh Nấm Epicoccum từ rong Fucus vesiculosus sản xuất epicoccone chống oxi hóa mới Ngoài ra, nấm Wardomyces anomalus nội sinh ở rong lục, sản xuất chất

xanthone có hoạt tính chống oxi hóa cao Việc sản xuất chất chống oxi hóa là cách thức của vi sinh vật nội sinh đối phó với các đáp ứng của rong chủ [37]

Các hoạt tính từ nấm biến như bảo vệ da khỏi tia nắng, hấp thụ tia UV hoặc bao vây gốc ROS; ức chế TYR, làm trắng da như cyclopentenone myrothenone A

và B, kojic acid và các dẫn xuất pyrone, eudesmane sesquiterpene, và

homothalin-II; kháng vi khuẩn C acnes và S epidermidis [28]

Chương 2 -VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Rong biển tự nhiên tại vùng biển tỉnh Khánh Hòa

Rong biển: Rong biển được thu thập ở vùng biển thuộc tỉnh Khánh Hòa tại những tọa độ khác nhau, mỗi loài thu 5 cây, bảo quản tại 4oC trong vòng 1-3 ngày trước khi tiến hành phân lập, được lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Tên loài rong được xác định bởi Tiến Sĩ Nguyễn Xuân Vị, công tác tại Viện Hải Dương học, Nha Trang Danh sách các loài rong trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Tên các mẫu rong thu thập được

Và hình ảnh các loài rong thu thập được trong hình 2.1

Hình 2.1 Ảnh 9 loài rong thu thập được

- Nấm nội sinh phân lập được trên rong biển

Enzyme tyrosinase (1000 U/mg, Sigma)

Các dung môi hữu cơ thông dụng ethyl acetate, methanol

Các KIT sử dụng tách chiết và tinh sạch DNA (Mega Quick spin Plus, Intron)

Các hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR gồm master mix 2X (hãng Intron), mồi xuôi ITS1 và mồi ngược ITS4

Các hóa chất sử dụng cho môi trường nuôi cấy vi sinh vật: cao nấm men, pepton, muối khoáng

Thiết bị nghiên cứu: Thiết bị và máy móc dùng trong nghiên cứu từ Phòng

Sinh học thực nghiệm và các phòng thí nghiệm khác của Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam gồm: máy lắc ổn nhiệt, máy nhân gene PCR, máy ly tâm nhỏ, máy đo pH, máy điện di DNA, buồng nuôi cấy vi sinh vật và các máy móc thông dụng khác…

Hình 2.2 Một số máy móc thiết bị tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.Phương pháp phân lập vi sinh vật

Phân lập nấm biển trên cây rong

Môi trường nuôi cấy vi nấm: Chúng tôi sử dụng môi trường PDA dextrose-agar) có thành phần như sau để phân lập vi nấm bám trên rong [44]