Sàng lọc và Định lượng Đồng thời một số chất kích thích tăng trưởng thực vật tổng hợp trong rau, quả bằng sắc ký lỏng khối phổ

Sàng lọc và Định lượng Đồng thời một số chất kích thích tăng trưởng thực vật tổng hợp trong rau, quả bằng sắc ký lỏng khối phổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Vũ Ngọc Tú

SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT TỔNG HỢP TRONG RAU, QUẢ BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2021

ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Vũ Ngọc Tú

SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT TỔNG HỢP TRONG RAU, QUẢ BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8440112.3

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Trần Cao Sơn

PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hường

Hà Nội - 2021

đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia; các anh, chị, em đồng nghiệp khoa Độc học và Dị nguyên, Tồn dư và Ô nhiễm hóa chất

đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể tham gia và hoàn thành chương trình học đúng thời hạn

Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia "Nghiên cứu phương pháp xác định các chất kích thích tăng trưởng thực vật" năm 2019-2020 đã hỗ trợ kinh phí và trang thiết bị cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Các Thầy giáo, Cô giáo khoa Hóa học - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, những người đã truyền đạt kiến thức và dạy dỗ giúp tôi trưởng thành hơn sau 2 năm học tập tại trường

Các bạn, đặc biệt là các bạn trong tập thể lớp K30 cao học hóa phân tích - khoa Hóa học - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của mình

Bố mẹ, gia đình và người thân đã luôn ở bên quan tâm, động viên trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Học viên

Vũ Ngọc Tú

ii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về các chất tăng trưởng thực vật 3

1.1.1 Khái quát về một số chất tăng trưởng thực vật 3

1.1.2 Độc tính của một số chất tăng trưởng thực vật 8

1.1.3 Quy định hiện hành đối với một số chất kích thích tăng trưởng 10

1.2 Phương pháp xác định chất kích thích tăng trưởng thực vật 13

1.2.1 Phương pháp xử lý mẫu 13

1.2.2 Kỹ thuật phân tích 17

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng chất phân tích 19

2.1.2 Đối tượng mẫu phân tích 19

2.2 Phương tiện nghiên cứu 20

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 20

2.2.2 Dung môi, hóa chất 21

2.2.3 Chất chuẩn 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 23

2.3.2 Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ 23

2.3.3 Phương pháp xử lý mẫu 24

2.3.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng 26

2.3.4 Phương pháp phân tích mẫu thực 27

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 27

Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Xây dựng phương pháp 28

3.1.1 Kết quả tối ưu điều kiện thiết bị khối phổ 28

3.1.2 Kết quả tối ưu quy trình xử lý mẫu 37

3.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng 40

3.2.1 Độ đặc hiệu 40

3.2.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 42

3.2.3 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn 44

3.2.4 Độ lặp lại, thu hồi 45

3.3 Kết quả ứng dụng 45

3.3.1 Kết quả sàng lọc 45

3.3.2 Kết quả định lượng 48

KẾT LUẬN 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 62

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo, công dụng của một số Auxin tổng hợp 4

Bảng 1.2: Công thức cấu tạo, công dụng của một số Cytokinin tổng hợp 8

Bảng 1.3: Quy định của Thông tư 50/2016/TT-BYT 10

Bảng 1.4: Quy định của một số quốc gia trên thế giới 12

Bảng 1.5: Một số cột làm sạch được sử dụng phổ biến 15

Bảng 1.6: Một số loại hỗn hợp phân bố 16

Bảng 2.1: Danh sách mẫu được lựa chọn để phân tích 19

Bảng 3.1: Mảnh phổ lý thuyết của các chất kích thích tăng trưởng thực vật 28

Bảng 3.2: Mảnh phổ thực của 6-BAP và CPPU 30

Bảng 3.3: Điều kiện phân tích của các chất kích thích tăng trưởng 31

Bảng 3.4: Điều kiện tìm mảnh mẹ 33

Bảng 3.5: Điều kiện tìm mảnh con 33

Bảng 3.6: Các điều kiện MS/MS 34

Bảng 3.7 Các thông số tối ưu của MS 35

Bảng 3.8: Chương trình gradient của pha động 36

Bảng 3.9: Tỷ lệ ion của các chất tăng trưởng thực vật 41

Bảng 3.10: Phương trình đường chuẩn các chất tăng trưởng thực vật 44

Bảng 3.11: Độ lặp lại và thu hồi trên nền mẫu rau, quả 45

Bảng 3.12: Kết quả phân tích sàng lọc 46

Bảng 3.13: Kết quả phân tích đối chứng 47

Bảng 3.14: Kết quả phân tích định lượng 48

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.1: Kết quả so sánh ba phương pháp chiết của CPPU 37

Hình 3.2: Kết quả so sánh ba phương pháp chiết của 6-BAP 37

Hình 3.3: Kết quả khảo sát dung môi chiết 38

Hình 3.4: Kết quả khảo sát nồng độ acid 38

Hình 3.5: Kết quả khảo sát hỗn hợp phân bố 39

Hình 3.6: Quy trình phân tích mẫu tối ưu 40

Hình 3.7: Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn 42

Hình 3.8: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 3 µg/kg 43

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADI Acceptable Daily Intake

Lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được

AOAC Association of Official Analytical

d-SPE Dispersive solid phase extraction Chiết pha rắn phân tán

ELISA Enzyme-linked Immune-sorbent

Assay

Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch

ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử

GCB Graphite carbon black Than đen hoạt tính

HLB Hydrophylic lipophilic balance Cân bằng thân nước, thân dầu

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

LC-MS/MS Liquid chromatography tandem

mass spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ hai lần

LC-HR/MS Liquid chromatography high

resolution mass spectrometry

Sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

MRL Maximum residue limit Giới hạn tồn dư tối đa

MRM Multi reaction monitoring Kiểm soát đa phản ứng

PSA Primary secondary amines Các amin bậc 1, bậc 2

QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective,

Rugged, Safe

Nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả,

ổn định, an toàn

RSD Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn

Để nâng cao lợi ích kinh tế, người nông dân đã sử dụng nhiều biện pháp để tăng năng suất cây trồng Bên cạnh những kỹ thuật truyền thống như cải tạo đất, luân canh xen vụ thì chất kích thích tăng trưởng đang ngày càng được sử dụng phổ biến bởi ưu thế tăng năng suất nhanh trong thời gian ngắn của nó Tuy nhiên, việc lạm dụng các chất kích thích, đặc biệt là các chất dạng tổng hợp để tăng sản lượng trong trồng trọt

đã dẫn đến sự tồn dư không mong muốn của các chất này trong các rau quả và các sản phẩm được sản xuất từ chúng Nhiều nghiên cứu đã xác định được trong một số loại rau, quả có chứa một số loại chất kích thích tăng trưởng có thể gây ảnh hưởng tới người sử dụng Hiện nay, ba nhóm kích thích tăng trưởng được sử dụng phổ biến là Auxins, Cytokinins và Geliberic acid Trong đó các chất kích thích tổng hợp (6-BAP, Picloram, TDZ, CPPU, 4-CPA, 2-NOA, MCPA, NAA,…) đã được chứng minh có thể gây rối loạn nội tiết và các tác dụng không mong muốn trên người

Hiện nay, các phương pháp định lượng các chất kích thích tăng trưởng thực vật rất đa dạng và phong phú Tuy nhiên, việc trang bị chất chuẩn còn gặp rất nhiều khó khăn bởi một số chất chuẩn không sẵn có và chi phí của hầu hết các chất đều rất cao Chính vì vậy, để khắc phục những khó khăn của phương pháp định lượng, phương pháp sàng lọc không cần chất chuẩn đang là một trong những giải pháp được các nhà khoa học lựa chọn để nghiên cứu Một trong những kỹ thuật sàng lọc có độ chính xác cao là LC-HR/MS Do đó, việc xây dựng một phương pháp sàng lọc và định lượng

đồng thời các chất kích thích tăng trưởng thực vật là vô cùng cấp thiết Đề tài "Sàng

lọc và định lượng đồng thời một số chất kích thích tăng trưởng thực vật tổng hợp trong rau, quả bằng sắc ký lỏng khối phổ" được thực hiện với các mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp sàng lọc một số chất kích thích tăng trưởng dạng tổng hợp trong rau, quả bằng sắc ký lỏng khối phổ

2 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời các chất kích thích tăng trưởng dạng tổng hợp trong trong rau, quả bằng sắc ký lỏng khối phổ

3 Ứng dụng phương pháp để phát hiện và xác định dư lượng các chất kích thích tăng trưởng trong rau, quả được thu mua trên địa bàn Hà Nội

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về các chất tăng trưởng thực vật

1.1.1 Khái quát về một số chất tăng trưởng thực vật

Chất kích thích tăng trưởng là một trong hai nhóm chất điều hòa tăng trưởng thực vật Các chất kích thích tăng trưởng thực vật bao gồm 3 nhóm: Auxins, Cytokinins và Gibberellins Chúng hoạt động làm thay đổi các quá trình sinh trưởng của cây (kích thích rễ, kéo dài thân, ngọn, làm nhanh sự hình thành lá, hoa và quả) Hiện nay, các nhóm chất kích thích tăng trưởng thực vật đang được sử dụng ở dạng tự nhiên và tổng hợp

1.1.1.1 Nhóm Auxin

Auxins là nhóm chất kích thích tăng trưởng được phát hiện đầu tiên Ngay từ những năm 1920, vai trò của Auxins đối với sự phát triển của thực vật đã được nghiên cứu và trình bày bởi nhà sinh học người Hà Lan Frits Warmolt Went Auxins trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là sinh trưởng Về cấu trúc, Auxins là các hợp chất dẫn xuất của tryptophan, có cấu trúc nhân indol

Ngày nay, Auxins được biết đến là chất kích thích tăng trưởng thực vật có ảnh hưởng lớn đến các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào Vì vậy, Auxins được

sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp với các chức năng: kích thích dãn tế bào (kéo dài, phình to); điều chỉnh tính hướng của cây (hướng quang, hướng địa, hướng hoá, hướng thuỷ); điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn (ngăn chặn sự phát triển của chồi bên); điều chỉnh sự hình thành rễ (nồng độ thấp kích thích sinh trưởng rễ, nồng độ cao ức chế sinh trưởng rễ); tạo quả không hạt; kìm hãm hoặc thúc đẩy sự rụng lá, hoa và quả; tăng

tỷ lệ đậu quả và kéo dài thời gian chín của quả

Sự vận chuyển của Auxins trong cây có tính chất phân cực rất nghiêm ngặt theo hướng gốc Chính vì vậy càng xa đỉnh ngọn, hàm lượng auxin càng giảm dần Ngoài đỉnh ngọn, Auxins còn được tổng hợp ở các cơ quan còn non khác như lá non, quả non, phôi hạt đang sinh trưởng, mô phân sinh tầng phát sinh Quá trình tổng hợp Auxins xảy ra thường xuyên và mạnh mẽ ở trong cây dưới xúc tác của các enzyme đặc hiệu

 Auxins tự nhiên

Trong tự nhiên, Auxins được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm và

vi khuẩn Một số Auxins tự nhiên được sử dụng phổ biến bao gồm: Indole-3-acetic acid (IAA), Indole-3-butyric acid (IBA), 4-chloro-indole-3-acetic acid (4-Cl-IAA), Phenyl acetic acid (PAA)…

 Auxins tổng hợp

Auxins được tổng hợp thường không ở dạng tự do, mà liên kết với một acid

amin (acid aspartic ở Pisum, acid glutamic ở cây cà chua), hay glucid (AIA-glucoz,

AIA-thioglucosid, AIA-inositol) Các dạng liên kết này không có hoạt tính Auxins nhưng dễ dàng phóng thích Auxins theo con đường enzym (bởi sự thuỷ phân trong môi trường), là các dạng dự trữ và vận chuyển của Auxins Chúng không bị phá huỷ bởi AIA-oxidase Một số Auxin tổng hợp và vai trò của chúng đối với sự sinh trưởng của thực vật được đưa ra tại Bảng 1.1

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo, công dụng của một số Auxin tổng hợp

Các loại thực vật thường

sử dụng

1 1-Naphthaleneacetic

acid (1-NAA)

- Làm tăng sự hình thành bó sợi cellulose

ở thực vật (sử dụng kết hợp với gibberellic acid)

- Kích thích sự hình thành rễ

- Chống rụng trái sớm

và thưa trái

Táo, oliu, cam, khoai tây,…

STT Chất Công thức

Các loại thực vật thường

sử dụng

2 β-Naphthyloxyacetic

acid (2-NOA)

Kích thích sự phát triển tế bào Các loại cây

3

Methyl

1-naphthaleneacetate

Ức chế nảy mầm, kéo dài thời gian ngủ

Các loại củ (khoai tây, khoai lang,

Cảm ứng tạo mô sẹo

và sự phát sinh của cây một lá mầm

Các cây lá rộng

STT Chất Công thức

Các loại thực vật thường

- Tăng năng suất cây trồng

- Tăng trổ bông (lúa)

- Đồng đều quả (nho)

Các loại cây ăn trái (dưa hấu, cà chua, cà tím,

ớt, bơ, quả

có múi, nho, vải thiều, lúa )

1.1.1.2 Nhóm Cytokinins

Cytokinins là nhóm kích thích tăng trưởng có chức năng kích thích sự phân chia

tế bào của thực vật Hiện nay, Cytokinins gồm hai loại là tự nhiên và nhân tạo [11, 59]

Về cấu trúc hóa học, Cytokinins gồm hai nhóm chất có công thức cấu tạo khác nhau Nhóm purine là những dẫn chất thế của adenine tại vị trí N6 (Kinetin, 6-BA…) Nhóm phenylurea được tìm ra sau này gồm có 1,3-diphenylurea, Forchlofenuron (CPP), Thidiazuron (TDZ)…

Ở mức độ phân tử, Cytokinins ảnh hưởng lên hoạt động của tế bào thông qua việc thúc đẩy sự tổng hợp một số RNA qua đó tác động lên quá trình tổng hợp protein, hoạt hóa enzym Ở mức độ tế bào, Cytokinins kích thích sự lớn lên và phân chia của tế bào, hoạt hóa hoặc ức chế một số giai đoạn quan trọng trong chu kì tế bào làm cho Cytokinins có những tác dụng lên mô cơ quan thực vật như: kích thích phát sinh chồi,

ra hoa, phá bỏ trạng thái ngủ của hạt, kích thích mọc mầm, tăng kích thước quả, ức chế hình thành và phát triển rễ, làm chậm quá trình già hóa của lá và quả,… Vì vậy, sử dụng Cytokinins, đặc biệt là loại tổng hợp để kích thích cây ra lá, hoa, tăng sản lượng

quả thu hoạch, ngâm bảo quản rau quả cho tác dụng rất mạnh Đặc biệt trong việc trồng giá đỗ, với mục đích làm giảm thời gian ngâm hạt và ủ mầm, tăng kích thước tạo

ra cọng giá trắng, mập cọng, giảm thiểu ra rễ

Qúa trình hấp thu Cytokinins diễn ra rất nhanh ở hầu hết các loại mô thực vật, trong đó có hạt đậu xanh dùng làm giá đỗ, tốc độ và mức độ hấp thu cao nhất trong vòng 30 phút đến 1 giờ sau khi được sử dụng Tốc độ chuyển hóa Cytokinins phụ thuộc vào enzym chuyển hóa trong tế bào mô và dạng tồn tại có hoạt tính của Cytokinins Đối với các tế bào mô thuộc họ đậu, enzym chuyển hóa Cytokinins là cytokinine oxidase Chúng chuyển hóa các Cytokinins tự nhiên thành adenine, còn Cytokinins tổng hợp không phải là cơ chất của enzym này nên không chịu tác động trên [4]

 Cytokinins tự nhiên

Các chất Cytokinin tự nhiên có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và là một nhóm phytohormone quan trọng ở trong cây Một số Cytokinin phổ biến bao gồm: Kinetin (KIN), Zeatin (ZEA), 1,3-diphenylurea (DPU), 6-(3-methyl-2-butenyl) aminopurine (2-iP), Adenine (ADE), 3-Benzyladenine (3-BA), Dihydrozeatin Riboside,

Bảng 1.2: Công thức cấu tạo, công dụng của một số Cytokinin tổng hợp S

1.1.2 Độc tính của một số chất tăng trưởng thực vật

Hiện nay, việc sử dụng bừa bãi chất kích thích tăng trưởng đặc biệt là loại tổng hợp sẽ làm cho các sản phẩm nông nghiệp chứa dư lượng chất kích thích, gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người và các loài sinh vật

 Nhóm Auxin

 Độc tố cấp tính

Theo Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ, độc tính của 2,4-D phụ thuộc vào các dạng hóa học của nó, bao gồm muối, este và dạng acid 2,4-D thường có độc tính thấp đối với con người, ngoại trừ một số acid và muối nhất định có thể gây kích ứng

mắt Kể từ năm 2005, liều gây chết trung bình hoặc LD50 được xác định ở chuột nhiễm độc cấp tính nghiên cứu là 639 mg/kg

Trong một báo cáo trước năm 1987, Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Thế giới (IARC) đã phân loại một số Auxin bao gồm 2,4-D, MCPA, 2,4,5-T là các tác nhân gây ung thứ nhóm 2B – “có khả thăng gây ung thư cho người” Trong khi đó, Cơ quan Bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (EPA) không xếp chúng vào nhóm này Cho đến tháng 6 năm 2015, IARC một lần nữa xác nhận 2,4-D là một tác nhân có thể gây ung thư Tuy nhiên, tháng 8 năm 2007, EPA đã đưa ra phán quyết rằng những dữ liệu hiện có không phản ánh bất cứ mối liên hệ nào giữa ung thư ở người và sự phơi nhiễm 2,4-D

Tháng 7 năm 2013, một nghiên cứu trên tạp chí Four Corners chỉ rằng nồng độ dioxin tăng cao trong phiên bản chung của 2,4-D, một trong những loại thuốc diệt cỏ được sử dụng rộng rãi nhất ở Úc Một nhà khoa học đã cho biết sản phẩm được thử nghiệm bởi Four Corners, được nhập khẩu từ Trung Quốc, có "một trong những chỉ số dioxin cao nhất đối với 2,4-D trong 10 đến 20 năm qua và có thể gây ra những rủi ro sức khỏe tiềm ẩn [11]

 Nhóm Cytokinin

Trong nông nghiệp, phơi nhiễm Cytokinins cũng gây độc cũng tương tự như hóa chất bảo vệ thực vật Các báo cáo của Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (US EPA- United States Environmental Protection Agency) công bố về độc tính cấp của Cytokinins thường là gây ngộ độc khi nuốt phải, kích ứng da và mắt ở mức độ vừa, đặc biệt gây kích ứng hô hấp và tăng nguy cơ viêm phổi ở những người hay tiếp xúc với thuốc Ngoài ra, nhiễm độc mãn tính gây ra bởi việc tiếp nhận hàng ngày thực phẩm có tồn dư Cytokinins cũng gia tăng các nguy cơ về sức khỏe

Các nghiên cứu thực hiện trên chuột đã chỉ ra phơi nhiễm lâu ngày (180 ngày) các loại Cytokinins như CPPU, TDZ gây teo tinh hoàn, biến dị ống dẫn mào tinh ở chuột đực, ức chế sự sống trên các tế bào tử cung, buồng trứng, gây rối loạn điều hòa sản xuất các hormon sinh dục nữ như progesteron, estradiol là bằng chứng cho thấy Cytokinins có thể gây ra nguy cơ vô sinh cho cả người và động vật [13]

 Gây quái thai

Thực hiện nghiên cứu và quan sát trên sự phát triển phôi thai của loài cá ngựa vằn trong môi trường nước có nhiễm Cytokinins, các nhà khoa học đã chứng minh ảnh hưởng của Cytokinins lên sự biểu hiện gen trong quá trình phát triển của phôi thai, đặc biệt kích hoạt chu trình tự chết của tế bào, gây ra những bất thường về hình thái học như cong vẹo cột sống, dị tật tim là những dị tật bẩm sinh nghiêm trọng trên các cá thể

sơ sinh Qua đó cho thấy nguy cơ cao Cytokinins cũng gây các dị tật tương tự đối với con người [20, 55]

 Giảm chức năng của hệ tạo máu

Thực hiện nghiên cứu in vitro trên sự hình thành tế bào bạch cầu người, Saito

và cộng sự [48] đã tìm thấy sự ức chế tổng hợp DNA của Cytokinins lên tế bào lympho non sau khi tế bào này được kích hoạt bởi một tác nhân kích thích hóa học, dẫn đến ức chế hình thành tế bào

Gong và cộng sự [20] đã phát hiện sự suy giảm hồng cầu, làm mất hồng cầu do Cytokinins gây ra khi nghiên cứu trên cá ngựa vằn phơi nhiễm Cytokinins cũng phát hiện sự suy giảm hồng cầu, làm mất hồng cầu do Cytokinins gây ra

1.1.3 Quy định hiện hành đối với một số chất kích thích tăng trưởng

Mức tồn dư tối đa của một số chất kích thích tăng trưởng thực vật được quy định tại Thông tư 50/2016/TT-BYT [2] được đưa ra tại Bảng 1.3

Bảng 1.3: Quy định của Thông tư 50/2016/TT-BYT

MRL (mg/kg) Nhóm Auxin

Theo thông tư 10/2019/TT-BNNPTNT, chỉ có Zeatin thuộc danh mục thuốc bảo

vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam

Mức tồn dư tối đa của một số chất kích thích tăng trưởng thực vật theo một số quy định của các nước trên thế giới được tổng hợp tại Bảng 1.4

Bảng 1.4: Quy định của một số quốc gia trên thế giới

1.2 Phương pháp xác định chất kích thích tăng trưởng thực vật

Hiện nay, nhiều phương pháp xác định đồng thời được xây dựng nhằm xác định

dư lượng các chất kích thích tăng trưởng thực vật trong rau, củ, quả và các sản phẩm

từ thực vật Các kỹ thuật phân tích chủ yếu được sử dụng là GC-MS, LC-MS/MS và ELISA [4, 14, 17, 24, 27, 40, 57]

1.2.1 Phương pháp xử lý mẫu

 Phương pháp chiết

Hiện nay, kỹ thuật chiết lỏng – lỏng vẫn là một trong những phương pháp xử lý mẫu được sử dụng phổ biến nhất trong phân việc phân tích các chất kích thích tăng trưởng thực vật Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được dựa trên cơ sở sự phân bố chất phân tích vào 2 pha lỏng (dung môi) không trộn lẫn được vào nhau Những dung môi với độ phân cực cao có thể hòa tan và chiết các chất kích thích tăng trưởng từ nền mẫu thực vật tốt hơn Hiệu suất chiết dựa phần lớn vào việc lựa chọn dung môi Dung môi lý tưởng cần chiết được lượng tối đa các chất và lượng tối thiểu các thành phần nền mẫu khác vào pha hữu cơ Do hầu hết các chất kích thích tăng trưởng tan tốt trong các dung môi hữu cơ phân cực hoặc dung dịch đệm có tính kiềm, rất nhiều dung môi khác nhau

đã và đang được áp dụng trong việc chiết chất phân tích này như: methanol [41], acetone:nước [17], methanol:đệm KH2PO4 [21], isopropanol:H2O:HCl [44] Trong số này, methanol là dung môi phổ biến nhất được sử dụng cho việc chiết các chất do chúng dễ dàng thâm nhập vào tế bào thực vật trong quá trình chiết do khối lượng phân

Cột C18 là cột chứa các pha tĩnh không phân cực như octadecylsilane (C18) Dịch chiết với 80% methanol được cho vào cột C18, các chất không phân cực sẽ được

giữ lại trên cột và được thu hồi thông qua quá trình rửa giải; các chất phân cực sau khi

bị loại ra khỏi cột C18 lại tiếp tục được cho vào cột SPE-silicagel để làm sạch và làm giàu [24, 34] Hai quá trình độc lập và liên tiếp được thực hiện trên mẫu để chiết và làm sạch Cytokinine khỏi nền mẫu được chiết, có thể thêm bước làm giàu mẫu nếu cần thiết Đầu tiên, mẫu sau khi đồng nhất được chiết bằng một số dung môi thông dụng như nước, methanol, ethyl acetat hoặc acetonitrile, dung dịch Bieleski (methanol/nước/acid formic) cũng thường được sử dụng và cho hiệu suất chiết tối ưu cũng như giảm thiểu chiết lipid trong mẫu

Dịch chiết được làm sạch bằng hai phương pháp phổ biến là chiết phân bố lỏng- lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE) Kỹ thuật LLE đòi hỏi tiêu tốn lượng dung môi hữu

cơ lớn, gây độc hại với môi trường cũng như yêu cầu thời gian phân bố lâu nên hiện nay không được áp dụng trong phân tích Cytokinins Trong khi đó kĩ thuật SPE có nhiều ưu điểm hơn như ít tốn dung môi, kĩ thuật chiết đơn giản, nhanh chóng nên đã

và đang được nghiên cứu áp dụng trong phân tích dư lượng Cytokinins trên nền mẫu rau, quả Cơ chế làm sạch của SPE chủ yếu dựa vào tương tác giữa pha tĩnh trong cột

và chất có trong dịch chiết, có thể là chất cần phân tích sẽ được lưu giữ trên cột, các tạp chất sẽ được rửa giải hoặc ngược lại Trong phân tích dư lượng Cytokinins, cơ chế lưu giữ chất phân tích được áp dụng phổ biến hơn cả, tương tác giữa Cytokinins với

pha tĩnh có thể là tương tác thân nước, kị nước, trao đổi ion, …tùy thuộc vào chất hấp

phụ trong cột Zhang và cộng sự [56] khi nghiên cứu xác định dư lượng Forchlorfenuron (CPPU) trên một số loại rau, quả đã khảo sát C18 làm pha tĩnh trong cột nhồi, độ thu hồi và RSD của phương pháp trên các nền mẫu lần lượt là 84,7-103,0%, 0,6-4,9% Các cột SPE truyền thống thường dựa trên một đơn cơ chế như cột C18, CGB, Al, PSA thì không hiệu quả trong việc phân lập đồng thời các Cytokinins

vì lí do đa dạng cấu trúc và tính chất hóa lí của chúng Vì vậy, việc kết hợp các cột lại

để tăng khả năng phân tách cũng đã được nghiên cứu, Ge và cộng sự đã kết hợp hai cột C18 và MCX trong hai bước làm sạch liên tiếp để phân tích đồng thời các Cytokinins trong nước dừa, tuy nhiên độ thu hồi chỉ đạt 31,6-67,9% do mẫu bị mất qua các bước làm sạch Hiện nay, một số loại pha tĩnh mới có tính đa tương tác đã được phát hiện và áp dụng thành công trong phân tích đồng thời dư lượng các Cytokinins, cho độ thu hồi và RSD phù hợp Một số cột làm sạch được sử dụng phổ biến được đưa

ra tại Bảng 1.5

3,5-dimethyl phenyl carbamoylated-cyclodextrin bonded silica gel

 Phương pháp QuEChERS

QuEChERS là tên viết tắt của Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged và Safe Phương pháp này do hai nhà khoa học Anasstasiades và Lehotay phát triển để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong rau quả Trong những năm gần đây, phương pháp

đã và đang được nghiên cứu, phát triển để phân tích các chất kích thích tăng trưởng

thực vật trong các nền mẫu và đã thu được hiệu quả tốt

Một số tác giả đã sử dụng acetonitril:methanol theo tỉ lệ phù hợp để chiết các chất kích thích tăng trưởng từ nền mẫu rau củ và hoa quả Hỗn hợp muối chiết (MgSO4, NaCl) được sử dụng để làm tăng độ phân cực của pha nước làm cho các chất kích thích được chiết vào acetonitrile dễ dàng hơn Lớp acetonitrile được tách khỏi nước nhờ muối chiết Dịch chiết acetonitrile sau đó được làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) với hỗn hợp chất hấp phụ như MgSO4, C18

Ở bước chiết, acetonitrile là dung môi phổ biến được sử dụng để chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu do tính chất dễ trộn lẫn với nước và dễ thâm nhập vào nền mẫu chứa nhiều nước, cũng có nghiên cứu sử dụng đồng thời methanol và ACN để tăng hiệu quả chiết với các chất phân tích tan tốt trong nước Hỗn hợp mẫu, dung môi được

bổ sung muối chiết gồm MgSO4, NaCl phối hợp với ly tâm lạnh để tách riêng hai lớp dung môi hữu cơ và nước

Bước làm sạch dựa trên kỹ thuật chiết phân bố pha rắn, chất hấp phụ được sử dụng là C18, carbon hoặc PSA Chất hấp phụ đóng vai trò loại bỏ các chất chiết có ảnh hưởng tới chất cần phân tích, giúp làm sạch nền mẫu, giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu lên sự phát hiện chất phân tích của thiết bị Ngoài các chất hấp phụ, MgSO4 cũng được sử dụng để loại bỏ nước còn lẫn trong lớp dung môi hữu cơ Việc chọn chất hấp phụ cho bước chiết phân bố pha rắn phụ thuộc vào khả năng lưu giữ của nó đối với chất phân tích và các chất chiết đồng thời từ nền mẫu có khả năng gây ảnh hưởng đến tín hiệu phân tích, thể hiện qua độ thu hồi, các chất hấp phụ được khảo sát và lựa chọn tùy theo từng nghiên cứu cụ thể Một số hỗn hợp phân tán được sử dụng phổ biến được đưa ra tại Bảng 1.6

Không sử dụng 71,0-90,0 0,5-3,4

Không sử dụng 72,6-122,4 5,2-11,8 Chen et al

pháp khó làm sạch được những tạp chất phức tạp nhưng với việc tích hợp với các thiết

bị phân tích hiện đại như LC-MS/MS, GC-MS/MS có khả năng phân tách tốt cùng với

độ nhạy cao, phương pháp phân tích vẫn đạt được sự chính xác và ổn định

1.2.2 Kỹ thuật phân tích

ELISA [57] là một kỹ thuật miễn dịch hóa học để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích Phương pháp ELISA dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzym Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên Nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện được biết thông qua cường độ màu

Mặc dù kỹ thuật ELISA có độ nhạy tốt đối với các Auxin nhưng lại tồn tại một số khó khăn như trong việc xử lý các mẫu có nền phức tạp và phân tích đồng thời các chất [20] Hiện nay, kỹ thuật ELISA vẫn được sử dụng để định lượng IAA thông qua IAA-ovalbumin hoặc phức liên hợp của IAA-BSA do tính chọn lọc và độ chọn lọc của nó

Sắc ký khí khối phổ là phương pháp được dùng trong phân tích lượng vết các hợp chất cần nhận danh chính xác bằng tỉ lệ giữa khối lượng và điện tích (m/z) Ưu điểm của phương pháp là có độ nhạy và độ chính xác cao GC-MS là phương pháp phổ biến nhất để định lượng các Auxin Mặc dù, một số báo cáo sử dụng GC-ECD để định lượng IAA, việc xác định hợp chất này vẫn được thực hiện bằng GC-MS trong hầu hết trường hợp So với LC-MS, GC-MS cung cấp độ nhạy cao hơn và được áp dụng rộng rãi cho phân tích Auxin và Auxin analog, đặc biệt là sau khi [13C6] IAA được tổng hợp

và được sử dụng như một chất nội chuẩn trong định lượng IAA Một trong những ví

dụ đầu tiên về việc sử dụng GC-MS/MS trong định lượng IAA là công trình của Muller và các cộng sự [40] sử dụng kỹ thuật Multiplex để định lượng dư lượng đa hoormon thực vật trong một lần đo duy nhất Phương pháp này cho phép nhóm nghiên cứu phát triển bản đồ phân bố IAA trên tất cả các bộ phận của cây Arabidopisis thaliana Gần đây, một khảo sát sử dụng 2-10 mg mô thực vật được phát triển để định lượng IBA, IAA và các chất chuyển hóa của IAA trong Arabidopsis và cà chua Tuy

nhiên, sắc ký khí lại không được sử dụng phổ biến để phân tích nhóm cytokinin do nhóm này có độ phân cực cao

Ma Liyan và cộng sự [35] đã xác định được 5 hợp chất (IAA, IBA, NAA,

2,4-D, 4-CPA) trong mẫu cà chua và giá đỗ bằng phương pháp sắc ký lỏng ba tứ cực khối phổ (LC-MS/MS) Cột sắc ký pha đảo 120 EC-C18 (3,0 mm × 50 mm) được sử dụng

để tách các chất Các mẫu được đồng nhất và chiết bằng hỗn hợp dung môi methanol:acetonitrile:nước:HOAC (40:40:20:1, v/v/v/v,), ly tâm và chiết lặp sau đó gộp dịch Dịch chiết được lọc qua màng có kích thước lỗ 0,2 µm (PTFE) và phân tích bằng LC-MS/MS Kết quả thu được cho thấy giới hạn định lượng của IAA, IBA, 2,4-

D, NAA lần lượt là 3,71; 9,26; 2,80; 47,6 µg/kg (mẫu cà chua) và 5,93; 33,3; 7,04; 49,0 µg/kg (mẫu giá đỗ), hệ số tương quan tốt từ 0,9980 tới 1, độ thu hồi trong khoảng

từ 70,3 đến 110,0%

Liu Sijie và cộng sự [32] đã sử dụng kỹ thuật QuEChERS để xử lý mẫu và sử dụng thiết bị UPLC-MS để định lượng đồng thời 19 chất kích thích tăng trưởng thực vật trên nền mẫu thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật Nghiên cứa sử dụng cột sắc ký pha đảo Acuqity UPLC HSS T3 (100 × 2,1 mm, 1,7 µm) và dung môi pha động (kênh A: 5mmol/L ammonium acetate trong nước và kênh B: ACN) Phương pháp có giới hạn định lượng trong khoảng từ 0,060–6,0 µg/kg, độ thu hồi từ 72,3-116%

Trong những năm gần đây, sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao (LC-HR/MS) là một kỹ thuật phân tích mới được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm và tập trung nghiên cứu Ưu điểm vợt trội của kỹ thuật là khả năng sàng lọc các chất với độ chính xác cao mà không cần sử dụng chuẩn Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có kết quả nghiên cứu sàng lọc các chất kích thích tăng trưởng thực vật trong rau, quả được công bố trên thế giới và Việt Nam Vì vậy, nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật LC-HRMS để sàng lọc và

LC-MS/MS để định lượng

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng chất phân tích

Đối tượng nghiên cứu của phương pháp sàng lọc và định lượng gồm 11 chất kích thích tăng trưởng tổng hợp thuộc nhóm Auxin và Cytokinin, có độc tính cao, có khả năng tích lũy sinh học và được sử dụng phổ biến hiện nay Cụ thể như sau:

- Nhóm Auxin (8 chất): 1-NAA, 2-NOA, Methyl 1-naphthaleneacetate, Picloram, MCPA, 4-CPA, 2,4-D; 2,4,5-T

- Nhóm Cytokinin (3 chất): 6-BAP, CPPU, TDZ

2.1.2 Đối tượng mẫu phân tích

Đối tượng mẫu được lựa chọn để khảo sát và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp bao gồm: rau mồng tơi và dưa hấu

Đối tượng mẫu được lựa chọn để phân tích ứng dụng phương pháp gồm 100 mẫu Mẫu được thu mua tại 5 chợ (Đồng Xa, Hà Đông, Xanh, Thượng Đình, Hôm) thuộc địa bàn thành phố Hà Nội Số lượng mẫu lấy tại các chợ giống nhau, cụ thể là 4 mẫu/loại Danh sách loại và số lượng mẫu từng loại được đưa ra tại Bảng 2.1

Bảng 2.1: Danh sách mẫu được lựa chọn để phân tích

Số lượng mẫu Phương pháp

sàng lọc

Phương pháp định lượng

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ

2.2.1.1 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

- Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao Ultimate 3000 Q-exactive, Thermo Scientific

- Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ (gồm sắc ký lỏng HPLC LC20AD-XR Shimadzu

và khối phổ ABSciex Triple Quad 6500)

- Cột sắc ký pha đảo Waters BEH C18 (100 mm x 1,7 µm x 2,1 mm) và tiền cột

- Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg, Metter Toledo

- Cân kỹ thuật, chính xác 0,01 g, Metter Toledo

- Máy đồng nhất mẫu, Phillips

- Máy đo pH, Metter Toledo

- Máy ly tâm, có thể đạt được tốc độ tối thiểu 6000 rpm đối với ống ly tâm 50

mL, Mikro 200R, Hettich

- Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 13000 rpm đối với ống ly tâm 2

mL, Mikro 200R, Hettich

- Máy lắc xoáy vortex, IKA

- Máy siêu âm, Elma – Đức

- Máy lắc ngang, IKA

- Hệ thổi khô, sử dụng khí nitơ

- Giấy lọc

2.2.2 Dung môi, hóa chất

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết dùng cho phân tích Nước được sử dụng cho thiết bị là nước đề ion, sử dụng cho quá trình chuẩn bị mẫu là nước cất 2 lần

- Methanol (Merck)

- Acetonitrile (Merck)

- Acid formic (Merck)

- MgSO4 khan (Merck)

- Acid acetic (Merck)

- Natri acetate (Merck)

- Bột PSA (Agilent)

- Bột C18 (Agilent)

- Dung dịch acid formic 0,1%: Hút 1 mL acid formic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần đã lọc qua màng lọc dung môi, lắc đều và rung siêu âm để loại bỏ bọt khí

- Dung dịch acid formic 1% trong acetonitrile: Hút 10 mL acid formic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần đã lọc qua màng lọc dung môi, lắc đều và rung siêu âm để loại bỏ bọt khí

- Dung dịch acid formic 0,1% trong acetonitrile: Hút 1 mL acid formic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần đã lọc qua màng lọc dung môi, lắc đều và rung siêu âm để loại bỏ bọt khí

- Dung dịch acid acetic 1% trong acetonitrile: Hút 10 mL acid acetic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, lắc đều

- Dung dịch acid acetic 0,1% trong acetonitrile: Hút 1 mL acid acetic vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần, lắc đều

- Dung dịch methanol:nước (3:1, v/v): đong 300 mL methanol và 100 mL nước vào bình 500 mL, đậy nắp và lắc đều

2.2.3 Chất chuẩn

2.2.3.1 Chất chuẩn gốc

Chuẩn 1-Naphthaleneacetic acid (1-NAA); β-Naphthyloxyacetic acid (2-NOA); Methyl 1- naphthaleneacetate; 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T); 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D); 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (Picloram); 2-Methyl-4-chlorohenoxyacetic acid (MCPA); 4-Chlorophenoxyacetic acid (4-CPA); 6-Benzylaminopurine (6-BAP); Forchlorfenuron (CPPU); Thidiazuron (TDZ), có độ tinh khiết ≥ 95% (LGC)

2.2.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

 Dung dịch chuẩn gốc các chất kích thích tăng trưởng thực vật 500 µg/mL

Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất chuẩn trên cân phân tích có độ chính xác đến 0,01 mg Hòa tan bằng MeOH và chuyển vào bình định mức 20 mL, định mức đến vạch và lắc đều

Bảo quản các dung dịch ở 2 ÷ 8ºC, sử dụng được trong vòng 6 tháng

Ghi chú: Nồng độ dung dịch chuẩn gốc cần được tính thực tế theo lượng chuẩn

cân và độ tinh khiết của chất chuẩn

 Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL

Dùng micropipet hút chính xác 200 µL các dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng MeOH và lắc đều

Bảo quản các dung dịch ở 2 ÷ 8ºC, sử dụng được trong 1 tháng

 Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 100 ng/mL

Dùng micropipet hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10

µg/mL vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng MeOH lắc đều

Bảo quản các dung dịch này ở 2 ÷ 8ºC, tránh ánh sáng, sử dụng được trong 1 tuần

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu rau, quả được lấy là các mẫu có nguy cơ (rau có ngọn dài, thân mập, giá không có rễ chùm, quả không hạt, khoai to không có mầm, ) Các mẫu này được thu mua tại các chợ, siêu thị và cửa hàng trên địa bàn thành phố Hà Nội

Lượng mẫu: mẫu rau, quả được lấy tối thiểu 1 kg

Bảo quản: mẫu được đựng vào túi ghép mí Sau đó, chuyển ngay về phòng thí nghiệm và bảo quản trong tủ mát 2 ÷ 4°C trước khi thực hiện phân tích

2.3.2 Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ

2.3.2.1 Khảo sát, tối ưu các điều kiện HRMS

Khảo sát điều kiện khối phổ: Tiến hành tra cứu mảnh phổ lý thuyết theo thư viện Mzcloud.com Sau đó, tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp Tiến hành tiêm 1 µL dung dịch các chất chuẩn 6-BAP, CPPU vào khối phổ Tiến hành đo mảnh phổ thực nghiệm bằng chế độ Fullscan đối với mảnh mẹ và phân mảnh tất cả các ion (AIF) để tìm kiếm mảnh con của chất phân tích

Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: lựa chọn cột sắc ký, khảo sát thành phần và chương trình gradient của hệ dung môi pha động

2.3.2.2 Khảo sát, tối ưu các điều kiện MS/MS

Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp

Các ion mẹ và ion con được xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật tiêm trực tiếp vào khối phổ (MS) Dùng kim tiêm mẫu 1 mL tiêm trực tiếp các chất kích thích tăng trưởng thực vật có nồng độ 1 µg/mL vào MS để khảo sát Lựa chọn ion con có cường

độ cao và đặc trưng nhất để định lượng và ion con có cường độ thấp hơn để xác nhận

2.3.2.3 Khảo sát, tối ưu các điều kiện LC

Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: lựa chọn cột sắc ký, thành phần và chương trình gradient của hệ dung môi pha động

Điều kiện phân tích cụ thể như sau:

- Cột sắc ký pha đảo Waters BEH C18 (100 mm x 1,7 µm x 2,1 mm) và tiền cột

- Pha động: gradient trên 2 kênh: kênh A (acid formic 0,1% trong nước), kênh B (ACN)

- Curtain gas (CUR): 25 psi

- Collision gas (CAD): 7 psi

- Ionspray Voltage (IS): 5000/-4500 V

- Temperature (TEM): 450 ºC

- Ion source gas 1 (GS1): 30 psi

- Ion source gas 2 (GS2): 30 psi

- Entrance Potential (EP): 10 V

- Thể tích bơm mẫu: 10 µL

- Tốc độ dòng pha động: 0,3 mL/phút

2.3.3 Phương pháp xử lý mẫu

2.3.3.1.Chuẩn bị mẫu sơ bộ

- Đồng nhất tối thiểu 250 g mẫu bằng máy đồng nhất mẫu

2.3.3.2 Quy trình xử lý mẫu

Ban đầu, tiến hành khảo sát 3 kỹ thuật đang được áp dụng phổ biến trên thế giới cho nhóm chất này gồm :chiết lỏng - lỏng, QuEChERS, chiết bằng cột SPE trên nền mẫu trắng (rau mồng tơi, dưa hấu) được thêm chuẩn ở mức 100 µg/kg Sau đó, phương pháp có diện tích píc của chất được phân tích (CPPU, 6-BAP) cao nhất được lựa chọn

để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

- Quy trình chiết lỏng - lỏng: cân chính xác khoảng 10 g trên cân phân tích Thêm 10 mL H2O và 10 mL ethylacetate, lắc xoáy 1 phút, sau đó lắc ngang 30 phút

Ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút Chuyển toàn bộ lớp dịch phía trên sang ống ly tâm khác Chiết lặp mẫu với 10 mL ethylacetate Sau đó, gộp dịch và lọc qua giấy lọc để loại bỏ toàn bộ chất rắn lơ lửng Thổi khô mẫu bằng khí nitơ tới cạn Sau

đó hòa cặn bằng 10 mL methanol Lọc mẫu qua màng lọc 0,2 µm vào lọ đựng mẫu 2

mL Sau đó, phân tích mẫu bằng sắc ký lỏng khối phổ

- Quy trình QuEChERS: cân chính xác khoảng 15 g mẫu trên cân phân tích Thêm 5 mL nước cất hai lần (đối với mẫu rắn), lắc xoáy 1 phút và để yên khoảng 10 phút Thêm 15 mL dung dịch acetonitrile có chứa 1% acid formic vào ống ly tâm, đậy

nắp kín, lắc xoáy 1 phút Thêm từ từ hỗn hợp muối chiết (6g MgSO4, 1,5g

CH3COONa), đậy nắp kín, lắc trộn đều bằng tay 1 phút Ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút Sau đó, hút 1 mL lớp dung dịch phía trên vào ống ly tâm 2 mL

đã được chuẩn bị hỗn hợp chất phân bố (150 mg MgSO4 và 50 mg bột C18) Đậy nắp, lắc xoáy 30 giây Ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 2 phút Hút 1 mL lớp dịch trong phía trên cho qua màng lọc 0,2 µm vào lọ đựng mẫu 2 mL Sau đó, phân tích mẫu bằng sắc ký lỏng khối phổ

- Quy trình làm sạch bằng SPE: Cân chính xác khoảng 4 g mẫu bằng cân phân tích vào ống ly tâm dung tích 50 mL Thêm 10 mL dung dịch methanol:nước (3:1, v/v), lắc vortex 1 phút, lắc ngang trong 30 phút Ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong

5 phút Chuyển toàn bộ dịch chiết sang ống ly tâm khác Chiết lặp mẫu với 10 mL dung dịch methanol:nước (3:1, v/v) Sau đó, gộp dịch và lọc qua giấy lọc để loại bỏ toàn bộ chất rắn lơ lửng Dịch được làm sạch qua cột SPE-Oasis HLB(hoạt hoá cột bằng 3 mL MeOH, 3 mL nước cất; nạp mẫu qua cột với tốc độ chảy không quá 2 mL/phút; rửa tạp bằng 3 mL nước cất; hút khô 1 phút; rửa giải: 4 mL dung dịch MeOH

có chứa 1% acid formic Dịch rửa giải được lọc qua màng 0,2 µm rồi phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ

Sau khi lựa chọn được kỹ thuật QuEChERS là kỹ thuật xử lý mẫu có hiệu suất thu hồi tốt nhất, tiến hành khảo sát, tối ưu các điều kiện của quy trình xử lý Mẫu khảo sát là mẫu trắng được thêm chuẩn ở mức 100 µg/kg Các thông số khảo sát cụ thể như sau:

- Khảo sát dung môi chiết: acetonitrile, acetonitrile chứa 1% acid acetic

2.3.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng

Tiến hành thẩm định, đánh giá các thông số sau: độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại, độ thu hồi

Đánh giá kết quả thẩm định với quy định của châu Âu (EC/657/2002) hoặc AOAC

2.3.4.1 Độ đặc hiệu

Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua việc so sánh píc của các chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Phương pháp có tính chọn lọc cao đối với chất phân tích khi không phát hiện tín hiệu của chất phân tích trên mẫu trắng, thời gian lưu của chất phân tích trên mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn không lệch quá 2,5%

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/20002 của Châu Âu

2.3.4.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu của chất phân tích và nhiễu nền (S/N) Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)

LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)

2.3.4.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo 7 điểm chuẩn có nồng độ từ giá trị định lượng Sau đó, lấy tối thiểu 5 điểm nằm trong khoảng tuyến tính Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó, vẽ đường biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc giữa diện tích píc thu được vào nồng độ

Các dung dịch chuẩn được pha trên dịch sau khi xử lý của mẫu trắng

2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau (n = 6) và tính toán kết quả theo các công thức sau:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)

RSD(%) = 100

x S

N

i i

Trong đó:

xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

x: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

n : Số lần thử nghiệm

Độ thu hồi: R(%) = R= x 100

Trong đó:

R: độ thu hồi (%)

C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

2.3.4 Phương pháp phân tích mẫu thực

Đường chuẩn trên nền mẫu thực được sử dụng để tính kết quả cho các mẫu tương ứng Do khối lượng cân của mẫu bằng thể tích dung môi chiết nên hàm lượng chất kích thích tăng trưởng trong mẫu bằng nồng độ chất đó trong dịch chiết

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả phân tích sàng lọc được xử lý bằng phần mềm Compound discoverer 3.1 Kết quả định lượng được xử lý bằng phần mềm Analyst của thiết bị LC-MS/MS Số liệu được xử lý bằng Excel

Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xây dựng phương pháp

3.1.1 Kết quả tối ưu điều kiện thiết bị khối phổ

3.1.1.1 Kết quả tối ưu điều kiện HR/MS

 Tìm kiếm mảnh phổ lý thuyết

Tiến hành tra cứu mảnh phổ lý thuyết theo thư viện Mzcloud.com, mỗi chất phân tích được phân tích bằng mảnh mẹ và các mảnh con ở cả chế độ âm và chế độ dương Kết quả được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1: Mảnh phổ lý thuyết của các chất kích thích tăng trưởng thực vật

(m/z)

Mảnh con (m/z)

1 1-naphthalene acetic

141.07097 101.03967

2 2-naphthoxyacetic acid 2-NOA 202.21 (-) 201.05572

143.05024 115.05532 65.03967

3

Trichlorophenoxyaceti

2,4,5-c a2,4,5-cid

2,4,5-T 255.5 (-) 252.92320

194.91767 158.94099 122.96432 94.96940

4

Dichlorophenoxyacetic

2,4-acid

2,4-D 221.03 (-) 218.96212

160.95664 124.98000 89.00329

STT Chất Viết tắt KLPT ESI Mảnh mẹ

(m/z)

Mảnh con (m/z)

88.00670 50.00362

7

Chlorophenoxyacetic

4-acid

4-CPA 186.59 (-) 185.00110

126.99562 91.01894 213.12850 161.09720 143.08662 71.05024

8 Methyl-1-naphtalene

155.0003 129.0212 111.0553 66.03445

9 6-Benzylaminopurine 6-BAP 225.25 (-) 224.09362

91.05423 65.03858

127.9913 102.0120 95.0491 59.99025 51.02293

STT Chất Viết tắt KLPT ESI Mảnh mẹ

(m/z)

Mảnh con (m/z)

50.0151

11 Forchlorfenuron CPPU 247.68 (+) 246.043963

127.00679 92.05057 91.03017 Kết quả đưa ra tại Bảng 3.1 cho thấy hầu hết các chất phân tích đều có thể phân tích bằng chế độ ion hóa phun điện tử âm, một số chất phân tích bằng chế độ dương

Từ đó, tiến hành xây dựng bảng mảnh phổ thực nghiệm của một số chất phân tích và đối chiếu với mảnh phổ lý thuyết để đánh giá độ tin cậy của thư viện phân tích cũng như điều kiện phân tích trên thiết bị

 Tìm kiếm mảnh phổ thực nghiệm một số chất phân tích

Tiến hành tiêm 1 µL dung dịch các chất chuẩn 6-BAP, CPPU (chưa có đầy đủ các chất chuẩn khi tiến hành khảo sát mảnh phổ) vào thiết bị HR-MS Tiến hành đo mảnh phổ thực nghiệm bằng chế độ "Fullscan" đối với mảnh mẹ và "All ion fragmentation" (AIF) để tìm kiếm mảnh con của chất phân tích Kết quả thu được như Bảng 3.2

Bảng 3.2: Mảnh phổ thực của 6-BAP và CPPU

STT Chất phân

tích

Chế độ phân tích

127.00679 127.00561 92.05057 92.04921 91.03017 91.02881

Kết quả phân tích cho thấy mảnh mẹ và mảnh con của CPPU, 6-BAP đều có mảnh mẹ và mảnh con tương ứng với mảnh phổ lý thuyết với độ lệch khối của mảnh phổ cho thấy độ lệch khối thấp hơn 5x10-6 Từ đó, sử dụng mảnh phổ lý thuyết cho các chất phân tích trong nhóm chất kích thích tăng trưởng thực vật có độ tin cậy cao Trên

cơ sở đó, tiến hành xây dựng nguồn dữ liệu đối chiếu (thư viện) để phân tích các chất kích thích tăng trưởng thực vật gồm một số thông tin trong thư viện như sau Điều kiện phân tích của các chất được đưa ra tại Bảng 3.3

Bảng 3.3: Điều kiện phân tích của các chất kích thích tăng trưởng

STT

Chất phân tích

Mảnh Mảnh mẹ

(m/z)

Mảnh con (m/z)

Dạng ion phân tích

Điện tích