Phát triển kỹ thuật cold pcr và real time pcr lna Để xác Định và sàng lọc nhanh các Đột biến kháng thuốc nucleot(s)ide của hepatitis virus b

Phát triển kỹ thuật cold pcr và real time pcr lna Để xác Định và sàng lọc nhanh các Đột biến kháng thuốc nucleot(s)ide của hepatitis virus b

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Lan Anh

PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ THÀNH PHẦN LIGNAN TRONG DƯỢC LIỆU NGŨ VỊ TỬ

THU TẠI NÚI NGỌC LINH, VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Lan Anh

PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ THÀNH PHẦN LIGNAN TRONG DƯỢC LIỆU NGŨ VỊ TỬ

THU TẠI NÚI NGỌC LINH, VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa Phân tích

Mã số: 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Tạ Thị Thảo

TS Nguyễn Thị Phương

Hà Nội - 2022

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành tại phòng thí nghiệm khoa Hóa phân tích-

tiêu chuẩn, viện Dược liệu và phòng thí nghiệm phòng Hóa phân tích, Viện Hóa

học-Vật liệu, viện Khoa học Công nghệ Quân sự

Với lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS

TS Tạ Thị Thảo bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, TS Nguyễn Thị Hà Ly và TS Nguyễn Thị

Phương khoa Hóa phân tích- tiêu chuẩn, viện Dược liệu đã luôn giúp đỡ, tạo điều

kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Hóa phân

tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

đã trang bị cho tôi kiến thức về nghiên cứu và khoa học nói chung trong suốt thời

gian học tập và nghiên cứu tại đây

Tôi xin chân thành cảm ơn các thủ trưởng, chỉ huy các cấp viện Hóa học-

Vật liệu, viện Khoa học Công nghệ Quân sự đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Y tế- Viện Dược Liệu đã hỗ trợ nghiên cứu

trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Y tế, đề tài “Nghiên cứu tạo sản phẩm hỗ trợ điều trị

bệnh gan mạn tính từ Ngũ vị tử (Schisandra sphenanthera Rehder et Wills.) thu hái

tại Việt Nam”

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

đã luôn động viên, giúp đỡ về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt luận

văn này

Tác giả

Nguyễn Thị Lan Anh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.1.TỔNG QUAN VỀ NGŨ VỊ TỬ 3

1.1.1.Đặc điểm và phân bố 3

1.1.2 Thành phần hóa học của Ngũ vị tử 3

1.1.3 Tác dụng sinh học 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ LIGNAN 5

1.2.1 Schisandrin 7

1.2.2 Gomisin B 8

1.2.3 Schisandrin A 8

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH LIGNAN TRONG NGŨ VỊ TỬ 8

1.3.1 Các chuyên luận Dược điển 8

1.3.2 Các nghiên cứu về phân tích Ngũ vị tử trong thực tế 9

1.4 ỨNG DỤNG MÔ HÌNH MÁY HỌC ĐỂ PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT CÓ DƯỢC TÍNH TRONG DƯỢC LIỆU VÀ CÁC MẪU THỰC VẬT 14

1.5 ỨNG DỤNG THỐNG KÊ ĐA BIẾN TRONG NHẬN DẠNG NGŨ VỊ TỬ THEO NGUỒN GỐC ĐỊA LÝ 16

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 18

2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHẦN MỀM 18

2.1.1 Chất chuẩn 18

2.1.2 Hóa chất khác 19

2.1.3 Thiết bị 19

2.1.4 Phần mềm xử lý số liệu 20

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Thông tin mẫu 20

2.2.2 Tiền xử lý mẫu 21

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.3.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp TLC định tính lignan trong Ngũ vị tử 22

2.3.2 Nghiên cứu xây dựng phương pháp HPLC-DAD định lượng đồng thời một số lignan chính trong Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh 23

2.3.3 Nghiên cứu xây dựng phương pháp UV/ANN định lượng đồng thời 3 lignan

trong Ngũ vị tử 27

2.3.4 Bước đầu xây dựng mô hình phân biệt Ngũ vị tử theo vị trí địa lý 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

3.1.NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TLC ĐỊNH TÍNH SCHISANDRIN, GOMISIN B VÀ SCHISANDRIN A TRONG DƯỢC LIỆU NGŨ VỊ TỬ THU TẠI VÙNG NÚI NGỌC LINH 31

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 31

3.1.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định tính 33

3.1.3 Đề xuất quy trình định tính SC, GB và SCA trong dược liệu Ngũ vị tử bằng phương pháp TLC 34

3.1.4 Áp dụng phương pháp TLC định tính SC, GB và SCA trong một số mẫu dược liệu Ngũ vị tử 35

3.2.NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-DAD ĐỊNH LƯỢNG SCHISANDRIN, GOMISIN B VÀ SCHISANDRIN A TRONG DƯỢC LIỆU NGŨ VỊ TỬ 37

3.2.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích trên hệ HPLC-DAD 37

3.2.2 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu 44

3.2.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng bằng HPLC-DAD 47

3.2.4 Đề xuất quy trình định lượng SC, GB và SCA trong dược liệu Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh bằng phương pháp HPLC-DAD 52

3.2.5 Áp dụng phương pháp định lượng SC, GB và SCA trên các mẫu Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh 53

3.3 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP UV/ANN ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI 3 LIGNAN TRONG NGŨ VỊ TỬ 55

3.3.1 Khảo sát tìm ma trận dữ liệu cho phương pháp UV-Vis kết hợp mạng nơ ron thần kinh nhân tạo ANN 55

3.3.2 Khảo sát thông số mạng ANN 58

3.3.3 Độ chính xác của phương pháp UV/ANN 62

3.4.BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG MÔ HÌNH PHÂN BIỆT NGŨ VỊ TỬ THEO VỊ TRÍ ĐỊA LÝ 68

KẾT LUẬN 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHỤ LỤC 78

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Thông tin chung của một số lignan có trong Ngũ vị tử 6

Bảng 1 2 Một số phương pháp định lượng lignan trong dược liệu Ngũ vị tử 11

Bảng 2 1 Thông tin bộ mẫu dùng để phát triển các phương pháp nghiên cứu… 21

Bảng 3 1 Giá trị Rf của các chất định phân ứng với 4 hệ dung môi khảo sát 32 Bảng 3 2 Giới hạn phát hiện của phương pháp định tính bằng TLC 34

Bảng 3 3 Các chương trình gradient khảo sát 39

Bảng 3 4 Các thông số sắc ký của 3 chất định phân ứng với các điều kiện khảo sát 39

Bảng 3 5 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất 43

Bảng 3 6 Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống 49

Bảng 3 7 IDL và IQL của SC, GB và SCA 50

Bảng 3 8 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 50

Bảng 3 9 Kết quả đánh giá độ thu hồi của phương pháp 52

Bảng 3 10 Hàm lượng SC, GB và SCA trong một số mẫu Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh 53

Bảng 3 11 Độ tương quan của mô hình ANN được huấn luyện với các thuật toán khác nhau 61

Bảng 3 12 Hiệu suất thu hồi của SC, GB và SCA xác định bằng phương pháp UV/ANN 63

Bảng 3 13 Nồng độ SC trong mẫu Ngũ vị tử xác định bằng phương pháp UV/ANN 65

Bảng 3 14 Nồng độ GB trong mẫu Ngũ vị tử xác định bằng phương pháp UV/ANN 66

Bảng 3 15 Nồng độ SCA trong mẫu Ngũ vị tử xác định bằng phương pháp UV/ANN 67

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Một số hình ảnh Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh 3

Hình 2 1 Hình ảnh mẫu dược liệu Ngũ vị tử dùng cho nghiên cứu 20

Hình 3 1 Sắc ký đồ TLC của 4 hệ dung môi khảo sát 32

Hình 3 2 Sắc ký đồ TLC đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp 33

Hình 3 3 Sắc ký đồ TLC xác định LOD của SC, GB và SCA 34

Hình 3 4 Sắc ký đồ TLC định tính SC, GB và SCA trong một số mẫu Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh 36

Hình 3 5 Phổ UV của SC, GB và SCA 37

Hình 3 6 Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu Ngũ vị tử theo DĐHK 38

Hình 3 7 Sắc ký đồ HPLC khảo sát chương trình rửa giải 40

Hình 3 8 Sắc ký đồ HPLC khảo sát thể tích tiêm mẫu 41

Hình 3 9 Các đường chuẩn định lượng SC, GB và SCA 43

Hình 3 10 Kết quả khảo sát phương pháp chiết mẫu 45

Hình 3 11 Kết quả khảo sát dung môi chiết 46

Hình 3 12 Kết quả khảo sát thời gian chiết 47

Hình 3 13 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp 48

Hình 3 14 So sánh phổ của các chất định phân trong mẫu thử dược liệu Ngũ vị tử và trong mẫu chuẩn 48

Hình 3 15 Phổ hấp thụ quang của chất chuẩn 55

Hình 3 16 Phổ hấp thụ của mẫu thực tế và mẫu thêm chuẩn 56

Hình 3 17 Phổ tín hiệu mối quan hệ giữa hệ số pha loãng và độ hấp thụ quang 57

Hình 3 18 Phổ UV-Vis của mẫu được pha loãng với dung môi với các tỉ lệ khác nhau 58

Hình 3 19 Hệ số tương quan của mô hình ANN với các lớp ẩn khác nhau 59

Hình 3 20 Hệ số tương quan của mô hình ANN với số neural ở lớp ẩn đầu khác nhau 60

Hình 3 21 Mô hình ANN trên cơ sở ma trận tín hiệu UV-Vis 64

Hình 3 22 Dữ liệu mô hình huấn luyện ANN 64

Hình 3 23 Đồ thị sự phụ thuộc của phương sai vào PC 68

Hình 3 24 Đồ thị sự phân bố nhóm mẫu qua thuật toán PCA 69

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt

ACN acetonitril acetonitril

ANN Artificial Neural Network Mạng nơron nhân tạo

CTPT Molecular formula Công thức phân tử

DA Discriminant Analysis Phân tích biệt thức

DĐHK Hong Kong Chinese Materia

Medica Standards Dược điển Hồng Kông

DĐTQ Pharmacopoeia of the People's

Republic of China Dược điển Trung Quốc

DMSO dimethyl sulfoxide dimethyl sulfoxide

ESI Electrospray ionization

Ion hóa bằng phương pháp phun điện tử

High performance liquid

chromatography diode array detector

KLPT Molecular mass Khối lượng phân tử

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

NIRS Near Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại gần

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

PC Principal Components Cấu tử chính

PCA Principal component analysis Phân tích thành phần chính

PLS Partial Least Square Bình phương tối thiểu từng

phần

R(%) recovery hiệu suất thu hồi

RSD(%) relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

RRLC Rapid resolution liquid

chromatography Sắc ký lỏng độ phân giải cao

SC schisandrin schisandrin

SCA schisandrin A schisandrin A

SIMCA Soft Independent Modelling of

Class Analogy

Phân nhóm tương tự sử dụng

mô hình hóa độc lập mềm

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

UV-Vis Ultra Violet - Visible Quang phổ hấp thụ phân tử

MỞ ĐẦU

Quả Ngũ vị tử Schisandra sp từ lâu được sử dụng trong y học cổ truyền

Trung Quốc để làm thuốc bổ, an thần, chữa phế hư, ho tức ngực, di tinh Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy quả Ngũ vị tử có tác dụng trong điều trị viêm gan siêu

vi mạn bảo vệ thận, chống oxy hóa, và nhiều tác dụng khác đối với sức khỏe con người Ở Việt Nam, năm 2007 một loài Ngũ vị tử đã được phát hiện mọc hoang với trữ lượng lớn ở vùng núi Ngọc Linh thuộc địa phận giữa hai tỉnh Kon Tum và

Quảng Nam Tên khoa học của loài này đã được xác định là Schisandra sphenanthera Rehder et Wils Ngoài ra, trên thị trường Việt Nam cũng tồn tại 2 loài Ngũ vị tử chính là Schisandra sphenanthera và Schisandra chinensis

Đã có nhiều tài liệu và nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng các lignan là thành phần chính, và cũng là thành phần có dược tính chính trong Ngũ vị tử, đặc biệt đối với 2 loài Ngũ vị tử có mặt ở Việt Nam, 3 lignan Schisandrin, Gomisin B và Schisandrin A là 3 hoạt chất chính nổi trội

Ngũ vị tử nói chung và các hợp chất lignan nói riêng đều có dược tính mạnh với nhiều tác động tới sức khỏe con người Vì lý do đó nên cần có các phương pháp

để xác định và kiểm soát hàm lượng các dược chất có mặt trong loại dược liệu này Trên thế giới, hiện nay đã có nhiều nghiên cứu phân tích đồng thời hàm lượng các hoạt chất có dược tính nói chung và lignan nói riêng trong Ngũ vị tử, chủ yếu bằng các phương pháp sắc ký hiện đại như HPLC Tuy nhiên ở Việt Nam vẫn còn rất ít các nghiên cứu chuyên sâu về xác định hàm lượng các hoạt chất có mặt Ngũ vị tử thu hái và tồn tại trên thị trường Việt Nam Trong dược điển Việt Nam V hiện cũng chỉ có phương pháp phân tích định tính các hợp chất lignan trong Ngũ vị tử bằng sắc ký bản mỏng (TLC), chưa hề đề cập tới phương pháp định lượng Điều này đã

bỏ phí cơ hội kiểm soát và phát triển một loại thảo dược quý vô cùng tiềm năng mà Việt Nam có Không chỉ vậy, việc kiểm soát và đánh giá và kiểm soát chất lượng dược liệu Ngũ vị tử trên thị trường và trong tự nhiên tại Việt Nam cũng là việc vô cùng quan trọng Vì vậy, cần phải có thêm nhiều nghiên cứu phát triển các phương pháp nhanh chóng, hiệu quả để đánh giá nhanh được nguồn gốc cũng như hàm lượng dược chất có mặt trong loại dược phẩm này

Ngày nay, cùng với sự phát triển của công nghệ kĩ thuật số và máy tính, ngày càng có nhiều nghiên cứu kết hợp giữa các thuật toán, các ứng dụng học máy và phân tích hóa học Việc kết hợp này giúp việc phân tích sau này trở nên đơn giản, nhanh chóng, ít sử dụng hóa chất hơn, từ đó góp phần vào phát triển khoa học bền vững và bảo vệ môi trường Không chỉ vậy, các quy trình phân tích có sử dụng kết hợp học máy có thể áp dụng để phân tích tiện lợi ở các phòng thí nghiệm quy mô nhỏ lẻ, chưa đủ điều kiện để trang bị đầy đủ các thiết bị phân tích hiện đại như HPLC

Nhiều nghiên cứu trên thế giới gần đây đã nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời các thành phần lignan trong Ngũ vị tử, tuy vậy, vẫn còn rất ít các nghiên cứu ứng dụng việc học máy hay kết hợp các thuật toán vào phân tích cũng như dự đoán đối với đối tượng này

Từ những lý do trên, luận văn thạc sĩ: “ Phát triển phương pháp phân tích

một số thành phần lignan trong dược liệu Ngũ vị tử thu hái tại núi Ngọc Linh, Việt Nam” hướng tới mục tiêu xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng

thời 3 lignan Schisandra, Gomisin B và Schisandra A trong dược liệu Ngũ vị tử, trên cơ sở đó xây dựng phương pháp UV-Vis kết mô hình học máy ANN để xác định một cách nhanh chóng hàm lượng 3 lignan trên và bước đầu khảo sát tính khả thi của mô hình phân loại dược liệu Ngũ vị tử dựa theo nguồn gốc địa lý Để giải quyết những mục tiêu trên, luận văn nghiên cứu thực hiện cụ thể những vấn đề sau:

1 Xây dựng phương pháp TLC định tính 3 lignan SC, GB và SCA trong dược liệu NVT

2 Xây dựng phương pháp HPLC-DAD định lượng đồng thời 3 lignan SC,

GB và SCA trong dược liệu NVT

3 Xây dựng phương pháp UV-Vis/ANN dự đoán đồng thời nồng độ 3 lignan SC, GB và SCA trong dược liệu NVT

4 Bước đầu khảo sát tính khả thi của việc xây dựng mô hình phân biệt Ngũ

vị tử dựa theo nguồn gốc vị trí địa lý

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Ngũ vị tử

1.1.1 Đặc điểm và phân bố

Ngũ vị tử là một chi loài (Schisandra) thuộc họ Ngũ vị (Schisandraceae), bộ Hồi (Illiciales), phân lớp Hoàng liên (Rancunulidae), lớp Hai lá mầm (Dicotyledones), ngành Hạt kín (Angiospermae) [1] Chi Ngũ vị tử (Schisandra)

gồm 6 loài phân bố chủ yếu ở phía Đông Nam Châu Á Schisandra sphenanthera và Schisandra chinensis là hai loài được sử dụng phổ biến nhất và cũng là hai loài

được tìm thấy ở Việt Nam[30, 41]

Ở Việt Nam, Ngũ vị tử phân bố chủ yếu ở vùng núi Ngọc Linh, thuộc tỉnh Kon Tum và Quảng Nam Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh, Việt Nam có tên

khoa học là Schisandra sphenanthera Rehder & E.H.Wilson, cây phân bố ở độ cao

1.200 – 1.600 m, tập trung nhiều ở những vùng có sinh thái là rừng cây bụi, rừng thứ sinh và rừng thông Ở Kon Tum, Ngũ vị tử phân bố ở các huyện Ngọc Lây, Đak

tô, Tu-mơ-rông, Konplông Ở Quảng Nam phân bố chủ yếu ở nam Trà My [1],[5]

A- Hoa B- Quả xanh C- Quả chín

Hình 1 1 Một số hình ảnh Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh

1.1.2 Thành phần hóa học của Ngũ vị tử

Theo một số nghiên cứu đã được công bố chỉ ra rằng lignan là thành phần hóa

học chính có trong Ngũ vị tử Bên cạnh đó, trong loài Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera còn có các triterpen như: schizandronic acid, anwuweizic acid,

schisanol và các thành phần có trong tinh dầu dễ bay hơi [4],[7]

Nhóm chất lignan trong loài Schisandra sphenanthera được chia thành một

số loại: dibenzocyclooctadien lignan; 4-aryltetralin lignan; diarylbutan lignan và 2,5-diaryltetrahydrofuran lignan [2, 7, 10] Trong đó, Dibenzocyclooctadien lignan gồm các chất: gomisin U, benzoylgomisin U, epigomisin O, tigloylgomisin O, benzoylgomisin P, tigloylgomisin P, angeloylgomisin P, benzoylgomisin Q, schisantherin A (gomisin C), schisantherin

2,3-dimethyl-1,4-B (gomisin 2,3-dimethyl-1,4-B), schisantherin C, schisantherin D, schisantherin E, deoxyschizandrin (schisandrin A, deoxyschisandrin), schisanhenol, isoschizandrin 2,3-dimethyl-1,4-diarylbutan lignan gồm các chất: dl-anwulignan, (+)-anwulignan, sphenanlignan

Và 2,5-diaryltetrahydrofuran lignan gồm: chicanin, D-epigalbacin, ganschisandrin

Với loài Ngũ vị tử nam Schisandra sphenanthera – loài Ngũ vị tử thu được

tại vùng núi Ngọc Linh, Việt Nam , đã có những nghiên cứu gần đây cho thấy trong quả của cây có chứa các lignan như: gomisin A, B, C, J, N, schisandrin, schisandrin

A, angeloylgomisin P [2], [5, 7, 9-11]

1.1.3 Tác dụng sinh học

Ngũ vị tử đã được chứng minh là có nhiều tác dụng sinh học, có tác động tới sức khỏe con người như tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, khả năng chống lại độc tính của cisplatin và tác dụng bảo vệ gan,…

Cao chiết cồn từ Ngũ vị tử nam Schisandra sphenanthera có tác dụng làm

giảm tình trạng gan nhiễm mỡ do rượu bia Nghiên cứu thực hiện theo mô hình NAFLD trên chuột nhắt đực chủng C57BL/6 được tiến hành bằng chế độ ăn thiếu methionine-cholin (MCD) Chuột được cho ăn chế độ ăn cơ bản được sử dụng làm

đối chứng Cả hai nhóm được điều trị ngẫu nhiên bằng cao chiết cồn Schisandra sphenanthera bằng đường uống trong 5 tuần Sau 5 tuần ăn chế độ MCD, tỷ lệ trọng

lượng gan/cơ thể của chuột được điều trị WZ cao hơn so với chuột đối chứng Giải phẫu mô học gan cho thấy sự giảm rõ rệt của tình trạng gan nhiễm mỡ, viêm và hoại

tính, 5,56% protein, 42,83% acid uronic và bao gồm rhamnose, arabinose, mannose, galactose, glucose với tỷ lệ phân tử là 13,52, 5,69, 3,92, 41,28 và 35,59 Kết quả cho thấy khi nồng độ của SSPW1 là 1 mg/mL, tốc độ lọc sạch các gốc tự do anion superoxid, gốc hydroxyl và DPPH lần lượt là 62,08%, 39,27% và 41,83%, SSPW1

có tác dụng chống oxy hóa in vitro [36]

Theo một nghiên cứu khác, tác dụng chống oxy hóa của lignan trong các mẫu Ngũ vị tử thu tại một số vùng khác nhau được đánh giá bằng thử nghiệm với sắt thiocyanat và thử nghiệm DPPH (2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl) Kết quả cho thấy có

sự khác biệt đáng kể về hàm lượng các lignan giữa Schisandra chinensis và Schisandra sphenanthera Khả năng chống oxy hóa của Schisandra chinensis vượt trội hơn hẳn so với Schisandra sphenanthera và các thành phần chính có tác dụng chống oxy hóa được

chứng minh là schisandrol A, schisandrol B và schisandrin B [46]

Ngũ vị tử có khả năng chống lại độc tính của Cisplatin (Cisplatin là một chất chống ung thư mạnh cho các loại khối u khác nhau, tuy nhiên, việc sử dụng lâm sàng của cisplatin thường bị hạn chế do gây độc tính trên thận) Các nghiên cứu đã chứng minh viên nén WZ (WZ, một chế phẩm từ dịch chiết ethanol của Ngũ vị tử

nam Schisandra sphenanthera) làm giảm độc tính do cisplatin gây ra ở tế bào biểu

mô thận HK-2 và ở chuột WZ có tác dụng bảo vệ thận trước độc tính của cisplatin bằng các kích hoạt phản ứng bảo vệ qua trung gian Nrf2, và điều này có tầm quan trọng đáng kể trong việc điều trị tổn thương thận gây bởi cisplatin trên lâm sàng [4]

Cao chiết cồn từ Ngũ vị tử nam Schisandra sphenanthera có tác dụng bảo vệ

chống ứ mật gây bởi acid lithocholic, một phần do kích hoạt con đường PXR và

thúc đẩy tái tạo gan [51] Schisandrol B được phân lập từ Ngũ vị tử Schisandra sphenanthera có tác dụng bảo vệ gan trong tổn thương gan do acetaminophen

(APAP) gây ra thông qua việc kích hoạt con đường NRF2/ARE và điều hòa các gen đích NRF2, giúp gan giải độc và tăng khả năng chống oxy hóa [29]

1.2 Tổng quan về lignan

Lignan là một nhóm các hợp chất diphenol được tìm thấy trong nhiều loài thực vật, các loại ngũ cốc, trong trà, cà phê và rượu Trong thực vật, lignan tồn tại chủ yếu ở thành tế bảo và mô, trong khi đó với ngũ cốc, lignan được tìm thấy nhiều

ở lớp vỏ cám Lignan đã được chứng minh là có nhiều tác dụng sinh học đối với động vật nói chung và con người nói riêng như khả năng chống oxy hóa, giải độc, chống hạ huyết áp, kháng virut, khả năng ức chế sự phát triển của các khối u và ngăn ngừa ung thư [14, 20, 43],…

Lignan là thành phần chính trong quả của các cây họ Ngũ vị (Schisandraceae) bao gồm cả Ngũ vị tử (Schisandra) Trong những năm gần đây đã

có gần 60 hợp chất lignan được chiết tách từ quả của cây Ngũ vị tử bắc (Schisandra chinensis) và Ngũ vị tử nam (Schisandra sphenanthera)[34] (Chi tiết trong Bảng 7

–Phụ lục) Trong số đó 3 lignan Schisandrin, Gomisin B và Schisandrin A là 3 hợp

chất xuất hiện ở cả 2 loài Schisandra chinensis và Schisandra sphenanthera (2 loài

Ngũ vị tử được tìm thấy ở Việt Nam) và được coi là chất đánh dấu cho 2 loài ngũ vị

tử kể trên [21, 22, 37-39] Vì vậy nghiên cứu này lựa chọn 3 lignan Schisandrin, Gomisin B và Schisandrin A để phát triển phương pháp phân tích và dự đoán đồng thời nồng độ của ba lignan này trong mẫu Ngũ vị tử ở Việt Nam nói chung và mẫu Ngũ vị tử tìm thấy tại núi Ngọc Linh nói riêng

Các thông tin về công thức phân tử, công thức cấu tạo, khối lượng phân tử, tính chất vật lý chung của Schisandrin, Gomisin B và Schisndrin A được trình bày trong Bảng 1.1

Bảng 1 1 Thông tin chung của một số lignan có trong Ngũ vị tử

-Trạng thái tồn tại:

dạng rắn màu trắng tới vàng nâu

2

Gomisin B (tên khác

schisantherin B)

-CTPT: C28H34O9-KLPT: 514,2 g/mol

-Trạng thái tồn tại:

dạng rắn màu trắng tới trắng ngà

-λmax =219 nm, 254

nm

-Nhiệt độ sôi: 638.6±55.0 °C

- Nhiệt độ nóng chảy: 99°C

97 pKa: 13.54±0.60 -Độ tan:

+ Trong DMSO: 80 mg/mL; + Trong Ethanol: 13 mg/mL

-Trạng thái tồn tại:

chất rắn màu trắng tới trắng ngà

+ Trong DMSO: ≥43.3 mg/mL;

+ Trong ethanol: ≥15.5 mg/mL

1.2.1 Schisandrin

Về tác dụng sinh học, schisandrin đã được chứng minh có tác dụng chống

xơ gan: các yếu tố tăng trưởng chuyển đổi (TGF)-β1 đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo ra EMT ở tế bào gan, 1 nguyên nhân gây ra bệnh xơ gan Sự ức chế TGF-β1 làm ức chế sự tổng hợp EMT giúp ngăn ngừa xơ gan Theo Park J.H và các cộng sự, schisandrin ức chế hoạt động tiền xơ hóa pro-fibrotic) của TGF-β1 trong tế bào AML12 do đó ngăn chặn sự tích tụ của các protein ECM Sự ức chế EMT của schisandrin được đánh giá bằng biểu hiện giảm vimentin và fibronectin,

và tăng E-cadherin và ZO-1 trong tế bào AML12 gây ra bởi TGF-β Schisandrin còn làm giảm sự phosphoryl hóa gây ra bởi TGF-β1 do đó làm giảm nguy cơ gây xơ gan [31] Bên cạnh đó, schisandrin còn được biết đến với các tác dụng khác như: tác

dụng cải thiện trí nhớ nhờ cơ chế chống oxy hóa [23], tác dụng chống viêm [32], tác dụng chống hen xuyễn [28]

1.2.2 Gomisin B

Về tác dụng sinh học, gomisin B đã được chứng minh có tác dụng chống viêm gan: theo nghiên cứu của Ming-Der Wu, các hợp chất gomisin B, G, (+)-gomisin K3 có tác dụng chống lại vius viêm gan B qua các xét nghiệm trên kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (anti-HBsAg) và kháng nguyên e (anti-HBeAg) [49]

Ngoài ra, gomisin B có tác dụng diệt côn trùng: gomisin B ở nồng độ 0,031 μmol/mL gây chết 50% LC50 theo hướng dẫn xét nghiệm sinh học của Drosophila melanogaster Meigen [35]

1.2.3 Schisandrin A

Về tác dụng sinh học, schisandrin A được chứng minh có tác dụng chống viêm [44] Ngoài ra, hợp chất schisandrin A còn có tác dụng bảo vệ gan Nghiên cứu của Mi Ji Jeong và cộng sự cho thấy việc bổ sung schisandrin A làm giảm đáng

kể nồng độ acid béo tự do và triglyceride trong huyết tương, trong khi đó mức cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao trong huyết tương HDL lại tăng lên ở những con chuột được bổ sung schisandrin A Hàm lượng acid béo tự do trong gan, chất

b o trung tính và hàm lượng cholesterol, cũng như sự tích lũy lipid ở gan, thấp hơn

rõ rệt ở nhóm sử dụng schisandrin A so với nhóm đối chứng Hoạt động của các enzyme gan liên quan đến tổng hợp acid b o và triglycerid đã giảm đáng kể khi bổ sung schisandrin A Ngoài ra, schisandrin A làm giảm đáng kể quá trình oxy hóa gan, giúp tăng hoạt động của các enzyme chống oxy hóa gan [25]

Nghiên cứu của nhóm tác giả Ye Lu cho thấy rằng, schisandrin A có thể bảo

vệ gan do tổn thương cấp tính bởi D-galactosamin Nồng độ aspartate transferase AST và alanine transaminase ALT trong nhóm dùng schisanrin A đã giảm đáng kể so với những người trong nhóm được điều trị bằng D-GalN [31] 1.3 Các phương pháp phân tích lignan trong Ngũ vị tử

amino-1.3.1 Các chuyên luận Dược điển

Dược điển là tài liệu thường được các đơn vị nghiên cứu, kiểm nghiệm và sản xuất áp dụng để kiểm tra, đánh giá chất lượng dược liệu Dược liệu Ngũ vị tử được qui định trong một số chuyên luận Dược điển như Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam

Dược điển Việt Nam V 2017 có qui định chuyên luận Ngũ vị tử (Fructus Schisandra chinensis) gồm một số chỉ tiêu để kiểm tra chất lượng dược liệu: mô tả,

vi phẫu, soi bột, tạp chất, chất chiết được, tỉ lệ vụn nát, định tính bằng phương pháp TLC với chất đối chiếu là deoxyschisandrin schisandrin A Tuy nhiên, chưa có chỉ tiêu định lượng hoạt chất để kiểm tra chất lượng dược liệu Ngũ vị tử [3]

Dược điển Trung Quốc (2015) có qui dịnh 2 chuyên luận riêng cho 2 loài Ngũ vị tử nam và Ngũ vị tử bắc DĐTQ sử dụng chỉ tiêu định tính bằng phương

pháp TLC với chất đánh dấu là schisandrin A cho Ngũ vị tử bắc Schisandra chinensis và anwuligan cho Ngũ vị tử nam Schisandra sphenanthera[38, 39] Đối

với chỉ tiêu định lượng hoạt chất, quy định schisandrin trong Ngũ vị tử bắc Schisandra chinensis không được thấp hơn 0,4%, quy định hàm lượng schisantherin

A Ngũ vị tử nam Schisandra sphenanthera không được thấp hơn 0,2% Cả 02

chuyên luận đều được tiến hành bằng phương pháp HPLC-UV

Giống như DĐTQ, Dược điển Hồng Kông cũng qui định riêng đối với 2 loài Ngũ vị tử Đối với chỉ tiêu định tính bằng phương pháp TLC, chất đánh dấu là

schisandrin A và schisandrin B đối với Ngũ vị tử bắc Schisandra chinensis; schisandrin A và schisantherin A đối với Ngũ vị tử nam Schisandra sphenanthera

Đối với chỉ tiêu định lượng hoạt chất, quy định hàm lượng schisandrin và

schisandrin B trong Ngũ vị tử bắc Schisandra chinensis không được thấp hơn 0,65%, đối với Ngũ vị tử nam Schisandra sphenanthera quy định hàm lượng

schisantherin A và schisandrin A không được thấp hơn 0,67% [21, 22]

1.3.2 Các nghiên cứu về phân tích Ngũ vị tử trong thực tế

1.3.2.1 Phương pháp định tính

TLC là phương pháp phổ biến để định tính dược liệu nói chung và dược liệu Ngũ vị tử nói riêng Các hợp chất lignan nhóm dibenzocyclooatadien là những thành phần chính của Ngũ vị tử, những hợp chất này đã được chứng minh về tác

dụng sinh học cho thấy có nhiều lợi ích đối với sức khỏe con người nên chúng thường được lựa chọn làm các chất đánh dấu hóa học trong định tính Ngũ vị tử

Một số nghiên cứu về phân tích định tính bằng phương pháp TLC các lignan

trong Ngũ vị tử loài Schisandra sphenanthera và Schisandra chinensis đã được báo

cáo trước đây phần lớn sử dụng Silicagel F254 làm pha tĩnh và quan sát ở ánh sáng

UV 254nm [21, 38, 47] Về pha động, DĐHK và DĐTQ đều sử dụng petroleum ether (30-60o) và hỗn hợp ethyl acetat cùng acid formic theo tỉ lệ 15:5:1 về thể tích [21, 38] Trong một nghiên cứu vào năm 2010 của mình, Wei và các cộng sự đã sử dụng một hỗn hợp dung môi pha động khác là Toluen- ethyl acetat với tỉ lệ 70:30 về thể tích [47]

1.3.2.2 Phương pháp định lượng

Đối với các nền mẫu phức tạp nói chung và nền mẫu dược phẩm nói riêng, trong những năm gần đây, các phương pháp sắc ký được chú ý và nghiên cứu nhiều hơn cả bởi độ chọn lọc và độ chính xác cao

Các hợp chất lignan trong NVT là những chất có khả năng hấp thụ mạnh ánh sáng vùng tử ngoại, vì vậy phương pháp HPLC kết nối với detector UV-PMT hoặc DAD là phương pháp phổ biến dung trong phân tích định lượng các lignan trong các loài Ngũ vị tử Ngoài ra, một số phương pháp khác như LC-MS/MS, HPTLC hay điện di mao quản cũng được nghiên cứu và áp dụng Các nghiên cứu này phần lớn đều sử dụng phương pháp chiết siêu âm với dung môi là ethanol hoặc methanol Với các phương pháp sắc ký lỏng, pha tĩnh được sử dụng đa số là cột tách C18, pha động là hỗn hợp nước và ACN với chế độ rửa giải gradient

Các nghiên cứu cụ thể về định lượng lignan trong Ngũ vị tử được trình bày như trong Bảng 1.2

Bảng 1 2 Một số phương pháp định lượng lignan trong dược liệu Ngũ vị tử

TT PP phân

tích

PP chiết

Dung môi chiết

Điều kiện sắc ký Hoạt chất định lượng TLTK

Pha tĩnh: Eclipse XDB-C18 (4,6×250 mm; 5µm ; Pha động gồm nước chứa 0,1% acid formic và ACN, chế độ rửa giải gradient; tốc độ dòng: 1,0 mL/phút;

bước sóng phát hiện: 230 nm

Schisandrin, Schisandrol B, schisantherin A, schisanhenol, anwulignan, schisandrin A, schisandrin B và schisandrin C trong Ngũ vị

Schisandrin, gomisin A, tigloylgomisin H, gomisin C, gomisin B, schisandrin A, gomisin N, schisandrin C trong Ngũ vị tử bắc

217 nm

Schisandrin, Gomisin J, Schisandrol B, angeloylgomisin H, Gomisin G, schisantherin A, schisantherin B, deoxyschisandrin, γ-schisandrin, schisandrin

B và schisandrin C trong Ngũ vị tử bắc

[24]

4 Siêu EtOH Pha tĩnh: Diamonsil C18 200 x 4,6 deoxyshisandrin, schisandrin trong Ngũ vị tử [53]

tốc độ dòng: 1,0 mL/phút; detector DAD quan sát tại 225 nm; detector khối phổ: chế độ ion hóa dương

schisandrol A, schisandrol B, gomisin G, schisantherin A, schisantherin D, schisanhenol, (+)-anwulignan, deoxyschisandrin, schisandrin B, schisandrin

C, 6-O-benzoylgomisin O và interiotherin A trong Ngũ vị tử nam

độ dòng: 0,8 mL/phút; detector phát hiện: MS/MS chế độ ion hóa dương

Schisandrin, gomisin D, tigloylgomisin H, gomisin J, angeloyl gomisin H, gomisin A, pregomisin, Gomisin C,Gomisin K1, Gomisin K3, Gomisin E, Deoxyschisandrin, gomisin N và schizandrin C

bước sóng λExcitation= 254 nm; λEmission=

Schisandrol A, schisandrol B, schisandrin A, schisandrin B, schisandrin C trong Ngũ vị tử bắc

[50]

Pha tĩnh: Zorbax Eclipse Plus C18 1,8

μm, 100 mm × 2,1 mm Pha động gồm nước và ACN; chế độ rửa giải gradien;

tốc độ dòng: 0,3 mL/phút; detector phát hiện: 220 nm

schisantherin A, schisantherin B, schisandrin

A schisandrol A, schisandrol B, schisandrin, schisandrin B, và schisandrin C trong Ngũ vị

214 nm

schizandrin, schisandrol B, schisantherin A, schisanhenol, anwulignan, deoxyschizandrin, schizandrin B và schizandrin C trong Ngũ vị

tử nam

[49]

1.4 Ứng dụng mô hình máy học để phân tích đồng thời một số chất có dược tính trong dược liệu và các mẫu thực vật

Thống kê đa biến được ứng dụng trong hóa phân tích để qui hoạch thực nghiệm, tối ưu hoá các thông tin hoá học trích ra từ tập số liệu phân tích và đưa ra tối đa những thông tin hữu ích từ tập số liệu ban đầu nhằm thiết lập một mô hình thống kê liên hệ giữa các biến tìm được bởi thực nghiệm với nhau cũng như giữa các biến này với những kết luận định tính và định lượng của mẫu Bằng các dữ liệu

về thành phần hóa học của mẫu phân tích, các phương pháp thống kê đa biến sẽ tìm

ra điểm giống nhau và khác nhau giữa các mẫu, từ đó phân loại chúng vào các nhóm khác nhau Với một mẫu bất kỳ chưa biết ta hoàn toàn có thể nhận dạng chúng xem chúng thuộc nhóm nào trong các nhóm đã được phân loại mà không cần biết thông tin về thành phần hóa học của mẫu phân tích [8, 12, 45, 53]

Các phương pháp sắc ký đã cho thấy sự hiệu quả trong việc phân tích các lignan nói chung trong Ngũ vị tử với độ chọn lọc và chính xác tuyệt vời Tuy vậy, nhược điểm của phương pháp này là chi phí cao, thao tác phức tạp cũng như thời gian phân tích lâu Vì vậy, trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển bùng

nổ của các thuật toán đa biến cùng trí tuệ nhân tạo, đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng việc học máy vào nghiên cứu để phân tích định lượng đồng thời một cách nhanh chóng và đơn giản hơn

Dựa trên tính mới mẻ và hiệu quả tuyệt vời của việc ứng dụng học máy vào phân tích đồng thời các hợp chất có trong các nền mẫu phức tạp, gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp này vào các đối tượng mẫu nhất định khác nhau Các phương pháp cung cấp bộ số liệu để xây dựng mô hình máy học hầu hết đều là những phương pháp hiện đại cung cấp dữ liệu đầu vào là phổ toàn phần với thao tác đơn giản, thời gian phân tích nhanh và ít sử dụng tới hóa chất như UV-Vis, IR (sử dụng kết hợp với thuật toán đa biến targeted như PCR, PLS, ) hay NMR, LC-MS/MS (sử dụng kết hợp với thuật toán đa biến non-targeted như ANN ,…, hoặc dữ liệu đầu vào là tín hiệu gián đoạn (nồng độ các chất phân tích trong chất như AAS, ICP-MS, ICP-OES,…

Với đối tượng là các mẫu dược phẩm và huyết tương, năm 2014 nhóm nghiên cứu của Mohsen Shahlaei đã phát triểu phương pháp xác định đồng thời hàm lượng acetaminophen (AMP) và codeine (COD) bằng ph p đo UV-Vis kết hợp với thuật toán thống kê PCA và mạng nơ ron nhân tạo ANN Mô hình ANN được tối ưu với 6 PC đầu vào và 5 nơ ron trong lớp ẩn Kết quả xác định đồng AMP và COD trong mẫu thực bằng mô hình đã đào tạo sau đó được đối chứng với kết quả thu được từ phương pháp tiêu chuẩn HPLC tuy rằng kết quả thu được từ phương pháp HPLC tốt hơn nhưng sự khác biệt là không đáng kể [42]

Năm 2006, Ali Reza Khanchi và các cộng sự đã sử dụng phương pháp Vis kết hợp với mạng thần kinh nhân tạo ANN để dự đoán nồng độ của các methylxanthines (caffeine, theobromine) trong bốn mẫu trà của Iran Sau đó, sử dụng phương pháp HPLC để đánh giá phương pháp đã xây dựng Nghiên cứu xây dựng ma trận tín trong khoảng 230-300nm với bước nhảy là 1nm Kết quả của phương pháp cho thấy độ tin cậy cao với căn bậc hai của bình phương tổng sai số trung bình (RMSE) của caffeine và theobromine lần lượt là 0,5 và 0,16 [26]

UV-Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Huế đã nghiên cứu định lượng đồng thời một số chất thuộc nhóm methylxanthines trong mẫu chè xanh Việt Nam trên cùng một cơ sở dữ liệu phổ Uv-Vis Các thuật toán PCR, PLS, ANN đã được nghiên cứu sử dụng kết hợp với dữ liệu thu được từ phương pháp UV-Vis để định lượng đồng thời cafein, theobromin, theophyllin trong 50 mẫu chè xanh Kết quả định lượng thu được được đối chứng với phương pháp HPLC và cho kết quả với độ lệch tương đối dưới 10% [6]

Qua tổng quan, có thể thấy phương pháp HPLC là kỹ thuật đang được sử dụng phổ biến nhất để định lượng các lignan có trong Ngũ vị tử Vì vậy, nghiên cứu này phát triển và tối ưu phương pháp HPLC-DAD thành phương pháp chuẩn để đối chứng Kết quả phân tích hàm lượng ba lignan (Schisandra, Schisandra A và Gomisin B) trong 26 mẫu Ngũ vị tử bằng HPLC-DAD sẽ được dùng làm cơ sở dữ liệu để kiểm tra độ chính xác của mô hình máy học đã xây dựng được

Một số nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng các phương pháp học máy đã được ứng dụng kết hợp với các ph p đo hiện đại để phân tích đồng thời một loạt các

chất có dược tính trên các nền mẫu thực vật đem lại hiệu quả khá cao và khả thi với các đặc điểm ưu việt là giá thành rẻ, đơn giản, thời gian chuẩn bị mẫu cũng như phân tích nhanh Trong đó, UV-Vis là phương pháp được sử dụng khá nhiều để kết hợp với các thuật toán đa biến với các chất phân tích có khả năng hấp thụ quang do đặc điểm dễ dàng tiếp cận và sử dụng, giá thành rẻ cũng như thao tác nhanh chóng đơn giản Tuy vậy, vẫn chưa có nghiên cứu nào trước đây ứng dụng các ph p đo hiện đại nói chung và UV-Vis nói riêng kết hợp với học máy để phân tích đồng thời các lignan cụ thể là schisandrin, schisandrin A và gomisin B trong Ngũ vị tử Đây chính là cơ sở để nghiên cứu này phát triển phương pháp định lượng đồng thời 3 lignan trên trong mẫu Ngũ vị tử dựa vào phổ UV-Vis kết hợp với mạng nơron nhân tạo ANN, kết quả thu được sau đó được đối chiếu với phương pháp HPLC-DAD để đánh giá độ chính xác cũng như hiệu quả của phương pháp nghiên cứu

1.5 Ứng dụng thống kê đa biến trong nhận dạng Ngũ vị tử theo nguồn gốc địa lý

Hiện nay có nhiều phương pháp phân tích thích hợp cung cấp bộ số liệu phổ toàn phần và gián đoạn (chỉ cung cấp nồng độ chất phân tích) cho việc xây dựng các

mô hình thuật toán để xác định và dự đoán nguồn gốc các mẫu với nhiều ưu nhược điểm khác nhau và thích hợp với từng đối tượng mẫu khác nhau Rất nhiều nghiên cứu về phân loại mẫu dựa vào bộ số liệu phổ toàn phần kết hợp thuật toán thống kê

đã được nghiên cứu trên các đối tượng mẫu thực vật Ví dụ đối với mẫu chè, các phương pháp như NMR kết hợp PCA và DA [27], IR kết hợp thuật toán SIMCA và

PLS-DA[18], UV-Vis kết hợp PCA-ANN[17],… Chứng minh việc sử dụng thuật

toán đa biến kết hợp với các phổ toàn phần trong việc phân loại và dự đoán nguồn gốc của các đối tượng mẫu thực vật là hoàn toàn khả thi

Đối với mẫu Ngũ vị tử, hiện nay phần lớn các nghiên cứu đều sử dụng dữ liệu đầu vào là phổ toàn phần, trong đó IR, UV và sắc ký là hai phương pháp được khai thác để nghiên cứu kết hợp với các thuật toán đa biến

Có thể nói phân loại thực vật bằng phương pháp sử dụng dữ liệu phổ hồng ngoại (IR) là một trong những phương pháp phổ biến nhất vì phổ hồng ngoại chứa nhiều thông tin về các chất, chi phí ph p đo rẻ, thời gian phân tích ngắn, không tốn hóa chất và không cần phải phá hủy mẫu Trong khi đó các phương pháp sắc ký

hiện đại (LC, GC) cung cấp bộ số liệu rõ ràng và đầy đủ về chất và các chất quan trọng được quan tâm trong từng mẫu

Lun Wu và nhóm cộng sự đã nghiên cứu và phân loại Ngũ vị tử các môi trường sống khác nhau dựa vào kết quả của phổ cận hồng ngoại (NIR)[48] Mô hình dựa trên thuật toán Random forest kết hợp mô hình PLS đã được xây dựng dựa trên

bộ số liệu NIR của 161 mẫu Ngũ vị tử thu thập từ các thành phố trên 3 vùng lớn của Trung Quốc (Liao Ning, Jin Lin và Hei Long Jiang), kết quả cho thấy mô hình này

có thể phân biệt chính xác đối với đối tượng này với độ chính xác lên tới 97,47% Sai số bình phương cơ bản của xác nhận chéo (RMSECV) của bộ hiệu chuẩn mô hình tối ưu là 0,0012 và sai số bình phương trung bình của dự đoán RMSEP là 0,0024 Phương pháp cũng được nhóm tác giả đánh giá là có tính ổn định và khả năng ứng dụng tốt để xác định nguồn gốc và đánh giá chất lượng của Ngũ vị tử tại Trung Quốc

Trong một nghiên cứu khác, Zhiyong Guo và cộng sự đã tiến hành phân tích một loạt 22 mẫu ngũ vị tử thuộc hai loại khác nhau bằng phương pháp UPLC-MS

và GC-MS[19] Bộ số liệu sau đó được sử dụng kết hợp thuật toán phân tích thành phần chính PCA để mô tả xu hướng chung của bộ số liệu Bộ số liệu 22 mẫu được chia thành 2 phần: 18 mẫu để dựng mô hình và 4 mẫu để xác nhận lại mô hình Các kết quả xác nhận được nhóm tác giả công bố là chính xác với cả 4 mẫu kiểm tra cho thấy phương pháp là khả thi đối với đối tượng mẫu

Tuy vậy, việc kết hợp dữ liệu phổ toàn phần với các thuật toán, mô hình thống kê đa biến để phân loại và dự đoán nguồn gốc của Ngũ vị tử vẫn chưa được nghiên cứu và khai thác nhiều Trong nghiên cứu này, ngân hàng mẫu chưa đủ để có thể xây dựng một mô hình nhận dạng mẫu dựa vào nguồn gốc địa lý hoàn chỉnh, tuy

vậy chúng tôi bước đầu khảo sát sự phân loại các nhóm mẫu dựa vào thuật toán

phân tích thành phần chính (PCA) để thấy được sự phân tách giữa các nhóm mẫu thu được từ các vị trí địa lý khác nhau, từ đó đánh giá sự khả thi của việc xây dựng

mô hình phân loại Ngũ vị tử dựa vào vị trí địa lý cho các nghiên cứu sau này

2.1.1.1 Chuẩn bị chất chuẩn cho phương pháp HPLC-DAD

Pha dung dịch chuẩn riêng rẽ của từng chất phân tích có nồng độ ấn định 1mg/mL bằng cách cân 5mg mỗi chất chuẩn trên cân phân tích độ chính xác tới 0,00001g rồi định mức trong bình định mức 5mL bằng ethanol

- Dung dịch chuẩn làm việc của từng chất phân tích: tiến hành pha loãng từng dung dịch chuẩn gốc đến nồng độ khoảng 20 µg/mL

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ mỗi chất từ 0,05 - 100 µg/mL

Các dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ 40C, sử dụng ổn định trong 02 tháng

2.1.1.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn để xây dựng mô hình định lượng đồng thời bằng UV-Vis kết hợp ANN

Dung dịch chuẩn gốc riêng từng chất: cân 9,29mg đối với SC; 12,55mg đối với GB và 2,96mg đối với SCA bằng cân phân tích có độ đọc đến 0,01mg Sau đó chuyển lượng đã cân vào bình định mức 25mL, hòa tan chất chuẩn bằng ethanol 99%, sau đó định mức tới vạch định mức bằng ethanol

Các dung dịch chuẩn gốc sau đó được chuyển vào ống falcon và được bảo quản ở nhiệt độ 40C và sử dụng trong vòng một tháng

Các dung dịch chuẩn trung gian và dung dịch đối chiếu trung gian được pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc trong dung môi ethanol 99% Các dung dịch này được pha và sử dụng ngay trong ngày

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (tại viện Dược liệu)

bao gồm: Hệ bơm binary LC-30AD, detector SPD-M20A DAD, hệ thống tiêm mẫu

tự động SIL-30AC, bộ phận ổn nhiệt CTO-10AS của Shimadzu Phần mềm điều khiển Labsolution

- Hệ thống HPTLC của Camag với bộ chấm mẫu Linomat 5, bộ phận khai triển dung môi tự động ADC2, bộ phận chụp kết quả TLC Visualizer 2 Phần mềm điều khiển visionCATS

- Cột sắc ký C18 của hãng Agilent, kích thước cột 250 x 4,6mm, kích thước hạt 5µm

- Thiết bị UV-Vis NIR Hitachi model UH4150 (tại viện Hóa học-Vật liệu, Viện Khoa học Công nghệ Quân sự): Dải bước sóng 175-3300 nm, bộ đơn sắc

chính: Bộ đơn sắc Czerny-Turner sử dụng Cách tử nhiễu xạ; sử dụng đèn Deuterium và đèn Halogen-Tungsten 50W; phần mềm xử lý dữ liệu: OS trên windows 7 Professional

- Cuvet thạch anh d=1cm

- Bản mỏng TLC Si 60 F254 (Merck)

- Bộ chiết hồi lưu

- Bếp cách thủy Memmert, WB – 14 LO)

- Cân phân tích Mettler Toledo , độ chính xác 0,00001 g

- Cân phân tích Mettler Toledo , độ chính xác 0,0001 g

- Cân kỹ thuật điện tử Ohaus độ chính xác 0,01 g

- Tủ sấy Memmert, ULM 500

- Cân xác định độ ẩm Sartorius, MA – 45)

- Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen, Universal – 320)

- Máy rung siêu âm

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Thông tin mẫu

Mẫu dùng cho nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích là 36 mẫu dược liệu Ngũ vị tử được thu thập từ 4 địa điểm khác nhau (núi Ngọc Linh, Việt Nam, Nam Trung Quốc, Bắc Trung Quốc và mẫu thị trường) Mẫu nghiên cứu được rửa sạch, sấy khô ở 55oC, bảo quản trong túi bóng kín ở nơi khô ráo thoáng mát

Mẫu được lưu tại Phòng lưu mẫu, khoa Hoá Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

Thông tin cụ thể của các mẫu được trình bày dưới bảng 2.1

Hình 2 1 Hình ảnh mẫu dược liệu Ngũ vị tử dùng cho nghiên cứu

Bảng 2 1 Thông tin bộ mẫu dùng để phát triển các phương pháp nghiên cứu STT Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu STT Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu

1 M2 Núi Ngọc Linh 19 M25 Núi Ngọc Linh

2 M3 Núi Ngọc Linh 20 M26 Núi Ngọc Linh

3 M4 Núi Ngọc Linh 21 M27 Mẫu thị trường

4 M5 Núi Ngọc Linh 22 M28 Mẫu thị trường

5 M6 Núi Ngọc Linh 23 M30 Mẫu thị trường

6 M7 Núi Ngọc Linh 24 M31 Mẫu thị trường

7 M8 Núi Ngọc Linh 25 M22 Lai Châu

8 M9 Núi Ngọc Linh 26 M23 Lai Châu

9 M10 Núi Ngọc Linh 27 M24 Lai Châu

10 M11 Núi Ngọc Linh 28 M1 Núi Ngọc Linh

11 M12 Núi Ngọc Linh 29 M16 Bắc Trung Quốc

12 M13 Núi Ngọc Linh 30 M19 Nam Trung Quốc

13 M14 Núi Ngọc Linh 31 NVT-01 Núi Ngọc Linh

14 M15 Bắc Trung Quốc 32 NVT-02 Núi Ngọc Linh

*Mẫu STT 1-24: Mẫu phát triển phương pháp dự đoán đồng thời UV/ANN

*Mẫu STT 31-36: Mẫu phát triển phương pháp phân tích định lượng HPLC-DAD

*Mẫu STT 1-20 & 25-30: Mẫu khảo sát xây dựng mô hình phân loại PCA

2.2.2 Tiền xử lý mẫu

Trước khi xử lý mẫu được nghiền nhỏ về dạng bột để dễ dàng cho việc chiết tách với dung môi

Để xây dựng thuật toán phân tích đồng thời nồng độ 3 lignan trong Ngũ vị

tử, 191 mẫu thêm chuẩn từ 24 mẫu Ngũ vị tử đã được phân tích bằng phương pháp HPLC-DAD phát triển trong báo cáo, kết quả định lượng được coi là đối chứng cho phương pháp UV-Vis kết hợp ANN

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp TLC định tính lignan trong Ngũ vị tử

1 giờ, lọc và cô lấy cắn trên bếp cách thủy Hòa tan cắn trong 1,0 mL ethanol

- Quá trình phân tích định tính bằng TLC được triển khai trên pha tĩnh là bản mỏng Si 60 F254 (Merck) với khoảng cách khai triển là 80mm

- Quy trình sắc ký: Chấm riêng biệt 2 µl dung dịch thử, dung dịch chuẩn Sau khi triển khai sắc ký được 8cm, tiến hành quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm 2.3.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động triển khai TLC

Tiến hành khảo sát một số hệ dung môi pha động có các thành phần cấu tử khác nhau Các hệ dung môi pha động khảo sát gồm:

+ Hệ 1: ete dầu hoả – ethyl acetat – acid formic (15:5:1,v/v)

+ Hệ 2: toluen : ethyl acetat : acid acetic (23:6:1, v/v)

+ Hệ 3: n-hexan : ethyl acetat (50:50, v/v)

+ Hệ 4: n-hexan : ethyl acetat : acid formic (50:50:0,5, v/v)

Hệ dung môi được lựa chọn là hệ cho các vết có Rf từ 0,2 - 0,8 Các vết trên sắc ký đồ TLC tách rõ ràng

2.3.1.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định tính bằng TLC

Tiến hành thẩm định phương pháp định tính theo hướng dẫn của AOAC với các tiêu chí độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện [40]

- Độ đặc hiệu: Trên sắc ký đồ TLC, mẫu thử phải cho các vết có cùng màu sắc và giá trị Rf với mẫu chuẩn Mẫu trắng không cho các vết có cùng Rf với mẫu thử và mẫu chuẩn

- Giới hạn phát hiện: Tiến hành sắc ký 1 dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp của

SC, GB và SCA có nồng độ giảm dần Giới hạn phát hiện được xác định tại nồng độ dung dịch chuẩn cho các vết sắc ký vẫn quan sát được bằng mắt thường khi soi dưới ánh sáng UV 254 nm

2.3.2 Nghiên cứu xây dựng phương pháp HPLC-DAD định lượng đồng thời

một số lignan chính trong Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh

2.3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát bước sóng phát hiện: Xác định phổ UV của SC, GB và SCA trên thiết bị HPLC-DAD bằng cách tiến hành sắc ký từng dung dịch chuẩn đơn SC, GB

và SCA để xác định cực đại hấp thụ λmax) Lựa chọn bước sóng tại vị trí cực đại hấp thụ làm bước sóng phát hiện

Khảo sát chương trình pha động: để tiến hành khảo sát pha động tiến hành chuẩn bị dung dịch chuẩn mỗi chất có nồng độ khoảng 25 μg/mL, dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ mỗi chất khoảng 25 μg/mL và dung dịch mẫu thử (mẫu NVT-

05 được sử dụng làm mẫu thử để xây dựng phương pháp trong tất cả các thí nghiệm sau này)

Dung dịch mẫu thử được chuẩn bị với quy trình tham khảo như sau: cân chính xác trên cân phân tích có độ đọc tới 0,0001g khoảng 0,2 g bột dược liệu Ngũ

vị tử đã xay nhỏ, ghi lại khối lượng chính xác, chuyển vào ống ly tâm 50 mL Thêm chính xác 25,00 mL ethanol Cân chính xác khối lượng bình Chiết siêu âm trong 30 phút Để nguội Cân lại ống, thêm ethanol bổ sung khối lượng đã mất Lọc sơ bộ qua giấy lọc thô Lọc dịch qua màng lọc cellulose acetat 0,45 μm thu được dung dịch thử

Các điều kiện sắc ký ban đầu được tiến hành với pha tĩnh là cột C18 (250 x 4,6mm, 5μm của hãng Agilent, pha động với nước ở kênh A và ACN ở kênh B Bước sóng phát hiện được đặt ở 254nm, thể tích tiêm mẫu là 10 μL, nhiệt độ cột

25oC và tốc độ dòng 0,8 mL/ phút

Tiến hành khảo sát chương trình rửa giải gradient với pha động gồm acetonitril (kênh B) phối hợp với nước (kênh A) theo các tỉ lệ khác nhau

Thể tích tiêm mẫu được khảo sát từ 10µl đến 30µl để thu được cường độ tín hiệu chất phân tích lớn nhất cũng như hình dạng cân đối

Các kết quả thu được với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu tR , độ phân giải (RS), và hệ số đối xứng (AS) RS ≥ 1,5; AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 (tối ưu xấp xỉ bằng 1); tR của các chất phân tích không quá dài nhưng phải đảm bảo tách xa nhau

2.3.2.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Khảo sát hai phương pháp chiết: chiết bằng phương pháp siêu âm, phương pháp đun hồi lưu cách thủy

Khảo sát dung môi chiết: Khảo sát các dung môi chiết là hỗn hợp nước – ethanol, nước – methanol với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn được dung môi chiết phù hợp nhất Trên cùng một nền mẫu tiến hành chiết theo quy trình chiết trên với các loại dung môi tỷ lệ khác nhau, mỗi loại tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình

Khảo sát thời gian chiết: 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút

2.3.2.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp HPLC

Sau khi khảo sát quá trình xử lí mẫu và các điều kiện sắc ký, xác định giá trị

sử dụng của phương pháp định lượng SC, GB và SCA trong Ngũ vị tử thu tại núi Ngọc Linh bằng HPLC-DAD theo hướng dẫn của ICH và có tham chiếu theo AOAC [40]

- Tính thích hợp của hệ thống: tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp đã chuẩn bị ở trên Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích píc Tính thích hợp của hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích Yêu cầu các giá trị thời gian lưu, diện tích píc có RSD ≤ 2%

- Độ đặc hiệu của phương pháp: tiến hành phân tích sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp SC, GB và SCA, dung dịch thử Ngũ vị tử và mẫu trắng ethanol với chương trình đã lựa chọn Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích píc Thời gian lưu pic SC, GB và SCA của dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch thử Ngũ vị tử phải tương đương nhau Pic trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các píc khác trong

nền mẫu Tín hiệu pic của chất định phân tích trong nền mẫu thử phải đạt độ tinh khiết pic lớn hơn 0,99

- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):

+ Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được LOD được chấp nhận tại nồng độ

mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3

+ Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp

10 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=10

Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích;

- Độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp:

+ Độ lặp lại: tiến hành thí nghiệm 6 lần với cùng một nồng độ, xác định độ lệch tương đối RSD (%) của hàm lượng

+ Độ tái lặp: bố trí thí nghiệm tương tự phần độ lặp lại của phương pháp nhưng tiến hành vào thời gian khác và phân tích trên cùng hệ thống HPLC Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dược liệu và tính toán độ lệch chuẩn tương đối, theo AOAC yêu cầu RSD ≤ 3,7% đối với chất phân tích có hàm lượng trong mẫu ≥ 0,1%

+ Hiệu suất thu hồi là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết

+ Tiến hành: thêm vào nền mẫu dược liệu Ngũ vị tử đã được xác định hàm lượng hoạt chất) một lượng chính xác chất chuẩn ở các mức 50%,100% và 150% so với hàm lượng SC, GB và SCA có trong mẫu khảo sát

Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức:

Trong đó:

R: độ thu hồi (%)

𝐶𝑡𝑐: Nồng độ (hoặc khối lượng) chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn

Cn: nồng độ (hoặc khối lượng) chất phân tích trong mẫu thử không thêm chuẩn

𝐶𝑥: Nồng độ (hoặc khối lượng) chuẩn thêm vào (theo lý thuyết)

Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng trong khoảng 0,1 – 1 % là: 95,0 – 105,0%

- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): (SD×100)/X

- Tương quan hồi quy tuyến tính: Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích píc sắc ký và nồng độ chất phân tích: Y = aC +b, trong đó a

là hệ số góc (hàm SLOPE); b là hệ số chắn (hàm INTERCEPT); R là hệ số tương quan R (hàm CORREL)

- Hàm lượng SC, GB và SCA trong mẫu thử được tính toán theo công thức:

X % : Hàm lượng của SC, GB và SCA tương ứng

C: Nồng độ SC, GB và SCA tính từ phương trình đường chuẩn (µg/mL) P: Độ tinh khiết của chất chuẩn (%)

Tiến hành chiết các mẫu ngũ vị tử theo quy trình đã được nghiên cứu và tối

ưu như khi phân tích bằng phương pháp HPLC-DAD

Dung dịch chiết của mẫu sau đó được chuyển vào các ống falcon 50mL và được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4oC và được sử dụng trong vòng 2 tháng

2.3.3.2 Chuẩn bị mẫu xây dựng bộ ma trận huấn luyện ANN

Tiến hành thêm chuẩn của 3 chất phân tích với các mức nồng độ khác nhau (từ 0-0.728ppm mỗi chất) vào các dịch chiết mẫu thực thu được 191 mẫu chuẩn với

nồng độ SC, GB và SCA khác nhau dùng để huấn luyện mô hình máy học (chi tiết ở phụ lục bảng 1)

Các mẫu được quét phổ UV-Vis trong khoảng 210-400nm theo các thông số

đã được khảo sát và tối ưu thu được bộ số liệu sử dụng huấn luyện mô hình ANN 2.3.3.3 Xử lý số liệu

Tiến hành đo phổ UV-Vis của 191 mẫu để xây dựng ma trận Kiểm tra độ chính xác của mô hình ANN với 32 mẫu Ngũ vị tử đã biết trước hàm lượng các chất phân tích (phân tích bằng phương pháp HPLC-DAD) Tính sai số của mô hình thông qua đại lượng RMSE căn bậc hai sai số toàn phương trung bình và hệ số R (hệ số tương quan) theo công thức sau:

- Hệ số tương quan R giữa kết quả tìm được theo mô hình ANN (a) và kết quả đã biết theo HPLC-DAD (b) trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra tính theo công thức:

√

- Căn bậc hai của trung bình tổng bình phương sai số (RMSE) giữa kết quả tìm được bằng mô hình ANN (a) so với kết quả xác định được theo phương pháp HPLC (b được tính theo công thức dưới đây cho 2 tập số liệu là mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra:

+ Với mẫu chuẩn:

RMSES= √

Trong đó N là số mẫu chuẩn;

+ Với mẫu kiểm tra:

RMSET= √

Trong đó M là số mẫu kiểm tra;

Sau đó tiến hành phân tích mẫu thực tế dựa trên mô hình đã xây dựng được Khi R tiến gần đến 1 và RMSES, RMSET càng thấp thì kết quả phân tích sẽ càng chính xác

2.3.3.4 Thuật toán đa biến với matlab

Các bước tiến hành phương pháp thống kê đa biến trong Matlab 2019a:

- Khởi động phần mềm Matlab, các cửa sổ chính sẽ hiện lên

- Trong cửa sổ Home chọn New Variable

+ Nhập bộ ma trận số liệu vào tab 1 (X)

+ Tab 2 nhập cột chứa tên mẫu (phải là số) (Y)

-Đặt tên các tab trong cửa sổ Workspace

* Thuật toán ANN

- Khai báo một mô hình ANN bằng câu lệnh sau:

net = fitnet [n1 n2…],'trainFcn' ;

net.trainParam.goal=0.0000000001; +Khai báo sai số tối thiểu

net.trainParam.epochs = 3000; +Khai báo số bước học tối đa

net.trainParam.max_fail=10; +Khai báo số bước overfit chấp nhận

net.divideParam.trainRatio = 80/100; +Chia dữ liệu thành 3 phần

net.divideParam.valRatio = 10/100;

net.divideParam.testRatio = 10/100;

net = train(net,Alearn',Clearn'); + Luyện mạng

trận tín hiệu mà ma trận nồng độ luyện

2.3.4 Bước đầu xây dựng mô hình phân biệt Ngũ vị tử theo vị trí địa lý

2.3.4.1 Chuẩn bị bộ dữ liệu cho mô hình

Dữ liệu để khảo sát mô hình phân biệt Ngũ vị tử theo vị trí địa lý được xây dựng bằng 24 mẫu Ngũ vị tử được thu thập tại 4 địa điểm khác nhau (núi Ngọc Linh, Lai Châu, Bắc Trung Quốc và Nam Trung Quốc) (Chi tiết tại bảng 2.1)

Các mẫu được xử lý theo quy trình xử lý mẫu đã được lựa chọn và tối ưu của phương pháp HPLC-DAD (mục 2.3.1.1 , sau đó được pha loãng 25 lần và tiến hành quét phổ UV-Vis với bước sóng từ 210-400 nm theo các thông số đã được tối ưu hóa như với phương pháp UV-Vis để xây dựng bộ số liệu cho mô hình ANN

2.3.4.2 Thuật toán đa biến với matlab

Trình tự các bước tiến hành phương pháp thống kê đa biến trong Matlab 2019a như sau:

- Khởi động phần mềm Matlab, các cửa sổ chính sẽ hiện lên

- Trong cửa sổ Home chọn New Variable

+ Nhập bộ ma trận số liệu vào tab 1 (X)

+ Tab 2 nhập cột chứa tên mẫu (phải là số) (Y)

-Đặt tên các tab trong cửa sổ Workspace

* Thuật toán PCA

[U,Z]= pca X,’NumComponents’,m ;

Figure; (Xuất hình ảnh biểu đồ)

Scatter Z :,1 ,Z :,2 ,25,Y,’filled’ ;

Colormap(jet) (Chuyển màu các nhóm khác nhau thành

các màu khác nhau để dễ dàng nhận biết)

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp TLC định tính schisandrin, gomisin B

và schisandrin A trong dược liệu Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Tiến hành khảo sát các hệ dung môi pha động khác nhau:

+ Hệ 1: ete dầu hoả – ethyl acetat – acid formic (15:5:1,v/v)

+ Hệ 2: toluen : ethyl acetat : acid acetic (23:6:1, v/v)

+ Hệ 3: n-hexan : ethyl acetat (50:50, v/v)

+ Hệ 4: n-hexan : ethyl acetat : acid formic (50:50:0,5, v/v)

Kết quả thu được như Hình 3.1

Từ sắc ký đồ TLC của 4 hệ dung môi khảo sát cho thấy, các giá trị Rf thu được đều nằm trong khoảng từ 0,2 - 0,8 Với các hệ dung môi có bổ sung thêm acid acetic hoặc acid formic như hệ 1, hệ 2 và hệ 4 cho các vết gọn hơn so với hệ không

bổ sung acid như hệ 3 Tuy nhiên việc bổ sung acid với tỷ lệ lớn, làm cho các vết di chuyển gần nhau hơn, không đảm bảo cho các vết tách khỏi nhau hoàn toàn Hệ 1 tương ứng với điều kiện được áp dụng trong chuyên luận Ngũ vị tử DĐVN V , tuy nhiên ứng với hệ này, vết GB dễ bị xen phủ với các vết khác có trong mẫu Đối với

hệ 4, hiệu quả tách với cả 3 chất định phân SC, GB và SCA tốt hơn Các vết tách rõ nét, có giá trị Rf phù hợp dùng cho phân tích định tính Chính vì vậy, nghiên cứu này lựa chọn hệ dung môi thứ 4 (gồm n-hexan, ethyl acetat và acid formic theo tỉ lệ 50:50:0,5 về thể tích) để tiến hành định tính SC, GB và SCA trong Ngũ vị tử thu tại vùng núi Ngọc Linh