Phát triển kỹ thuật cold pcr và real time pcr lna Để xác Định và sàng lọc nhanh các Đột biến kháng thuốc nucleot(s)ide của hepatitis virus b

Phát triển kỹ thuật cold pcr và real time pcr lna Để xác Định và sàng lọc nhanh các Đột biến kháng thuốc nucleot(s)ide của hepatitis virus b

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Chu Văn Sơn

PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT COLD-PCR VÀ TIME PCR LNA ĐỂ XÁC ĐỊNH VÀ SÀNG LỌC NHANH CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC NUCLEOT(S)IDE CỦA HEPATITIS VIRUS B

REAL-LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Chu Văn Sơn

PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT COLD-PCR VÀ TIME PCR LNA ĐỂ XÁC ĐỊNH VÀ SÀNG LỌC NHANH CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC NUCLEOT(S)IDE CỦA HEPATITIS VIRUS B

REAL-Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh PGS.TS Phùng Thị Bích Thủy

Hà Nội - 2022

i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS

Nguyễn Thị Vân Anh, người thầy đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian định

hướng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học, thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ sự cảm ơn chân thành đến PGS.TS Phùng Thị Bích Thủy,

BSCKII Lê Thị Ngân, và ThS Nguyễn Minh Hằng, đã hỗ trợ và tư vấn cho tôi rất

nhiều trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể quý thầy, cô trong Bộ môn Hoá sinh

và Sinh học phân tử và quý thầy, cô trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập

và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học, Phòng Sau đại học, các thành viên trong nhóm nghiên cứu Phòng Sinh học Nano và Ứng dụng, phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành chương trình học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn đội ngũ cán bộ Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Nhi Trung ương, Bệnh Viện Đa Khoa Xanh Pôn đã hỗ trợ và cung cấp nguồn mẫu bệnh phẩm thực hiện nghiên cứu và các thông tin lâm sàng của bệnh nhân

Luận văn đã được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của Quỹ Phát triển khoa học

và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 108.04-2017.307

Cuối cùng, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, người thân và bạn

bè, những người đã động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi có thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Hà Nội, tháng 12 năm 2022 Học viên cao học

Chu Văn Sơn

ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

viết tắt

Tiếng Anh Tiếng Việt

ADF Adefovir Thuốc Adefovir

ALT Alanine aminotransferase Chỉ số men gan Alanine

aminotransferase AST Aspartate aminotransferase Chỉ số men gan Aspartate

aminotransferase

Bp Base pairs Cặp Bazơ Nitơ

cccDNA Covalently closed circular DNA ADN mạch vòng khép kín

COLD-PCR CO-amplification at Lower

Denaturation

PCR biến tính ở nhiệt độ thấp temperature - PCR

DNA Deoxyribonucleic acid Vật liệu di truyền axit

deoxyribonucleic EC50 Effective Concentration 50 Nồng độ hiệu quả tối đa một nửa EPF End point Fluorescence Tín hiệu huỳnh quang bão hòa ETV Entecavir Thuốc Entecavir

FAM 6-carboxyfluorescein Dye huỳnh quang FAM

HBcAg Hepatitis B Core Antigen Kháng nguyên lõi virus HBV HBeAg Hepatitis B envelope Antigen Kháng nguyên vỏ virus HBV HBsAg Hepatitis B Surface Antigen Kháng nguyên bề mặt virus HBV HBV Hepatitis B Virus Virus viêm gan B

HIV Human Immunodeficiency Virus Virus suy giảm miễn dịch người

HEX 6 - carboxy - 2',4,4',5',7,7' –

hexachlorofluorescein

Dye huỳnh quang HEX

IU (International Unit) Đơn vị đo lường các giá trị của

một chất, dựa trên hoạt độ sinh học có hiệu lực

iii

LMV Lamivudine Thuốc Lamivudine

LdT Telbivudine Thuốc Telbivudine

LNA Lock-Nucleic Acid Nucleotide dạng cầu khóa

MALDI-

ToF

Matrix-assisted laser desorption/ionization- Time of flight

Khối phổ laze đề ion hóa/ion hóa sử dụng chất nền hỗ trợ theo thời gian di chuyển

MGB Minor groove binder Phân tử bám vào rãnh xoắn

nhỏ của DNA

NA Nucleot(s)ide Analogs Cấu trúc tương tự nucleot(s)ide NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới

ORF Open Reading Frame Khung đọc mở

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi

RNA Ribonucleic acid Vật liệu di truyền axit ribonucleic RTase Reverse Transcriptase Enzym phiên mã ngược

TDF Tenofovir dipivoxil Thuốc Tenofovir dipivoxil

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

iv

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về viêm gan B và HBV 3

1.1.1 Viêm gan B 3

1.1.2 Virus viêm gan B 3

1.1.3 Gánh nặng bệnh tật gây ra bởi HBV 7

1.1.4 Chẩn đoán viêm gan B 8

1.1.5 Thuốc điều trị viêm gan B 10

1.2 Đột biến kháng thuốc Nucleos(t)ide của HBV 13

1.2.1 Cơ chế kháng thuốc Nucleos(t)ide của HBV 13

1.2.2 Các loại đột biến kháng thuốc Nucleos(t)ide của HBV 14

1.3 Tình hình kháng thuốc của HBV tại Việt Nam 17

1.3.1 Đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân đang điều trị 17

1.3.2 Đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân chưa điều trị 17

1.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV 18

1.4.1 Polymerase chain reaction (PCR) kết hợp với giải trình tự Sanger 18

1.4.2 Giải trình tự thế hệ mới 18

1.4.3 COLD-PCR kết hợp với giải trình tự Sanger 19

1.4.4 Real time PCR sử dụng đầu dò Taqman LNA 21

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1 Mẫu bệnh phẩm 22

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 22

2.2 Phương pháp 23

2.2.1 Thiết kế mồi nhân đoạn gen RTase của HBV 23

2.2.2 Thiết kế đầu dò LNA phát hiện các đột biến kháng thuốc NA 25

2.2.3 Tạo các mẫu chuẩn chứa trình tự gen kiểu dại và đột biến 25

v

2.2.4 Xây dựng phương pháp COLD-PCR phát hiện đột biến kháng thuốc HBV

27

2.2.5 Xác định độ nhạy của phương pháp COLD-PCR 29

2.2.6 Xây dựng phương pháp real time PCR sử dụng đầu dò Taqman LNA 29

2.2.7 Xác định độ nhạy và giới hạn phát hiện của phương pháp real time PCR sử dụng đầu dò Taqman LNA 30

2.2.8 Đánh giá hiệu quả của phương pháp COLD-PCR và real time PCR Taqman LNA trên mẫu bệnh phẩm 31

2.2.9 Phân tích số liệu thống kê 31

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 Đặc điểm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 32

3.2 Xác định nhiệt độ biến tính giới hạn của phương pháp COLD-PCR 35

3.3 Đánh giá độ nhạy của phương pháp COLD-PCR xác định đột biến kháng thuốc NA 36

3.4 Kết quả sàng lọc đột biến kháng thuốc NA bằng phương pháp COLD-PCR 38 3.5 Thiết kế bộ đầu dò Taqman LNA cho phản ứng real time PCR phát hiện nhanh các đột biến kháng thuốc NA 44

3.6 Đánh giá độ nhạy và giới hạn phát hiện của phương pháp real time PCR Taqman phát hiện các đột biến kháng thuốc NA 47

3.7 Đánh giá khả năng phát hiện đột biến kháng thuốc NA của phương pháp real time PCR Taqman LNA trên mẫu bệnh phẩm 56

KẾT LUẬN 63

KIẾN NGHỊ 64

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN KẾT QUẢ CỦA LUẬN VĂN 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc hạt virion (A) và genome của virus HBV (B) 4 Hình 2 Cấu trúc vùng gene mã hóa enzym HBV Pol và các đột biến phổ biến tương ứng với loại thuốc kháng 5 Hình 3 Sơ đồ mô tả chi tiết chu trình lây nhiễm và nhân lên của virus HBV trong tế bào chủ 7 Hình 4 Tỉ lệ nhiễm HBV trên thế giới trên mọi độ tuổi (A) và ở trẻ dưới 5 tuổi (B) 8 Hình 5 Cấu trúc phân tử các thuốc điển hình loại NA 12 Hình 6 Quy tắc đánh số enzym Polymerase quy định tính kháng thuốc của virus HBV 14 Hình 7 Mô hình minh họa của phản ứng COLD-PCR 20 Hình 8.Kết quả real time PCR SYBR Green xác định Tc 35 Hình 9 Kết quả giải trình tự gen sản phẩm PCR truyền thống và COLD-PCR với khuôn là tỷ lệ pha loãng 1%, 5% và 10% của các plasmid mang các rtA194T (G709T), rtM204I (G741T) và rtN236T (A836C) trong plasmid kiểu dại 37 Hình 10 Biểu đồ tín hiệu khuếch đại bằng phản ứng real time PCR TaqMan LNA thời gian thực để phát hiện đột biến L180M ở nồng độ đầu vào là 5 x 107 IU/ml 48 Hình 11 Biểu đồ đường biểu diễn tín hiệu khuếch đại của phản ứng real time PCR TaqMan LNA phát hiện các đột biến kháng thuốc NA ở các tỷ lệ (% mt/wt) khác nhau 49 Hình 12 Biểu đồ tương quan tuyến tính giữa chu kì ngưỡng và tỷ lệ % mt/wt của các đột biến 50 Hình 13 So sánh kết quả real time PCR Taqman LNA và kết quả COLD-PCR kết hợp giải trình tự gen Sanger ở một số mẫu bệnh 60 Hình 14 Kết quả so sánh trình tự vùng gen chứa vị trí bám của đầu dò V207M (A)

và đầu dò N238T (B) 62

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Danh sách đột biến kháng thuốc NA phổ biến 16

Bảng 2 Trình tự mồi nhân bản vùng gen chứa các đột biến kháng thuốc NA 24

Bảng 3 Thành phần mastermix phản ứng phản ứng PCR 26

Bảng 4.Thành phần phản ứng TOPO TA-Cloning 26

Bảng 5 Thành phần mastermix của phản ứng real time PCR SYBR xác định nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ biến tính tới hạn 28

Bảng 6 Chu trình nhiệt phản ứng COLD-PCR 29

Bảng 7 Thành phần mastermix phản ứng real time PCR Taqman LNA 30

Bảng 8 Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân tham gia nghiên cứu 33

Bảng 9 Chu trình nhiệt phản ứng COLD-PCR hoàn chỉnh 36

Bảng 10 Tần xuất đột biến kháng thuốc NA của các bệnh nhân nhi viêm gan B mạn tính chưa điều trị 40

Bảng 11 Tần xuất đột biến kháng thuốc của các bệnh nhân người lớn viêm gan B mạn tính điều trị NA 42

Bảng 12 Trình tự đầu dò Taqman LNA phát hiện các đột biến kháng thuốc NA của HBV 45

Bảng 13 Endpoint Fluorescence (EPF) và giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) của phản ứng real time PCR phát hiện đột biến NA ở các nồng độ pha loãng -log10 52

Bảng 14 Kết quả sàng lọc đột biến kháng thuốc NA bằng real time PCR Taqman LNA so sánh với kết quả COLD-PCR kết hợp giải trình tự gen 57

1

MỞ ĐẦU

Viêm gan B là một căn bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus viêm gan B (HBV) Đây là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến sơ gan và ung thư gan Theo thống kế của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện có khoảng 2 tỷ người nhiễm HBV trên toàn thế giới

và khoảng 296 triệu người mắc viêm gan B mạn tính Ước tính năm 2019, mỗi năm

có khoảng 1,5 triệu ca mắc mới và các biến chứng của viêm gan virus B là nguyên nhân gây ra 820.000 ca tử vong trên toàn thế giới trong đó chủ yếu là sơ gan và ung thư gan [70] Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao, ước tính khoảng 8-25% dân

số [26]

Điều trị viêm gan B mạn tính, hiện có 2 nhóm thuốc được cấp phép sử dụng

để ức chế sự nhân lên của virus và hạn chế tổn thương gan trong lúc cơ thể hình thành miễn dịch với virus là nhóm thuốc dạng tiêm như Pegylated inteferon alfa-2a hoặc Interferon alfa-2b, và nhóm thuốc dạng uống có cấu trúc tương tự nucleot(s)ide (NA), gồm 5 loại: Lamivudine (LMV), Telbivudine (LdT), Adefovir (ADF), Tenofovir (TDF), và Entecavir (ETV) [36] So sánh giữa 2 nhóm thuốc nói trên, nhóm thuốc dạng tiêm vừa có khả năng ức chế virus vừa bổ trợ miễn dịch, tuy nhiên có tỉ lệ đáp ứng thấp hơn, giá thành cao hơn và có nhiều tác dụng phụ hơn so với nhóm thuốc NA [30] Nhóm thuốc NA mặc dù có tỉ lệ đáp ứng cao hơn, nhưng lại có hiệu quả giảm dần theo quá trình điều trị do xuất hiện tính kháng thuốc của HBV Sự kháng thuốc của HBV phát sinh do một số đột biến trong vùng gen mã hóa enzym phiên mã ngược (RTase, là đích tấn công của thuốc NA) làm giảm ái lực của thuốc NA với enzym RTase Do đó, việc sử dụng thuốc NA đóng vai trò như tác nhân chọn lọc với các chủng virus có khả năng kháng thuốc, khả năng kháng thuốc của quần thể virus tăng nhanh và tương ứng với thời gian sử dụng thuốc Những bệnh nhân này nếu không lựa chọn loại thuốc kháng virus phù hợp thì khả năng thất bại điều trị, đồng thời còn

có thể kéo theo tình trạng kháng chéo Bởi vậy, xác định sớm xu hướng kháng thuốc trước và trong quá trình điều trị viêm gan B là một trong những yếu tố quyết định tới hiệu quả của toàn bộ quá trình điều trị

2

Nhiều kỹ thuật sinh học đã được phát triển để ứng dụng xác định đột biến kháng thuốc ở HBV, phương pháp PCR vùng gen mã hóa enzym RTase HBV kết hợp giải trình tự Sanger được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong xác định đột biến kháng thuốc của HBV Đồng thời, kỹ thuật này cho phép xác định các đột biến mới, các đột biến

“tiềm năng” trong quần thể Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp là độ nhạy thấp, khoảng 10 – 20% đột biến/quần thể [36] Do đó, khả năng ứng dụng trong chẩn đoán sớm không cao Phương pháp MALDI-ToF và giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing- NGS có độ nhạy cao, tuy nhiên yêu cầu máy móc và trang thiết bị đắt tiền nên khó áp dụng cho chẩn đoán [36] Một số nhóm nghiên cứu

đã phát triển những phương pháp cải tiến để khắc phục những hạn chế của các phương pháp trên như phương pháp real time PCR Taqman probe có ưu điểm đơn giản và có

độ nhạy cao (1-5% đột biến/quần thể) [17,45] Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu này chỉ tập trung vào một vài đột biến kháng thuốc, phổ đột biến còn hạn chế nên chưa bao phủ được những đột biến đang lưu hành hiện nay ở Việt Nam

Do đó, tôi thực hiện đề tài: “Phát triển kỹ thuật COLD-PCR và real time

PCR LNA để xác định và sàng lọc nhanh các đột biến kháng thuốc Nucleot(s)ide của Hepatitis virus B”

Với những mục tiêu chính như sau:

- Phát triển kỹ thuật COLD-PCR có độ nhạy cao để xác định phổ đột biến và các đột biến mới/tiềm năng liên quan đến tính kháng thuốc NA của HBV

- Phát triển kỹ thuật real time PCR LNA có độ nhạy cao để sàng lọc nhanh, phát hiện sớm các đột biến kháng thuốc NA của HBV, ứng dụng xác định sớm xu hướng kháng thuốc, hỗ trợ bác sĩ lâm sàng lựa chọn liệu pháp điều trị hiệu quả cho bệnh nhân viêm gan B mạn tính

3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về viêm gan B và HBV

1.1.1 Viêm gan B

Viêm gan B là một bệnh nhiễm trùng phổ biến trên toàn thế giới do HBV gây

ra Nó có thể gây nhiễm trùng mạn tính và có nguy cơ cao dẫn đến tử vong do xơ gan

và ung thư gan [70] Nhiễm trùng mạn tính được đặc trưng bởi sự tồn tại của kháng nguyên HBsAg trong ít nhất 6 tháng (có hoặc không có đồng thời HBeAg) Sự tồn tại dai dẳng của HBsAg là dấu hiệu chính của nguy cơ phát triển bệnh viêm gan mạn tính và ung thư biểu mô tế bào gan về sau Theo hướng dẫn Bộ Y tế 2014, viêm gan

B mạn tính được xác định khi có HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti HBc IgG (+), AST, ALT tăng từng đợt hoặc liên tục trên 6 tháng, có bằng chứng tổn thương

mô bệnh học tiến triển, xơ gan (được xác định bằng sinh thiết gan hoặc đo độ đàn hồi gan hoặc Fibrotest hoặc chỉ số Aspartate aminotransferase-to-Platelet Ratio Index (APRI)) mà không do căn nguyên khác

1.1.2 Virus viêm gan B

1.1.2.1 Hệ gen virus

HBV là virus điển hình thuộc phân họ Hepadnaviridae (nhóm virus tấn công

tế bào gan (hepa-) và genome DNA (-dna)) Hạt virus (virion) HBV dạng khối cầu có đường kính 42 nm, bao gồm lớp vỏ ngoài lipid và hạt nucleocapsid dạng khối đa diện

20 mặt, kích thước 27 nm, chứa genome và các protein virus [44] Lớp vỏ ngoài virus được cấu thành bởi lớp phospholipid từ tế bào gan, và các glycoproteins của virus (HBsAg) Sau đó là lớp lõi virus, gồm các proteins lõi (HBcAg) Trong cùng là capsid của HBV, gồm genome virus ở dạng sợi đôi không hoàn chỉnh và protein Polymerase (P protein) Cấu trúc của lõi (core) của HBV là một DNA mạch đôi không khép kín, với trọng lượng phân tử 2×106 dalton, có kích thước khoảng 3,2 kb, gồm ba khung

mã hóa và có bốn khung đọc mở khác nhau (ORF), mã hóa cho polymerase của virus, kháng nguyên HBc và HBe, protein điều hòa HBx và gen mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt của virus (LHBs, MHBs và SHBs)

4

Hình 1 Cấu trúc hạt virion (A) và genome của virus HBV (B) [77]

Khung đọc mở Surface protein (S) mã hóa cho các protein bề mặt, là các kháng nguyên của HBV và có thể chia theo cấu trúc và chức năng thành các gen pre-S1, pre-S2 và gen S Gen S: Mã hóa cho protein chính Gen S và preS2 mã hóa loại protein trung bình (M) Gen S, preS1 và preS2 mã hóa protein lớn (L) của vỏ ngoài chứa 390 acide amine, tham gia vào việc gắn virus vào tế bào gan, lắp ráp virion và

giải phóng virus ra khỏi tế bào

Khung đọc mở Core protein (C): gồm gen C và preC Gen C mã hóa cho protein lớn của lõi gồm 138 acid amin, có khả năng gắn kết với acid nucleic, tham

gia vào quá trình lắp ráp virus

Khung đọc mở X protein (X): là gen có kích thước nhỏ nhất, mã hóa cho hai protein tham gia vào các giai đoạn phiên mã và sao chép trong quá trình nhân đôi của

HBV, ngoài ra chúng còn đóng vai trò chủ yếu trong sự phát triển thành ung thư gan

Khung đọc mở Polymerase protein (P): Gen P chiếm ¾ bộ gen của virus, gối lên phần cuối gen C, phần đầu gen X và toàn bộ gen S Gen P mã hóa một polypeptide chứa 832 acid amin rất giàu histidine, trọng lượng phân tử khoảng 90 kD, có hoạt tính

DNA polymerase và enzym phiên mã ngược (DNA polymerase phụ thuộc RNA)

5

Trong các khung đọc mở của virus HBV, khung đọc mở liên quan trực tiếp tới tính kháng thuốc của virus là khung đọc mở P mã hóa cho enzym HBV polymerase [77] Khung đọc mở này bao gồm 4 vùng, tương ứng với 4 vùng chức năng của enzym, bao gồm: terminal protein, spacer, POL/RT, và Rnase H Vùng POL/RT thực hiện chức năng polymerase và phiên mã ngược, gồm 7 domains: A, B, C, D, E, G (I),

và F (II)

Hình 2 Cấu trúc vùng gene mã hóa enzym HBV Pol và các đột biến phổ biến

tương ứng với loại thuốc kháng [65]

1.1.2.2 Vòng đời và cơ chế lây nhiễm của virus

Chu trình xâm nhập và nhân lên của virus tả tóm tắt các bước như sau:

1) Virus nhận biết và bám vào các phân tử HSPG (heparan sulfate proteoglycans) trên thành tế bào gan Liên kết này có thể bị đảo ngược 2) Virus bám vào tế bào chủ qua một loại thụ thể đặc hiệu với preS1

6

3) Có hai con đường virus xâm nhập vào tế bào: qua nhập bào, sau đó giải phóng nhân khỏi lớp vỏ nhân qua các bóng nội bào; hòa trộn vỏ virus từ màng tế bào

4) Virus giải phóng nhân virus chứa hệ gen đã gắn với polymerase của nó vào

8) Hình thành cấu trúc cccDNA Phân tử cccDNA được tổ chức thành một cấu trúc giống với các sợi chromatin của tế bào chủ

9) Phiên mã

10) Toàn bộ các mRNA của virus đều chứa một vùng trình tự polyA Các mRNA này đều được vận chuyển ra tế bào chất bởi các cơ quan của tế bào chủ

11) Dịch mã các protein cấu trúc, polymerase và các protein bỏ của virus

12) Đóng gói vỏ nhân virus

13) Phiên mã ngược trên vùng pregenomic RNA và hoàn thiện hệ gen trưởng thành của virus trong vỏ nhân Toàn bộ quá trình hình thành nhân của virus diễn ra trong chất tế bào

14) Nhân virus có thể bám ngược trở lại nhân tế bào để tiếp tục quá trình tạo ra các cccDNA (bước 7 – 13) để tạo thêm các nhân virus mới hoặc được đóng

vỏ để giải phóng ra khỏi tế bào chủ Quá trình đóng vỏ tạo thành hạt virus hoàn chỉnh diễn ra và tận dụng màng lưới nội nhất của tế bào chủ

7

15) Thực nghiệm cho thấy, đa phần các cccDNA trong tế bào bị nhiễm là được tạo mới Số lượng cccDNA có thể đến 50 cccDNA trên một tế bào, tùy thuộc vào loài

Hình 3 Sơ đồ mô tả chi tiết chu trình lây nhiễm và nhân lên của virus HBV

trong tế bào chủ [66]

1.1.3 Gánh nặng bệnh tật gây ra bởi HBV

HBV là tác nhân gây bệnh của phần lớn các ca mắc các bệnh về gan, và được coi là dịch bệnh ở nhiều quốc gia trên thế giới mặc dù đã có các chương trình bao phủ vaccine [53] Theo thống kê của WHO, đến năm 2019, trên thế giới ước tính có khoảng 296 triệu người nhiễm viêm gan B mạn tính, với khoảng 1,5 triệu ca nhiễm mới mỗi năm [70] Chỉ trong năm 2019, HBV là nguyên nhân gây ra cái chết của 820.000 người trên toàn thế giới, chủ yếu do diễn biến xơ gan hoặc ung thư gan Tỉ

lệ mắc trung bình theo độ tuổi cao nhất tập trung ở các quốc gia thuộc khu vực Saharan (Châu Phi), Châu Đại Dương, khu vực Trung, Đông và Đông Nam Á Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao, ước tính 8-25% dân số, trong đó có khoảng

1.1.4 Chẩn đoán viêm gan B

Các chỉ thị huyết thanh chẩn đoán nhiễm HBV [61]:

HBsAg: xuất hiện trong huyết thanh trong vòng 1-10 tuần của người bị nhiễm

sau khi tiếp xúc với HBV Kháng nguyên bề mặt này có hai dạng hình cầu và hình ống Cấu tạo của hai dạng này gồm protein, lipid, carbonhydrat, nhưng không có acid nucleic nên được xem là dạng không hoàn chỉnh của HBV HBsAg là chỉ điểm huyết thanh học thường được dùng để xác định nhiễm HBV HBsAg xuất hiện rất sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng, tăng cao dần và biến mất sau 4-8 tuần kể từ khi có triệu chứng Nếu sau 6 tháng mà vẫn còn HBsAg thì có nguy cơ chuyển thành người mang HBsAg mạn tính Sự hiện diện của HBsAg trong huyết thanh chứng tỏ có DNA của virus trong tế bào gan Định lượng HBsAg có giá trị tiên lượng, nếu trong giai đoạn

9

bình phục hàm lượng HBsAg không nhỏ hơn 1/4 so với trị số ban đầu thì có nguy cơ trở thành người mang virus mạn tính

HBcAg: tìm thấy trong tế bào gan của người nhiễm HBV Trong huyết thanh,

HBcAg hiện diện như một thành phần của virus hoàn chỉnh chứ không ở dạng tự do HBcAg chỉ xuất hiện trong tế bào gan và chỉ có thể phát hiện được khi làm sinh thiết gan Khi trong một tế bào gan có HBcAg bao giờ cũng có HBsAg trên màng tế bào

và nồng độ DNA polymerase luôn luôn tăng cao

HBeAg: là loại kháng nguyên hòa tan trong huyết thanh, xuất hiện sau HBsAg

2-4 tuần (khoảng 1,5 tháng sau khi nhiễm virus) Sự xuất hiện kháng nguyên này trong huyết thanh chỉ ra sự lây nhiễm Sự tồn tại dai dẳng của HBeAg trong huyết thanh sau 3 tháng dẫn đến tăng khả năng viêm gan B mạn tính Vì hàm lượng của nó

tỷ lệ thuận với lượng virus, do đó qua kháng nguyên này có thể đánh giá được mức

độ nhiễm của người bệnh

Hạt Dane: Huyết thanh của người bị nhiễm HBV cũng chứa một số lượng ít

hơn những hạt kích thước khoảng 42 nm Đó là những virus còn nguyên vẹn và có khả năng gây nhiễm

Anti-HBc: Sự tăng nồng độ Anti-HBc IgM xuất hiện đồng thời với sự tăng

ALT Do kháng thể này được sản xuất khi có sự tổng hợp của Nucleocapside của virus, sự xuất hiện của anti-HBc IgM trong huyết thanh phản ánh đang có sự nhân lên của virus và bệnh đang ở giai đoạn cấp hoặc giai đoạn nhiễm mạn tính có tái hoạt động Sau nhiều tháng, kháng thể Anti-HBc IgM mất đi trong giai đoạn hồi phục, thay thế bằng kháng thể anti-HBc IgG Anti-HBc IgG nói chung tồn tại rất lâu dài

Anti-HBe: Trong giai đoạn sớm của thời kỳ hồi phục và trước khi HBsAg biến

mất, anti-HBe xuất hiện thay thế HBeAg mất đi, chỉ ra sự tiến triển tốt của bệnh

Anti-HBs: Kết thúc của nhiễm HBV là sự biến mất của HBsAg và xuất hiện

anti-HBs Kháng thể anti-HBs thường được phát hiện sau khi HBsAg biến mất 2-8 tuần Khoảng 30-50% bệnh nhân không phát hiện được anti-HBs sau 6 tháng

10

Chẩn đoán dương tính HBV bằng vật liệu di truyền:

Định lượng HBV DNA huyết thanh là một thành phần quan trọng trong việc đánh giá bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính và đánh giá hiệu quả điều trị kháng virus Hầu hết các xét nghiệm HBV DNA được sử dụng trong thực hành lâm sàng dựa trên phản ứng chuỗi khuếch đại polymerase (PCR) với giới hạn phát hiện thấp hơn 10-15 IU/mL và phạm vi giới hạn xác định được có thể lên tới 7-8 log10 IU/mL [19]

Ngoài ra hiện nay đang có một số dấu ấn sinh học mới đang được nghiên cứu như cccDNA [11], Hepatitis B core-related antigen (HBcrAg) [48], HBV RNA [25]

1.1.5 Thuốc điều trị viêm gan B

Mục đích của các liệu pháp điều trị kháng virus là làm giảm thiểu sự nhân lên của HBV, cũng như là giảm tình trạng viêm gan, từ đó có thể phòng ngừa diễn biến thành xơ gan và ung thư gan Bệnh nhân được chỉ định điều trị kháng virus khi phát hiện nồng độ DNA virus trong huyết thanh vượt 20.000 IU/mL, tăng ALT/AST hoặc

có tiền sử viêm gan hoặc xơ gan Hiện thuốc điều trị viêm gan B phố biến nhất là nhóm thuốc có cấu trúc tương tự nucleot(s)ide (Nucleo(t)ide analogues- NA), gồm 5 loại: Lamivudine (LMV), Telbivudine (LdT), Adeforvir (ADF), Tenofovir (TDF), và Entecavir (ETV) Tuy nhiên, thuốc không có khả năng điều trị dứt điểm virus HBV

mà chỉ ức chế quá trình nhân lên của virus, hạn chế tổn thương gan gây ra bởi virus, thêm thời gian giúp cơ thể người bệnh hình thành miễn dịch đối với virus [30]

Thuốc thuộc nhóm NA hoạt động dựa trên nguyên lý chính đó là ức chế quá trình phiên mã từ pregenomic RNA của virus thành sợi DNA Cơ chế tác dụng của các thuốc NA dựa vào đặc tính không đọc sửa của enzym RTase của HBV Các thuốc

NA cần phải kích hoạt cơ chế kháng virus của chúng thông qua quá trình phosphoryl hóa, chuyển hóa chúng thành dạng nucleoside tri- hoặc di- phosphates Các dạng phân

tử này trở thành nguyên liệu vô dụng, không thể dùng cho quá trình kéo dài sợi DNA của virus, do đó ngăn cản quá trình nhân lên của virus Các thuốc NA chính được chia thành 3 nhóm thuốc chính là l-Nucleoside (Lamivudine, Telbivudine), Alkyl Phosphonate (Adefovir và Tenofovir), và d-Cyclopentane (Entecavir)

Adefovir [9-(2-phosphonylmethoxyethyl) adenine] là thuốc ức chế HBV thuộc nhóm alkyl phosphonate [22], được FDA chấp thuận để điều trị năm 2008 cho trẻ em

từ 12–17 tuổi và được thương mại hóa ở dạng prodrug là Adefovir dipivoxil Khi vào

tế bào, ADF được phosphoryl hóa 2 lần bởi AMP để hình thành dạng hoạt động là ADFpp [41] ADFpp thể hiện hoạt động dừng tổng hợp chuỗi khi tham gia vào phản ứng tổng hợp DNA của HBV; đồng thời, đóng vai trò chất cạnh tranh dATP [23]

Tenofovir (TDF) là thuốc nhóm alkyl phosphonate thế hệ sau của ADF TDF được cấp phép điều trị cho trẻ em từ 12 tuổi trở lên bị nhiễm HBV mạn tính từ năm

2014 Theo báo cáo của Marcellin và cộng sự (2008), TDF cho hiệu quả vượt trội so với ADF, với tỉ lệ đáp ứng trên bệnh nhân âm tính HBeAg và dương tính HBeAg lần lượt là 93% (so với 63% khi sử dụng ADF), và 76% (so với 13% khi sử dụng ADF) [39] Một phân tích gộp báo cáo rằng TDF và ETV là thuốc kháng virus mạnh nhất cho bệnh nhân HBeAg dương tính và TDF là lựa chọn điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân HBeAg âm tính TDF không chỉ là phương pháp điều trị đầu tiên được ưu tiên

để hình thành dạng hoạt động ETV-triphosphate Khi đó, ETV-triphosphate thể hiện

3 hoạt động: ức chế quá trình priming của HBV Pol; cạnh tranh dGTP; và dừng tổng hợp chuỗi sau 2 – 3 nucleotide tiếp theo từ vị trí ETV [54, 58, 80] ETV là một chất

ức chế mạnh HBV DNA polymerase, có hiệu lực lớn hơn từ 30 đến 2.200 lần so với LMV để giảm sự sao chép DNA của virus trong thực nghiệm [51] Hơn nữa, ETV có một rào cản di truyền cao đối với sự kháng thuốc Ở những bệnh nhân bị bệnh mà kháng LMV, cần phải có một liều ETV cao hơn để đạt được sự ức chế virus đầy đủ

Sự xuất hiện của các biến thể kháng ETV liên quan chặt chẽ với các chất thay thế kháng LMV [60] Do đó, ETV là phương pháp điều trị hiệu quả đối với bệnh nhân chưa từng điều trị NA, nhưng không phải là điều trị tối ưu cho bệnh nhân kháng ami [52]

Hình 5 Cấu trúc phân tử các thuốc điển hình loại NA

13

1.2 Đột biến kháng thuốc Nucleos(t)ide của HBV

1.2.1 Cơ chế kháng thuốc Nucleos(t)ide của HBV

HBV có tốc độ nhân lên lớn, có thể sản sinh mới khoảng 1012 hạt virus trong vòng một ngày và có tốc độ đột biến cao, xấp xỉ 1/105 nucleotide trong mỗi chu kỳ nhân bản của virus [36] Enzym HBV polymerase không có cơ chế đọc sửa sau phiên

mã (3’-5’ exonuclease), tính chất này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hoạt động của thuốc NA, tuy nhiên các đột biến không được chỉnh sửa và dễ dàng biểu hiện, đồng nghĩa với khả năng xuất hiện đột biến kháng thuốc cao Nếu thuốc điều trị có khả năng ngăn chặn hoàn toàn chu trình nhân bản hệ gen virus, nghĩa là dừng toàn bộ quá trình tổng hợp sợi mới, cũng dừng toàn bộ quá trình tạo ra đột biến, các thuốc

NA ức chế quá trình nhân lên của virus nhưng không hoàn toàn loại bỏ sự hiện diện của virus Trong quá trình điều trị, tính ức chế của các thuốc NA đóng vai trò là tác nhân chọn lọc với quần thể virus Theo thời gian điều trị, các cá thể virus kiểu dại (không kháng thuốc) dần bị loại bỏ và thay thế bằng các cá thể virus có khả năng kháng thuốc [50] Bên cạnh việc xuất hiện đột biến trong quá trình điều trị, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến kháng thuốc của HBV tồn tại ngay cả ở những bệnh nhân chưa từng điều trị với NA [16]

Đột biến kháng thuốc NA thường được tìm thấy trong gen polymerase của HBV DNA (vùng P) Hiện nay, có một sự đồng thuận về danh pháp của các đột biến kháng thuốc trong đó quy tắc đánh số được đề xuất bởi HEP DART International Committee (2001) được chấp nhận rộng rãi Theo đó, gen polymerase HBV có cấu trúc gồm 4 domains chính, bao gồm: Terminal, Spacer, RT, và RNA-se H Trong đó, domain phiên mã ngược (RT) đóng vai trò quan trọng nhất liên quan tới tính kháng thuốc của virus, được đánh số bắt đầu từ motif amino acid bảo thủ EDWGPCDEHG [57], tên đột biến tương ứng vị trí các axit amin từ đầu đến cuối của gen RT từ rt1 đến rt344 Các đột biến chủ yếu được tìm thấy ở các tiểu vùng A, B, C, D và E của domain RT

14

Hình 6 Quy tắc đánh số enzym Polymerase quy định tính kháng thuốc của

virus HBV [57]

1.2.2 Các loại đột biến kháng thuốc Nucleos(t)ide của HBV

Đột biến kháng thuốc của HBV được phân loại thành 2 dạng: đột biến sơ cấp

và đột biến thứ cấp Đột biến sơ cấp là các đột biến thay thế các amino acid tại một

số vị trí đặc thù với các loại thuốc kháng virus do đó làm giảm ái lực của thuốc với enzym HBV polymerase, nhưng đồng thời làm ảnh hưởng tới chức năng enzym HBV polymerase dẫn đến giảm hiệu suất nhân bản; đột biến thứ cấp là các đột biến thay đổi các amino acid của enzym HBV polymerase bị khiếm khuyết, giúp hồi phục chức năng nhân bản của virus

Đột biến kháng thuốc Lamivudine (LMV): được tìm thấy ở vùng motif bảo thủ YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate) (rtY203 – rtD206), thuộc domain C của enzym HBV Polymerase Các đột biến sơ cấp phổ biến nhất gồm có rtM204I/V [10,46] Các thử nghiệm in vitro cho thấy những đột biến này làm giảm

độ nhạy với lamivudine xuống > 100 lần Hai đột biến rtA181T/V/S và rtT184G/L/S thì hiếm xuất hiện ở bệnh nhân kháng LMV Các đột biến thứ cấp phục hồi hiệu suất nhân bản gồm rtL80V/I, rtI169T, rtV173L,rtL180M, rtS202I [43, 55, 59] Đột biến rtA181T/V quy định khả năng kháng đồng thời ADF và/hoặc TDF [68], đột biến rtM204I/V không có tính chất này Nhóm các đột biến rtI169T, rtT184G/L/S, và rtS202I góp phần quy định khả năng kháng ETV, nhưng không mang lại khả năng

15

kháng ETV khi xuất hiện độc lập [24, 59, 62, 68-69] Một số dạng đột biến kháng LMV thường được phát hiện bao gồm: rtM204I, rtL180M + rtM204V, rtL180M + rtM204I, rtV173L + rtL180M + rtM204V, và rtL80V/I + rtL180M + rtM204I [9, 79]

Tỉ lệ phát hiện các đột biến kháng thuốc LMV là khoảng 14 – 32% sau 1 năm tiếp nhận điều trị, tỉ lệ này sẽ tăng lên sau mỗi năm kéo dài điều trị, và có thể lên tới 60 – 70% sau 5 năm điều trị [35] Các yếu tố làm tăng tỉ lệ xuất hiện đột biến kháng thuốc LMV gồm: điều trị dài ngày, nồng độ DNA HBV cao trước khi dùng thuốc và lượng virus còn tồn tại quá cao sau đợt điều trị ban đầu [35,76] Các đột biến xuất hiện ở bệnh nhân kháng LMV cũng có thể gây ra kháng Telbivudine (LdT) [31,33]

Adefovir (ADF) hoạt động bằng cách ức chế cả enzym reverse transcriptase

và DNA polymerase, đồng thời có thể làm kết thúc sớm trình tổng hợp sợi DNA nhân virus ADF thường được khuyến nghị điều trị cho các bệnh nhân đã kháng LMV Đột biến kháng thuốc ADF phổ biến nhất là hai đột biến rtA181T/V và rtN236T [29] Các thử nghiệm in vitro đã chỉ ra rằng các đột biến kháng ADF làm giảm hiệu quả điều trị từ 3 đến 15 lần [12,67] Tỷ lệ đột biến kháng ADF sau 1, 2, 3, 4 và 5 năm được báo cáo là 0%, 3%, 11%, 18 %, và 29% ở bệnh nhân âm tính HBeAg [27] Tỉ lệ xuất hiện kháng thuốc sau 5 năm điều trị bằng ADF là khoảng 20%, ở bệnh nhân dương tính với HBeAg [38] Các yếu tố làm tăng nguy kháng ADF là điều trị thiếu liều và đơn trị liệu với ADF ở bệnh nhân đã kháng LMV

Đột biến kháng thuốc Entecavir (ETV), các đột biến quy định sự kháng ETV được xác định nằm trong domain B (rtI169T, rtL180M, và rtT184G)/L/S), domain C (rtS202I và rtM204I/V), và domain E (rtM250V) Đặc biệt, để HBV có khả năng kháng ETV, đồng thời 3 đột biến cần được biểu hiện: rtL180M + rtM204V cùng với

1 trong 3 đột biến rtT184G/L/S, rtS202I, hoặc rtM250V Khi đột biến rtL180M và rtM204V/I xuất hiện, tiếp theo sau bằng các đột biến làm thay đổi trình tự acid amin

là rtT184, rtS202, hoặc rtM250 thì sẽ dẫn đến hiện tượng kháng ETV Trong trường hợp không có đột biến đến liên quan đến kháng LMV, đột biến rtM250V gây ra mức giảm độ nhạy (EC50) với ETV xuống 9 lần trong khi những đột biến rtI169T, rtT184G/L/S hoặc rtS202G/I có ít ảnh hưởng hơn.Tuy nhiên, khi có đột biến liên

16

quan đến kháng LMV, các đột biến liên quan đến ETV làm giảm độ nhạy với ETV xuống 100 lần, đặc biệt khi có 2 hoặc nhiều đột biến liên quan đến ETV [59] Tỉ lệ xuất hiện kháng ETV thường là thấp, 0,8 – 1,2% ở bệnh nhân dùng ETV sau 5 năm Tuy nhiên, đối với bệnh nhân đã kháng với LMV, thì tỉ lệ này lại rất cao, 43 – 51% [60]

Đột biến kháng Tenofovir (TDF), đột biến rtA194T có liên quan đến tình trạng kháng TDF ở bệnh nhân đồng nhiễm với HIV [49,55]

Đột biến kháng đa thuốc: Điều trị kéo dài bằng liệu pháp NA đơn trị liệu đã dẫn đến việc chọn lọc các đột biến kháng thuốc của virus dẫn đến kháng liệu pháp ban đầu và sau đó là liệu pháp thay thế Ví dụ, quần thể virus đột biến kháng LMV

và sau đó xuất hiện kháng ADF đã được báo cáo ở những bệnh nhân kháng LMV được chuyển sang đơn trị liệu ADF [73]

Bảng 1 Danh sách đột biến kháng thuốc NA phổ biến [15, 28, 37]

Lamivudine

rtI169T, rtV173L, rtL180M, rtA181T/V, rtT184G/L/S

rtM204I/V, rtV207M, rtQ215S

rtI233V, rtN236T, rtP237H, rtN238A/T

-

17

1.3 Tình hình kháng thuốc của HBV tại Việt Nam

1.3.1 Đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân đang điều trị

Các nghiên cứu về đột biến kháng thuốc trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị được thực hiện khá nhiều nhằm khảo sát các kiểu đột biến kháng thuốc

và làm cơ sở cho việc lựa chọn phác đồ điều trị thay thế phù hợp Ngoài ra, những dữ liệu từ các nghiên cứu này còn là nguồn tham khảo quan trọng cho những nghiên cứu đột biến kháng thuốc trên bệnh nhân chưa điều trị Tác giả Hồ Tấn Đạt nghiên cứu trên 122 bệnh nhân đang điều trị với LMV ghi nhận có tới 63,9% trường hợp có đột biến kháng LMV, ngoài các đột biến kháng LMV thường gặp như rtM204V/I và rtL180M, còn ghi nhận sự xuất hiện của đột biến phối hợp rtM204I + rtL180M + rtV207I với tỷ lệ 0,8% [3] Tác giả Nguyễn Thị Nhã Đoan ghi nhận tỷ lệ đột biến kháng thuốc ở 60 bệnh nhân đang điều trị bằng thuốc NA là 33,3%, trong đó kháng LMV là 32,75%, kháng ADF là 6% [4] Tác giả Nguyễn Sử Minh Tuyết nghiên cứu trên 50 bệnh nhân đã và đang điều trị LMV cho thấy có 11/50 mẫu có đột biến rtL180M, 9/50 mẫu có đột biến rtM204V và 12/50 mẫu có đột biến rtM204I [8]

1.3.2 Đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân chưa điều trị

Nghiên cứu về đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị chưa nhiều và chưa có nghiên cứu nào được tiến hành một cách đầy

đủ với cỡ mẫu đủ lớn Tác giả Nguyễn Hùng Cường nghiên cứu trên 67 đối tượng nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị phát hiện đột biến kháng thuốc LMV là 3,84%, kháng ADF và ETV là 0 % [1] Tác giả Đặng Mai Anh Tuấn tiến hành nghiên cứu đột biến kháng thuốc của HBV từ 894 mẫu máu của bệnh nhân tại các bệnh viện tại

TP Hồ Chí Minh gồm bệnh nhân đang điều trị và chưa điều trị ghi nhận tỷ lệ đột biến kháng thuốc phát hiện được là 9,28%, trong đó kháng LMV chiếm 4,7% [7]

và đặc hiệu thấp hơn so với real time PCR Đặc biệt, khó có thể phân biệt hỗn hợp nhiều kiểu gen trong quần thể, đặc biệt với những mẫu DNA có tỉ lệ alen hiếm (đột biến)/ alen ưu thế (kiểu dại) thấp như mẫu mô ung thư, mẫu dịch ối trong chẩn đoán trước sinh, hoặc các mẫu xét nghiệm đột biến kháng thuốc của virus/vi khuẩn, đột biến gen ty thể [72]

Trong ứng dụng xác định đột biến kháng thuốc ở HBV, phương pháp PCR kết hợp giải trình tự Sanger đoạn gen mang đột biến được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong xác định đột biến kháng thuốc do khả năng xác định các đột biến kháng thuốc trên toàn bộ vùng gene mã hóa enzym HBV polymerase Đồng thời, kỹ thuật này cho phép xác định các đột biến mới, các đột biến “tiềm năng” trong quần thể Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp là độ nhạy thấp, khoảng 10 – 20% đột biến/quần thể [36] Do đó, khả năng ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng không cao; thường được dùng để xác nhận một cách định tính sự xuất hiện của đột biến kháng thuốc

1.4.2 Giải trình tự thế hệ mới

Phương pháp giải trình tự thế hệ mới đang cho thấy tính hiệu quả, độ tin cậy,

độ nhạy cao với khả năng phát hiện các alen rất hiếm trong quần thể khi áp dụng cho phát hiện các đột biến quan tâm Đối với HBV, phương pháp này cho phép giải cùng lúc hàng trăm mẫu bệnh phẩm, và có thể đọc toàn bộ hệ gen virus, cho phép phát hiện các đột biến có tần số alen nhỏ dưới 10% [13,56] Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này đó là kinh phí cao, không phù hợp với lượng mẫu nhỏ vì gây ra lãng phí, đòi hỏi trình độ kỹ thuật về tin sinh học cao và phải có nền tảng phân tích đột biến

19

trên dữ liệu lớn Do đó, mặc dù cho thấy nhiều ưu điểm, nhưng việc áp dụng phương pháp này vào thực tế lâm sàng tại các cơ sở y tế là còn rất nhiều hạn chế

1.4.3 COLD-PCR kết hợp với giải trình tự Sanger

Để khắc phục nhược điểm độ nhạy thấp do sự nhân bản không chọn lọc của phương pháp PCR kết hợp giải trình tự Sanger, phương pháp PCR biến tính ở nhiệt

độ thấp được phát triển bởi nhóm nghiên cứu của Jin Li và cộng sự vào năm 2008, là một biến thể của phương pháp PCR truyền thống nhằm làm giàu có định hướng các alen hiếm trong quần thể, từ đó làm tăng tỉ lệ các alen hiếm/alen ưu thế, cuối cùng

tăng độ nhạy của phản ứng [32]

Xuất phát từ sự khác biệt về nhiệt độ biến tính của các đoạn DNA có trình tự khác nhau, nhóm nghiên cứu đặt giả thuyết: có thể tìm được một nhiệt độ biến tính thấp hơn nhiệt độ biến tính tiêu chuẩn (95˚C), sao cho tại đó chỉ có một vài loại DNA

có trình tự hoặc cấu hình nhất định bị biến tính thay vì toàn bộ các sợi đôi DNA trong quần thể, do đó chỉ những sợi DNA bị biến tính có thể tham gia vào các bước tiếp theo của phản ứng PCR Nhiệt độ biến tính này được gọi là nhiệt độ biến tính tới hạn (critical denaturation temperature) Trong trường hợp tối ưu, tại nhiệt độ biến tính tới

hạn, chỉ các sợi mang đột biến bị biến tính và được làm giàu

Có 2 dạng phản ứng COLD-PCR được đề xuất bởi nhóm nghiên cứu của Jin

Li và cộng sự là fast và full-COLD-PCR [32] Phản ứng fast-COLD-PCR dựa vào sự giảm nhiệt độ nóng chảy khi một số đột biến xảy ra (ví dụ G>A, G>T, C>A, C>T),

do đó khi đưa tới nhiệt độ biến tính tới hạn cao hơn nhiệt độ nóng chảy của sợi đôi đột biến và thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của sợi đôi kiểu dại, chỉ những sợi đôi DNA mang đột biến bị biến tính và tham gia vào phản ứng PCR Mặt khác, phản ứng full- COLD-PCR có khả năng làm giàu tất cả các dạng đột biến trong quần thể, bao gồm các đột biến tăng nhiệt độ nóng chảy (A>G, T>C…), không thay đổi nhiệt độ nóng chảy (A>T, G>C…), và giảm nhiệt độ nóng chảy (G>A, C>T…) Khác với phản ứng fast-COLD-PCR, phản ứng full-COLD-PCR làm giàu đột biến dựa vào sự biến tính của sợi đôi heteroduplex tạo bởi sợi đơn đột biến và sợi đơn kiểu dại Theo lý thuyết, sợi đôi dạng heteroduplex luôn có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn các sợi đôi

20

homoduplex Do đó, tại nhiệt độ biến tính tới hạn cao hơn nhiệt độ nóng chảy của sợi đôi heteroduplex, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của sợi đôi homoduplex, các sợihomoduplex không biến tính và tham gia các phản ứng sau đó

Trong ứng dụng xác định đột biến kháng thuốc của HBV, nhóm nghiên cứu của Can Liu và cộng sự [34], nhóm của Danny Ka Ho Wong và cộng sự [71], và gần đây có nghiên cứu của Vũ Thiên Sơn năm 2017 (thành viên trong nhóm nghiên cứu của chúng tôi) [6], đã phát triển kỹ thuật COLD-PCR phát hiện đột biến kháng thuốc

NA của HBV với độ nhạy 5-10% đột biến Tuy nhiên các nghiên cứu này chỉ tập trung tối ưu phương pháp COLD-PCR trên domain B và C, do đó bỏ qua các các đột biến quy định tính kháng thuốc quan trọng như N236T (kháng ADF) trên domain D

và M250I/V (kháng ETV) trên domain E

Hình 7 Mô hình minh họa của phản ứng COLD-PCR [34]

21

1.4.4 Real time PCR sử dụng đầu do Taqman LNA

Kỹ thuật real time PCR được ứng dụng rộng rãi trong các xét nghiệm định tính, định lượng đột biến, với ưu độ nhạy cao, cho khả năng xử lý đồng thời số lượng mẫu lớn, quy trình đơn giản và hiệu quả cao nên dễ áp dụng trong chẩn đoán thường quy tại bệnh viện tuyến Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng real time PCR có những khó khăn khi phân tích đột biến điểm bởi vì các đoạn gen đích đột biến và kiểu dại chỉ khác nhau một nucleotide Tuy nhiên, việc thiết kế các đầu dò là phần thách thức nhất về mặt kỹ thuật khi thiết kế các xét nghiệm real time PCR phát hiện và định lượng các đột biến điểm Khả năng phân biệt đặc hiệu của đầu dò đạt hiệu quả cao khi khoảng cách ΔTm giữa Tm của mẫu dò bắt cặp hoàn toàn và Tm của mẫu dò bắt cặp không hoàn toàn phải đủ lớn Nói cách khác, ΔTm càng cao, khả năng phân biệt trình tự gen đột biến và kiểu dại của phản ứng real time PCR càng cao

Sử dụng các đầu dò Taqman LNA giúp tăng cường đáng kể độ đặc hiệu đồng thời giảm các tín hiệu nhiễu của phản ứng real time PCR phân biệt các trình tự gen đích khác biệt chỉ 1 nucleotide so với đầu dò Taqman bình thường [63, 78] Do việc kết hợp một LNA đơn vào đầu dò TaqMan ngắn về mặt lý thuyết làm tăng ΔTm lên tới 9,6°C [18], nên việc sử dụng đầu dò LNA giúp nâng cao khả năng phân biệt đặc hiệu của phản ứng real time PCR

Một số hướng tiếp cận sử dụng real time PCR trong phát hiện đột biến có nhóm nghiên cứu của Fotinie Ntziora và cộng sự (2013) phát triển kỹ thuật ASRM real time PCR sử dụng đầu dò molecular beacon phát hiện 6 đột biến rtV173L, rtL180M, rtA181V, rtT184A, rtM204I, và rtN236T [45], nghiên cứu của Bhattacharya và cộng

sự (2013) phát triển kỹ thuật real time PCR sử dụng đầu dò dạng cầu khóa (LNA) và MGB để phát hiện bộ ba đột biến rtV173L, rtL180M, rtM204I [17] Tuy nhiên, những nghiên cứu này chỉ tập trung vào một số đột biến phổ biến trong khu vực nghiên cứu của họ mà phổ đột biến đột biến kháng thuốc NA còn hạn chế Bên cạnh đó, thiết kế molecular beacon probe khá phức tạp và không có nhiều lựa chọn các chất nhuộm huỳnh quang có bước sóng khác nhau cho molecular beacon probe nên không dễ áp dụng cho phát hiện nhiều đột biến điểm đơn nucleotide

22

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm là mẫu huyết thanh của 228 bệnh nhân viêm gan B mạn tính được thu bằng cách ly tâm 4˚C và thu mẫu Mẫu bệnh phẩm được lựa chọn theo các tiêu chuẩn hướng dẫn chẩn đoán và điều trị viêm gan B, số 5548/QĐ-BYT, của Bộ Y

tế ban hành năm 2014

Mẫu được chia thành 2 loại:

- 130 mẫu huyết thanh chọn lọc bệnh nhân nhi mới tới điều trị tại Khoa Gan mật, Bệnh viện Nhi Trung Ương và Khoa Nhi Tiêu hóa - Dinh dưỡng- Lây, Bệnh viện

Đa khoa Xanh Pôn

- 98 mẫu huyết thanh chọn lọc từ ngân hàng mẫu sẵn có tại Khoa Vi sinh của các bệnh nhân người lớn viêm gan mạn tính đã và đang điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai Các thông tin được thu thập về mẫu bệnh phẩm bao gồm: tuổi, giới tính, loại thuốc điều trị, genotype HBV, tải lượng virus, chỉ số sinh hóa như chỉ số men gan ALT/AST, HBeAg Quy trình thu thập mẫu nghiên cứu được thông qua bởi Hội đồng

y đức tại tại Bệnh viện Nhi Trung Ương mã số 39/BVNTW-VNCSKTE

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Việc tách chiết DNA tổng số (gDNA) của virus HBV từ mẫu huyết tương được thực hiện sử dụng bộ sinh phẩm QIAamp DNA Blood minikit (Qiagen, Đức) theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất Nồng độ DNA sau tinh sạch được định lượng bằng hệ thống quang phổ NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Mỹ)

DNA tổng số của virus HBV được khuếch đại bằng phản ứng PCR, COLD-PCR

và real time PCR, sử dụng mastermix bao gồm nTaq HOT Polymerase (Enzynomics, Hàn Quốc), TOPreal™ qPCR 2XPreMIX (Enzynomics, Hàn Quốc), mồi xuôi, mồi ngược và đầu dò tương ứng

23

Hệ thống máy ABI 9700 (Applied Biosystems/ Thermo Fisher Scientific - Mỹ)

và PCR Proflex – (Applied Biosystems/ Thermo Fisher Scientific - Mỹ) được sử dụng

trong các phản ứng PCR thông thường; hệ thống máy LightCycler 96 instrument (Roche Diagnostics, Đức) và ABI 7500 (Applied Biosystems/ Thermo Fisher Scientific - Mỹ)

được sử dụng trong các phản ứng real time PCR

Các sản phẩm DNA plasmid tinh sạch và sản phẩm PCR được điện di tương ứng trên gel agarose 1 % và 1,5 %, cùng với marker 100 bp và 1 kb trong đệm TAE 1X, tại 100V trong 30 phút sử dụng bể điện di Mupid-One (ADFance Inc., Nhật Bản) và soi gel sử dụng hệ thống chụp ảnh Gel Doc XR (BioRad, Mỹ)

Xét nghiệm chức năng gan: AST, ALT được thực hiện trên hệ thống máy sinh hóa tự động Cobas (Roche) và máy AU 5822 (Beckman Coulter) Định lượng tải lượng HBV sử dụng bộ sinh phẩm COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®HBV Test trên

hệ thống máy COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®Analyzer (Roche Diagnostics) Định lượng HBsAg: Xét nghiệm định lượng bằng kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang ECLIA (ElectroCheluminescent Immunoassay), sử dụng bộ thuốc thử Elecsys HBsAg II Quant (Roche Diagnostics) Xét nghiệm định tính HBeAg bằng kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang ECLIA (ElectroCheluminescent Immunoassay),

sử dụng bộ thuốc thử HbeAg Elecsys (Roche Diagnostics)

Sản phẩm PCR của gDNA kiểu dại được nhân dòng vào vector pTOPv2 sử dụng

bộ sinh phẩm nhân dòng TOPcloner™ TA Kit (Enzynomics, Hàn Quốc) Đồng thời, đoạn gene chứa các đột biến kháng thuốc được tổng hợp hóa học và nhân dòng vào vector pUC19 sử dụng dịch vụ của công ty TNHH Sinh hóa Phù Sa (Phusa Biochem, Việt Nam)

2.2 Phương pháp

2.2.1 Thiết kế mồi nhân đoạn gen RTase của HBV

Dựa vào cơ sở dữ liệu trình tự genome HBV được tạo bởi 50 trình tự tham chiếu thuộc 8 genotype (A-H), truy xuất từ cơ sở dữ liệu trình tự gene của NCBI, sử dụng phần mềm Snapgen 3.2.1 và phần mềm CLUSTAL X phiên bản 2.1 chúng tôi so sánh

Vị trí trên gen

Fw1- HBV TCCTGCTCAAGGAACCTCTATG

B-E 398

532–553 Rv1- HBV TGTACAATATGTTCCTGTGG 910–929

Fw2- HBV ACCTGTATTCCCATCCCA

B-C 194

595–615 Rv2- HBV AGGGACTCAAGATGTTGTA 768–788

Fw3- HBV AGTTATATGGATGATGTGGTAT

D-E 198

732–757 Rv3- HBV GTACAATATGTTCCTGTG 910–929

Thiết kế 3 cặp mồi: Cặp mồi Fw1/Rv1 HBV được thiết kế cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen P1 có kích thước 398 bp gồm các domain B, C, D, và E của RTase HBV có chứa các đột biến kháng thuốc NA phổ biến nhất: rtV173L, rtL180M, rtA181V/T, rtT184G/L, rtA194T, rtS202I/G, rtM204I/V, rtN236T, and rtM250I/V Phản ứng COLD-PCR và real time PCR sử dụng 2 cặp mồi Fw2/Rv2 HBV và Fw3/Rv3 HBV Fw2/Rv2 HBV nhân bản đoạn gen P2 có kích thước 194 bp (domain B và C) chứa các đột biến rtV173L, rtL180M, rtA181V/T, rtT184G/L, rtA194T, rtS202I/G, rtM204I/V Fw3/Rv3 HBV nhân bản đoạn gen P3 có kích thước 198 bp (domain D và E) chứa các đột biến rtN236T, and rtM250I/V Kích thước của đoạn gen P2 và P3 được lựa chọn < 200 bp để đảm bảo hiệu suất của phản ứng real time PCR và đảm bảo sự khác biệt về nhiệt độ nóng chảy giữa homoduplex (đột biến-đột biến; kiểu dại-kiểu dại)

và heteroduplex (đột biến-kiểu dại) cho phản ứng COLD-PCR

25

2.2.2 Thiết kế đầu dò LNA phát hiện các đột biến kháng thuốc NA

Locked-Nucleic Acid (các nucleotide được bổ sung liên kết cộng hóa trị giữa

vị trí 2’ và 4’ trên gốc đường) có nhiệt độ nóng chảy cao hơn nucleotide thông thường

từ 2 – 8 oC), đã được ứng dụng nhiều trong thiết kế đầu dò của kỹ thuật real time PCR phát hiện các đột biến hiếm trong quần thể cho độ nhạy cao, giảm độ nhiễu tín hiệu huỳnh quang [63]

Sử dụng cơ sở dữ liệu trình tự và kết quả so sánh trình tự, với mỗi vị trí đột biến, một cặp đầu dò được thiết kế để phát hiện các đột biến kháng thuốc NA Để phân biệt được alen đột biến và alen kiểu dại, các LNA được đặt tại các vị trí trên đầu

dò để đảm bảo hiệu quả phân biệt đặc hiệu sao cho đầu dò phát hiện đột biến chỉ gắn đặc hiệu với khuôn đột biến, không gắn với khuôn kiểu dại, và ngược lại Tương ứng với mỗi đột biến, chúng tôi sử dụng các dye huỳnh quang khác nhau để phát hiện và định lượng được riêng biệt từng đột biến.TaqMan LNA probe bắt cặp bổ sung với khuôn kiểu dại được thiết kế với đầu 5’ gắn chất nhuộm phát huỳnh quang fluorescent reporter dye 6-carboxyfluorescein (FAM) và đầu 3’ gắn chất hấp thụ huỳnh quang IBFQ, TaqMan LNA probe bắt cặp bổ sung với khuôn đột biến được thiết kế với đầu 5’ gắn chất nhuộm phát huỳnh quang 6-carboxy-2',4,4',5',7,7' – hexachlorofluorescein (HEX) và đầu 3’ gắn chất hấp thụ huỳnh quang IBFQ Đầu dò LNA được thiết kế sử dụng công cụ LNAnalyzer (IDT, Hoa Kỳ) và được tối ưu hóa dựa trên các phương pháp đã mô tả trước đây [40,47,74]

2.2.3 Tạo các mẫu chuẩn chứa trình tự gen kiểu dại và đột biến

Sử dụng các trình tự mồi Fw/Rv HBV đã thiết kế, phản ứng PCR được thực hiện với khuôn là DNA một số mẫu huyết tương bệnh nhân viêm gan B Sau đó, sản phẩm PCR được giải trình tự bằng mồi vector M13 và kiểm tra sự tồn tại của các đột biến kháng thuốc đã được công bố Sản phẩm PCR có trình tự không mang các đột biến kháng thuốc được lựa chọn làm đoạn gen kiểu dại và được nhân dòng vào vector pTOPv2 bằng phương pháp TA-TOPO Cloning sử dụng bộ sinh phẩm nhân dòng TOPcloner™ TA Kit (Enzynomics, Hàn Quốc) tạo mẫu chuẩn HBV kiểu dại

6 nTaq HOT (5 Units/µl) 0,25

7 Khuôn DNA (plasmid tái tổ hợp) 2

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 95 oC trong 10 phút; 45 chu kỳ khuếch đại:

95 oC trong 15 giây, 60 oC trong 20 giây và 72 oC trong 20 giây

- Trình tự T1 chứa đột biến điểm rtT184L, rtM204V

- Trình tự T2 chứa đột biến điểm rtA194T, rtM204I

- Trình tự T3 chứa đột biến điểm rtT184G, rtS202G, rtV207M, rtN238T

- Trình tự T4 chứa đột biến điểm rtL180M, rtS202I, rtN236T, rtN238A, rtM250V

27

Các đoạn trình tự sau đó được đặt tổng hợp gen và nhân dòng tiếp theo vào vector pUC19, thực hiện bởi công ty TNHH Sinh hóa Phù Sa (Phusa Biochem, Việt Nam) Kết quả tổng hợp gen được xác định điểm đột biến bằng giải trình tự gen Sanger DNA sequencing

Các plasmid tái tổ hợp chứa trình tự gen kiểu dại và trình tự gen đột biến của HBV sau khi tạo bằng nhân dòng gen và đặt tổng hợp gen được xác định số lượng phân

tử DNA theo công thức:

Trong đó:

• ng: khối lượng phân tử ADN (plasmid), đơn vị là ng

• 6,022*1023: số Avogadro’s: đây là một hằng số, được định nghĩa là số lượng phân tử trong mỗi mol vật chất

• Chiều dài: chiều dài của đoạn ADN gồm chiều dài plasmid tái tổ hợp + đoạn chèn (đơn vị là bp)

Sau khi xác định được nồng độ số bản sao của các plasmid tái tổ hợp, pha loãng liên tiếp 10 lần tạo dải nồng độ pha loãng 5 x 108 – 5 IU/mL (1 IU tương đương với 5,82 bản sao) Sau đó, lượng plasmid tương ứng được trộn lẫn để chuẩn bị các mẫu plasmid hỗn hợp có tỉ lệ phần trăm đột biến/kiểu dại (mt/wt) lần lượt là 100 %, 50 %,

10 %, 5 %, 1 %, 0,1 %, và 0 % Các mẫu hỗn hợp plasmid theo tỉ lệ nói trên được sử dụng làm khuôn cho các phản ứng PCR, COLD-PCR, và real time PCR để tính toán độ nhạy của phản ứng

2.2.4 Xây dựng phương pháp COLD-PCR phát hiện đột biến kháng thuốc HBV

Để phát triển phương pháp PCR biến tính ở nhiệt độ thấp (COLD-PCR), trước hết, nhiệt độ nóng chảy (Tm) của từng dạng sợi đôi, và nhiệt độ biến tính tới hạn (Tc) cần được xác định Nhiệt độ nóng chảy của các dạng sợi đôi trình tự gen P2 và P3 kiểu dại được xác định bằng phản ứng real time PCR sử dụng SYBR Green làm dye huỳnh

28

quang gắn sợi đôi với cặp mồi khuếch đại Fw2/Rv2 HBV và Fw3/Rv3 HBV tương tứng theo chu trình nhiệt 95 oC trong 10 phút; 35 chu kỳ khuếch đại Tx trong 15 giây, 60 oC trong 20 giây, và 72 oC trong 20 giây; phân tích nhiệt độ nóng chảy: gia nhiệt +0,2oC/s

từ 65 – 97 oC; sự thay đổi của tín hiệu huỳnh quang (giảm dần) theo sự gia nhiệt được thu nhận trong 5s/mỗi chu kỳ gia nhiệt trên hệ thống máy LightCycler 96 (Roche Diagnostics, Đức)

Nhiệt độ biến tính tới hạn được xác định dựa trên Tm của P2 và P3, sau đó thực hiện phản ứng real time PCR sử dụng dye huỳnh quang SYBR Green với gradient nhiệt

độ biến tính (Tx) bắt đầu từ nhiệt độ Tm +0,7 oC, giảm dần theo chu trình nhiệt 95 oC trong 10 phút; 35 chu kỳ khuếch đại Tx trong 15 giây, 60 oC trong 20 giây, và 72 oC trong 20 giây Nhiệt độ biến tính tới hạn Tc được xác định là nhiệt độ Tx thấp nhất mà tại đó không thu được tín hiệu khuếch đại giảm 0,4 oC Thành phần mastermix của phản ứng real time PCR SYBR xác định nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ biến tính tới hạn của phản ứng COLD-PCR được trình bày trong Bảng 5 Sau khi xác định được Tc, chu trình nhiệt của phản ứng COLD-PCR được trình bày trong Bảng 6

Bảng 5 Thành phần mastermix của phản ứng real time PCR SYBR xác định

nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ biến tính tới hạn

29

Bảng 6 Chu trình nhiệt phản ứng COLD-PCR

Giai đoạn Nhiệt độ

( o C) Thời gian Số chu kỳ

2.2.5 Xác định độ nhạy của phương pháp COLD-PCR

Để xác định độ nhạy của phương pháp COLD-PCR, sử dụng khuôn phản ứng là mẫu plasmid hỗn hợp có tỉ lệ phần trăm mt/wt lần lượt là 10%, 5%, 1%, và 0%, tiến hành phản ứng COLD-PCR và PCR Sản phẩm khuếch đại được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%, tinh sạch và gửi dịch vụ giải trình tự gen Sanger DNA sequencing tại

1st Base (Axil Scientific Pte, Singapore) Độ nhạy của phản ứng COLD-PCR được xác định là tỷ lệ % mt/wt thấp nhất có thể phân tích được bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger DNA sequencing

2.2.6 Xây dựng phương pháp real time PCR sử dụng đầu dò Taqman LNA

Locked-nucleic acid (LNA), một dạng nucleotide đặc biệt có nhiệt độ biến tính cao hơn so với nucleic acid thông thường, có khả năng giảm độ dài đầu dò, giảm khoảng cách giữa các dye huỳnh quang quencher và reported, từ đó giảm nhiễu và tăng độ

Bảng 7 Thành phần mastermix phản ứng real time PCR Taqman LNA

5 Đầu dò đột biến (1 µM) 0,5-1,5

6 Đầu dò kiểu dại (1 µM) 0,5-1,5

7 Khuôn DNA (plasmid tái tổ hợp) 5

Chu trình nhiệt của phản ứng real time PCR: 95 oC trong 10 phút; 45 chu kỳ khuếch đại: 95 oC trong 15 giây, 62 oC trong 45 giây (thu tín hiệu khuếch đại), 5 chu kỳ đầu tiên không thu tín hiệu khuếch đại

2.2.7 Xác định độ nhạy và giới hạn phát hiện của phương pháp real time PCR

sử dụng đầu dò Taqman LNA

Để xác định độ nhạy và giới hạn phát hiện (Limit of detection-LoD) của phương pháp real time PCR Taqman LNA, chúng tôi thực hiện phản ứng real time PCR sử dụng khuôn đầu vào là các mẫu đối chứng có tỷ lệ 0%, 0,1%, 1%, 5%, 10%, 50% và 100% mt/wt với tổng nồng độ đầu vào giảm dần từ 5 x 107 IU/ml đến 5 x 102 IU/ml Độ nhạy của phương pháp được xác định là tỷ lệ % mt/wt thấp nhất có thể phát hiện được bằng phản ứng real time PCR với chu kỳ ngưỡng (giá trị Ct) và tín hiệu huỳnh quang cuối

31

(EPF) phân biệt rõ ràng với mẫu đối chứng (0% mt/wt) và nồng độ DNA tối thiểu có thể được phát hiện ở độ nhạy này, được xác định là giới hạn phát hiện của phản ứng real time PCR

2.2.8 Đánh giá hiệu quả của phương pháp COLD-PCR và real time PCR

Taqman LNA trên mẫu bệnh phẩm

228 mẫu bệnh nhân viêm gan B mạn tính được sàng lọc các đột biến kháng thuốc bằng đồng thời 2 phương pháp: COLD-PCR kết hợp giải trình tự và real time PCR Taqman LNA So sánh hiệu quả ứng dụng của 2 phương pháp thông qua khả năng phát hiện các đột biến kháng thuốc NA, thời gian thực hiện xét nghiệm và phân tích kết quả

2.2.9 Phân tích số liệu thống kê

Các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm SPSS 20 Thống kê được coi là có ý nghĩa với giá trị P < 0,05 Độ tương đồng về khả năng phát hiện đột biến của phương pháp COLD-PCR và real time PCR Taqman LNA được đánh giá với hệ số Cohen’s kappa sử dụng phần mềm SPSS 20