Nghiên cứu thành phần hóa họcvà hoạt tính kháng ung thư của loài vấu diều (caesalpinia latisiliqua (cav ) hanttink) Ở việt nam

Nghiên cứu thành phần hóa họcvà hoạt tính kháng ung thư của loài vấu diều (caesalpinia latisiliqua (cav ) hanttink) Ở việt nam

TỔNG QUAN

Vi sinh vật phân giải agar

Vi sinh vật phân giải agar là nhóm có khả năng sinh enzyme phân cắt agar và sử dụng như nguồn carbon chính cho sự sinh trưởng và phát triển Vi sinh vật phân giải agar đã được phân lập từ nhiều nguồn, bao gồm nước biển, trầm tích biển, tảo biển, nhuyễn thể biển, nước ngọt và đất Vi sinh vật phân giải agar đã được tìm thấy trong nước biển ở các khu vực địa lý khác nhau: Ở Châu Âu, bắc Wales Vương quốc Anh [13], và Biển Địa Trung Hải ở Pháp [33]; Ở Châu Á, vịnh Sagami ở tỉnh Kanagawa [38], trầm tích Vịnh Ise [8], tại Noma Point ở độ sâu 230 m [31], Porphyra ở Nhật Bản [7], bờ biển Hạ Môn ở Biển Hoa Đông [42], và từ tảo đỏ phân huỷ ở bờ Biển Đông ở đảo Hải Nam [43]; Ở châu Mỹ, vịnh San Vicente [25] Niebla ở Chile

[42], Halifax ở Canada [30] Vi sinh vật phân giải agar được tìm thấy trong đường tiêu hóa của một số loài nhuyễn thể biển ăn rong biển Vi sinh vật phân giải agar đã được phát hiện trong ruột của ốc Turbo cornutus (Turbinidae batillus cornutus) ở bờ biển Kangnung thuộc Biển Đông của Hàn Quốc [15] Hầu hết các vi sinh vật phân giải agar được phân lập từ môi trường biển, tuy nhiên một số được phát hiện trong nước ngọt và đất Vi sinh vật phân giải agar đã được phân lập từ hồ IJsselmeer ở Hà Lan [41], các mẫu đất từ Gifu, Nhật Bản [39], Kanto, Nhật Bản [21], và Karnataka, Ấn Độ [23] Vi sinh vật phân giải agar được phát hiện thuộc các chi Alteromonas, Pseudomonas, Vibrio, Cytophaga, Agarivorans, Thalassomonas, Pseudoalteromonas, Bacillus và Acinetobacter Hầu hết trong số chúng thuộc nhóm vi khuẩn gram âm và enzyme phân hủy agar chủ yếu là enzyme ngoại bào Enzyme phân hủy agar được gọi chung là agarase

Bảng 1 1 Một số vi khuẩn sinh agarase đã được công bố [18]

Phân loại Protein Chủng Signal peptide Họ GH

Khối lượng phân tử (kDa)

Nhiệt độ tối ưu (℃) pH tối ưu

Sản phẩm phân cắt Co-factor

Aga A Alteromonas agarilytica Yes GH96 155 - 7,2 A4, A6 Ca 2+ - -

Aga D Thalassomonas sp LD5 - - 180 40 8 A4 Ca 2+ - -

CaLJ 96 Catenovulum agarivorans Yes GH96 200 37 7 A4 Ca 2+ 12,65 -

103 85% hoạt tính sau khi ủ ở 50 °C trong 1 giờ

334 57% hoạt tính sau khi ủ ở 50 °C trong 1 giờ

Aga4436 Flammeovirga sp.OC4 Yes GH16 54 55 6,5 NA4, NA6 Co 2+ , Mn 2+ - 80% hoạt tính sau khi ủ ở 50 °C trong 48 giờ AgaA Microbulbifer sp JAMB-A9

Yes GH16 48 55 7 NA No 517,3 80% hoạt tính tối đa sau khi ủ ở 60°C trong 15 phút AgaP Pseudoalteromonas sp

Yes GH16 72,5 55 5,5 NA4, NA6 - 207,5 Hơn 50% hoạt tính tối đa sau khi ủ ở 55°C trong 60 phút

Agy1 Saccharophagus sp AG21 Yes GH16 69 55 7,6 NA4, NA6 Fe 2+ , Na + ,

RagaA7 Microbulbifer sp JAMB-A7 Yes GH16 49 50 7 NA4 No 398 50% hoạt tính sau khi ủ ở

50ºC trong 502 phút AgaDL6 Flammeovirga sp HQM9 Yes GH16 52,8 50 3 NA4, NA6 Mg 2+ , - Hơn 98% hoạt tính tối đa

Phân loại Protein Chủng Signal peptide Họ GH

Khối lượng phân tử (kDa)

Nhiệt độ tối ưu (℃) pH tối ưu

Sản phẩm phân cắt Co-factor

Aga4 Flammeovirga sp MY04 Yes GH16 - 50 7,5 NA4, NA6 Na + , DTT - Hơn 80% hoạt tính tối đa sau khi ủ ở 50°C trong 1 giờ Aga672 Aquimarina agarilytica ZC1 Yes GH16 98 25 7 NA4 and

Aga3027 Flammeovirga sp OC4 Yes GH16 90 43 9 NA4, NA6 Mn 2+ , Sr 2+ - Hơn 80% hoạt tính tối đa sau khi ủ ở 40°C trong 48 giờ

AgaB Flammeovirga sp OC4 Yes GH16 106 45 8 NA4, NA6 No 700 Hơn 80% hoạt tính tối đa sau khi ủ ở 45°C trong 1 giờ

AgaA Agarivorans sp LQ48 Yes GH16 51 40 7 NA4, NA6 Mn 2+ 909,1 Hơn 80% hoạt tính tối đa sau khi ủ ở 40°C trong 1 giờ

Aga672 Aquimarina agarilytica ZC1 Yes GH16 98 25 7 NA4 and

No 154,3 80% hoạt tính còn lại sau khi ủ ở 40°C trong 1 giờ

Yes GH16 50 45 6,5 NA4, NA6 Co 2+ , Cu 2+ ,

AgaB 34 Agarivorans albus YKW-34 Yes GH16 49 30 7 NA4 No 50 80% hoạt tính còn lại sau khi ủ ở 40°C trong 1 giờ β-agarase Microbulbifer sp Q7 Yes GH16 65 40 6 NA4, NA6 No - 90% hoạt tính còn lại sau khi ủ ở 37°C trong 2 giờ CaAga1 Cellulophaga algicola

Yes GH16 39 40 7 NA4, NA6 Mn 2+ , Fe 2+ ,

36,21 80% hoạt tính còn lại sau khi ủ ở 70°C trong 2 giờ

GH16B Bacteroides uniformis NP1 Yes GH16 - - - NA4, NA6 - - -

DagA Streptomyces coelicolor Yes GH16 32 40 7 NA4, NA6 Co 2+ 39,06 Khả năng chịu nhiệt tốt ở

Phân loại Protein Chủng Signal peptide Họ GH

Khối lượng phân tử (kDa)

Nhiệt độ tối ưu (℃) pH tối ưu

Sản phẩm phân cắt Co-factor

AgaA Marinimicrobium sp H1 Yes GH16 57,5 40 6 NA4 Na + , K + ,

Good thermost ability at 50 °C (Yan, et al., 2020)

Yes GH50 97 55 6 NA4 Co 2+ , Mn 2+ 874,61 Good thermost ability at 45 °C

AgaW Cohnella sp LGH Yes GH50 97 50 7 NA4 (main)

AgaACN41 Vibrio sp strain CN41 Yes GH50 110 40 7,5 NA4 - 5 -

Yes GH50 105 40 7 NA4 No 1700 90% residual activity after incubati ng at 50 °C for 1 h AgWH50 A Agarivorans gilvus

VejGH50 B Vibrio sp EJY3 Yes GH50 111 65 7 NA4 - 43,5 -

VejGH50C Vibrio sp EJY3 Yes GH50 107 45 9 NA4 - 229,8 -

Aga1 Paenibacillus sp SSG-1 Yes GH86 165 40 5 NA4, NA6 - - -

AgaXa Catenovulum sp X3 Yes GH118 52 52 7,4 NA6, NA8,

NA10, NA12, cơ chất tối thiểu là NA8

588,2 90% hoạt tính còn lại sau khi ủ ở 40°C trong 1 giờ

AgaC Vibrio sp PO-303 Yes GH118 47 45 6 NA4, NA6,

Phân loại Protein Chủng Signal peptide Họ GH

Khối lượng phân tử (kDa)

Nhiệt độ tối ưu (℃) pH tối ưu

Sản phẩm phân cắt Co-factor

Khả năng bền nhiệt cơ chất tối thiểu là NA8

AgaJA2 Agarivorans sp JA-1 Yes GH118 52 35 7 NA8 - - -

No GH16 46,9 60 6 NA4, NA6 Na + , K + 1.14 ×

Khả năng chịu nhiệt tốt ở 50 ° C

AgaML Metagenomic library No GH16 71,6 50 7 NA4, NA6 Ca 2+ ,

Khả năng chịu nhiệt tốt ở 55 ° C YM01-1 Catenovulum agarivorans

Hoạt tính tối đa của enzyme phân giải laminarin của N3-1 Microbulbifer sp BN3 và ZgAgaC Zobellia galactanivorans đạt hơn 80% và 90% sau khi ủ ở 50°C trong 1 giờ.

AgaB Zobellia galactanivorans Yes GH16 40 - - NA2, NA4

Yes GH39 134 25 5 NA2, NA4 No 10,7 -

VejGH50A Vibrio sp EJY3 Yes GH50 108 45 7 NA2 - 144,7 -

Phân loại Protein Chủng Signal peptide Họ GH

Khối lượng phân tử (kDa)

Nhiệt độ tối ưu (℃) pH tối ưu

Sản phẩm phân cắt Co-factor

Yes GH50 105 40 7.5–8 NA2 Cu 2+ , Pb 2+ ,

371 - β-agarase Alteromonas sp E-l Yes GH50 89 40 7,5 NA2 K + , Na + ,

AgaB Marinimicrobium sp H1 Yes GH50 88,8 60 7 NA2 Ba 2+ - - β-agarase Pseudomonas atlantica Yes - - - 8 NA2 Na + 88 nmol min -1

Yes GH86 40 50 7 NA2 Ca 2+ , Cd 2+ ,

No GH50 84,6 60 7 NA2 Ca 2+ 9,6 93% hoạt tính còn lại sau khi ủ ở 70°C trong 180 phút

VejGH50D Vibrio sp EJY3 No GH50 85,5 30 7 NA2 - 3,07 -

AgaB Vibrio sp Strain JT0107 No GH50 106 - - NA2 - - -

No GH86 79,73 30 6,5 NA2 Na + , Mg 2+ ,

Agarase

Agar là một trong ba hydrocoloid chính thu được từ môi trường nước, hai loại còn lại là carrageenan và alginate Agar bao gồm agarose và agaropectin trong đó thành phần của mỗi loại khác biệt ở mỗi loại sinh vật và điều này lần lượt ảnh hưởng đến các đặc tính và ứng dụng của agar [10] Đặc tính hóa lý kèm theo là các ứng dụng tương ứng của agar phụ thuộc rất lớn vào tỷ lệ của agarose và agaropectin cũng như thành phần của các nhóm liên kết Agarose có cấu trúc mạch thẳng được sắp xếp xen kẽ hai phân tử β-D-galactose và 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 tạo thành 1 đơn vị neoagarobiose hoặc liên kết α-1,3 tạo thành 1 đơn vị agarobiose (Hình 1.1) Trong khi agaropectin là hỗn hợp dị thể có cấu trúc mạch ngắn, thành phần phân tử tương tự agarose và có thêm các liên kết với các gốc –OSO3-, –OCH3, glucuronate, hoặc pyruvate ở vị trí C2 hoặc C6 của phân tử 3,6- anhydro-α-L-galactose

Hình 1 1 Cấu trúc cơ bản của các dimer lặp lại trong agar

Về khối lượng, agarose có khối lượng phân tử cao trên 100 kDa Trong khi đó, agaropectin có khối lượng phân tử nhỏ hơn dưới 20 kDa, trong thành phần cấu tạo có chứa sulfate từ 5 đến 8% nên thường không được ứng dụng trong thực phẩm [12] Tuy nhiên agaropectin là polysaccharide để tạo thành agarose khi thực hiện loại bỏ bớt hàm lượng sulfate trong cấu tạo của agaropectin Nồng độ agaropectin cao có ở trong

Agar có trong thành tế bào và trong không gian nội bào của tảo đỏ, chủ yếu là những loài thuộc chi Gracilaria, Gelidium và Gelidiella [34] Chúng bao gồm các loài như Gracilaria tikvahiae [35], Gelidium sesquipedale [29], các chi Pterocladia,

Ancatkopeltis và Ceramium [11,37], Gracilaria cliftonii [22], Gracilaria asiatica và Gracilaria lemaneiformis [26] Tảo chứa agar được gọi là agarophytes [10] Ngoài ra, agar cũng có thể thu nhận ở một số loài tảo khác, chẳng hạn như Pyropia yezoensis

[36] Mặc dù thường được sử dụng làm thực phẩm như nori, Pyropia yezoensis cũng là một nguồn agar khác Các loại tảo đỏ có thể được tìm thấy ở môi trường biển, nước lợ và ít phổ biến hơn là một số nước ngọt Ví dụ, Gracilaria tikvahiae là loài đặc hữu của khu vực Tây Bắc Đại Tây Dương của Hoa Kỳ [35], trong khi Gracilaria lemaneiformis phát triển ở Trung Quốc dọc theo bờ biển Bán đảo Liaodong [26]

Một số loài chỉ phát triển tự nhiên ở một số vùng trên thế giới Gelidium là nguồn thu agar tốt nhưng việc canh tác loại tảo này khó khăn và chỉ được trồng ở một số quốc gia và vùng lãnh thổ Trong khi đó, tảo Gracilaria dễ canh tác và được trồng phổ biến trên thế giới Gracilaria được nuôi trong ao, cửa sông, Do vậy, Gracilaria trở thành nguồn sản xuất agar quan trọng trên thế giới

Agar là hỗn hợp của agarose và agaropectin với tỷ lệ khác nhau tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu và quá trình sản xuất Tính chất của từng loại agar có sự khác biệt, tuy nhiên các loại agar đều có một số tính chất lý hóa [32], cụ thể:

Tính tan: Agar không tan trong nước lạnh, tan nhẹ trong ethanolamine và tan tốt trong formamide Khi ở trạng thái ẩm, agar tan tốt trong nước ở 25ºC, ở trạng thái sấy khô agar chỉ tan trong nước nóng Agar sẽ đông lại ở 40-50ºC và nóng chảy ở 80- 85ºC

Agar tạo gel nhờ khả năng chuyển từ cấu trúc cuộn sang xoắn khi đun, tạo mạng lưới nhốt giữ dung dịch thành gel Khác với các chất tạo gel khác, agar không đòi hỏi thêm chất xúc tác (như kali, canxi, đường hay môi trường axit) để tạo gel Nồng độ agar và phân tử lượng ảnh hưởng đến đặc tính và độ bền của gel, phân tử lượng càng lớn, gel càng bền Dung dịch agar 1,5% tạo gel ở nhiệt độ 32-43°C, và không tan chảy dưới 85°C, một đặc tính quan trọng phân biệt agar với các chất tạo gel khác.

Tính chịu nhiệt: Agar chịu nhiệt tốt, khả năng tạo gel không thay đổi ở nhiệt độ trên 100°C và điều này thuận lợi cho việc khử trùng Độ nhớt: Độ nhớt của agar phụ thuộc vào hàm lượng agaropectin Độ nhớt của agar tương đối ổn định ở pH 4,5-9,0 Agar có thể sử dụng tốt trong khoảng pH 5-8

Agar có khoảng lưu giữ và tăng cường mùi vị của sản phẩm khi trộn lẫn, có vai trò cố định mùi vị của thực phẩm Agar tạo gel không hương vị, trong suốt nên có thể được bổ sung thêm đường, glucose, glycerine làm cho thực phẩm có độ sánh hấp dẫn Quá trình tạo gel và tan chảy ở nhiệt độ cao không làm thay đổi thuộc tính ban đầu của agar

Nhờ các đặc tính trên, agar được sử dụng trong chế biến đồ ngọt, phụ gia cho các món nướng, bánh kẹo, sản phẩm từ thịt và các sản phẩm sữa [4] Phần lớn vi sinh vật không có khả năng phân giải agar do vậy giá thể agar được sử dụng phổ biến cho nuôi cấy vi sinh vật Ngoài ra, agar đã được thử nghiệm để sản xuất màng sinh học agar-protein đậu nành để tăng cường tính chất hóa lý, làm giảm độ hòa tan của màng và cho phép lưu giữ các hoạt chất sinh học Agar còn được ứng dụng trong ngành dệt, sản xuất thực phẩm chức năng, phát triển vật liệu thông minh, vật liệu composite, vật liệu hấp phụ, [12]

Agarase là enzyme thuộc nhóm glycoside hydrolase có khả năng thủy phân agar tạo thành các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp Agarase được chia làm hai loại enzyme là α-agarase (EC 3.2.1.158) phân cắt liên kết α-1,3-glycoside và β- agarase (EC 3.2.1.81) phân cắt liên kết β-1,4-glycoside trong nội phân tử agar tạo các

CaZy Khối lượng phân tử của chúng có sự chênh lệch lớn từ 20 đến 360 kDa Enzyme nhỏ nhất được tìm thấy ở chủng vi khuẩn Vibrio sp AP-2 từ tảo biển với khối lượng

Khối lượng phân tử của agarase khác nhau tùy theo nguồn gốc vi khuẩn Enzyme agarase nhỏ nhất được tìm thấy ở vi khuẩn Alteromonas agarlyticus GJ1B từ nước biển với khối lượng 20 kDa, trong khi enzyme lớn nhất có mặt ở vi khuẩn từ đất như Bacillus sp MK03 với khối lượng lên đến 113 kDa Kích thước của agarase từ vi khuẩn nước ngọt như Cytophaga flevensis thường nhỏ hơn, khoảng 26 kDa.

1 có hoạt tính đặc hiệu đạt 397 U/mg, cao nhất trong tất cả các enzyme đã công bố trước năm 2010 [24]

Hình 1 2 Sơ đồ vị trí phân cắt của agarse

Tình hình nghiên cứu trong nước

Liên quan trực tiếp tới enzyme agarase từ vi sinh vật, Nguyễn Thị Hồng Liên và cộng sự (2020) đã phân lập vi sinh vật sinh enzyme agarase từ nước biển và xác định hoạt tính của enzyme [3] Từ 8 mẫu nước biển thu thập tại các địa điểm khác nhau ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, đã phân phập được 21 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải agar trên đĩa thạch với đường kính vòng phân giải dao động từ 4,0 đến 7,0 cm sau 2 ngày ủ ở nhiệt độ phòng Năm chủng vi khuẩn (M1, M5, M7, M62B, và M71) tạo đường kính vòng phân giải lớn nhất có hoạt độ enzyme agarase thô được xác định trong khoảng 0,15 – 0,22 U/mL khi phản ứng với cơ chất agarose, và có trình tự 16S rDNA tương đồng (> 96%) với chi Vibrio Trong đó, chủng vi khuẩn

Trong đánh giá khả năng phân giải rong biển, chủng vi khuẩn M71 nổi bật với hoạt tính agarase cao nhất Sử dụng dịch chiết thô chứa enzyme từ chủng M71 với nồng độ 5% (v/v) đã tạo ra hiệu quả thủy phân mạnh mẽ đối với rong đỏ Gracilaria Sau 24 giờ ủ ở nhiệt độ 40°C, lượng đường khử giải phóng đạt tới 915 µM/mL, chứng minh tiềm năng phân giải rong biển đáng kể của chủng vi khuẩn này.

Liên quan tới ứng dụng của agarase trong sản xuất agarooligosaccharide (AOS) làm prebiotics, Nguyễn Trọng Hải (2016) đã phân lập được 64 chủng vi sinh vật (trong đó có 26 nấm mốc) sinh agarase [1] Kết hợp sàng lọc theo hoạt tính thủy phân agar, agarose và khả năng tạo prebiotic đã chọn được chủng Penicillium oxalicum HL28 sinh tổng hợp agarase cho mục tiêu tạo AOS Agarase sinh tổng hợp từ chủng P oxalicum HL28, được làm sạch qua lọc màng Cut-off 10 kDa, tủa muối ammonium sulfate 60 - 70%, lọc gel Sephadex G50 Hoạt độ riêng thu được là 0,415 U/mg, hiệu suất thu hồi đạt 2,06% Khối lượng phân tử khoảng 44 kDa, là endoagarase, phân cắt tốt các liên kết β-glycoside như CMC, guar gum, agarose Hoạt động tối ưu ở 50°C và pH 7, bị kìm hãm bởi EDTA và các ion Mg 2+ , Cu 2+ , EDTA,

Fe 2+ (1mM), hoạt hóa bởi các ion Zn 2+ , Na + , K + , Mn 2+ , Ba 2+ , Ca 2+ (1mM) Giá trị động học enzyme tinh sạch với cơ chất agarose là Km: 2,23 mg/ml; Vmax: 1,1 U/mg Agarase từ P oxalicum HL28 được thử nghiệm thủy phân agarose tạo prebiotic

Như vậy, hiện còn khá ít nghiên cứu tới enzyme thủy phân agar và chưa có nghiên cứu tạo agarase tái tổ hợp nào được thực hiện Việc sử dụng enzyme agarase phân cắt đặc hiệu các liên kết nội phân tử agar sẽ giúp định hướng thành phần sản phẩm, đặc tính hóa lý và phổ ứng dụng đa dạng cho agar trong công nghiệp thực phẩm, công nghệ sinh học, y học, dược phẩm và hóa học.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Trong luận văn này, 120 chủng vi khuẩn phân giải agar phân lập tại Việt Nam đang lưu giữ tại Sưu tập Giống Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm được sử dụng phục vụ nghiên cứu (Bảng 3.1).

Hóa chất và thiết bị

Hóa chất dùng cho nuôi cấy:Agar, CuSO4, Na2SO4, Na2CO3, NaHCO3,

C4H4O6KNa.4H2O, MoO3.H2O, H3AsO4, H2SO4, FeSO4, CaCl2, MgSO4, (NH4)2SO4,

Các hóa chất thường dùng cho nuôi cấy và phân tích bao gồm K2HPO4, NaCl, Na2HPO4, NH4Cl, EDTA, FeCl3.6H2O, ZnCl2, CuCl2.2H2O, CoCl2.H2O, H3BO3, MnCl2.4H2O, biotin, thiamin, agar, axit citric, cao nấm men, glycin, HCl, NaOH, NH4NO3 Nguồn gốc của các hóa chất này rất đa dạng, có thể từ Ấn Độ, Hàn Quốc, Trung Quốc và cả Việt Nam.

Hóa chất dùng cho điện di protein: Acrylamide (Sigma, Mỹ); Tris-base

(Sigma, Mỹ); Ammonium per sulfate (Sigma, Mỹ); Glycine (Scharlau, Tây ban Nha); Methanol (Scharlau, Tây ban Nha); N’N’-bis-methylene-acrylamide (Merck, Đức); HCl; Sodium dodecyl sulfate (Scharlau, Tây ban Nha); Acetic acid (Scharlau, Tây ban Nha), Marker protein #26610 (Thermo scientific, Mỹ), Comassie blue briliant R250 (Merck, Đức),

Hóa chất dùng cho sinh học phân tử: Enzyme Taq DNA Polymerase (Thermo scientific, Mỹ), dNTPs (Thermo scientific, Mỹ), thanh chuẩn DNA 1kb (Thermo scientific, Mỹ); Agarose dùng trong điện di DNA (Biobasis, Canada); Ethidium bromide (Pharmacia-Biotech),

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị, máy móc: máy lắc ổn nhiệt (Grant), box cấy (Bioblock-Scientific), cân điện tử (Precisa), máy đo pH (Toledo), máy ly tâm lạnh cao tốc (Sorvall), Kính hiển vi kỹ thuật số StereoBlue SB 1903 (Euromex), kính hiển vi quang học Eclipse E600 (Nikon), nồi hấp thanh trùng (Himayatoko), …

Dụng cụ: Đĩa Petri, bình tam giác các loại, pipet tự động các loại, đầu côn các loại, ống falcon, ống nghiệm, ống Eppendorf, ống đong, cốc đong, đèn cồn, bình schott.

Môi trường nghiên cứu

Môi trường làm giàu vi sinh vật (MSA): CaCl2 0,1 g/L; FeSO4 0.05 g/L; MgSO4 0,5 g/L; (NH4)2SO4 0,5 g/L; K2HPO4 0,5 g/L; NaCl 0,5 g/L; Agar 2 g/L.Cân các thành phần muối khoáng, hòa tan trong nước RO, chỉnh pH về 7,0 bằng dung dịch HCl 5N Bổ sung agar rồi hấp khử trùng 121°C trong 15 phút

Môi trường nuôi cấy (MSAY): CaCl2 0,13 g/L; MgSO4.7H2O 1,02 g/L; (NH4)2SO4 0,5 g/L; K2HPO4 0,65 g/L; NaCl 0,5 g/L; Yeast extract 2 g/L; Agar 20 g/L Cân các thành phần muối khoáng, hòa tan trong nước RO, chỉnh pH về 7,0 bằng dung dịch HCl 5N Bổ sung agar rồi hấp khử trùng 121°C trong 15 phút Để nguội sau đó đổ đĩa

Môi trường làm giàu vi sinh vật (M9): Bổ sung Agar 1 g vào 867 ml nước rồi hấp khử trùng 121°C trong 15 phút, thêm vào các thành phần như sau:

100 ml M9 salt solution (10X) Na2HPO4 33.7 mM

1 ml Biotin (1 mg/ml) Biotin 1 μg

1 ml Thiamin (1 mg/ml) Thiamin 1 μg

10 ml Trace elements solution (100X) Trace elements 1X

Môi trường nuôi cấy (M9 agar) bao gồm: 16 g Agar hòa tan trong 867 ml nước, hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút Sau đó thêm các thành phần khác và lắc đều Để nguội rồi đổ đĩa.

Hòa tan 5g EDTA trong 800ml nước Điều chỉnh pH đến 7,5 bằng NaOH Tiếp theo, thêm các thành phần còn lại theo tỉ lệ đã định trước rồi thêm nước để đạt thể tích cuối cùng là 1L Lọc dung dịch qua màng lọc 0,22μm để khử trùng.

Biotin (1 mg/ml): Đối với 50 ml dung dịch gốc, hòa tan 50 mg biotin trong

45 ml nước Thêm từng lượng nhỏ NaOH 1N cho đến khi biotin tan hết Thêm nước đến thể tích cuối cùng là 50 ml Khử trùng dung dịch qua bộ lọc 0,22 μm Chuẩn bị phần định lượng 1 ml và bảo quản ở-20 °C

Pha chế dung dịch gốc thiamin với nồng độ 1 mg/ml: Hòa tan 50 mg thiamin-HCl trong 45 ml nước, thêm nước cất đến thể tích cuối cùng 50 ml Lọc dung dịch qua bộ lọc 0,22 μm để khử trùng Chuẩn bị phần định lượng 1 ml và bảo quản ở nhiệt độ -20 °C.

M9 salt solution (10X): Na2HPO4.2H2O 75.2 g/L, KH2PO4 30 g/L, NaCl 5 g/L, NH4Cl 5 g/L Hòa tan các muối trong 800 ml nước và điều chỉnh pH đến 7.2 bằng NaOH Định mức đến 1000ml rồi hấp khử trùng 121°C trong 15 phút

1 M MgSO 4 : Đối với 100 ml dung dịch gốc, hòa tan 24,65 g MgSO4.7H2O trong 87 ml nước rồi hấp khử trùng 121°C trong 15 phút

1 M CaCl 2 : Đối với 100 ml dung dịch gốc, hòa tan 14,70 g CaCl2.2H2O trong 94,5 ml nước rồi hấp khử trùng 121°C trong 15 phút

Môi trường nuôi sinh enzyme (MSAY): CaCl2 0,13 g/L; MgSO4.7H2O 1,02 g/L; (NH4)2SO4 0,5 g/L; K2HPO4 0,65 g/L; NaCl 0,5 g/L; Yeast extract 2 g/L; Agar

1 g/L Cân các thành phần muối khoáng, hòa tan trong nước RO, chỉnh pH về 7,0 bằng dung dịch HCl 5N Bổ sung agar rồi hấp khử trùng 121°C trong 15 phút

Lưu ý: Bổ sung thêm NaCl 2,5% khi nuôi cấy mẫu có nguồn gốc từ biển.

Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp bảo quản và nuôi cấy vi khuẩn phân giải agar

Lấy 1 chấm đầu que cấy khuẩn lạc vi khuẩn cần làm sạch và cấy ria lên đĩa Petri chứa môi trường MSA, sau đó đem nuôi ở nhiệt độ 28°C trong 2-4 ngày Khi thấy khuẩn lạc đã mọc và làm lõm thạch mà không thấy xuất hiện khuẩn lạc khác lạ thì chọn lấy một khuẩn lạc riêng rẽ và cấy giữ giống vào trong ống nghiệm nút cao su chứa môi trường MSA Đem các ống nghiệm nuôi cấy ở nhiệt độ 28°C trong 4-7 ngày, sau đó cất giữ trong tủ mát Trường hợp vi khuẩn chưa sạch (có khuẩn lạc lạ) thì phải làm sạch lại như cách trên Phương pháp được xây dựng tại phòng thí nghiệm

2.4.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA vi khuẩn [16]

Dùng pipet lấy một lượng sinh khối vi sinh vật cho vào ống Eppendorf chứa

Lấy 750 µl dung dịch SSC 2x Sau đó, ủ các ống Eppendorf trên ở 100°C trong 10 phút và ly tâm 12000 vòng/phút/10°C Bỏ dịch, giữ phần sinh khối, thêm vào 750 µl nước khử ion để rửa sạch tế bào và ly tâm 12000 vòng/phút/1 phút/10°C Dùng pipet loại bỏ 650 µl, trong ống Eppendorf còn khoảng 100 µl dịch và tế bào Bổ sung vào mỗi ống Eppendorf.

100 àl hạt thủy tinh và 100 àl dung dịch Phenol:Chloroform (50:50) Đưa vào mỏy phá tế bào trong 1 phút Sau đó ly tâm ở 13000 rpm trong 10 phút ở 10°C, thu khoảng

50 àl dịch trong phớa trờn cựng chuyển sang Eppendorf mới

Cho vào mỗi Eppendorf ở trờn 150 àl dung dịch binding buffer + silica đó được ủ tại 50ºC trong khoảng 30 phút Ủ tại nhiệt độ phòng khoảng 1-2 phút để DNA bám vào hạt silica Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 10 ° C, loại sạch dịch trong ống thu kết tủa Kết tủa được rửa với 500 àl washing buffer, sau đú ly tõm 12000 rpm trong 1phút Lặp lại 3 lần để làm sạch DNA Để khô phần kết tủa trong 15 phút ở box vụ trựng Bổ sung 15 àl nước PCR và ủ ở 55°C trong 5 phỳt để DNA hũa tan vào nước Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút Dịch DNA sau đó được bảo quản ở-20°C

2.4.3 Phương pháp định danh vi khuẩn dựa trên đoạn gen 16S rDNA [16]

PCR gen định danh vi sinh vật

Thành phần phản ứng PCR gồm: 5 µl 10× Polymerase Buffer; 1 µl 10 µM mồi xuôi 16S27F; 1 µl 10 µM mồi ngược 16S1492R; 1 µl 10 mM dNTPs; 0,25 µl DNA polymerase (5 đơn vị/µl); 2 µl DNA khuôn; 40 µl nước khử ion Sau đó tiến hành chạy phản ứng trên máy PCR C1000 Touch Thermal Cycler theo chu trình: 94°C: 3 phút; (94°C: 30 giây, 52°C: 30 giây, 72°C: 1 phút) × 30; 72°C: 10 phút; 10°C: ∞ Sản phẩm PCR được bảo quản ở -20°C và kiểm tra bằng điện di DNA.

Bản gel được chuẩn bị bằng agarose 1% trong dung dịch TAE 0,5×, đặt trong lò vi sóng để agarose tan hoàn toàn, sau khi nguội bớt, agarose được đổ vào khuôn có lược cài sẵn để tạo bản gel với số giếng nạp mẫu cần thiết Chờ 30 phút cho agarose đông, gỡ lược, đặt bản gel vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE 0,5× ngập trên bản gel khoảng 1-2 mm Trộn đều các mẫu DNA cần chạy điện di với loading dye theo tỉ lệ 4:1, nhỏ vào cỏc giếng trờn bản gel, đồng thời một giếng chạy 2 àl DNA thang chuẩn 1kb (Thermo scientific) Chạy điện di ở 50V trong 10 phút, sau đó điều chỉnh lên 100V trong 25 phút

Nhuộm DNA và đọc kết quả

Kết thúc điện di, gel được lấy ra và nhuộm với Ethyldium bromide (EtBr) trong 20 phút, sau đó vớt gel ra và rửa bằng nước để loại bỏ Ethyldium bromide bám không đặc hiệu Sau khi rửa, các băng DNA được quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng

UV bằng máy soi gel SynGene Đọc trình tự DNA và dựng cây phân loại

Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc sử dụng kit BigDye® Terminator v3.1 Sequencing Standard (Thermo, Mỹ) theo hướng dẫn của hãng Máy đọc trình tự, model 3500 Genetic analyzer của hãng Thermo được sử dụng Các chuỗi ADN được so sánh với cơ sở dữ liệu của GenBank thông qua giao diện tìm kiếm giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide đặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov hoặc http://www.ezbiocloud.net/ Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó xử lý bằng phần mềm BioEdit Sau đó sử dụng chương trình MEGA 11 để xây dựng cây phân loại nhằm xác định vị trí phân loại của chủng vi sinh vật quan tâm

2.4.4 Phương pháp nuôi thu enzyme phân giải agar

Chuẩn bị chủng giống: Cấy các chủng vi khuẩn được bảo quản lạnh trong ống thạch nghiêng MSAY sang đĩa MSAY nuôi ở 30°C trong 2-3 ngày để hoạt hóa giống, giống sau khi được hoạt hóa sẽ được cấy lại vào ống thạch nghiêng, nuôi trong vòng 2-3 ngày ở 30°C để giống mọc kín bề mặt thạch, cung cấp giống cho nuôi chiết enzyme

Cỏch vào giống: Lấy ẳ đầu que cấy sinh khối vi khuẩn cho vào mụi trường nuôi chiết enzyme nuôi ở 30°C trong 2 ngày Trong quá trình nuôi thì quan sát khả năng phát triển của chủng

Thu chiết enzyme: Dịch sau nuôi ly tâm 4500 rpm trong 15 phút Ly tâm thu lấy dịch chiết và bảo quản ở-20°C

Phương pháp được xây dựng tại phòng thí nghiệm

2.4.5 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE [39]

Nguyên tắc: Dựa trên quá trình dịch chuyển của các phân tử protein tích điện trong một dung dịch đặt trong điện trường Vận tốc dịch chuyển của các phân tử mang điện phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của phân tử do đó các phân tử protein khác nhau sẽ có vận tốc dịch chuyển khác nhau, nhờ đó mà có thể phân tách một hỗn hợp protein

Chuẩn bị mẫu: Lấy khoảng 80 àl enzyme vào cỏc effendoff, thờm 20 àl loading dye 4X, đun 100 ºC, 1 phút, sau đó làm lạnh, spin lại trước khi điện di Hút

15 àl mẫu sau xử lớ điện di

Chuẩn bị gel: Sau khi lắp kính thật khít, cài lược vào khuôn và đánh dấu bên ngoài để mép gel cách chân lược khoảng 0.4 cm, đổ lớp separating gel đến mức đánh dấu rồi cho ngay 1 lớp nước cất lên bề mặt Chờ 30 phút để lớp running gel đông, đổ nước cất đi, cài lược và đổ tiếp lớp stacking gel, chờ 30 phút để gel đông Đặt bản gel vào buồng điện di, đổ dung dịch điện giải 1x đến vạch quy định của thiết bị, gỡ lược, loại bỏ các mẩu gel thừa bên trên giếng để giếng sạch, khi load mẫu sẽ dễ dàng hơn

Phần gel phân tách 10% (Running gel)

Phần gel cô 5% (Stacking gel)

Sau khi đổ lớp gel phân tách thì cho ngay một lớp ethanol 100% lên trên, chờ

Đưa gel vào tủ lạnh để cô đặc trong 30 phút Sau đó, loại bỏ lớp ethanol và đổ thêm lớp gel cô đặc Đặt lược chải vào gel và tiếp tục đông tụ trong 30 phút Cuối cùng, đặt bản gel vào buồng điện di, tiến hành nạp mẫu và chạy điện áp 120 V trong vòng 2 giờ để hoàn tất quá trình điện di.

Tiến hành nhuộm gel đối với SDS-PAGE: Nhuộm gel trong Coomassie brilliant blue ở 50°C trong 1 giờ hoặc lâu hơn để Coomassie brilliant blue bắt màu với protein Tẩy màu bằng dung dịch tẩy I trong 30 phút, lặp lại 2 lần Ngâm gel trong dung dịch tẩy II ở nhiệt độ thường, kèm theo lắc tới khi thấy rõ các vạch protein Quan sát, chụp ảnh gel để lưu kết quả

2.4.6 Phương pháp điện di Zymogram [39]

Nguyên tắc: trước tiên hỗn hợp gồm các enzyme và protein được phân tách trên gel SDS-PAGE có bổ sung cơ chất Sau khi phân tách phản ứng enzyme được tiến hành trong gel, emzyme có mặt sẽ thủy phân cơ chất Sau phản ứng, bản gel sẽ được nhuộm bằng Lugol (5% I2 + 10% KI) [39] Những phần cơ chất bị enzyme thủy phân sẽ không bắt màu thuốc nhuộm, và do đó tạo nên các băng màu sáng hơn so với màu nền của gel

Chuẩn bị mẫu: Lấy khoảng 80 àl enzyme vào cỏc effendoff, thờm 20 àl loading dye 4X, đun 100 ºC, 2 phút, sau đó làm lạnh, spin lại trước khi điện di Hút

15 àl mẫu sau xử lớ điện di

Thành phần gel: tương tự phương pháp điện di SDS-PAGE, chỉ thay cơ chất agarose 0,1 % trong đệm Tris-HCl 20 mM pH 8.0 vào nước cất trong running gel

Tiến hành: tiến hành tương tự như SDS-PAGE nhưng phần nhuộm gel thì làm như sau:

-Ngâm gel trong dung dịch 2% Triton X-100 ngập gel, lắc 30 phút (làm 2 lần) -Ngâm gel trong 100ml dung dịch đệm 20 mM Tris-HCl pH 8.0 lạnh, lắc 15 phút (làm 2 lần)

-Ngâm gel trong đệm 20 mM Tris-HCl pH 8.0 nóng (ủ 37˚C), để ít nhất là 1 giờ

-Nhuộm gel bằng dung dịch Lugol (5% I2 + 10% KI), lắc đều, quan sát băng enzyme xuất hiện trên gel và chụp ảnh

2.4.7 Xác định hoạt tính enzyme bằng Somogyi-Nelson [30] Định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính agarase (U) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1μmol đường khử trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm

Chuẩn bị các dung dịch: