Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của loài Ô rô hoa tím (acanthus ilicifolius l )

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của loài Ô rô hoa tím (acanthus ilicifolius l ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của loài Ô rô hoa tím (acanthus ilicifolius l )

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lê Thị Mỹ Hạnh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG

VIÊM CỦA LOÀI Ô RÔ HOA TÍM (Acanthus ilicifolius L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lê Thị Mỹ Hạnh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG

VIÊM CỦA LOÀI Ô RÔ HOA TÍM (Acanthus ilicifolius L.)

Chuyên ngành : Hóa Hữu cơ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn : TS Lê Thị Huyền

PGS.TS Nguyễn Thị Mai

LỜI CẢM ƠN

Luận văn thạc sĩ khoa học này được hoàn thành tại Phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Phòng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc TS Lê Thị Huyền và PGS.TS Nguyễn Thị Mai đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, cộng sự và những người thân đã luôn quan tâm, động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 10 năm 2023 Học viên

Lê Thị Mỹ Hạnh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN I DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT V DANH MỤC HÌNH VII DANH MỤC BẢNG IX

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về chi Acanthus 3

1.1.1 Giới thiệu về họ ô rô (Acanthaceae) 3

1.2.3 Hoạt tính chống ung thư 15

1.3 Giới thiệu về loài ô rô hoa tím (Acanthus ilicifolius L ) 16

1.3.1 Đặc điểm thực vật 16

1.3.2 Công dụng 17

1.3.3 Tình hình nghiên cứu 17

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp chiết nguyên liệu thực vật 19

2.3 Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập các hợp chất 19

2.3.1 Phương pháp chiết hai pha lỏng – lỏng 19

2.3.2 Sắc ký lớp mỏng 19

2.3.3 Sắc ký cột (CC) 20

2.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 20

2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ 20

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 29

3.1.1 Hợp chất 1: (2R,3R,4R)-3,4-dihydroxy-7-methoxyflavan D-apiofuranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 64

PHỤ LỤC 65

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ALP Alkaline phosphatase Phosphatase kiềm

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

CC Column Chromatography Sắc ký cột

COSY 1H-1H- Correlation Spectroscopy Phổ COSY

COX Cyclooxygenases Enzyme tổng hợp prostaglandin DEPT Distortionless Enhancement by

iNOS Inducible nitric oxide synthase Enzyme tạo ra nitric oxide từ

amino L-arginine acid

JAK2 Janus kinase 2 Một enzyme thuộc tyrosine

kinase MC3T3-E1 Dòng tế bào nguyên xương MBC Minimum bactericial

concentration

Nồng độ kháng sinh tối thiểu

MIC Minimal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

L-929 Mouse fibrolast cell line from a

C3H/An male mouse

Dòng tế bào nguyên sợi ở chuột đực C3H/An

LOX Lipoxygenase Enzyme oxy hóa chất béo NOESY Nuclear Overhauser Enhancement

Spectroscopy

Phổ NOESY

PBMC Peripheral Blood Mononuclear

Cells

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi

RAW264.7 A macrophage cell line Dòng tế bào đại thực bào

STAT3 Signal transducer and activator of

transcription 3

Bộ chuyển đổi tín hiệu và chất kích hoạt phiên mã 3

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

TNF Tumor Necrosis Factors Yếu tố hoại tử khối u

κB Kappa B Tế bào hoạt hóa B

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây sâm đất 3

Hình 1.2: Cây xuyên tâm liên 3

Hình 1.3: Hình ảnh loài Acanthus ilicifolius 4

Hình 1.4: Cấu trúc các hợp chất alkaloid từ chi Acanthus 6

Hình 1.5: Cấu trúc các hợp chất terpenoid từ chi Acanthus 7

Hình 1.6: Cấu trúc các hợp chất flavonoid từ chi Acanthus 9

Hình 1.7: Cấu trúc các hợp chất khác từ chi Acanthus 13

Hình 1.8: Hình ảnh loài ô rô hoa tím 16

Hình 2.1: Sơ đồ chiết vỏ và thân cây loài A ilicifolius 24

Hình 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài A ilicifolius 25

Hình 3.13: Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 37

Hình 3.14: Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 39

Hình 3.15: Cấu trúc hóa học của hợp chất 5 40

Hình 3.16: Các tương tác HMBC chính của hợp chất 5 41

Hình 3.17: Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 42

Hình 3.18: Các tương tác HMBC chính của hợp chất 6 43

Hình 3.19: Cấu trúc hóa học của hợp chất 7 44

Hình 3.20: Các tương tác HMBC chính của hợp chất 7 46

Hình 3.21: Cấu trúc hóa học của hợp chất 8 46

Hình 3.22: Các tương tác HMBC chính của hợp chất 8 48

Hình 3.23: Cấu trúc hóa học của hợp chất 9 48

Hình 3.24: Cấu trúc hóa học của hợp chất 10 49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các hợp chất alkaloid phân lập từ chi Acanthus 5

Bảng 1.2: Các terpenoid phân lập từ chi Acanthus 6

Bảng 1.3: Các flavonoid phân lâp từ chi Acanthus 8

Bảng 1.4: Các chất phân lập từ chi Acanthus 10

MỞ ĐẦU

Thế giới thực vật là nguồn cung cấp phong phú các hoạt chất thiên nhiên đắt giá trong ngành công nghiệp thuốc và dược mỹ phẩm Trên thế giới, đã công bố hơn 265.000 loài thực vật Trong đó, có 150.000 loài được phân bố ở các vùng nhiệt đới, 35.000 loài có ở các nước ASEAN Hiện nay, đã có 0,5%, nghĩa là 1.300 loài được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và chứng minh về giá trị chữa bệnh

Việt Nam là đất nước có địa hình chữ S đặc trưng với khí hậu nhiệt đới gió màu quanh năm giúp cho thảm thực vật trở nên đa dạng và phong phú Từ xa xưa, người nước Nam đã biết kết hợp các loại thực vật tạo nên các vị thuốc dân gian còn lưu truyền đến ngày nay Trong những năm gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng và trị bệnh trở nên phổ biến hơn ở các nước Đông Nam Á Với những điều kiện thuận lợi trên cùng với việc kế thừa những tiến bộ khoa học kỹ thuật, việc nghiên cứu phân lập các hợp chất thiên nhiên mang hoạt tính sinh học càng được quan tâm hơn

Chi Acanthus được nhân dân sử dụng trong nhiều bài thuốc điều trị chứng

viêm, mặt khác các nghiên cứu trong và ngoài nước bước đầu cho thấy các hợp chất được phân lập từ chi này có khả năng ức chế hoạt động của một số chủng vi khuẩn

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng 2-benzoxazolinone từ loài ô rô hoa tím Acanthus

illicifolius là hoạt chất chính có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của ký sinh trùng Leishmanicidal – gây viêm loét ở da, niêm mạc và nội tạng [4] Ở vùng tây Bengal,

loài ô rô hoa tím được sử dụng phổ biến nhờ khả năng chữa lành các vết thương Theo

các tài liệu y học dân tộc, lá A ilicifolius được sử dụng để điều trị bệnh thấp khớp,

rắn cắn, tê liệt và hen suyễn [7] Các chiết xuất từ loài này giàu các hoạt chất thuộc nhóm lignan và megastigmane glycoside, chúng có tác dụng mạnh trong giảm đau và kháng viêm [26],[57]

Xuất phát từ các các vấn đề nêu trên, nhóm nghiên cứu đề xuất thực hiện đề

tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của loài ô rô hoa

Mục tiêu của luận văn: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hoá học chủ yếu của loài ô rô hoa tím Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm một số chất có hoạt tính, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo

Nội dung luận văn bao gồm:

1 Phân lập các hợp chất từ loài ô rô hoa tím (A ilicifolius) bằng các phương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Giới thiệu về họ ô rô (Acanthaceae)

Họ ô rô (Acanthaceae) nằm trong bộ Lamiales mang đặc điểm của loài thực vật thân thảo, cây bụi hay dây leo nhiệt đới; một số có gai Lá đơn, mọc đối xếp chéo chữ thập với mép lá nhẵn (hoặc đôi khi có răng cưa hay thùy) Cụm hoa hình đầu mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thường có màu tím đỏ hoặc trắng

Theo dân gian, các loài thực vật thuộc họ này được phổ biến rộng rãi làm thuốc

như: loài Ruellia tuberosa L (cây nổ hay sâm đất) (Hình 1.1) có tác dụng hỗ trợ thận

và bàng quang Tại một số nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, … loài

Andrographis paniculata (Burm.f.) Wall ex Nees (cây xuyên tâm liên)

được sử dụng theo dân tộc học để điều trị rắn cắn, bọ cắn, tiểu đường, kiết lỵ , sốt và sốt rét [12]

Hình 1.1: Cây sâm đất Hình 1.2: Cây xuyên tâm liên Acanthaceae là một họ lớn gồm 250 chi và hơn 2700 loài phân bố chủ yếu ở Nam và Đông Nam Á, ở châu Phi và Nam Mỹ [43] Ở Việt Nam có khoảng 55 chi và khoảng 195 loài

1.1.2 Chi Acanthus

Acanthus là một chi thuộc họ ô rô (Acanthaceae) phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt

đới và cận nhiệt đới, có khoảng 30 loài phổ biến được biết đến Hầu hết các loài thuộc chi này đều là cây thân thảo cao khoảng 2 m, mọc theo bụi, lá mọc đối nhau và tập

trung ở gốc cây Lá nguyên hoặc có răng cưa, tán dài hình lông chim Hoa mọc thẳng thành cụm tập trung ở đầu cây và lưỡng tính

Trong Y học cổ truyền, nhiều loài thuộc chi Acanthus có tác dụng chống ung

thư, trị đái tháo đường, kháng viêm và chống nhiễm trùng,…[43]

Hình 1.3: Hình ảnh loài Acanthus ilicifolius

Từ thời cổ đại, các loài thuộc chi Acanthus (điển hình là loài A ilicifolius)

được sử dụng dưới dạng thuốc đắp, thuốc sắc cho thấy khả năng chống viêm trong điều trị các bệnh về vết thương hở, vết bỏng, các bệnh về da liễu,… Ngoài ra, chúng còn được biết đến là một loại cây cảnh Địa Trung Hải phổ biến được trồng trong khuân viên và được trạm trổ thành hoa văn trang trí các đầu cột trong kiến trúc Hy Lạp [41]

1.1.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Từ xa xưa, các loài ô rô được sử dụng rất nhiều trong các bài thuốc dân gian

Điều này đã đặt nền tảng cho nghiên cứu thành phần hóa học của chi Acanthus từ

sớm Zhang và cộng sự (2004) đã phát hiện một số hợp chất thuộc nhóm glycoside

có khả năng chống oxy hóa và kháng viêm Một số loài thuộc chi Acanthus được các

nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh

học như A ilicifolius, A ebracteatus, A volubilis, A integrifolius Trong đó, loài A

ilicifolius được tập trung nghiên cứu nhiều nhất Các nghiên cứu hóa sinh của Singh

cùng công sự (2011) đã công bố rất nhiều hợp chất hóa học mang hoạt tính sinh học thuộc các nhóm chất: alkaloid, phenylethanoid, lignan, flavonoid, megastigmane, alcohol glycoside [14],[58]

1.1.4 Alkaloid

Alkaloid là nhóm chất phổ biến trong chi Acanthus, các hợp chất này xuất hiện

chủ yếu dưới dạng khung benzoxazinoid Phần lớn số lượng alkaloid phân lập được

từ Acanthus có nhiều giá trị về nghiên cứu hoạt tính sinh học, dưới đây là các alkaloid

đã được phân lập và công bố

Bảng 1.1: Các hợp chất alkaloid phân lập từ chi Acanthus

Hình 1.4: Cấu trúc các hợp chất alkaloid từ chi Acanthus

1.1.5 Terpenoid

Terpenoid là một nhóm các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ tự nhiên chứa

các đơn vị isoprene, và là một trong những lớp chất chính của chi Acanthus Cho đến

nay, có khoảng 17 hợp chất terpenoid được công bố (21-38) từ chi Acanthus

Bảng 1.1: Các hợp chất terpenoid phân lập từ chi Acanthus

31 3β,24-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid A monanus [1]

tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa để thu hút nhiều động vật đến thụ phấn Flavonoid là

Bảng 1.2: Các flavonoid phân lâp từ chi Acanthus

Hình 1.6: Cấu trúc các hợp chất flavonoid từ chi Acanthus (Tiếp)

1.1.7 Các hợp chất khác

Trong chi Acanthus còn phân lập được nhiều hợp chất thuộc các nhóm như

triterpene, lignan, megastigmane, phenolic, ….Dưới đây là một số chất tiêu biểu

Bảng 1.3: Các hợp chất khác phân lập từ chi Acanthus

72 Stigmasterol octadecanoate A ilicifolius [62]

74 Stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside A ilicifolius [62]

75 (+)-Lyoniresinol 3α-O-β-glucopyranoside A ilicifolius [57]

76 (-)-Lyoniresinol 3α-O-β-glucopyranoside A ilicifolius [57]

Hình 1.7: Cấu trúc các hợp chất khác từ chi Acanthus

Hình 1.7: Cấu trúc các hợp chất khác từ chi Acanthus (Tiếp)

1.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn

A ilicifolius được sử dụng như một loại thuốc truyền thống ở Ấn Độ để điều

trị bệnh thấp khớp, hen suyễn, tê liệt, bệnh vẩy nến Năm 2008, theo nghiên cứu của trường đại học Tây Bengal, khả năng bảo vệ gan và chống vi khuẩn từ dịch chiết ethanol, butanol và chloroform của lá và rễ của loài này đã thử nghiệm với 4 loại vi

khuẩn: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và

Proteus vulgaris và 3 loại nấm: Candida albicans, Aspergillus fumigatus và Aspergillus niger Kết quả cho thấy, chiết xuất cồn và chloroform của lá có tác dụng

ức chế mạnh đối với B subtilis, S aureus, C albicans, A fumigatus và A niger và

có tác dụng ức chế vừa phải đối với P aeruginosa và P vulgaris Ngoài ra, dịch chiết

chloroform cho giá trị MIC (0,5 mg/mL) và MBC (2 mg/mL) thể hiện hoạt tính chống lại mầm bệnh trên da mạnh nhất so với các các dịch khác Những kết quả này cho

thấy các dịch chiết từ A ilicifolius có khả năng ức chế hoạt động của một số loại nấm

gây viêm nhiễm và có tác dụng kháng khuẩn [11],[14],[45]

Năm 2004, Bravo và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của 2 dẫn

xuất của benzoxazole được phân lập từ loài A ilicifolius: 3,5-dimethyl-4-hydroxy

benzoate và 3,5-dimethoxy-4-hydroxy methyl benzoate trên 2 loại vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) Kết quả cho thấy, 3,5-dimethyl-4-hydroxy benzoate có tác dụng ức

Đồng thời, 2 dẫn xuất benzoxazole trên đều có tác dụng ức chế mạnh đối với vi khuẩn Gram (-) như nhau [19]

và các mô bị tổn thương từ sự xâm phạm ban đầu, đồng thời bắt đầu sửa chữa mô

Năm 2008, Kumar và các cộng sự đã chứng minh về tính kháng viêm của loài

A ilicifolius, các chất chống viêm như các dẫn xuất pyrazoline tổng hợp (phenidone,

BW 755C; chất ức chế COX và LOX) và một số polyphenol cũng là những chất chống oxy hóa mạnh góp phần vào quá trình ức chế enzyme COX-LOX Tiến hành đánh giá khả năng ức chế IL-6 và TNF – cytokine gây viêm bám dính với enzyme LOX trong PBMC ở người cho giá trị IC50 lần lượt là 88,64 ± 6,3 μg/ml và 39,41 ±

2,84 μg/ml Dựa vào các thử nghiệm trên, A ilicifolius chứa các hoạt chất kháng viêm

tiềm năng có thể ức chế các enzyme COX–LOX từ đó ức chế quá trình gây viêm [13],[31]

Năm 2012, Kumar và cộng sự tiếp tục nghiên cứu về khả năng kháng viêm

của cặn methanol của lá loài A ilicifolius, từ chiết xuất lá của loại cây này có chứa

acteoside một chất thể hiện hoạt tính ức chế COX và LOX tự nhiên (tương ứng là 87% và 79%) và khả năng diệt gốc tự do mạnh mẽ nhờ đó làm tăng hàm lượng chất

nhầy trong mô dạ dày Từ nghiên cứu trên, cặn lá của A ilicifolius có đặc tính chống

loét cũng như chống viêm [32]

Năm 2019, tương tự Kumar, Biswas và các đồng nghiệp cũng tiến hành các

thí nghiệm đánh giá tính chống viêm của cặn lá loài A ilicifolius Kết quả cho thấy, dịch chiết lá A ilicifolius thể hiện hoạt tính chống oxy hóa giá trị IC50 cao hơn (78,90

± 1,87 µg/mL) trong khi đó hoạt tính ức chế enzyme LOX đáng kể có giá trị IC50 =

108,61 ± 2,72 µg/mL trên màng tế bào hồng cầu ở người Như vậy, A ilicifolius mang

các chất tiềm năng thể hiện tính kháng viêm [47]

Năm 2023, một nghiên cứu của Zhang và các cộng sự khẳng định các hợp chất phenylethanoid có khả năng ức chế quá trình sản sinh kappa-B (NF-κB) p65, tiểu đơn

vị ức chế của NF kappa B alpha, Janus kinase 2 (JAK2), và làm gián đoạn tín hiệu bộ kích hoạt phiên mã 3 (STAT3), các enzym tổng hợp oxit nitric cảm ứng trong các đại thực bào RAW264.7 qua chất trung gian LPS, từ đó kích thích gia tăng hàm lượng của interleukin-10 và enzyme tổng hợp oxide nitric nội mô – giảm phù nề ở các vị trí

viêm Do đó, hợp chất phenylethanoid từ loài A ilicifolius cho thấy hoạt động chống

viêm bằng cách làm gián đoạn các đường truyền tín hiệu NF-κB và JAK/STAT

1.2.3 Hoạt tính chống ung thư

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách không có tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa (di căn) Các thành phần

chiết xuất từ chi Acanthus đã cho thấy khả năng tham gia chống ung thư đa dạng và

hiệu quả cao

Năm 2001, Bahu và cộng sự đã chứng minh rằng chiết xuất ethanol của lá A

ilicifolius đã ức chế sự hình thành các gốc tự do có nguồn gốc oxy (ODFR) cho giá

trị IC50 là 600 μg/ml (Fe2+/ascorbate), 980 μg/ml (Fe3+/ADP/ascorbate) tương ứng quá trình sản sinh các gốc superoxide, gốc hydroxyl, gốc oxit nitric và lipid peroxide Mặt khác, sử dụng dịch chiết qua đường uống làm giảm đáng kể độc tính trên gan do CCl4 gây ra ở chuột, ức chế các enzym glutamate oxaloacetate transaminase (GOT), glutamate pyruvate transaminase (GPT) và phosphatase kiềm (ALP) trong các tế bào

mô và huyết thanh Dựa trên những nghiên cứu trên, chiết xuất ethanaol của loài A

ilicifolius có tiềm năng trong việc làm giảm khối u, ức chế sự hình thành các khối u [7]

Năm 2002, nhóm nghiêm cứu của Bahu đã tiếp tục thực hiện các thí nghiệm

khảo sát khả năng kháng ưng thư của loài A ilicifolius trên chuột Ngoài ra, các chất

trong cặn ethanol gây độc tế bào đối với các tế bào sợi nguyên bào phổi (L-929) và nồng độ cần thiết để làm chết 50% tế bào là 18 g/ml Nếu dùng đường uống chiết xuất

có khả năng làm giảm thể tích khối u và tăng tuổi thọ lên 75% ở động vật chứa tế bào

khối u cổ trướng (EAC) [8],[40] Từ kết quả thu được cho thấy chiết xuất ethanol của loài này có hiệu quả trong hoạt động chống ung thư ở chuột

Loài: Acanthus ilicifolius L

Phân bố: Loài ô rô hoa tím được tìm thấy đầu tiên tại Ấn Độ, sau đó phân bố sang các quốc gia khác như: Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia và Malaysia Ở Việt Nam, cây mọc ven biển, có khi cả trong đất liền, ven sông suối ở Hòa Bình, Ninh Bình

Mô tả: ô rô (còn có một số tên gọi khác như lão thử cân, sơn ngưu bàng, dã hồng hoa…) là cây thảo cao 0,5 - 1,5m, thân tròn màu xanh, có nhiều rãnh dọc Lá mọc đối, sát thân, hầu như không cuống, phiến cứng, mép lượn sóng, có răng cưa không đều và có gai nhọn Hoa màu xanh lam hay trắng hoặc tím tùy điều kiện môi trường, xếp 4 dãy thành bông Quả nang dạng bầu dục, màu nâu bóng, có 4 hạt dẹp,

có vỏ trắng trắng và xốp

Hình 1.8: Hình ảnh loài ô rô hoa tím

1.3.2 Công dụng

Từ xa xưa, ô rô hoa tím được biết đến có tác dụng lợi tiểu, tiêu viêm và làm long đờm Cây có vị hơi mặn, tính mát, có tác dụng làm tan máu ứ, tiêu sưng, giảm đau, tiêu đờm Toàn cây thường dùng trị đau lưng nhức mỏi, tê bại, ho đờm, hen suyễn Rễ và lá còn được dùng trị phù, tiểu buốt, tiểu dắt, chữa thấp khớp Các dịch chiết nước và methanol của cây được báo cáo là có tiềm năng dược lý khác nhau, như kháng viêm và chống ung thư

Ở Việt Nam, theo kinh nghiệm dân gian, ô rô là vị thuốc thường được dùng dưới hình thức thuốc uống để các bệnh viêm dạ dày và đường ruột, viêm gan hoặc đau nhức xương khớp Ngoài ra lá cây thường được giã nhỏ vắt lấy nước cốt uống, lấy bã đắp giúp giảm viêm, giảm sưng Ở Trung Quốc, rễ được dùng trị bệnh gan, gan lách sưng to, hen suyễn, đau dạ dày

1.3.3 Tình hình nghiên cứu

Ô rô hoa tím được nghiên cứu nhiều ở các nước mà nó phân bố như Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam,… Các công trình đã công bố chủ yếu tập trung vào nghiên cứu vào thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, tác dụng dược lý của các loài khác nhau tùy theo khu vực Ở Việt Nam cũng đã có một vài nghiên cứu chi tiết về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của ô rô hoa tím

Năm 2008, từ loài A ilicifolius, PGS TS Phan Văn Kiệm cùng với các cộng

sự đã phân lập được bảy hợp chất khác nhau: acancifoliuside (105), acteoside (90),

isoacteoside (106), acanthaminoside (14), (+)-lyoniresinol 3α-O-β-glucopyranoside

(75), (-)-lyoniresinol (107), và α-amyrin (27) [30] Trong đó, các hợp chất acteoside

(90), isoacteoside (106) và (+)-lyoniresinol 3α-O-β-glucopyranoside (75) thể hiện

khả năng kích thích trực tiếp lên sự hình thành của xương trong những tế bào

MC3T3-E1 được nuôi cấy Vì thế A ilicifolius có thể có đóng vai trò trong việc hỗ trợ điều trị

loãng xương

Năm 2013, Firdaus và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của

loài A ilicifolius qua khả năng bắt gốc tự do DPPH Năm cặn chiết (acetone,

methanol, acetone 70%, methanol 80% và nước) được đánh giá sơ bộ hoạt tính quyét

gốc tự do DPPH, kết quả cho thấy cặn chiết methanol có hiệu quả chống gốc tự do cao nhất (141.30%), trong khi cặn nước cho hiệu quả thấp nhất (0.0037%) [40]

Flavonoid và các hợp chất phenolic của loài A ilicifolius cho thấy hoạt tính chống

oxi hóa tốt trên động vật [5] Ở một nghiên cứu khác của Dey và cộng sự cho thấy

cặn chiết từ thân của loài A ilicifolius thể hiện hoạt tính bắt gốc tự do đáng kể, gần giống

với của acid ascorbic [6]

Hợp chất 12 và 96 phân lập từ loài A.ilicifolius được đánh giá hoạt tính kháng

khuẩn trên các chủng vi khuẩn E coli, Streptococcus viridans, P aeruginosa, Proteus

sp., Acinetobacter sp., Klebsiella pneumoniae và Streptococcus pneumoniae [48]

Các cặn chiết của loài A.ilicifolius được Govindasamy và cộng sự đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đối với bảy loại khuẩn gây nhiễm trùng da và kháng lại methicillin: S

aureus (MRSA), L plantarum, S pyogenes, S epidermis, C albicans, P aeruginosa,

và T rubrum Trong đó, cặn chloroform cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối

với tất cả các loại khuẩn (trừ S.epidermis và L plantarum) [14] Hợp chất 59 và 60

được đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn Bacillus subtilis với MIC lần lượt là 64 và

128 µg/mL [37]

Bộ phận hoa của loài A ilicifolius được Firdaus và các cộng sự đánh giá hoạt

tính gây độc tế bào [40] Kết quả cho thấy, trong tất cả những cặn chiết, cặn methanol

có giá trị LC50 thấp nhất (22 μg/ml) trong khi cặn nước có giá trị LC50 cao nhất là 10 μg/ml Dey cùng các cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên tế bào sợi nguyên bào phổi (L-929) và dòng tế bào Hela/κB với cặn chiết methanol thô của loài

A ilicifolius và cho thấy hoạt tính đáng kể với giá trị LC50 là 60 μg [6]

Cặn methanol từ lá A ilicifolius cho thấy hoạt tính bảo vệ gan đối với một

lượng nhỏ carbon tetrachloride (CCl4) trên chuột [7] Cặn ethanol từ A ilicifolius có

hoạt tính chống đái tháo đường rất mạnh trên chuột Wistar, lượng đường huyết được giảm thiểu bằng cặn này hơn đáng kể so với sử dụng glibenclamide Nó cũng gia tăng

sự tái tạo của tế bào β trong tuyến tụy, vì thế rất có giá trị trong việc điều trị bệnh đái

tháo đường [59]

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

Tên khoa học: Acanthus ilicifolius L

Nơi thu mẫu: Rừng ngập mặn vườn Quốc gia Xuân Thủy, tỉnh Nam Định Ngày thu mẫu: 25/11/2022

Người giám định: TS Nguyễn Thế Cường, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mẫu tiêu bản: NCCT-128 tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Nguyên liệu thực vật được nghiền nhỏ, siêu âm với MeOH ở nhiệt độ phòng Dịch chiết MeOH được cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho phần chiết MeOH

Phần chiết MeOH được chiết với các dung môi theo độ phân cực tăng dần: n-hexane,

ethyl acetate và nước cho các phần chiết tương ứng

2.3.1 Phương pháp chiết hai pha lỏng – lỏng

Phương pháp dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng không hòa trộn (một pha nước và một pha hữu cơ) Các hợp chất hữu cơ sẽ được chuyển từ một pha nước sang một pha hữu cơ còn các chất nền phân cực sẽ ở lại trong pha nước Quá trình chiết có thể được thực hiện ở các điều kiện được kiểm soát ví dụ như pH, độ phân cực của dung môi chiết, tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/ pha nước, nhiệt độ

2.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng trên silica gel là phương pháp thích hợp cho phân tích các hợp chất hữu cơ Vì sự phân tích TLC trên silica gel là một quá trình hấp phụ các hợp chất được phân tách theo độ phân cực theo cách tương tự như trong sự phân tách sắc

ký cột Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích để lựa chọn các hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột Để định tính các hợp chất, các giá trị Rf và màu sắc của các vệt

chất được phát hiện trên bản mỏng TLC cần được mô tả Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá định tính số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với chiều dày lớp silica gel

là 0.2 mm

2.3.3 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột thường được thực hiện dưới trọng lực của dung môi Cột sắc ký được thiết kế với khóa dưới và nhám trên có đường kính trong và chiều cao tùy theo lượng mẫu cần phân tách Chất hấp phụ dùng cho CC là silica gel (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với các cỡ hạt 63-200 µm và 40-63 μm hoặc silica gel RP-18 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức)

2.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography-HPLC)

là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới

áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua một cột sắc ký Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khì mà chúng chảy ra khỏi cột

Sắc ký lỏng hiệu năng cao được thực hiện trên thiết bị HPLC Agilent cột J’sphere H-80, chiều dài 250mm x 20mm ID

Hiện nay các phương pháp phổ là các phương pháp hiện đại thường dùng để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Các phổ NMR phổ biến nhất trong xác định cấu trúc các chất hữu cơ, là phổ cộng từ hạt nhân proton (1H-NMR, 600 MHz) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-

13 (13C-NMR, 150 MHz) Trong phổ 1H-NMR, các thông số quan trọng là độ dịch

chuyển hóa học (δ), cường độ tín hiệu và hằng số tương tác (J) Phổ 13C-NMR cho

biết thông tin về số lượng nguyên tử carbon có trong chất hữu cơ Ngoài ra còn phổ DEPT cho biết các tín hiệu là CH3, CH2, CH hay C, từ đó cho phép dự đoán cấu trúc của hợp chất nghiên cứu Phổ NMR đo trên máy: Bruker AM600 FT-NMR của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Khi đo phổ NMR, để có tín hiệu tốt thì mẫu cần được pha loãng trong dung môi ít ảnh hưởng đến tín hiệu của chất Khi đó để đo phổ 1H-NMR thì cần dung dung môi không chứa hydro như CCl4, CS2 hoặc dùng dung môi đã được deuteri hoá Độ

dịch chuyển (δ) được biểu thị theo ppm Tetramethylsilane (TMS) là chất chuẩn nội

- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H- H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian Dựa vào kết quả phổ này có thể

2.4.3 Phổ HR-ESI-MS

Phổ khối phân giải cao cho phép xác định các chất phân tích đến 0.001 đơn vị khối lượng nguyên tử gần nhất Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Agilent Accurate mass 6530 QTOF LC/MS tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.4.4 Độ quay cực

Độ quay cực [α]D được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY Polarimeter của Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute-NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Skekan Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD-Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị

OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm

Chất thử đã pha ở các nồng độ được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng Giếng không có chất khử nhưng có TBUT (190 µL) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA 20%

Ủ trong tủ ấm 72 giờ Sau 72 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 370C, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng

10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút rồi đọc kết quả OD ở bước sóng 540 mm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek)

Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi

có hoạt tính tốt với IC50 < 20 μg/ml, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt khi IC50 < 5 µM

 Dung môi: n-hexane, dichloromethane, acetone, methanol, ethyl

acetate loại sắc ký (Hàn Quốc, Đài Loan, Indonesia)

 Acid sulfuric 98% (Trung Quốc)

 Silica gel Merck (Đức): cỡ hạt 40-63 μm và 63-200 μm

 Máy cô quay chân không Büchi - rotavapor (Thụy Sĩ)

 Cân phân tích Sartorius (Đức), Toledo Mettle (Mỹ), Adam (Anh)

 Thiết bị siêu âm Branson (Mỹ)

 Cân đĩa loại 2 kg (Việt Nam)

Để định hướng cho việc phân lập các hợp chất, phần trên mặt đất của loài ô rô

(A ilicifolius) được rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 40oC Mẫu sau đó được nghiền mịn, ngâm chiết methanol có sự hỗ trợ của thiết bị chiết siêu âm Dịch chiết

methanol này tiếp tục được cất loại dung môi dưới áp giảm bằng máy cất quay chân

không thu được phần chiết MeOH và chiết phân bố trong n-hexane, ethyl acetate và

cặn nước

Tiến hành ngâm mẫu bột khô của loài A ilicifolius (3.1 kg) trong MeOH chiết

siêu âm ở nhiệt độ 35 độ trong 24 phút, quy trình lặp lại 5 lần, mỗi lần 10,0 L, sau đó lọc thu được 186 g dịch chiết Gộp các dịch lọc MeOH rồi cất loại dung môi dưới áp giảm bằng máy cất quay chân không thu được phần chiết MeOH Phần chiết MeOH được hòa bằng nước sau đó được chiết với các dung môi theo độ phân cực tăng dần:

n-hexane, ethyl acetate và nước cho các dịch chiết hữu cơ tương ứng Cất loại dung

môi các dịch chiết dưới áp suất giảm thu được các phần chiết tương ứng: n-hexane

(AI1), ethyl acetate (AI2), còn lại là phần chiết nước AI3 Phần chiết nước được tiếp

túc chạy sắc ký cột diaion với hệ dung môi MeOH/H2O với tỷ lệ MeOH tăng dần 25%, 50%, 75% và 100%, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 4 phân đoạn

kí hiêụ là AI3A-AI3D

Hình 2.1: Sơ đồ chiết vỏ và thân loài A ilicifolius

Hình 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài A ilicifolius

Cặn nước (AI3) được phân cắt trên cột Diaion HP-20, với hệ dung môi rửa

giải MeOH/H2O (25:75, 50:50, 75:25, 100:0) thu được 4 phân đoạn kí hiệu AI3A,

AI3B, AI3C, AI3D Phân đoạn AI3C (13,5g) được phân tách trên cột silicagel pha

thuận, hệ dung môi D/M (7/1, v/v) thu được các phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là

(1.3/1, v/v) để thu được ba phân đoạn AI3C2A- AI3C2C Phân đoạn AI3C2B (1,6

g) được phân lập trên cột silica gel, hệ dung môi D/M (10/1, v/v) thu được bốn phân

đoạn nhỏ AI3C2B1- AI3C2B4 Phân đoạn AI3C2B3 (350 mg) được tiếp tục phân

tách trên HPLC hệ dung môi ACN 35% trong nước để thu được hai chất sạch kí hiệu

lần lượt là AI2B1 (chất 1) (3.5mg, tR 32.1 min) và AI2B7 (chất 4)(2.7mg, tR 26.9

min) Tương tự, phân đoạn AI3C2B2 (412 mg) cũng được tinh chế trên HPLC hệ

dung môi ACN 38% trong nước để thu được 3 chất sạch kí hiệu lần lượt là

và AI2B5 (chất 5) (9.8 mg, tR 51.3 min)

Phân đoạn AI3C3 (1.6 g) được phân tách trên cột Silica gel pha đảo RP-18,

hệ dung môi M/W (1.7/1, v/v) thu được các phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là

AI3C3A-AI3C3D Phân đoạn AI3C3B (348 mg) được tiếp tục phân tách trên HPLC hệ dung

môi ACN 33% trong nước để thu được hai chất sạch kí hiệu lần lượt là AI2B4 (chất

Phân đoạn AI3C4 (2.1 g) được phân tách trên cột Silica gel pha đảo RP-18,

hệ dung môi M/W (1.5/1, v/v) thu được các phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là

AI3C4A-AI3C4C Phân đoạn AI3C4A (409 mg) được tiếp tục phân tách trên HPLC hệ dung

môi ACN 38% trong nước để thu được ba chất sạch kí hiệu lần lượt là AI4A8 (chất

Trạng thái: rắn vô định hình, màu vàng

1H-NMR (CD3OD, 600 MHz), 13C-NMR (CD3OD, 150 MHz) xem bảng 3.2 CTPT: C20H18O10, M = 418.0899 g/mol

2.8.3 Hợp chất 3: Quercitrin

Trạng thái: rắn vô định hình, màu vàng

1H-NMR (CD3OD, 600 MHz), 13C-NMR (CD3OD, 150 MHz) xem bảng 3.3 CTPT: C21H20O11, M = 448.4 g/mol

2.8.4 Hợp chất 4: 6-O-vanilloylarbutin

Trạng thái: rắn vô định hình, màu vàng

1H-NMR (CD3OD, 600 MHz), 13C-NMR (CD3OD, 150 MHz) xem bảng 3.4 CTPT: C20H22O11, M = 438.4 g/mol

2.8.5 Hợp chất 5: Balanophonin

Trạng thái: lỏng vô định hình, màu vàng nhạt

1H-NMR (CD3OD, 600 MHz), 13C-NMR (CD3OD, 150 MHz) xem bảng 3.5 CTPT: C20H20O6, M = 356.4 g/mol

2.8.6 Hợp chất 6: (7S, 8R)-5-methoxy-balanophonin

Trạng thái: lỏng vô định hình, màu vàng nhạt

1H-NMR (CD3OD, 600 MHz), 13C-NMR (CD3OD, 150 MHz) xem bảng 3.6 CTPT: C21H23O7, M = 387.4 g/mol

2.8.7 Hợp chất 7: Tomentosaman A

Trạng thái: lỏng vô định hình, màu vàng

1H-NMR (CD OD, 600 MHz), 13C-NMR (CD OD, 150 MHz) xem bảng 3.7

CTPT: C19H21O7, M = 361.437 g/mol

2.8.8 Hợp chất 8: Acanthoside B

Trạng thái: rắn vô định hình, màu trắng

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz), 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) xem bảng 3.8 CTPT: C28H36O13, M = 580.6 g/mol

2.8.9 Hợp chất 9: Syringaresinol

Trạng thái: tinh thể, không màu

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz), 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) xem bảng 3.9 CTPT: C22H26O8, M = 418.4 g/mol

2.8.10 Hợp chất 10: (+)-Lyoniresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside

Trạng thái: tinh thể, không màu

1H-NMR (CD3OD, 600 MHz), 13C-NMR (CD3OD, 150 MHz) xem bảng 3.10 CTPT: C28H38O13, M = 582.462 g/mol

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.1 Hợp chất 1: (2R,3R,4R)-3,4-dihydroxy-7-methoxyflavan

5-O-[β-D-apiofuranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside (Hợp chất mới)

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học hợp chất 1 Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng chất rắn vô định, hình màu vàng Công

thức phân tử được xác định là C27H34O14 dựa vào tín hiệu pick ion giả phân tử tại m/z

= 583.2028 [M+H]+ (tính theo [C27H35O14]+, 583.2021); tại m/z = 600.2298 [M+NH4]+(tính theo [C27H34O14NH4]+, 600.2287); tại m/z = 605.1843[M+Na]+ (tính theo [C27H34O14Na]+, 605.1841) trên phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS

Trên phổ 1H-, 13C-NMR và HSQC cho thấy sự có mặt của một vòng thơm tại

[(δC/δH: 140.1, 127.9/7.56 (2H, d, J = 8,0 Hz), 129.1/7.41 (2H, t , J = 8,0 Hz) và 128.6/7.34 (t, J = 8,0 Hz)], một vòng thơm thế 4 vị trí ở các vị trí 1,2,3,5 [(δC/δH:

Các tương tác HMBC từ H-4 (δH 4.89) đến C-5 (δC 160.0) và từ một proton

anomeric tại δ 4.89 (H-1ʹ′, Glc) đến δ 98.8 (C-6 ) gợi ý đường glucose gắn với C-6