Đánh giá khả năng tạo mạch máu in vitro của tế bào gốc trung mô

Đánh giá khả năng tạo mạch máu in vitro của tế bào gốc trung mô Đánh giá khả năng tạo mạch máu in vitro của tế bào gốc trung mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.BS Đỗ Xuân Hai PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung

Hà Nội - 2022

Tôi xin cam đoan đề tài: “Đánh giá khả năng tạo mạch máu in vitro của tế

bào gốc trung mô” là một công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS.BS Đỗ Xuân Hai và PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Các số liệu nghiên cứu khoa học và kết quả nghiên cứu của luận văn là trung thực và tài liệu tham khảo đã được ghi rõ nguồn trích dẫn Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Người cam đoan

Đỗ Thị Xuân Phương

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng trân trọng và gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS.BS

Đỗ Xuân Hai, PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung là những người thầy, người cô đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu, đồng thời cũng là người luôn lắng nghe, động viên và giúp đỡ tôi những lúc gặp khó khăn

Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn chân thành tới TS Thân Thị Trang Uyên, các thành viên trong nhóm R&D của Trung tâm ứng dụng Y học tái tạo và công nghệ cao Vinmec, những người đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn CN Phạm Bích Hạnh, CN Nguyễn Thùy Dương,

CN Đỗ Diệu Linh, CN Lê Thị Nhi đã hỗ trợ nhiệt tình cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn cao học này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô trong Bộ Môn Sinh học Tế bào, các anh chị, các em trong nhóm Ung thư thực nghiệm Cảm ơn đến các Thầy,

Cô, các anh chị Bộ môn Phẫu thuật thực hành Học viên Quân Y đã đồng hành và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm việc

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn đề tài VINIF 2020 DA07 đã hỗ trợ kinh phí để thực hiện luận văn cao học này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn

bè đã luôn yêu thương, ủng hộ, và tạo cho tôi một chỗ dựa vững chắc để giúp tôi vượt qua mọi khó khăn, thử thách

Xin chân thành cảm ơn!

Nghiên cứu này được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Quỹ Đổi mới sáng

tạo Vingroup (VinIF) “Ứng dụng tế bào gốc MUSE trong tạo mạch máu nhân tạo bằng công nghệ in 3D sinh học không sử dụng khuôn”, mã số: VINIF 2020 DA07

Hà Nội, tháng 12 năm 2022

Học viên cao học

Đỗ Thị Xuân Phương

MỞ ĐẦU 1

Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSC) 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Tiềm năng biệt hóa đa dòng 5

1.1.3 Khả năng tiết các phân tử có hoạt tính sinh học 6

1.1.4 Tế bào gốc trung mô trong y học tái tạo 7

1.1.5 Tế bào gốc trung mô trong điều trị bệnh tim mạch 8

1.2 Mô hình mạch máu in vitro Matrigel 10

1.3 Tế bào nội mô (EC) và tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn (HUVEC) 13

1.4 Hệ hạt nano SiO2@FITC COOH trong đánh dấu tế bào 15

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 18

2.2 Hóa chất và thiết bị 19

2.2.1 Hóa chất 19

2.2.2 Thiết bị 20

2.2.3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Phân lập và nuôi cấy tế bào 22

Phân lập tế bào gốc trung mô từ máu dây rốn 22

Phân lập tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn 22

Phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 23

Phân lập tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn 23

2.3.2 Đánh giá sự biểu hiện dấu ấn bề mặt sinh học 24

Tế bào gốc trung mô 24

Tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn 24

2.3.3 Đánh giá khả năng biệt hóa thành xương, sụn và mỡ của MSC 25

Biệt hóa thành nguyên bào xương 25

2.3.4 Đánh giá khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô của MSC 27

Biệt hóa tế bào MSC thành tế bào nội mô 27

Đánh giá tế bào sau biệt hóa 27

2.3.5 Đánh giá khả năng tạo mạch in vitro của MSC 28

2.3.6 Đánh giá khả năng đánh dấu tế bào của hệ hạt SiO2@FITC COOH 28

2.3.7 Đánh giá tính tương thích sinh học của hệ hạt 29

2.3.7.1 Đánh giá ảnh hưởng của hệ hạt SiO2@FITC COOH lên khả năng tăng sinh của MSC và HUVEC 29

2.3.7.2 Đánh giá ảnh hưởng của hệ hạt SiO2@FITC COOH lên khả năng di chuyển của tế bào 29

2.3.7.3 Đánh giá ảnh hưởng của hệ hạt SiO2@FITC COOH lên sự già hóa tế bào.30 2.3.7.4 Đánh giá ảnh hưởng của hệ hạt SiO2@FITC COOH lên khả năng tạo mạch của tế bào HUVEC 31

2.3.8 Phân tích thống kê 31

2.3.9 Đạo đức trong nghiên cứu 31

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả phân lập và nuôi cấy MSC từ mô mỡ, dây rốn, máu dây rốn và tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn 32

3.1.1 Tế bào MSC từ mô mỡ, dây rốn và máu dây rốn 32

3.1.1.1 Khả năng bám dính và hình thái tế bào sau phân lập 32

3.1.1.2 Sự biểu hiện dấu ấn bề mặt 33

3.1.1.3 Khả năng biệt hóa đa dòng của MSC sau phân lập và nuôi cấy 34

3.1.2 Kết quả phân lập và nuôi cấy HUVEC 36

3.1.2.1 Hình thái tế bào sau phân lập và nuôi cấy tăng sinh 36

3.2 Khả năng tạo mạch in vitro trên Matrigel của MSC 37

3.2.1 Đánh giá khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô của MSC 37

3.2.2 Khả năng tạo mạch in vitro trên Matrigel của MSC 41

3.3 Đánh giá tiềm năng sử dụng hệ hạt SiO2@FITC COOH để đánh dấu tế bào 44

3.3.1 Tín hiệu huỳnh quang và sự phân bố của hệ hạt khi ủ với tế bào 44

3.3.3 Ảnh hưởng của hệ hạt SiO2@FITC COOH lên khả năng di chuyển của tế

bào 47

3.3.4 Ảnh hưởng của hệ hạt SiO2@FITC COOH lên sự già hóa tế 48

3.3.5 Ảnh hưởng của hệ hạt SiO2@FITC COOH lên khả năng tạo mạch của tế bào HUVEC 49

THẢO LUẬN 51

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 57

BẢN THẢO 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Từ viết tắt Từ tiếng Anh Từ tiếng Việt

ISCT International Society for Cellular

Therapy

Hiệp hội quốc tế về liệu pháp

tế bào

HSC Haematopoietic stem cells Tế bào gốc tạo máu

iPSC Human induced pluripotent stem cell Tế bào gốc vạn năng cảm ứng

HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial

Cells

Tế bào nội mô tĩnh mạch dây

rốn

MHC Major Histocompatibility Complex Phức hệ phù hợp tổ chức

chính BDNF Brain-derived neurotrophic factor Yếu tố thần kinh có nguồn

gốc từ não VEGF Vascular endothelial growth factor Yếu tố tăng trưởng nội mô

mạch máu HGF Hepatocyte growth factor Yếu tố tăng trưởng tế bào gan FGF Fibroblast growth factors Yếu tố tăng trưởng nguyên

bào sợi PDGF-BB Platelet-derived growth factor Yếu tố tăng trưởng có nguồn

gốc từ tiểu cầu EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 Môi trường nuôi cấy tế bào

nội mô HBSS Hanks’ Balanced Salt Solution

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

PBS Phosphate-buffered saline Muối đệm photphat Pen/Strep Penicillin/Streptomycin

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA

Hình 1 Các nguồn phân lập MSC phổ biến 4Hình 2 Cấu tạo thành mạch máu 13Hình 3 Hình thái tế bào ADMSC, UCMSC và UCBMSC sau phân lập (P0) Và sau khi cấy chuyển lần 2 (P2) 33Hình 4 Sự biểu hiện dấu ấn bề mặt và khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy 35Hình 5 Hình thái và sự biểu hiện dấu ấn bề mặt của tế bào HUVEC 37Hình 6 Hình thái tế bào MSC biến đổi theo thời gian trong môi trường biệt hóa tế bào nội mô 38Hình 7 Kết quả phân tích dấu ấn của tế bào MSC biệt hóa nội mô 39Hình 8 Sự hình thành mạch theo thời gian của ADMSC, UCMSC và UCBMSC trên Matrigel 42 Hình 9 Sự tạo mạch tại thời điểm 8h 42Hình 10 Định lượng khả năng hình thành mạch của ADMSC, UCMSC và

UCBMSC tại thời điểm 8h so với HUVEC 44Hình 11 Vị trí phân bố của hạt khi ủ với tế bào UCMSC và HUVEC 45 Hình 12 Tế bào nhuộm với thuốc nhuộm của hãng 46Hình 13 Ảnh hưởng của hệ hạt đến khả năng tăng sinh của tế bào HUVEC và UCMSC 47Hình 14 Tác động của hệ hạt đến khả năng di chuyển của tế bào HUVEC và UCMSC 48Hình 15 Tác động của hệ hạt đến sự già hóa tế bào HUVEC và UCMSC 49Hình 16 Ảnh tạo mạch của HUVEC sau khi nhuộm với hệ hạt 50

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 So sánh các đặc điểm của MSC phân lập từ ba nguồn 5

Bảng 2 Các phương pháp đánh giá hình thành mạch máu phổ biến hiện nay 10

Bảng 3 Các hóa chất được sử dụng 19

Bảng 4 Các thiết bị được sử dụng 20

Bảng 5: Dụng cụ và vật tư tiêu hao 21

Bảng 6 Tỷ lệ biểu hiện dấu ấn bề mặt của ADMSC, UCMSC và UCBMSC 34

Bảng 7 Biểu hiện dấu ấn sinh học của tế bào HUVEC ở P2 36

Bảng 8 Mức độ biểu hiện dấu ấn bề mặt sinh học của các tế bào MSC sau khi nuôi cấy biệt hóa thành nội mô 40

MỞ ĐẦU

Tế bào gốc trung mô đã được biết đến là tế bào gốc đa năng đặc trưng bởi khả năng biệt hóa đa dòng và khả năng tiết các phân tử có hoạt tính sinh học Kể từ bài báo đầu tiên về sự phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột của Friedenstein và cộng sự vào năm 1970, nhiều cơ quan và mô đã được báo cáo trở thành nguồn phân lập tế bào gốc trung mô như máu dây rốn, dây rốn, mô mỡ, màng

ối, tủy răng Mặc dù tủy xương là một nguồn phổ biến để phân lập tế bào gốc trung

mô, tuy nhiên việc thu thập tủy xương là một quá trình xâm lấn và tế bào gốc trung

mô từ tủy xương có số lượng, khả năng biệt hóa, sự già hóa giảm dần khi độ tuổi của người hiến tặng tăng Một số nguồn thay thế được nghiên cứu nhiều nhất như

mô mỡ, dây rốn và máu dây rốn với những ưu điểm như phương pháp thu thập ít xâm lấn hơn, đều là chất thải sau quá trình thẩm mỹ hoặc quá trình sinh đẻ nên không ảnh hưởng đến vấn đề đạo đức trong nghiên cứu Tế bào gốc trung mô với tiềm năng tái tạo và biệt hóa đã và đang được nghiên cứu ứng dụng trong điều trị nhiều loại bệnh khác nhau

Đã có nhiều báo cáo về vai trò của tế bào gốc trung mô trong quá trình tái tạo

mạch bằng cách tiết ra các yếu tố tăng trưởng kích thích sự hình thành mạch in vitro

và in vivo như yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu, yếu tố tăng trưởng nguyên bào

sợi, yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu và khả năng biệt hóa thành tế bào

nội mô in vitro Tuy nhiên khả năng biệt hóa và tạo mạch trực tiếp của tế bào gốc

trung mô vẫn còn ít được nghiên cứu

Bên cạnh đó việc đánh dấu tế bào và quan sát sự hình thành mạch theo thời gian đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu bản chất và cơ chế tạo mạch Viện Vật Lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phát triển một vật liệu mới dựa trên vật liệu nền nano silaca chứa tâm màu FITC - SiO2@FITC COOH với mong muốn ứng dụng trong sinh học như một chất đánh dấu tế bào Chúng tôi đánh giá xem hệ hạt SiO2@FITC COOH có phải là một vật liệu tiềm năng trong đánh dấu tế bào MSC và tế bào nội mô phục vụ cho nghiên cứu đặc biệt là trong nghiên

cứu hình thành mạch Trên cơ sở đó chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Đánh giá khả

năng tạo mạch máu in vitro của tế bào gốc trung mô” Đây là nghiên cứu bước

đầu với mục tiêu tạo mạch máu nhân tạo tương thích sinh học cao từ tế bào gốc trung mô, có ý nghĩa quan trọng trong y học tái tạo với các mục tiêu như sau:

Mục tiêu đề tài

1 Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ máu dây rốn, dây rốn và mô mỡ,

tế bào nội mô từ tĩnh mạch dây rốn người

2 Đánh giá khả năng tạo mạch in vitro của tế bào gốc trung mô phân lập từ

máu dây rốn, dây rốn và mô mỡ

3 Đánh giá tiềm năng sử dụng hệ hạt nano SiO2@FITC COOH làm chất đánh dấu tế bào

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSC)

1.1.1 Giới thiệu chung

Tế bào gốc trung mô (MSC) là tế bào gốc đa năng trưởng thành có khả năng

di chuyển đến các mô bị tổn thương và biệt hóa thành các tế bào chuyên biệt, đây là những tế bào đã được nhiều nghiên cứu trong y học, đặc biệt là trong lĩnh vực y học tái tạo Hiệp Hội Quốc tế về liệu pháp tế bào (ISCT) [30] đã đưa ra các tiêu chí tối thiểu đối với định nghĩa MSC của con người bao gồm: Thứ nhất, các tế bào bám dính trên bề mặt nuôi cấy phẳng Thứ hai, các tế bào có hình thái giống nguyên bào sợi Thứ ba, các tế bào có thể biệt hóa dưới một kích thích nhất định thành tế bào xương, tế bào mỡ và tế bào sụn Và thứ tư, các tế bào biểu hiện các dấu ấn dương tính CD105, CD73, CD90 (>95%) và không biểu hiện các dấu ấn bề mặt âm tính CD45, CD34, CD14 hoặc CD11b, CD79α hoặc CD19 và HLA-DR (<2%)

Một số dấu ấn bề mặt khác biệt giữa các MSC từ các mô khác nhau chẳng hạn: mức độ cao của CD34 chỉ biểu hiện trên MSC có nguồn gốc từ mô mỡ CD27

có thể được tìm thấy trên MSC có nguồn gốc từ tủy xương [73] Các tiêu chí này cung cấp các đặc điểm cho quá trình phân lập, sàng lọc MSC và nuôi cấy tăng sinh

in vitro, không làm mất khả năng biệt hóa của chúng MSC đã được sử dụng như

một loại tế bào gốc đầu tiên trong y học tái tạo sau tế bào gốc tạo máu (HSC) do

khả năng phân lập dễ dàng, mở rộng ex vivo nhanh chóng và cũng ghép tự thân

[73]

Tế bào gốc trung mô (MSC) được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như tủy xương, máu dây rốn [75], dây rốn [16], mô mỡ [110], tủy răng[50] và gần đây

là máu kinh nguyệt [44, 78] (Hình 1) Tủy xương (BM) là nguồn đầu tiên được báo cáo phân lập được MSC Tuy nhiên, tế bào gốc trung mô từ tủy xương có một số nhược điểm như việc thu thập xâm lấn và sự suy giảm số lượng MSC và khả năng biệt hóa khi tuổi tăng Gần đây hơn, máu dây rốn (UCB), mô dây rốn (UC) và mô

mỡ (AD) được giới thiệu như một nguồn phân lập MSC thay thế đầy hứa hẹn, có thể thu bằng một phương pháp ít xâm lấn hơn Cả ba nguồn tế bào MSC này đều dễ thu nhận và ít ảnh hưởng vấn đề đạo đức do là chất thải sinh học của cơ thể người hiến tặng Mặc dù MSC từ các nguồn khác nhau có một số điểm tương đồng đáp ứng các tiêu chí tối thiểu của ISCT, vẫn có sự khác biệt về số lượng tế bào, tốc độ tăng trưởng, tần số tạo cụm, khả năng ức chế miễn dịch và khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào khác

*Nguồn: Theo Merino-González C và cộng sự (2016) [67]

Hình 1 Các nguồn phân lập MSC phổ biến

Bảng 1 So sánh các đặc điểm của MSC phân lập từ ba nguồn [52, 62]

(Máu dây rốn)

UCMSC (Dây rốn)

ADMSC (Mô mỡ)

Phương pháp thu nhận Không xâm lấn Không xâm lấn Xâm lấn

Biệt hóa thành xương

Càng nhiều dấu * biểu hiện mức độ càng cao, “- “biểu diễn sự không biểu hiện

1.1.2 Tiềm năng biệt hóa đa dòng

Tế bào gốc trung mô (MSC) là tế bào gốc đa năng, chúng đặc trưng bởi khả năng biệt hóa đa dòng Ngoài tiềm năng biệt hóa thành các dòng tế bào trung mô thông thường như xương, sụn, mỡ [30]…, MSC còn cho thấy khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào biểu mô như tế bào thần kinh [55], tế bào tim [40] và tế bào nội mô [76] Trong đó tiềm năng biệt hóa thành tế bào nội mô đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành mạch máu mới và ứng dụng để chữa các bệnh về tim mạch như thiếu máu cục bộ [17, 95], nhồi máu cơ tim [71] Chính các tiềm năng

biệt hóa lớn này đã mở ra những hướng nghiên cứu triển vọng khi sử dụng tế bào gốc trung mô trong y học tái tạo

1.1.3 Khả năng tiết các phân tử có hoạt tính sinh học

Sự tiết paracrine của MSC được xác định đầu tiên bởi Haynesworth và cộng

sự [43] Nhóm tác giả báo cáo rằng MSC sản xuất và giải phóng một lượng lớn các yếu tố tăng trưởng, chemokine và cytokine có khả năng tác động đến các tế bào lân cận Trong thực tế, những yếu tố tiết này có khả năng làm tăng sự hình thành mạch, giảm apoptosis và xơ hóa, tăng cường sự sống và biệt hóa tế bào thần kinh, kích thích tái tạo mạng lưới ngoại bào, hạn chế viêm cục bộ và điều chỉnh các phản ứng miễn dịch [53] Bằng cách này, MSC trực tiếp hoặc thông qua sự tiết lân cận (paracrine) tạo ra sự tái tạo để thay thế các tế bào tổn thương, giảm tổn thương mô

và cuối cùng thúc đẩy quá trình sửa chữa cơ quan Những chất tiết này bao gồm các phân tử và túi ngoại bào có cả tác động lân cận hoặc ra xa Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng MSC tiết các yếu tố tăng trưởng như VEGF-A, HGF, FGF, TGF-β và PDGF-BB [45, 72] có ý nghĩa quan trọng trong việc kích thích quá trình tạo mạch Yếu tố tăng trưởng tế bào gan 1 (HGF-1) là phối tử có ái lực cao đối với thụ thể tyrosine kinase Met, thụ thể này có liên quan đến nhiều hoạt động tái tạo bao gồm tạo mạch, tạo cơ và tạo máu [61] Hoạt động kích thích tạo mạch của HGF-1 được chứng minh bằng các nghiên cứu trong đó việc tiêm plasmid HGF-1 để điều trị thiếu máu cục bộ chi ở động vật [84] và ở người [69, 92] Yếu tố tăng trưởng biến đổi beta (TGF-β) hoạt động ức chế miễn dịch mạnh mẽ bằng cách ngăn chặn sự trưởng thành của tế bào tua [36], kích thích sản xuất T-reg [60] và ngăn chặn sự tạo

ra các tế bào Th17 gây viêm [88] Tác động của TGF-β trong việc ức chế tăng sinh

tế bào T của MSC đã được Zhao và cộng sự chứng minh [111] Các nghiên cứu sau

đó đã chứng minh rằng việc sử dụng MSC cho động vật bị tổn thương do thiếu máu cục bộ đối với hệ thần kinh trung ương dẫn đến kết quả hệ thần kinh được cải thiện, ngược lại khi làm im lặng TGF-β trong MSC không ghi nhận được kết quả như trên [109] Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) là một yếu tố kích thích tạo mạch được mô tả đầu tiên năm 1991 [23] Glycoprotein này hoạt động như một yếu

tố tăng trưởng cho các tế bào nội mô, được sản xuất bởi nhiều loại mô để đáp ứng với việc giảm áp lực oxy Vai trò của VEGF trong quá trình hình thành mạch qua trung gian MSC ban đầu được mô tả trong các nghiên cứu về việc sử dụng MSC từ tủy xương vào cơ tim thiếu máu cục bộ ở mô hình động vật bị suy tim Kích thích hình thành mạch và tăng sinh tế bào nội mô có liên quan đến sự biểu hiện VEGF của MSC trong cả nghiên cứu trên động vật nhỏ và lớn [42, 99] Hiệu quả vượt trội của việc sử dụng MSC trong các mô hình suy tim, so với việc sử dụng VEGF đơn thuần đã được chứng minh trong các nghiên cứu tiếp theo [94] Hơn nữa, VEGF hoạt động như một phân tử ngăn chặn quá trình chết theo chu trình bằng cách ức chế p53 qua kích hoạt FAK (kinase bám dính) và cũng bằng cách kích thích biểu hiện Bcl-2 và A1 [38, 46]

1.1.4 Tế bào gốc trung mô trong y học tái tạo

Trong vài thập kỷ qua, y học tái tạo sử dụng nhiều loại tế bào gốc của con người để điều trị các mô và cơ quan bị tổn thương và hư hỏng Những bằng chứng mới đã cho thấy rằng liệu pháp tế bào gốc có tiềm năng lớn để cải thiện khả năng tái tạo ở các mô bị tổn thương chẳng hạn như tim, não, tủy sống, gan [28] Các chiến lược y học tái tạo bao gồm sử dụng khả năng biệt hóa và khả năng tiết các chất có hoạt tính sinh học của tế bào gốc để tái tạo lại các mô và cơ quan bị mất hoặc bị hư hỏng [86] Tiềm năng tái tạo của các tế bào gốc như tế bào mô gốc trung mô (MSC), tế bào gốc đa năng cảm ứng (iPSC) và tế bào gốc phôi (ESC) đã được thành lập để phục hồi các mô bị tổn thương của con người [103] MSC có ứng dụng cao trong lĩnh vực liệu pháp tế bào gốc do các đặc điểm hấp dẫn của chúng như A: khả năng biệt hóa thành gân, xương, sụn, dây chằng, cơ, tế bào thần kinh B: thu thập mẫu dễ dàng C: phân lập đơn giản và nuôi cấy tăng sinh tương đối nhanh D: thử nghiệm lâm sàng trên người bởi MSC cho thấy kết quả khả quan của cả cấy ghép MSC đồng loài và tự thân do tác dụng điều hòa miễn dịch của chúng [19, 79] MSC được nuôi cấy mở rộng đã không biểu hiện dấu hiệu bề mặt tế bào MHC lớp II, biểu hiện kém MHC lớp I và không có phân tử đồng kích thích [60] Do đó, MSC của người không thể trình diện kháng nguyên và có khả năng né tránh khỏi hệ thống

miễn dịch người được cấy ghép [57] Những quan sát này được sử dụng để đề xuất rằng MSC có thể được sử dụng như một liệu pháp điều trị trong y học tái tạo để sửa chữa các mô bị hư hỏng do các cơ chế, ví dụ, biệt hóa thành các tế bào thay thế, thay đổi môi trường ngoại bào với tác dụng paracrine/ juxtacrine của cytokine, yếu

tố hòa tan và yếu tố tăng trưởng hoặc tái tổ chức của chất nền ngoại bào [14]

Nguồn phân lập MSC có thể ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị [45] Ví dụ, cấy ghép dị loài MSC có nguồn gốc từ mô mỡ ở người (ADMSC) sang chuột cải thiện

sự hình thành mạch, tái tạo trục và phục hồi chức năng tốt hơn BM-MSC [112] ADMSC gây ra mức độ cao của các yếu tố hướng thần kinh như BDNF, VEGF và HGF[112]

1.1.5 Tế bào gốc trung mô trong điều trị bệnh tim mạch

Tế bào gốc trung mô đã được chứng minh là tế bào gốc hiệu quả nhất và ứng dụng nhiều nhất cho điều trị nhồi máu cơ tim so với các loại tế bào gốc khác [5] Các đặc điểm nổi bật của tế bào gốc trung mô như dễ dàng phân lập từ các mô khác nhau, khả năng nuôi cấy tăng sinh, khả năng biệt hóa thành tế bào cơ tim và tế bào mạch máu, khả năng di chuyển đến các vị trí viêm, khả năng miễn dịch trong người nhận và khả năng sửa chữa gen để cải thiện tiềm năng cấy ghép hoặc biệt hóa khiến chúng trở thành nguồn tế bào phổ biến [80] MSC cho thấy tiềm năng biệt hóa thành

tế bào cơ tim đã được chứng minh khi tiếp xúc với tác nhân khử methyl DNA azacytidine), chúng biểu hiện các gen tim, có hình thái tế bào cơ tim và hoạt động

(5-co bóp như tế bào cơ tim [101, 102].Sau khi BM-MSC được tiêm vào tim bị nhồi máu, chúng góp phần vào quá trình tái cấu trúc cơ tim, giảm kích thước vùng nhồi máu, giảm hình thành sẹo, sửa chữa mạch máu, hình thành mạch, kích hoạt các yếu

tố tái tạo khác và cuối cùng là sự di chuyển đến đích của tế bào gốc, do đó có thể tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tái tạo tế bào cơ [65] Sau đó, nhiều nghiên cứu tiền lâm sàng đã được thực hiện, đã chứng minh cải thiện chức năng tâm thất trái (LV), giảm kích thước vùng nhồi máu và tỷ lệ tử vong sau khi cấy ghép MSC trong các mô hình động vật như chuột nhắt, chuột cống, lợn, chó và cừu trong nhồi máu

cơ tim cấp tính hoặc mạn tính [32] Tiêm trong cơ tim liều cao MSC dị sinh đã được chứng minh là an toàn trên lợn [81] và trong một nghiên cứu khác báo cáo rằng việc tiêm MSC vào tĩnh mạch đã làm thay đổi điện sinh lý cơ tim [83]

Trong các nghiên cứu về thiếu máu cục bộ, hầu hết dữ liệu cho thấy liệu pháp tế bào được thực hiện bằng cách sử dụng UCBMSC Bằng chứng đầu tiên về hiệu quả điều trị của UCBMSC là nghiên cứu của nhóm Sanberg và cộng sự năm

2005 [89], trong đó chuột được sử dụng để gây thiếu máu cục bộ Nhóm tác giả đã chứng minh, tiêm UCBMSC vào tĩnh mạch làm giảm các triệu chứng sau đột quỵ ở chuột Trong một nghiên cứu khác, nhà khoa học đã kiểm tra tác động của UCBMSC trong mô hình não thuyên tắc huyết khối ở chó [21], UCBMSC được cấy ghép qua động mạch nền 1 ngày sau khi gây thiếu máu cục bộ, kết quả thu được thể tích vùng nhồi máu đã giảm ở nhóm được cấy ghép UCBMSC trong khi thể tích vùng nhồi máu tăng lên ở các nhóm đối chứng, UCBMSC biểu hiện các yếu tố bảo

vệ thần kinh, chẳng hạn như yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF) và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) vào 4 tuần sau khi cấy ghép Những kết quả này cho thấy rằng việc cấy ghép UCBMSC cho thấy hiệu quả của chúng bằng cách giảm thể tích tổn thương nhồi máu Do đó, việc cấy ghép UCBMSC vào động mạch có thể có hiệu quả trong điều trị lâm sàng bệnh thiếu máu não

Mặc dù nhiều nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của MSC trong tái tạo tim, một vài nghiên cứu báo cáo về sự hình thành khối u sau khi cấy ghép BM-MSC [13, 48].Trái ngược với những kết quả này, nhiều nghiên cứu tiền lâm sàng đã chứng minh sự an toàn của MSC mà không có bất kỳ dấu hiệu hình thành khối u nào trong các mô hình động vật lớn [41] Một số thử nghiệm áp dụng ghép tế bào đơn nhân tủy xương tự thân để điều trị nhồi máu cơ tim và báo cáo rằng các chỉ số về chức năng tim đã được cải thiện [29, 74]

Đối với các trường hợp bệnh tim mạch bị tổn thương cấu trúc, hư hỏng phải phẫu thuật thay thế và ghép mạch mới được đề xuất Tuy nhiên, khó khăn của

phương pháp này là nguồn tạng hiến tặng khan hiến, yêu cầu về miễn dịch là tạng phù hợp tổ chức, đòi hỏi cơ sở vật chất kỹ thuật cao và rất tốn kém Việc tạo ra các mạch máu nhân tạo tương thích sinh học cao, chỉ chứa các tế bào tạo mạch đang được chú trọng Tế bào nội mô đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc mạch và quá trình tạo mạch nhân tạo Đã có một số nghiên cứu báo cáo về khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô của MSC có nguồn gốc từ mô mỡ (ADMSC) [35, 90], tủy xương (BM-MSC) [106], máu dây rốn (UCBMSC) [37] và dây rốn (UCMSC) [18]

Hiện nay, người ta biết đến MSC kích thích quá trình hình thành mạch thông qua việc tiết các yếu tố tăng trưởng, cytokine, kích thích các tế bào tạo mạch như kích

thích tế bào nội mô tạo mạch in vitro, tuy nhiên đặt ra một thắc mắc rằng MSC có

tự tạo thành mạch được hay không Vì vậy việc nghiên cứu MSC hình thành mạch

cùng với sự biệt hóa thành các tế bào thành mạch có vai trò lớn trong nghiên cứu bản chất khả năng kích thích tạo mạch của MSC

1.2 Mô hình mạch máu in vitro Matrigel

Các thí nghiệm hình thành mạch là một công cụ quan trọng để nghiên cứu cả

cơ chế hình thành mạch và tiềm năng phát triển các chiến lược điều trị để điều chỉnh

sự hình thành mạch mới Do đó, trong những năm gần đây, một số phương pháp đánh giá sự hình thành mạch đã được giới thiệu [97] Một trong những vấn đề mà các nhà nghiên cứu sự tạo mạch phải đối mặt là khó khăn trong việc tìm kiếm các phương pháp thích hợp Thí nghiệm lý tưởng sẽ bao gồm đáng tin cậy, đơn giản về mặt kỹ thuật, dễ dàng định lượng và quan trọng nhất là phù hợp về mặt sinh lý học

Bảng 2 Các phương pháp đánh giá hình thành mạch máu phổ biến hiện nay [96] Loại xét

nghiệm

Tên thí nghiệm

Sự hình thành lumen đang được tranh luận Các tế bào không phải nội mô cũng tạo mô hình mạch

Nhạy cảm với áp lực oxy Do mạng lưới mạch máu đã có từ trước, việc hình dung các mao mạch mới có thể khó khăn

In vivo Cá ngựa vằn Xét nghiệm tương

đối nhanh (6–12 giờ) Định lượng đầy đủ Sự phá vỡ

hệ mạch không làm hỏng phôi

Không chỉ ra điểm cụ thể trong dòng mạch bị gián đoạn

Đắt tiền để duy trì trong điều kiện nuôi

Không phân biệt được giữa tác dụng gây độc tế bào và ức chế thực

sự

In vivo Matrigel

plug

Cung cấp một môi trường tự nhiên hơn cho quá trình hình thành mạch Kỹ thuật không khó

Kinh phí đắt Thời gian dài

Quá trình hình thành mạch in vivo rất năng động và phức tạp, các xét nghiệm hình thành mạch in vivo được coi là thông tin đầy đủ nhất nhưng thường tốn kém, mất thời gian và cần được đào tạo chuyên sâu để thực hiện Các xét nghiệm in vitro

có xu hướng nhanh hơn, ít tốn kém hơn và dễ giải thích hơn Các xét nghiệm hình

thành mạch in vitro hoạt động trên nguyên tắc mà các tế bào nội mô hình thành cấu

trúc giống như ống khi được nuôi cấy trên chất nền hỗ trợ [31] Chất này kích thích

sự gắn kết, di chuyển và biệt hóa của các tế bào nội mô vào các ống theo cách tương

tự in vivo [51, 59] Sự hình thành các điểm nối chặt chẽ giữa các tế bào nội mô đã

được xác nhận bằng kính hiển vi điện tử [8] Sự hình thành mạch được mô hình hóa trong ống nghiệm bằng một số các xét nghiệm, quá trình nuôi cấy ngắn hạn các tế bào nội mô trong Matrigel - một hỗn hợp protein sền sệt thu được từ tế bào sarcoma chuột Engelbreth -Holm - Swarm [24] Xét nghiệm Matrigel này nhanh chóng và dễ

thực hiện và cũng cho phép mô hình in vitro về hành vi của tế bào nội mô, bao gồm

sự tồn tại, apoptosis và các bước dẫn đến sự hình thành và xâm lấn mao mạch Nó cũng quan trọng để điều tra tác động của thuốc hoặc các phân tử nhỏ lên quá trình

hình thành mạch in vitro trước khi chúng được phát triển thành các liệu pháp điều

trị lâm sàng [54] Tuy nhiên, mặc dù Matrigel đã được chứng minh là hướng các tế bào nội mô theo con đường biệt hóa [33], vẫn còn vấn đề liệu các mạch hình thành trên Matrigel có lưu thông được không Sự hình thành Lumen cũng có thể không xảy ra khi các ống hình thành trên collagen hoặc fibrin [113] Ngoài ra, các loại tế bào không phải nội mô khác, bao gồm nguyên bào sợi chính của người, dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt ở người (PC3) và tế bào u nguyên bào thần kinh đệm (U87-MG) đã được chứng minh là hình thành “mạch” trên Matrigel [30], suy đoán rằng có thể Matrigel không phải là một chất kích thích cụ thể sự biệt hóa nội

mô [30] Tuy nhiên việc đánh giá các tế bào không phải nội mô hình thành mạch trên Matrigel chưa được làm rõ Việc so sánh tiềm năng biệt hóa thành tế bào nội

mô của MSC từ các nguồn mô mỡ, dây rốn và máu dây rốn là một hướng tiếp cận khác để đánh giá khả năng tạo mạch của MSC

Nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng để định lượng sự hình thành mạch trong xét nghiệm Matrigel này Báo cáo của Khoo và cộng sự (2011) [54] đã chứng minh hai phương pháp định lượng Angiosys và Wimasis đều dễ sử dụng, định lượng chính xác quá trình hình thành mạch Trong nghiên cứu này, chúng tôi

sử dụng phương pháp định lượng bằng Image J đây là một phần mềm miễn phí, dễ

dàng sử dụng và nhanh chóng để định lượng khả năng hình thành mạch trên Matrigel của MSC từ ba nguồn AD, UC và UCB

1.3 Tế bào nội mô (EC) và tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn (HUVEC)

Lớp tunica trong cùng bao gồm một lớp tế bào nội mô (ECs) bao bọc toàn bộ

hệ mạch Nội mô của một người trưởng thành được ước tính xấp xỉ 1 x 1013 ECs [9] Vài các dấu hiệu đặc trưng được sử dụng để xác định ECs, bao gồm cadherin nội mô mạch máu, phân tử kết dính tế bào nội mô tiểu cầu 1, thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGFRs) và isolectinB4 [66] Trong giai đoạn phát triển, hầu hết các ECs bắt nguồn từ trung bì tấm bên [82] và thông qua quá trình sinh mạch, các ECs nguyên thủy kết hợp thành các ống mạch máu ban đầu [87] Sau

đó, các ống ECs ban đầu này tạo ra các mạch xa hơn thông qua quá trình hình thành mạch, một quá trình nhiều bước bao gồm ECs tăng sinh, di cư, xâm lấn, hình thành lòng mạch và ổn định ống Các mạch mới hình thành tuyển dụng các tế bào xung

*Nguồn: Theo Weidmann và cộng sự (2015) [107]

Hình 2 Cấu tạo thành mạch máu

quanh (tế bào cơ trơn – SMCs, pericytes) tạo ra sự ổn định và khi đó tế bào ECs ở trạng thái nghỉ [12]

Ngoài quá trình hình thành mạch, ECs đóng vai trò quan trọng trong các quá trình đa dạng, như đông máu, viêm, chức năng rào cản, điều chỉnh lưu lượng máu,

và tổng hợp hoặc giảm các thành phần ECM [22] Với các chức năng quan trọng này làm cho ECs khỏe mạnh không thể thiếu cho sự phát triển bình thường của mạch máu và cân bằng nội môi Trong các mạch máu trưởng thành, các ECs sẽ không hoạt động trừ khi được kích hoạt bởi các tín hiệu proangiogenic, một danh sách đầy đủ các yếu tố như vậy gần đây đã cung cấp [26] Với vai trò quan trọng của ECs trong mạch máu và cân bằng nội môi, không có gì đáng ngạc nhiên khi cân bằng tạo mạch bị xáo trộn và rối loạn chức năng ECs là những phát hiện phổ biến trong một số rối loạn bệnh lý, bao gồm tăng huyết áp, xơ vữa động mạch, bệnh mạch máu toàn thân, đột quỵ, hội chứng viêm và ung thư [22] Vì vậy trong nghiên cứu bệnh lý tim mạch, các tế bào nội mô ECs thường được chú trọng

Với mục tiêu tạo ra mô nhân tạo và cấy mô vào bệnh nhân, nghiên cứu hiện tại tập trung vào việc tạo ra các hệ thống mạch máu nhân tạo có chức năng trong ống nghiệm Là một trong những cách tiếp cận khả thi, các chiến lược dựa trên tế bào tập trung vào việc thúc đẩy quá trình hình thành mạch bằng cách lắp ráp các tế bào mạch máu Ví dụ Moya và cộng sự [70] gần đây đã chứng minh việc lắp ráp các ECs để tạo thành một mạng lưới mao mạch người liên kết với nhau và có thể sử dụng được như một phần của thiết bị vi lỏng (microfluidic) khi chúng điều chỉnh mức giảm áp suất thích hợp giữa các kênh 'động mạch' và 'tiểu tĩnh mạch' Nhưng ở dạng hiện tại không hữu ích cho việc lắp ráp mô 3D hoặc cấy ghép vào cơ thể sống Trong y học tái tạo, đặc biệt là tạo ra một mạch máu thay thế để chữa trị các bệnh tim mạch liên quan đến tổn thương và hư hỏng mạch Tạo ra mạch máu từ các tế bào tạo mạch mà không chứa các vật liệu khác đang được chú trọng, do khả năng tương thích sinh học cao Tế bào nội mô đóng vai trò quan trọng do là yếu tố tham trong quá trình thải ghép, điều hòa nội mô, tương tác với các tế bào mạch máu [6]

Trong nghiên cứu in vitro, để nghiên cứu cơ chế và các chất ảnh hưởng đến quá

trình hình thành mạch, nguồn tế bào nội mô được sử dụng phổ biến nhất là tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn (HUVEC) do các ưu điểm của nó: dễ phân lập và nuôi

cấy tăng sinh in vitro, thu thập không xâm lấn vì là chất thải sinh học.HUVEC là

mô hình rất hữu ích cho bất kỳ nghiên cứu nào về các thuộc tính chung của EC người, nhưng các nguồn EC khác có thể là mô hình tốt hơn cho các nghiên cứu về các khu vực bệnh lý cụ thể Tuy nhiên, HUVEC là đơn giản nhất và có là loại EC có sẵn của người, và dễ dàng chuẩn bị một lượng lớn tế bào [10]

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng việc lắp ráp các ECs với các tế bào mạch máu

bổ sung, chẳng hạn như pericytes và tế bào cơ trơn, là rất quan trọng để tạo ra các mạch máu nhân tạo ổn định, chức năng và các mô chức năng thay thế [25, 56] Tuy nhiên, nguồn tế bào nội mô cung cấp đủ cho tạo mạch máu nhân tạo là một vấn đề cần được giải quyết Theo cơ chế miễn dịch, thì tế bào nội mô của chính người nhận

là lý tưởng nhất, tuy nhiên việc thu nhận tế bào nội mô ở nhiều bệnh nhân là không khả quan đặc biệt là ở những bệnh nhân lớn tuổi có tiền sử bệnh nền phức tạp, những người mắc các bệnh lý gây suy giảm chức năng của tế bào nội mô Việc sử dụng tế bào HUVEC cũng không khả quan do HUVEC là tế bào nội mô trưởng thành, nếu sử dụng để tạo mạch máu nhân tạo và ghép dị gen dễ gây tình trạng thải ghép và bệnh nhân sẽ phải duy trì các biện pháp ức chế miễn dịch, gây ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống Hiện nay, liệu pháp tế bào gốc trung mô (MSC) với các

ưu điểm đã được chứng minh như dễ phân lập và nuôi cấy mở rộng, khả năng điều hòa và ức chế miễn dịch, khả năng biệt hóa đa dòng, MSC trở thành ứng cử viên sáng giá cho nguồn tế bào nội mô cung cấp cho tạo mạch nhân tạo

1.4 Hệ hạt nano SiO 2 @FITC COOH trong đánh dấu tế bào

Các chất đánh dấu tế bào là những chất gắn hoặc xâm nhập vào tế bào và có khả năng phát tín hiệu khi được kích thích bởi một nguồn sáng và được thu nhận qua một hệ thống Có nhiều phương pháp để đánh dấu tế bào như sử dụng protein huỳnh quang green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP) [27] Mặc dù các protein phát huỳnh quang này đang được sử dụng phổ biến tuy nhiên những hạn chế như độ phức tạp thí nghiệm để tạo ra tế bào gắn protein huỳnh

quang này hơn nữa chúng được báo cáo không duy trì thời gian dài trong tế bào sau khi biểu hiện [77] Ngoài ra, phải kể đến các thuốc nhuộm huỳnh quang phân tử nhỏ

có tính ứng dụng cao hơn do mật độ lớn, khả năng phát quang cao, nhắm mục tiêu phân bố đều trong tế bào và không gây độc tế bào như eFluor670, CFSE và CellTrace Violet (CTV) được sử dụng để theo dõi sự tăng sinh tế bào in vitro và in

vivo bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy [11, 64, 85] Tuy nhiên, eFluor670 và

CTV có thể gây ra hiệu ứng huỳnh quang nền cao, thậm chí tạo tín hiệu dương tính giả nếu phân tử tích tụ ở vị trí ngoài mục tiêu

Trong nghiên cứu quá trình tạo mạch, việc đánh dấu và quan sát các tế bào khi tham gia vào quá trình tạo mạch là quan trọng để hiểu rõ về bản chất, cơ chế tạo mạch của tế bào Thách thức chính trong việc đánh dấu tế bào là sự kết hợp giữa phân tử thuốc nhuộm và tế bào đích, sao cho tế bào được đánh dấu có thể duy trì tín hiệu huỳnh quang trong một thời gian dài mà quá trình đó không ảnh hưởng đến chức năng tế bào Các hạt nano có thể đáp ứng được yêu cầu do cấu trúc và đặc tính hóa học của chúng có thể được biến đổi tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nhập bào Các vật liệu có kích thước nano mét hiện nay đang được đặc biệt quan tâm nghiên cứu chế tạo và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Các tế bào và các thành phần cấu tạo của nó nằm ở thang sub-micro và micro mét, các protein và đại phân tử trong các tế bào có kích thước ở thang nano vì vậy các hạt có kích thước từ vài đến vài trăm nano mét đã trở thành các chất đánh dấu và đầu dò lý tưởng để đưa vào các

hệ sinh học Các phương pháp hóa học bề mặt đa dạng giúp cho việc bọc, chức năng hóa và tích hợp các hạt nano với các phân tử sinh học trở nên dễ dàng Điều này đã

mở cánh cửa cho nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử và y sinh, như vận chuyển thuốc và gen, thiết kế các mô, phát hiện protein, ADN và tế bào, đánh dấu các vi khuẩn gây độc thực phẩm (E.coli và Samonella) Hơn nữa, chúng có thể mang các phân tử đánh dấu (chất màu huỳnh quang) với mật độ lớn vào trong tế bào và có thể

dễ dàng kiểm soát số lượng các phân tử này Các hạt nano thường được chia thành nhiều loại tùy thuộc vào hình thái, kích thước và tính chất hóa học của chúng Có thể liệt kê một số loại hạt nano thường dùng trong các phân tích sinh học như: các

hạt nano kim loại (vàng và bạc), các hạt nano từ tính (oxit sắt), các hạt nano chứa chất màu và một số vật liệu nano khác.

Các hạt nano silica thuộc nhóm loại vật liệu khác với những ưu điểm rõ ràng như sự ổn định về cấu trúc, không độc, có khả năng tương thích sinh học cao Do

đó, sự kết hợp của nó với chất màu huỳnh quang sẽ tạo ra lợi thế trong ứng dụng làm chất đánh dấu sinh học Hạt nano silica chứa tâm màu là các hạt SiO2 xốp, kích thước nano, có thể chứa một số lượng lớn phân tử màu hữu cơ trong một hạt silica đơn Vậy nên, khả năng phát quang của các hạt nano silica có thể được điều khiển bằng mật độ số phân tử chất màu trong mỗi hạt Nền silica chứa rất ít oxy tự do nên giảm nguy cơ tín hiệu huỳnh quang bị dập tắt Độ bền quang cao cũng là một trong những ưu điểm cho phép các hạt nano silica được sử dụng trong các ứng dụng đòi hỏi cường độ kích thích mạnh trong thời gian dài [63] Các hạt silica với nhóm –OH trên bề mặt có thể tham gia phản ứng hoá học để tạo các nhóm chức có khả năng liên kết đặc hiệu với các phân tử sinh học như là amin (- NH2), carboxyl (-COOH) hay thiol (-SH) tùy theo từng mục đích sử dụng Trong môi trường sinh học, hạt nano silica được gắn nhóm chức COOH giúp phân tử hạt phân tán đều hơn, dễ dàng tạo đơn hạt hơn Bằng cách điều chỉnh các thông số chế tạo, có thể điều khiển kích thước hạt cũng như số lượng tâm màu trong hạt hay loại tâm màu đưa vào Thêm vào đó, độ pH của môi trường thay đổi không làm các hạt silica bị phồng lên hay thay đổi độ xốp Vì vậy, người ta có thể tạo ra một nhóm lớn các hạt phát quang với các tính chất quang đa dạng dùng trong đánh dấu Chất màu FITC (fluorescein isothiocyanate) là phân tử huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất với vai trò như một chất đánh dấu trong tế bào Phân tử này bị phân hủy quang rất nhanh dưới ánh sáng kích thích Vì vậy, việc đưa FITC vào nền silica làm tăng độ bền quang là một bước tiến mới [46] FITC có đỉnh hấp thụ tại 480 nm, đỉnh phát quang tại 520 nm

Hệ hạt nano SiO2@FITC COOH là một phương pháp nhuộm tế bào mới, chưa được đánh giá, vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá tác động của hệ hạt lên các hoạt động sinh lý của tế bào MSC và HUVEC như tăng sinh, di cư, già hóa

và tạo mạch

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Tế bào gốc trung mô phân lập từ máu dây rốn, dây rốn

và mô mỡ

Máu dây rốn và dây rốn được thu thập sau khi em bé sinh ra tại Bệnh viên

Đa khoa Quốc tế Vinmec, Hà Nội, trong khoảng thời gian từ tháng 4 năm 2022 đến tháng 10 năm 2022, người mẹ được thông báo đầy đủ về mục đích nghiên cứu và đồng ý hiến tặng mẫu máu dây rốn và mô dây rốn

Mô mỡ được thu thập bằng phương pháp hút thẩm mỹ tại khoa thẩm mỹ Bệnh viên Đa khoa Quốc tế Vinmec, Hà Nội trong khoảng thời gian từ tháng 4 năm

2022 đến tháng 10 năm 2022 Người hiến tặng được thông báo đầy đủ về mục đích nghiên cứu và đồng ý hiến tặng mẫu mô mỡ

Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu

- Máu dây rốn: Người mẹ không mắc các bệnh truyền nhiễm như HIV, HBV, HCV Tổng thể tích máu thu được ≥ 90 mL Mẫu thu thập không quá 2 giờ trước khi phân lập

- Dây rốn: Người mẹ không mắc các bệnh truyền nhiễm như HIV, HBV, HCV Chiều dài dây rốn ≥ 10 cm

- Mô mỡ: Bệnh nhân không mắc các bệnh truyền nhiễm như HIV, HBV, HCV Thể tích mỡ hút được ≥ 30 mL

Kết quả thu thập mẫu:

- Máu dây rốn: Thể tích máu dây rốn trung bình là 120 mL (n=3)

- Dây rốn: Chiều dài dây rốn trung bình là 20 cm (n=3)

- Mô mỡ: Thể tích mỡ hút trung bình là 65 mL (n=3)

• Vật liệu nghiên cứu:

❖ Matrigel (Angiogenesis Assay Kit (In Vitro) (ab204726) (Abcam, Anh))

❖ Hệ hạt nano SiO2@FITC COOH được cung cấp bởi Viện Vật lý

+ Kích thước hạt: 70-100 nm + Mật độ hạt: 8.1012 hạt/ mL + Nồng độ hạt: 5 mg/ mL + Dung dịch pha loãng: PBS 1X

Mỹ

STEMPRO Osteogenesis Differentiation Kit,

STEMPRO Adipogenesis Differentiation Kit,

STEMPRO Chondrogenesis Differentiation Kit

Thermo Fisher Scientific, Mỹ

18 Alizarin Red S, Oil Red O, Alcian Blue Sigma-Aldrich, Mỹ

19 HCl 0.1 N

20 Angiogenesis Assay Kit (In Vitro) Abcam, Anh

Mỹ

Mỹ

10 Tủ thao tác với hóa chất bay hơi ESCO, Indonesia

12 Máy đo OD SpectraMAX Plus

2.2.3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao

Bảng 5: Dụng cụ và vật tư tiêu hao STT Dụng cụ và vật tư tiêu hao Hãng sản xuất

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập và nuôi cấy tế bào

Phân lập tế bào gốc trung mô từ máu dây rốn

Tế bào gốc trung mô máu dây rốn (UCBMSC) được phân lập theo phương pháp của Nguyen TL và cộng sự (2022) [72] Mẫu máu được ly tâm tỷ trọng sử dụng Ficoll-Paque 430 x g/ 30 phút/ 20oC để phân lập các tế bào đơn nhân trong máu trước khi gieo vào đĩa nuôi cấy với môi trường StemMACSTM MSC (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Đức) Đồng thời, huyết tương từ mẫu máu sẽ được thu thập để thu lấy huyết thanh tự thân, sử dụng để phủ lên bề mặt đĩa nuôi cấy cũng như bổ sung vào môi trường nuôi cấy Môi trường được loại bỏ và thay mới sau 48-72 giờ Quần thể MSC sẽ được phát hiện sau 2-3 tuần

Phân lập tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn

Phương pháp phân lập tế bào gốc trung mô dây rốn (UCMSC) được tiến hành theo Hoang DH và cộng sự (2020) [45] Dây rốn được rửa 3 lần với cồn 70% để khử trùng và 3-4 lần với PBS và loại bỏ máu Mẫu dây rốn được băm nhỏ trước khi được ủ lắc với 200 U/mL collagenase loại I (Gibco, Massachusetts, USA) trong 2h ở 37oC Sau đó bổ sung thêm PBS vào dung dịch và lọc qua màng lọc 100 µm, ly tâm 400 x g/

10 phút/ 4oC để thu cặn tế bào Cặn tế bào được hòa trong môi trường nuôi cấy

StemMACSTM MSC (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) rồi chuyển vào chai nuôi cấy đã phủ bề mặt bằng CTSTM CELLstartTM (Gibco, Massachusetts, USA) (pha loãng trong PBS tỉ lệ 1:100), nuôi ở điều kiện 5% CO2, 37oC Mỗi 5mg mô dây rốn, cặn tế bào thu được sẽ được gieo vào 1 chai T25 Thay môi trường sau mỗi 3 ngày

Phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ

Phương pháp phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (ADMSC) được tiến hành theo Tissiani và cộng sự (2012) [100] Mô mỡ được rửa 2-3 lần với PBS bằng phương pháp ly tâm ở 500 x g/ 10 phút/ 20oC để loại bỏ máu, thu lớp mỡ nổi phía trên Mô được ủ lắc với 200 U/mL collagenase loại I (Gibco, Massachusetts, USA) pha loãng trong Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) và 0,1% human albumin trong 1 giờ ở

37oC Tế bào được thu thập bằng ly tâm ở 500 x g/ 10 phút/ 20oC loại bỏ dịch nổi thu cặn tế bào, hòa cặn trong môi trường nuôi cấy StemMACSTM MSC (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) Gieo tế bào ở mật độ 5000 tế bào/ cm2 vào chai nuôi cấy T75 đã được phủ CTSTM CELLstartTM (Gibco, Massachusetts, USA) (pha loãng trong PBS tỉ lệ 1:100), nuôi cấy ở 37oC và 5% CO2

Phân lập tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn

Phương pháp phân lập tế bào tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn (HUVEC) được tiến hành theo Baudin và cộng sự (2007) [10] Dây rốn được rửa với cồn 70o để khử trùng và PBS loại bỏ máu Dùng kim tiêm bơm PBS qua tĩnh mạch dây rốn để rửa và loại máu tĩnh mạch Bơm 500 U/mL collagenase loại I (Gibco, Massachusetts, USA) pha loãng trong HBSS và 0.1% human albumin vào tĩnh mạch dây rốn đã cố định một đầu Cố định đầu còn lại và ủ ở 37oC trong 20 phút Thu dịch trong tĩnh mạch sau khi ủ

và ly tâm 400 x g/ 10 phút Cặn tế bào được hòa với môi trường nuôi cấy EGM-2 (Lonza, Thụy Sĩ) và gieo vào chai nuôi cấy T75 Sau 2 ngày môi trường được thay thế

và loại bỏ tế bào trôi nổi

2.3.2 Đánh giá sự biểu hiện dấu ấn bề mặt sinh học

Phương pháp phân tích tế bào bằng Flow cytometry là một kỹ thuật dựa trên nguồn kích thích laser, bằng cách đưa tế bào vào một dòng chất lỏng, sau đó cho đi qua một thiết bị dò điện tử được sử dụng để đếm tế bào, phân loại tế bào và nhận diện các dấu ấn bề mặt của tế bào

Tế bào gốc trung mô

Flow Cytometry sử dụng BD Stemflow™ hMSC Analysis Kit Các mẫu sử dụng cho đánh giá Flow bao gồm:

+ Cocktail positive gồm có CD90 FITC/ CD105 PerCP-Cy5.5/ CD73 APC

+ Cocktail negative gồm có CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA-DR PE

+ Isotype control gồm có mIgG1 - κ FITC/ mIgG1- κ PerCP-Cy5.5/ mIgG1- κAPC (Positive Isotype) và mIgG1 - κ PE/ mIgG2a - κ PE (Negative Isotype)

+ 2 ống Isotype control bao gồm Positive Isotyope và Negative Isotype + 2 ống Cocktail bao gồm Cocktail Positive và Cocktail Negative

Tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn

- Khi tế bào đạt độ bao phủ 80% bề mặt nuôi cấy ở lần cấy chuyển thứ 2, thu khoảng 2 x 106 tế bào sử dụng TrypLE (Thermo Fisher Scientific,

USA) để chạy flow cytometry

- Tế bào được chia thành 6 ống với các điều kiện sau:

+ Ống Unstain: chỉ bao gồm tế bào không có kháng thể + 3 ống nhuộm với 3 kháng thể kháng dương tính gồm: CD31-FITC, CD146-FITC, CD105-PerCP Cy5.5 và

+ 1 ống nhuộm với kháng thể âm tính CD90-FITC + 1 ống nhuộm với Myosin heavy chain-APC: Fix tế bào với formaldehyde 4% trong 20 phút Ly tâm 300 x g trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi Bổ sung 500 µL PBS/BSA 0,5%, ly tâm 300 x g trong 5 phút

Bổ sung 100 µL saponin 0,5%, trộn đều và ủ 4oC trong 15 phút Ly tâm 300x g trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi Bổ sung 50 µL kháng thể đã được pha loãng trong Perm/Wash 1X trộn đều và ủ ở 4oC trong 30 phút Ly tâm 300xg trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi Bổ sung 200 µL PBS/BSA 0,5% và trộn đều

Phân tích tế bào dòng chảy sử dụng Beckman Coulter flow cytometer và phần mềm

Navious

2.3.3 Đánh giá khả năng biệt hóa thành xương, sụn và mỡ của MSC

Biệt hóa thành nguyên bào xương

Nuôi tế bào MSC ít nhất hai tuần trong môi trường biệt hóa tạo xương (STEMPRO Osteogenesis Differentiation Kit, Thermo Fisher Scientific, USA)

Quy trình:

- Khi tế bào đạt 80% độ bao phủ tiến hành thu tế bào bằng trypLe

- Gieo tế bào trong môi trường StemMACS với mật độ 122000 tế bào/500 µl/ giếng vào đĩa 24 giếng để tế bào đạt độ bao phủ 80% sau khi bám dính

- Ủ tế bào vào tủ 37oC, 5% CO2, 6 giờ để tế bào bám dính hoàn toàn

- Sau khi tế bào bám dính, thay môi trường biệt hóa tạo xương STEMPRO Osteogenesis Differentiation Kit Nuooic ấy trong 14 ngày, thay môi trường sau mỗi 3 ngày

- Khi tế bào xuất hiện các dấu hiệu của nguyên bào xương, rửa sạch bằng PBS và được cố định với 4% paraformaldehyde 30 phút ở nhiệt độ phòng Tế bào được rửa lại bằng nước cất và nhuộm với 2% Alizarin Red

S (pH=4.2) trong vòng 2-3 phút ở nhiệt độ phòng Rửa lại tế bào với nước cất Chụp ảnh và soi trên kính hiển vi soi ngược (Olympus, Nhật Bản)

Biệt hóa thành nguyên bào mỡ

Quy trình thu tế bào và gieo tế bào giống biệt hóa nguyên bào xương

- Môi trường biệt hóa tạo mỡ là STEMPRO Adipogenesis Differentiation

Kit, Thermo Fisher Scientific, USA

- Nuôi cấy trong 14 ngày, thay môi trường sau mỗi 3 ngày

- Khi xuất hiện các giọt mỡ, rửa tế bào với PBS, cố định tế bào bằng 4% paraformaldehyde 30 phút ở nhiệt độ phòng Nhuộm tế bào với dung dịch Oil Red O (pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1 Oil Red O : 2 nước cất) trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Chụp ảnh và soi trên kính hiển vi soi

ngược (Olympus, Nhật Bản)

Biệt hóa thành nguyên bào sụn

- Gieo 5 l huyền phù tế bào MSC (107 tế bào/ml) thành giọt vào mỗi giếng và ủ trong tủ 37oC, 2% CO2 cho tế bào bám dính, sau đó bổ sung môi trường biệt hóa tạo sụn (STEMPRO Chondrogenesis Differentiation Kit, Thermo Fisher Scientific, USA) nuôi cấy trong ít nhất hai tuần, thay môi trường sau mỗi 3 ngày

- Khi tế bào cuộn tròn thành giọt sụn, tiến hành nhuộm giọt sụn Rửa tế bào với PBS và cố định bằng 4% paraformaldehyde trong 30 phút ở nhiệt

độ phòng Tế bào được rửa lại bằng PBS và nhuộm với dung dịch 1% Alcian Blue trong 3% acetic acid (pH = 2,5) trong vòng 30 phút ở nhiệt

độ phòng Rửa lại với 0,1 N HCl và nước cất Chụp ảnh và soi trên kính hiển vi soi ngược (Olympus, Nhật Bản)

2.3.4 Đánh giá khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô của MSC

Biệt hóa tế bào MSC thành tế bào nội mô

Phương pháp biệt hóa được tiến hành theo Gaafar và cộng sự (2014) [34] Cả 3 loại tế bào MSC ở lần cấy chuyển thứ 3 được gieo vào đĩa 6 giếng với mật độ 5000 tế bào/ cm2 và nuôi cấy với môi trường EGM-2 (Lonza, Thụy Sĩ) trong 21 ngày Thay môi trường sau mỗi 3 ngày Tế bào sau khi biệt hóa được thu bằng CTSTM TrypLETM(Thermo Fisher Scientific, USA) để đếm tế bào dòng chảy phát hiện các dấu ấn đặc trưng của tế bào nội mô

Đánh giá tế bào sau biệt hóa

Tế bào sau khi thu được chia thành các ống:

+ 1 ống Unstain: chỉ chứa tế bào không nhuộm kháng thể

+ 1 ống nhuộm với các kháng thể kháng CD31-FITC, 1 ống nhuộm với REA Control Antibody (S), human IgG1

+ 1 ống nhuộm với các kháng thể kháng CD34-FITC, 1 ống nhuộm với Isotype Control Antibody, mouse IgG2a

+ 1 ống nhuộm với các kháng thể kháng CD146-FITC, 1 ống nhuộm với Isotype Control Antibody, mouse IgG1

+ 1 ống nhuộm với kháng thể Cocktail Positive MSC gồm CD90 FITC, CD105 PerCP-CyTM5.5 và CD73 APC 1 ống nhuộm với Isotype control gồm có mIgG1 - κ FITC/ mIgG1- κ PerCP-Cy5.5/ mIgG1- κAPC

Phân tích tế bào dòng chảy sử dụng Beckman Coulter flow cytometer và phần mềm Navious

2.3.5 Đánh giá khả năng tạo mạch in vitro của MSC

Đánh giá tạo mạch in vitro của MSC và HUVEC trên Matrigel sử dụng bộ kit Angiogenesis Assay Kit (In Vitro) (Abcam, Anh) Gieo 2 x 104 tế bào vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đã được coat 50 µl Extracellular Matrix Solution theo hướng dẫn của nhà cung cấp Với đối chứng âm, tế bào được nuôi trong môi trường bổ sung 10 µM Suramin (chất ức chế tạo mạch) Với đối chứng nền, tế bào được gieo vào giếng phủ 50

µl dung dịch CTSTM CELLstartTM (Gibco, Massachusetts, USA) (pha loãng trong PBS

tỉ lệ 1:300) Theo dõi tạo mạch trong 10 giờ Nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang đi kèm bộ kit theo hướng dẫn của nhà cung cấp và chụp ảnh dưới kính hiển vi huỳnh quang (Olympus, Nhật Bản) Định lượng và phân tích bằng Image J 1.53q

2.3.6 Đánh giá khả năng đánh dấu tế bào của hệ hạt SiO 2 @FITC COOH

Tế bào khi đạt mật độ khoảng 80% sẽ được thu bằng TrypLE và cấy chuyển sang đĩa 6 giếng với mật độ tế bào là 2 x 105 tế bào/ giếng Môi trường nuôi cấy tế bào

sẽ được bổ sung thêm hệ hạt SiO2@FITC COOH với các nồng độ 50 và 100 µg/mL Ủ

tế bào trong tủ nuôi cấy 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ Sau đó, tế bào được rửa với PBS 2 lần và được cố định bằng paraformaldehyde (PFA) 4% trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Thuốc nhuộm DAPI được sử dụng để nhuộm nhân tế bào Hình ảnh tế bào thu nhận được chụp bằng kính hiển vi huỳnh quang (Olympus, Nhật Bản)

2.3.7 Đánh giá tính tương thích sinh học của hệ hạt

2.3.7.1 Đánh giá ảnh hưởng của hệ hạt SiO 2 @FITC COOH lên khả năng tăng

sinh của MSC và HUVEC

Để đánh giá sự tác động của hệ hạt nano đến khả năng tăng sinh tế bào MSC và HUVEC, chúng tôi sử dụng xét nghiệm MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)

Các bước được tiến hành như sau:

+ MSC và HUVEC được gieo với mật độ lần lượt là 2500 tế bào và 2000 tế bào trong100 µL môi trường nuôi cấy chứa hệ hạt SiO2@FITC COOH với các nồng độ là

1, 10, 50 và 100 µg/mL / giếng Đối chứng sinh học (ĐCSH) là tế bào được nuôi trong môi trường bình thường không bổ sung hệ hạt Tế bào được nuôi trên đĩa 96 giếng đã được phủ CTSTM CELLstartTM (pha loãng trong PBS tỉ lệ 1:300) trong tủ nuôi cấy

37oC, 5% CO2

+ Đánh giá số tế bào sống tại các thời điểm 24h, 28h, và 72h bằng kit MTT (Abcam, Cambridge, UK): Hút bỏ 50 µL môi trường cũ, thêm 50 µL MTT Reagent vào mỗi giếng Để vào tủ nuôi cấy 37oC trong 3 giờ Sau 3 giờ, thêm 150 µL MTT Solvent vào mỗi giếng, trộn đều, lắc trong 15 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng 560nm

2.3.7.2 Đánh giá ảnh hưởng của hệ hạt SiO 2 @FITC COOH lên khả năng di

chuyển của tế bào

Để đánh giá ảnh hưởng của hệ hạt đến khả năng di chuyển của MSC và HUVEC, chúng tôi sử dụng phương pháp tạo vết rạch để quan sát sự che phủ của tế bào vào vết rạch theo thời gian Phương pháp thực hiện theo Hoang HD và các cộng sự (2020) [45]

Các bước được tiến hành như sau:

+ Tế bào MSC và HUVEC được gieo vào đĩa 24 giếng với mật độ tế bào lần lượt

là 150.000 tế bào và 100.000 tế bào/ 500 µL môi trường nuôi cấy/ giếng để đạt độ bao phủ 100% sau khi tế bào bám dính

+ Sau khi tế bào bám dính, hút bỏ môi trường cũ, cho môi trường mới chứa Mitomycin C nồng độ 10 µg/mL đối với MSC và 5 µg/mL đối với HUVEC (250 µL/ giếng) để vào tủ 37oC trong 2 giờ

+ Sau 2 giờ, loại bỏ môi trường cũ, rửa bằng môi trường, tạo vết rạch bằng đầu tip 200 µL vô trùng, rửa lại bằng môi trường để loại các tế bào bong, chết

+ Thêm môi trường mới chứa hệ hạt nano SiO2@FITC COOH với các nồng độ 50

và 100 µg/mL Đối chứng sinh học bổ sung môi trường nuôi cấy thông thường

+ Chụp ảnh tại các thời điểm sau khi rạch sau mỗi 4h bằng kính hiển vi huỳnh quang soi ngược (Canon, Tokyo, Nhật Bản) với độ phóng đại 10X Tỉ lệ di chuyển tế bào đến vùng bị thương được phân tích bằng phần mềm ImageJ 1.53q

2.3.7.3 Đánh giá ảnh hưởng của hệ hạt SiO 2 @FITC COOH lên sự già hóa tế bào

Các tế bào ở lần cấy chuyển thứ 3 (P3) được gieo trong đĩa 24 giếng với mật độ 10.000tế bào/ cm2 Bổ sung hệ hạt ở các nồng độ 50 và 100 µg/mL, đối chứng không

bổ sung hệ hạt Tế bào được ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ Sau đó sử dụng

bộ kit Senescence Cells Histochemical Staining Kit (Sigma-Aldrich, Missouri, USA)

để đánh giá sự già hóa tế bào theo các bước sau: Loại bỏ môi trường nuôi cấy, rửa tế bào 2 lần với PBS 1X Sau đó tế bào được cố định bằng 1X Fixation Buffer trong 6 phút ở nhiệt độ phòng sau đó rửa 3 lần với PBS 1X Tế bào được ủ với thuốc nhuộm Staining Mixture qua đêm ở 37oC không có CO2 Các tế bào được rửa 2 lần với PBS và sau đó nhuộm nhân với DAPI (Abcam, Cambridge, UK) Tế bào được kiểm tra và chụp ảnh bẳng kính hiển vi soi ngược (Canon, Tokyo, Nhật Bản) Hình ảnh được phân tích bằng phần mềm ImageJ 1.53q