Tóm tắt: Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn

Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn.

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

1 Người hướng dẫn 1: TS Nguyễn Văn Hạnh, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2 Người hướng dẫn 2: TS Nguyễn Hữu Đức, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 1: TS Nguyễn Văn Long, Bệnh viện Bưu điện, Tập đoàn Bưu chính viễn thông Việt Nam

Phản biện 2: GS TS Nguyễn Huy Hoàng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Lai Thành, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1 Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

2 Thư viện Quốc gia Việt Nam

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài:

Tế bào có chức năng gan biệt hóa từ tế bào gốc đang là một hướng được các nhà khoa học quan tâm, chúng có nhiều tiềm năng ứng dụng trong trị liệu tế bào hay trong nghiên cứu thử nghiệm sàng lọc các hoạt chất hoặc thuốc ở dạng tế bào chức năng riêng lẻ hoặc phối hợp để tạo các vi cơ quan (organoids)

Để biệt hóa tế bào gốc thành tế bào có chức năng gan có thể sử dụng các tác nhân như các cytokine và các nhân tố tăng trưởng, hoặc chuyển gen Một số cytokine và các nhân tố tăng trưởng được biết là có tác dụng nhất

định đối với sự biệt hóa và phát triển tế bào gan trong điều kiện in vitro Tuy

nhiên, việc sử dụng các tác nhân này vẫn có những khác biệt và vẫn còn thiếu một phương thức để đạt hiệu quả như mong đợi

Nhằm góp phần bổ sung thêm thông tin khoa học và điều kiện biệt hóa mới, cũng như mở ra khả năng nghiên cứu ứng dụng sản xuất tế bào gan

cho các mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn” Mục tiêu: (1) Phân lập và nhân nuôi in vitro thành công TBGTM thu từ

cuống rốn làm vật liệu để biệt hóa tế bào và có thông tin về các điều kiện liên quan đến tính ổn định, tiềm năng biệt hóa và khả năng duy trì nguồn TBGTM

trong điều kiện nuôi in vitro; (2) Biệt hóa TBGTM cuống rốn thành tế bào

có biểu hiện một số chỉ thị đặc trưng tế bào gan

Nội dung nghiên cứu: (1) Thu nhận, phân lập và nhân nuôi in vitro TBGTM

từ mẫu cuống rốn; (2) Nghiên cứu đánh giá tính ổn định, tiềm năng biệt hóa

và khả năng duy trì nguồn TBGTM trong điều kiện nuôi in vitro; (3) Nghiên

cứu biệt hóa TBGTM cuống rốn thành tế bào có biểu hiện các chỉ thị đặc

trưng tế bào gan bằng các tác nhân khác nhau trong điều kiện in vitro

Cơ sở khoa học và thực tiễn của đề tài:

Đề tài tiếp tục thực hiện, phát triển các nghiên cứu sâu hơn các nghiên cứu đã thực hiện tại viện Công nghệ sinh học cũng như hướng nghiên cứu đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm

Đề tài hoàn thiện sẽ cung cấp những thông tin có giá trị trong lĩnh vực nghiên cứu TBGTM cuống rốn, từ phương pháp thu thập, phân lập và đánh giá tiềm năng tế bào đến khả năng biệt hóa của chúng Qua đó cho thấy tiềm năng ứng dụng kết quả vào định hướng tạo tế bào gan phục vụ thử nghiệm, sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học, cũng như xây dựng các mô

hình để thử nghiệm các loại thuốc mới

Những đóng góp mới của luận án:

Luận án đã cung cấp đầy đủ các thông tin về khả năng biệt hóa tạo

tế bào có chức năng gan từ nguồn TBGTM phân lập từ cuống rốn trẻ sơ sinh

Đề tài là nghiên cứu đầu tiên sử dụng hệ thống Tet-ON kích hoạt thể hiện

quá mức gen HNF4α để biệt hóa TBGTM cuống rốn thành tế bào có một số

chức năng của tế bào gan

CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 Nguồn tế bào gốc trung mô, tiềm năng biệt hóa và ứng dụng

1.1.1 Nguồn tế bào gốc trung mô

Trong nhiều mô khác nhau của cơ thể người đều có mặt của tế bào gốc trung mô (TBGTM) Nguồn TBGTM cơ bản được biết đến là tủy xương, tuy nhiên trong những phát hiện về sau cho thấy nhiều nguồn tách TBGTM với số lượng lớn hơn tủy xương nhiều lần như mô mỡ, máu ngoại

vi, răng sữa, máu cuống rốn, màng dây rốn, màng nhau, nội mạc tử cung, màng ối…trong số những nguồn cung cấp TBGTM này, thì dây rốn được xem là nguồn khá lý tưởng

1.1.2 Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô

Khả năng tăng sinh mạnh mẽ là một ưu điểm của TBGTM, ngoài

ra TBGTM còn có tiềm năng biệt hóa tạo thành nhiều loại tế bào khác nhau

như các tế bào nguyên bào xương, tế bào sụn, tế bào cơ, tế bào mỡ, tế bào thần kinh, tế bào gan,…

1.1.3 Ứng dụng của tế bào gốc trung mô

Ứng dụng lâm sàng qua trị liệu TBG (Stem cell therapy) được xem

là tiềm năng ứng dụng quan trọng nhất của TBG Từ TBG có thể tạo ra các loại tế bào mới, mô mới để bổ sung hoặc thay thế cho các tế bào và mô cơ quan bị tổn thương hay mất chức năng

1.2 Cấu tạo cuống rốn, ưu điểm của tế bào gốc trung mô từ cuống rốn

1.2.1 Cấu tạo cuống rốn

Dây rốn được bọc bởi màng ối và có cấu tạo gồm có hai động mạch

và một tĩnh mạch, bao quanh là các mô nhầy hay gelatin, còn gọi là lớp Wharton’s jelly (WJ)

1.2.2 Ưu điểm của tế bào gốc trung mô từ cuống rốn

(1) Dễ thu hoạch và xử lý TBG, không gây bất kỳ ảnh hưởng gì đến sức khỏe của cả mẹ và con (2) Có thể chủ động kiểm soát tình trạng các bệnh truyền nhiễm đối với các mẫu nghiên cứu bằng các xét nghiệm trước sinh đối với sản phụ (3) Khả năng phân chia tốt và số lượng tế bào thu được

trực tiếp hoặc sau tăng sinh in vitro là rất lớn, không còn khả năng tạo ra khối

u ác tính như TBG phôi (4) TBG từ dây rốn có thể lưu trữ lâu dài (5) Biểu hiện HLA ở mức thấp và ít bị đào thải trong cấy ghép (6) TBG dây rốn thuộc loại đa tiềm năng, chúng có thể biệt hóa thành các loại tế bào như: tế bào máu, tế bào xương, tế bào cơ tim, tế bào sụn, tế bào mỡ, tế bào gan,

1.3 Tình hình nghiên cứu

1.3.1 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc người

Nghiên cứu TBG ở Việt Nam được thực hiện từ năm 1995, trên các TBG dòng tủy Gần đây, việc nghiên cứu TBG phát triển mạnh với nhiều loại tế bào được nghiên cứu như TBG máu cuống rốn Đối với nguồn TBGTM (chủ yếu là TBG làm giàu từ tủy xương) đã được sử dụng để điều

trị các tình trạng xương khác nhau, chẳng hạn như điều trị lâm sàng bao gồm các ca phục hồi gãy xương chi, gãy xương chày, khắc phục hoại tử đầu xương

1.3.2 Tình hình nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào gan

1.3.2.1 Tình hình nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào gan

Nghiên cứu của Mattiucci và cộng sự (2018) đã chứng minh rằng, TBGTM dây rốn có thể biệt hóa và điều trị bệnh về gan

Hiện nay, có một số dòng tế bào gan được biệt hóa từ TBG đa năng của người đã được thương mại hóa Các công ty cung cấp lớn đều ở Mỹ và Nhật Bản (Yokohama; iCell; Otsu), các công ty này cung cấp các loại tế bào

có đặc điểm và có chức năng phục vụ cho những thí nghiệm cụ thể

1.3.2.2 Các hướng biệt hóa tạo tế bào gan

a Nghiên cứu in vivo và in vitro

Năm 2013, nhóm khoa học Nhật Bản, tại Đại học quốc gia Yokohama thực hiện cấy ghép các TBG đa năng được phân lập từ da và máu người vào gan chuột Tháng 10 năm 2015 các nhà khoa học tại Đại học Jerusalem Hebrew (Israel) tạo ra bước đột phá mới khi nuôi cấy thành công tế bào gan người có chức năng Cũng trong năm 2015, nhóm nghiên cứu của tiến sĩ Roel Nusse - Đại học Stanford - Mỹ đã xác định được một quần thể phát triển hạt nhân và các tế bào tự đổi mới tiếp giáp với các tĩnh mạch trung tâm trong gan

b Sử dụng hóa chất cảm ứng biệt hóa

Một số hormone, cytokine, vitamin, các ion Ca2+ một số hóa chất hay sử dụng trong cảm ứng biệt hóa tế bào như Dexamethason,

Indomethacin, Hydrocortison, TGF-β…với một hàm lượng và tỷ lệ nhất

định tùy thuộc vào mỗi một loại tế bào

c Biệt hóa bằng các chất nền

Tế bào hoạt động nằm trong chất nền ngoại bào ECM (Extra cellular matrix) ECM có chứa các hợp chất cao phân tử như collagen, laminin, fibronectin Ngoài vai trò làm cấu trúc như một giá thể cho các tế bào, ECM còn có vai trò sinh lý như một vi môi trường của các tế bào

d Biệt hóa bằng tổ hợp các cytokine và hóa chất

Trong hầu hết các phương pháp biệt hóa, TBGTM có thể được định hướng tới tế bào có chức năng tế bào gan thông qua các giai đoạn biệt hóa (quá trình biệt hóa gây ra bởi các tác nhân FGF, HGF và các thành phần khác) và giai đoạn trưởng thành tế bào gan (gây ra bởi OSM và dexamethasone) để tạo thành một kiểu hình đặc trưng của tế bào gan chưa trưởng thành

e Đồng nuôi cấy với các tế bào đã biệt hóa

Nhóm nghiên cứu của Stecklum (2014) đã sử dụng TBG máu cuống rốn đồng nuôi cấy với tế bào alpha gan chuột AML12 Nhóm tác giả chỉ ra rằng để từng bước nghiên cứu cảm ứng biệt hóa tế bào có thể sử dụng phương pháp đồng nuôi cấy

f Biệt hóa bằng phương pháp chuyển gen

Phương pháp này thường được sử dụng để điều hòa sự biệt hóa TBG phôi Đưa gen cần chuyển vào tế bào nhằm bổ sung một số gen hoạt động vào hệ gen của TBG phôi, khởi động sự biệt hóa TBG theo con đường tạo thành tế bào chuyên hóa mong muốn

1.3.2.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc trong biệt hóa và điều trị các bệnh lý về gan tại Việt Nam

Tại Việt Nam, năm 2013, Đoàn Chính Chung và cộng sự đã biệt hóa TBGTM từ màng cuống rốn thành tế bào gan sử dụng phương pháp biệt hóa dựa vào sự thay đổi môi trường nuôi cấy

Năm 2014, Nguyễn Thị Kim Nguyền và cộng sự đã biệt hóa được tế

bào giống tế bào gan in vitro từ TBG thu nhận từ mô mỡ

Năm 2015, Trương Thị Hải Nhung đã nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh xơ gan trên mô hình chuột bị xơ gan sử dụng liệu pháp TBG Tiếp theo kết quả nghiên cứu này, Nguyễn Minh Thư và cộng sự (2021) cũng

đã tiến hành thí nghiệm tiêm TBGTM từ dây rốn với liều 5x105 tế bào/con trên chuột tổn thương gan do tắc mật

Trong nghiên cứu lâm sàng, năm 2021, Đào Trường Giang và cộng

sự đã đánh giá kết quả của ghép tế bào gốc tủy xương tự thân để điều trị xơ gan mất bù do viêm gan B

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.2 Vật liệu, hóa chất nghiên cứu

2.2.1 Mẫu nghiên cứu

Mẫu cuống rốn được thu từ những sản phụ khỏe mạnh (thai kỳ đủ tháng, có kết quả âm tính với các xét nghiệm sàng lọc bệnh nhiễm trùng, bao gồm virus HIV, virus viêm gan B, virus viêm gan C, virus CMV và vi khuẩn giang mai) đồng ý hiến tặng, đồng ý qua phiếu tình nguyện tham gia nghiên cứu

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu trong luận án được thực hiện tại Phòng Công nghệ sinh học động vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18, Hoàng Quốc Việt, Nghĩa Đô, Cầu Giấy, Hà Nội

2.2.3 Hóa chất và các bộ kit sử dụng

2.2.4 Thiết bị nghiên cứu

2.2.5 Môi trường thao tác, nuôi cấy, bảo quản

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thu thập, phân lập và nhân nuôi tế bào

2.3.2 Phương pháp cấy chuyển tế bào

2.3.3 Phương pháp đông lạnh và giải đông tế bào

2.3.4 Phương pháp nhuộm nhiễm sắc thể

2.3.5 Phương pháp đánh giá tiềm năng biệt hóa của tế bào phân lập được 2.3.6 Phương pháp đánh giá đặc trưng tế bào gốc của tế bào phân lập được

2.3.7 Phương pháp đánh giá tốc độ tăng trưởng tế bào

2.3.8 Phương pháp biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan

2.3.9 Phương pháp đánh giá các chỉ thị của tế bào sau xử lý biệt hóa 2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thu nhận, phân lập, nhân nuôi in vitro TBGTM từ mẫu cuống rốn 3.1.1 Thu nhận, phân lập tế bào gốc từ mảnh mô cuống rốn

Các mẫu mô cuống rốn và mẫu mô thành mạch có kích thước khoảng 1mm3 được nuôi trong các đĩa nuôi 4 giếng (NUNC), trong môi trường DMEM/F12 bổ sung các thành phần khác Kết quả theo dõi chúng tôi quan sát thấy các tế bào kết dính trên bề mặt đĩa thông qua tế bào mọc ra ở rìa của

các mảnh mô từ ngày nuôi cấy thứ 14

3.1.2 Nhân nuôi in vitro, bảo quản lạnh tế bào gốc cuống rốn

Trong quá trình phát triển in vitro, có thể quan sát thấy độ đồng nhất

chưa cao ở các quần thể các tế bào lúc ban đầu Từ ngày nuôi cấy thứ 18, các TBGTM tăng sinh rất nhanh, phát triển dày thành nhiều lớp xoắn gối lên nhau (Hình 3.3)

Hình 3.3 Quá trình phát triển in vitro của tế bào phân lập được: Tế bào mọc

kín đĩa nuôi thành những mảng song song, cuộn xoắn gối lên nhau

Sau 90 ngày từ khi cọng rạ được cho vào ngân hàng lạnh, chúng tôi giải đông ngẫu nhiên một cọng rạ để kiểm tra tỷ lệ sống sót của các tế bào Đĩa nuôi tế bào trước đông lạnh cũng được kiểm tra để làm đối chứng so

sánh

Từ bảng 3.1 cho thấy, trước khi cho đông lạnh, tỷ lệ tế bào sống khá cao (98,33 ± 0,58 %) Ở tế bào sau giải đông, tỷ lệ tế bào sống sống sót giảm, chỉ đạt 85,29 ± 1,56 %, tuy nhiên những tế bào còn sống vẫn mang hình thái nguyên bào sợi đặc trưng của TBGTM

Chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của hai điều kiện bảo quản phổ biến (tủ đông -80oC và nitơ lỏng -196oC) Kết quả chỉ ra ở tế bào sau giải đông có tốc độ tăng trưởng tế bào tương đối cao (từ 104 tế bào/cm2 đến 8x104 tế bào/cm2 sau 10 ngày nuôi cấy) ở cả trong 2 điều kiện nhiệt độ khảo sát (Hình 3.4)

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản TBGTM đến khả năng tăng

trưởng của tế bào sau giải đông

Để so sánh khả năng phân lập TBGTM từ mẫu mô trước và sau khi

đã được đông lạnh, chúng tôi tiến hành hai lô thí nghiệm Các TBGTM từ

Bảng 3.1 Kết quả đếm tế bào và tỷ lệ sống tế bào

nhóm phân lập từ mô tươi (nhóm 1) bắt đầu tăng sinh sau 7-10 ngày nuôi cấy Độ phủ bề mặt đĩa nuôi của tế bào lên 50-60% sau 14-18 ngày nuôi cấy Trong khi đó TBGTM phân lập từ mô cuống rốn đông lạnh (nhóm 2) bắt đầu tăng sinh sau 15 ngày nuôi cấy Phải đến sau 20-25 ngày nuôi cấy, độ phủ bề mặt đĩa nuôi của tế bào ở nhóm này mới đạt 50-60%

3.1.3 Đánh giá tốc độ tăng trưởng của tế bào

Theo biểu đồ ở hình 3.7, ta thấy, tốc độ tăng trưởng của tế bào P4 trước đông lạnh tăng rất nhanh ở những ngày đầu, từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 5, và từ ngày thứ 6 trở đi, tốc độ này dần ổn định, lượng tế bào tăng sinh không còn cao Trong khi đó, TBGTM cuống rốn P4 sau giải đông tăng trưởng rất chậm ở những ngày đầu, và tăng nhanh dần kể từ ngày thứ 5 Tuy nhiên, tốc độ tăng trưởng của tế bào trước đông lạnh nhanh hơn nhiều so với tốc độ tăng trưởng của tế bào sau khi giải đông

Hình 3.7 Biểu đồ tốc độ tăng trưởng của tế bào P4 trước đông lạnh và tế bào

P4 sau đông lạnh

Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy ở nhóm phân lập từ mô cuống rốn tươi thời gian nhân đôi mật độ tế bào giảm nhẹ ở các lần cấy chuyển từ 2 đến 5 Trong khi đó ở phân lập từ mô cuống rốn đông lạnh, thời gian nhân đôi mật

độ tế bào có xu hướng tăng lên muộn hơn Tại lần cấy chuyển 2, thời gian nhân đôi mật độ tế bào là 36,00 giờ, nhưng thời gian tăng lên 40,00 giờ ở lần cấy chuyển 4 và 5

Đánh giá số lượng tế bào giữa hai nhóm thí nghiệm, nồng độ tế bào tăng lên trong 7 ngày nuôi cấy đã tăng lên gần như cấp số nhân (Hình 3.8) Trong 3 ngày đầu, số lượng TBGTM được phân lập từ mô cuống rốn tươi và

mô cuống rốn đông lạnh là tương tự nhau, sau đó chúng có một chút chậm trễ trong việc mở rộng và tăng sinh so với số lượng tế bào có nguồn gốc từ

mô cuống rốn tươi Đến ngày thứ 7, tốc độ tăng sinh dần ổn định, lượng tế bào tăng sinh không còn cao

Hình 3.8 Tổng số tế bào tăng

sinh được ghi lại mỗi ngày

trong 7 ngày nuôi cấy ở 2

nhóm thí nghiệm: mô cuống

rốn tươi và mô cuống rốn

đông lạnh

Bảng 3.2 Sự gia tăng TBGTM của mẫu mô cuống rốn tươi và mô cuống

rốn đông lạnh từ giai đoạn cấy chuyển 2 đến giai đoạn cấy chuyển 5

3.2 Đánh giá tính ổn định, tiềm năng biệt hóa và khả năng duy trì nguồn

TBGTM trong điều kiện nuôi in vitro

3.2.1 Đánh giá tính ổn định di truyền của TBG phân lập được

Bộ nhiễm sắc thể thu được sau khi phân tích đều cho thấy là bình thường, điển hình nhiễm sắc thể có số lượng ổn định, cấu trúc không thay đổi ở các lần cấy chuyển thứ 2, 10 và 15

3.2.2 Đánh giá tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc

3.2.2.1 Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào mỡ

Các tế bào tạo mỡ với hình dạng khối tròn bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 7 sau khi tiến hành cảm ứng biệt hóa trong khi không xuất hiện ở

tế bào đối chứng Khi nhuộm với thuốc nhuộm Oil red (Merck), chúng luôn bắt màu đỏ chiếm phần lớn tế bào chất Ngược lại, các tế bào đối chứng không có sự thay đổi về mặt hình thái, không xuất hiện giọt mỡ và bắt màu thuốc nhuộm

Khi so sánh khả năng biệt hóa TBGTM thành tế bào mỡ ở nhóm phân lập từ mô cuống rốn tươi và mô cuống rốn đông lạnh cũng cho kết quả tương tự

3.2.2.2 Biệt hóa tế bào gốc thành nguyên bào xương

Hình thái đặc trưng của nguyên bào xương (osteoblast) ở tế bào được biệt hóa bắt đầu xuất hiện sau 7 ngày nuôi trong môi trường biệt hóa: tế bào chuyển từ dạng dài mỏng thuôn mảnh giống nguyên bào sợi sang dạng tròn

và hình hạt đậu Sự kết hợp của ion calcium (tính chất đặc trưng của nguyên bào xương) hiện diện trong tế bào chất với thuốc nhuộm tạo nên phức hợp

có màu đỏ cam

Khi so sánh khả năng biệt hóa TBGTM thành tế bào xương ở nhóm phân lập từ mô cuống rốn tươi và mô cuống rốn đông lạnh cũng cho kết quả tương tự

3.2.3 Đánh giá đặc trưng tế bào gốc trung mô