Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Ngọc Hà NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT PHÂN TÁCH TẾ BÀO TỚI SỰ SỐNG VÀ SỰ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC Hà Nội - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Ngọc Hà NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT PHÂN TÁCH TẾ BÀO TỚI SỰ SỐNG VÀ SỰ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Trung Nam Hà Nội - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu luận văn công trình nghiên cứu tơi dựa tài liệu, số liệu tơi tự tìm hiểu nghiên cứu Chính vậy, kết nghiên cứu đảm bảo trung thực khách quan Đồng thời, kết chưa xuất nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực sai tơi hồn chịu trách nhiệm trước phát luật Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc Hà LỜI CẢM ƠN Sau thời gian tiến hành triển khai nghiên cứu, em hoàn thành nội dung luận văn “Nghiên cứu ảnh hưởng chất phân tách tế bào tới sống biểu kháng nguyên bề mặt tế bào gốc trung mơ” Luận văn hồn thành khơng cơng sức thân mà cịn có giúp đỡ, hỗ trợ tích cực nhiều cá nhân tập thể Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Trung Nam, người trực tiếp hướng dẫn luận văn Thầy dành cho em nhiều thời gian, tâm sức, cho em nhiều ý kiến, nhận xét quý báu, chỉnh sửa chi tiết nhỏ luận văn, giúp luận văn em hoàn thiện mặt nội dung hình thức Thầy ln quan tâm, động viên, nhắc nhở kịp thời để em hồn thành luận văn tiến độ Nghiên cứu thực hỗ trợ kinh phí từ đề tài: Phát triển liệu pháp cho bệnh não thiếu máu cục thiếu oxy sử dụng tế bào gốc tạo máu kích thích Mã số QTJP01.01/20-22, chủ nhiệm: TS Nguyễn Trung Nam Em xin gửi lời cảm ơn tới bác sĩ CK2 Trần Trung Kiên GS Nguyễn Duy Ánh bệnh viện phụ sản Hà Nội cung cấp mẫu nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Em xin trân trọng cảm ơn ban Lãnh đạo, phòng Đào tạo, phòng chức Học viện khoa học Công nghệ thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học - Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam dạy dỗ bảo tận tình trình em học tập Em xin cảm ơn cán Trung tâm nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc liệu pháp gen (STEMREC), Viện Công nghệ sinh học, giúp đỡ tạo điều kiện để em hồn thiện khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè ln động viên, quan tâm giúp đỡ em trình học tập thực luận văn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ 1.1.1 Tế bào gốc trung mô 1.1.2 Đặc điểm chung tế bào gốc trung mô 1.1.3 Các nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô 1.1.4 Y đức nghiên cứu tế bào gốc trung mô 10 1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÁCH TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ 10 1.2.1 Ngun lý bám dính tế bào .11 1.2.2 Các phương pháp phân tách 12 1.2.3 Một số nghiên cứu chất phân tách tế bào 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU, NGUYÊN VẬT LIỆU .17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ vật tư tiêu hao 17 2.1.3 Thiết bị sử dụng 17 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Phân lập tế bào gốc trung mô từ dây rốn .17 2.2.2 Nuôi cấy tế bào 18 2.2.3 Đánh giá khả phân tách enzyme lên tế bào UC-MSC .18 2.2.4 Xác định số lượng tỷ lệ sống sót UC-MSC sau xử lý với chất phân tách 18 2.2.5 Đánh giá biểu marker bề mặt MSC sau xử lý với chất phân tách 19 2.2.6 Thí nghiệm khả biệt hóa nhuộm phát biệt hố MSC 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 PHÂN LẬP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ DÂY RỐN 20 3.2 NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ .21 3.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN TÁCH CỦA TRYPSIN VÀ TRYPLE LÊN TẾ BÀO UC-MSC 22 3.4 XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VÀ TỶ LỆ SỐNG/CHẾT CỦA TẾ BÀO .26 3.4.1 Số lượng tỷ lệ sống/chết tế bào sau tiếp xúc với trypsin .26 3.4.2 Số lượng tỷ lệ sống/chết tế bào sau tiếp xúc với TrypLE .28 3.5 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỆT HÓA CỦA MSC THÀNH NGUYÊN BÀO XƯƠNG .30 3.6 ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CÁC MARKER BỀ MẶT CỦA TẾ BÀO MSC 31 3.6.1 Đánh giá biểu marker bề mặt tế bào MSC sau phân tách trypsin 31 3.6.2 Đánh giá biểu marker bề mặt tế bào MSC sau phân tách TrypLE 35 KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .45 DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT AD-MSC AF AF-MSC AT BM BM-MSC CSF DC DP DP-MSC MSC NK UC UC-MSC Adipose messenchymal stem cells (Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ) Amniotic fluid (Nước ối) Amniotic fluid messenchymal stem cells (Tế bào gốc trung mô từ nước ối) Adipose tissue (Mô mỡ) Bone marrow (Tủy xương) Bone marrow messenchymal stem cells Tế bào gốc trung mô từ tủy xương Colony stimulating factor (Yếu tố kích thích bạch cầu hạt) Dendritic cell (Tế bào đuôi gai) Dental pulp (Tủy răng) Dental pulp messenchymal stem cells (Tế bào gốc trung mô từ tủy răng) Messenchymal stem cells Tế bào gốc trung mô Natural killer (Tế bào giết tự nhiên) Umbilical cord (Dây rốn) Umbilical cord messenchymal stem cells (Tế bào gốc trung mơ từ dây rốn) DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Một số nguồn phân lập tế bào gốc trung mô (Messenchymal Stem Cells) Hình 1.2 Quá trình phân tách tế bào enzyme 11 Hình 3.1 Quá trình phân lập MSC từ dây rốn 20 Hình 3.2 Q trình ni cấy tế bào gốc trung mơ Hình ảnh tế bào chụp độ phóng đại 40X .21 Hình 3.3 Hiệu phân tách tế bào trypsin thời gian khác 22 Hình 3.4 Hiệu phân tách tế bào trypsin thời gian khác sau ngày nuôi cấy 23 Hình 3.5 Hiệu phân tách tế bào TrypLE khoảng thời gian khác sau ngày nuôi cấy 24 Hình 3.6 Hiệu phân tách tế bào TrypLE khoảng thời gian khác sau ngày nuôi cấy 25 Hình 3.7 Số lượng tế bào thu sau sử dụng trypsin phân tách 5, 30, 60 120 phút 26 Hình 3.8 Số lượng tế bào UC-MSC sống (%) sau sử dụng trypsin phân tách 5, 30, 60 120 phút 27 Hình 3.9 Số lượng tế bào thu sau sử dụng TrypLE phân tách khoảng thời gian 5, 30, 60 120 phút 28 Hình 3.10 Số tế bào UC-MSC sống (%) sau sử dụng TrypLE phân tách mốc thời gian 5, 30, 60 120 phút 29 Hình 3.11 Hình ảnh nhuộm biệt hóa tế bào gốc trung mô sau xử lý với trypsin TrypLE mốc thời gian khác 30 Hình 3.12 Mức độ biểu kháng nguyên bề mặt tế bào sau xử lý với trypsin 34 Hình 3.13 Mức độ biểu kháng nguyên bề mặt tế bào sau xử lý với TrypLE 37 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu chứng minh liệu pháp tế bào gốc có phát triển vượt bậc nghiên cứu in vitro in vivo Nhờ đặc điểm bật tế bào gốc có khả trì đặc tính gốc thời gian dài khả biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác điều kiện định, nên tế bào gốc có khả thay tế bào bị tổn thương nhờ có khả điều trị số bệnh Đặc điểm giúp tế bào gốc sử dụng điều trị bỏng sâu, rộng, khôi phục hệ thống máu bệnh nhân bị bệnh rối loạn máu, chữa trị tổn thương gan não Đồng thời mở triển vọng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư [1] Cho đến nay, loại tế bào gốc tế bào gốc phôi bao gồm tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc trung mô tế bào gốc biể mô ứng dụng y học thành công tiềm chúng nhiều bị hạn chế so với tế bào gốc phôi Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell - MSC) loại tế bào sử dụng nhiều cho y học tái tạo Trong thập kỷ qua, MSC sử dụng nghiên cứu tiền lâm sàng để điều trị nhiều bệnh lý khác nhau, bao gồm rối loạn thần kinh, thiếu máu cục tim, tiểu đường bệnh xương sụn [2] Khi nhu cầu MSC ngày lớn cho phương pháp điều trị đó, nhiệm vụ cấp bách cần phải sản xuất lượng lớn để đáp ứng nhu cầu Lượng tế bào cho liều điều trị nằm khoảng từ 1,5 đến 120 x 10 MSC [3] Trong quy trình tăng sinh tế bào gốc, tế bào sản xuất phải thu hoạch loại bỏ khỏi bình phản ứng với số lượng lớn khả sống sót cao Q trình thu hoạch tế bào ảnh hưởng đến chất lượng tế bào thu Do đó, việc đánh giá ảnh hưởng phương pháp tách đến MSC điều cần thiết Hiện nay, phịng thí nghiệm sử dụng phương pháp nuôi cấy phân tách khác nhau, chưa có quy chuẩn riêng cho quy trình ni cấy MSC tiêu chuẩn Do đó, cần có quy trình riêng cho phịng thí nghiệm để đảm tốin ưu cho việc nuôi cấy thu hoạch MSC [4] Trên giới có nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp tách khác lên MSC Tuy nhiên, Việt Nam nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng phương tách MSC Hiện có hai loại enzyme sử dụng phổ biến nuôi cấy tế bào trypsin TrypLE Trong đó, trypsin protease serine tuyến tụy với tính đặc hiệu cho liên kết peptide liên quan đến nhóm carboxyl axit amin bản, arginine lysine, TrypLE Express protease tái tổ hợp tạo trình lên men Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng enzyme lên UC-MSC Xuất phát từ vấn đề trên, em tiến hành thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng trypsin TrypLE đến đặc điểm MSC Mục đích nghiên cứu đánh giá hiệu hai chất phân tách tế bào gốc trung mô khoảng khoảng thời gian khác Trên sở đó, “Nghiên cứu ảnh hưởng chất phân tách tế bào tới sống biểu kháng nguyên bề mặt tế bào gốc trung mô” tiến hành với mục tiêu nghiên cứu cụ thể sau:  Đánh giá hiệu hai chất phân tách thành huyền phù tế bào UCMSC  Đánh giá ảnh hưởng hai chất phân tách đến khả biệt hóa (differentiation) UC-MSC  Đánh giá ảnh hưởng hai chất phân tách đến biểu kháng nguyên bề mặt tế bào sau phương pháp phân tích dòng chảy (flow cytometry)