Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Ngọc Hà NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT PHÂN TÁCH TẾ BÀO TỚI SỰ SỐNG VÀ SỰ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC Hà Nội - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thị Ngọc Hà NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT PHÂN TÁCH TẾ BÀO TỚI SỰ SỐNG VÀ SỰ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Trung Nam Hà Nội - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu luận văn công trình nghiên cứu tơi dựa tài liệu, số liệu tơi tự tìm hiểu nghiên cứu Chính vậy, kết nghiên cứu đảm bảo trung thực khách quan Đồng thời, kết chưa xuất nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực sai tơi hồn chịu trách nhiệm trước phát luật Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc Hà ii LỜI CẢM ƠN Sau thời gian tiến hành triển khai nghiên cứu, em hoàn thành nội dung luận văn “Nghiên cứu ảnh hưởng chất phân tách tế bào tới sống biểu kháng nguyên bề mặt tế bào gốc trung mơ” Luận văn hồn thành khơng cơng sức thân mà cịn có giúp đỡ, hỗ trợ tích cực nhiều cá nhân tập thể Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Trung Nam, người trực tiếp hướng dẫn luận văn Thầy dành cho em nhiều thời gian, tâm sức, cho em nhiều ý kiến, nhận xét quý báu, chỉnh sửa chi tiết nhỏ luận văn, giúp luận văn em hoàn thiện mặt nội dung hình thức Thầy ln quan tâm, động viên, nhắc nhở kịp thời để em hoàn thành luận văn tiến độ Nghiên cứu thực hỗ trợ kinh phí từ đề tài: Phát triển liệu pháp cho bệnh não thiếu máu cục thiếu oxy sử dụng tế bào gốc tạo máu kích thích Mã số QTJP01.01/20-22, chủ nhiệm: TS Nguyễn Trung Nam Em xin gửi lời cảm ơn tới bác sĩ CK2 Trần Trung Kiên GS Nguyễn Duy Ánh bệnh viện phụ sản Hà Nội cung cấp mẫu nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Em xin trân trọng cảm ơn ban Lãnh đạo, phòng Đào tạo, phòng chức Học viện khoa học Công nghệ thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học - Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam dạy dỗ bảo tận tình trình em học tập Em xin cảm ơn cán Trung tâm nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc liệu pháp gen (STEMREC), Viện Công nghệ sinh học, giúp đỡ tạo điều kiện để em hồn thiện khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè ln động viên, quan tâm giúp đỡ em trình học tập thực luận văn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ .3 1.1.1 Tế bào gốc trung mô 1.1.2 Đặc điểm chung tế bào gốc trung mô .4 1.1.3 Các nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô 1.1.4 Y đức nghiên cứu tế bào gốc trung mô .10 1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÁCH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ 10 1.2.1 Nguyên lý bám dính tế bào .11 1.2.2 Các phương pháp phân tách 12 1.2.3 Một số nghiên cứu chất phân tách tế bào 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU, NGUYÊN VẬT LIỆU .17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ vật tư tiêu hao .17 2.1.3 Thiết bị sử dụng 17 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Phân lập tế bào gốc trung mô từ dây rốn .17 2.2.2 Nuôi cấy tế bào 18 2.2.3 Đánh giá khả phân tách enzyme lên tế bào UC-MSC 18 2.2.4 Xác định số lượng tỷ lệ sống sót UC-MSC sau xử lý với chất phân tách 18 2.2.5 Đánh giá biểu marker bề mặt MSC sau xử lý với chất phân tách 19 2.2.6 Thí nghiệm khả biệt hóa nhuộm phát biệt hố MSC 19 iv CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 PHÂN LẬP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ DÂY RỐN 20 3.2 NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ 21 3.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN TÁCH CỦA TRYPSIN VÀ TRYPLE LÊN TẾ BÀO UC-MSC 22 3.4 XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VÀ TỶ LỆ SỐNG/CHẾT CỦA TẾ BÀO 26 3.4.1 Số lượng tỷ lệ sống/chết tế bào sau tiếp xúc với trypsin 26 3.4.2 Số lượng tỷ lệ sống/chết tế bào sau tiếp xúc với TrypLE 28 3.5 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỆT HÓA CỦA MSC THÀNH NGUYÊN BÀO XƯƠNG 30 3.6 ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CÁC MARKER BỀ MẶT CỦA TẾ BÀO MSC 31 3.6.1 Đánh giá biểu marker bề mặt tế bào MSC sau phân tách trypsin 31 3.6.2 Đánh giá biểu marker bề mặt tế bào MSC sau phân tách TrypLE 35 KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .45 v DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT AD-MSC Adipose messenchymal stem cells (Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ) AF Amniotic fluid (Nước ối) AF-MSC Amniotic fluid messenchymal stem cells (Tế bào gốc trung mô từ nước ối) AT Adipose tissue (Mô mỡ) BM Bone marrow (Tủy xương) BM-MSC Bone marrow messenchymal stem cells Tế bào gốc trung mô từ tủy xương CSF Colony stimulating factor (Yếu tố kích thích bạch cầu hạt) DC Dendritic cell (Tế bào đuôi gai) DP Dental pulp (Tủy răng) DP-MSC Dental pulp messenchymal stem cells (Tế bào gốc trung mô từ tủy răng) MSC Messenchymal stem cells Tế bào gốc trung mô NK Natural killer (Tế bào giết tự nhiên) UC Umbilical cord (Dây rốn) UC-MSC Umbilical cord messenchymal stem cells (Tế bào gốc trung mô từ dây rốn) vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Một số nguồn phân lập tế bào gốc trung mô (Messenchymal Stem Cells) Hình 1.2 Quá trình phân tách tế bào enzyme 11 Hình 3.1 Quá trình phân lập MSC từ dây rốn 20 Hình 3.2 Q trình ni cấy tế bào gốc trung mơ Hình ảnh tế bào chụp độ phóng đại 40X 21 Hình 3.3 Hiệu phân tách tế bào trypsin thời gian khác 22 Hình 3.4 Hiệu phân tách tế bào trypsin thời gian khác sau ngày nuôi cấy 23 Hình 3.5 Hiệu phân tách tế bào TrypLE khoảng thời gian khác sau ngày nuôi cấy 24 Hình 3.6 Hiệu phân tách tế bào TrypLE khoảng thời gian khác sau ngày nuôi cấy 25 Hình 3.7 Số lượng tế bào thu sau sử dụng trypsin phân tách 5, 30, 60 120 phút 26 Hình 3.8 Số lượng tế bào UC-MSC sống (%) sau sử dụng trypsin phân tách 5, 30, 60 120 phút 27 Hình 3.9 Số lượng tế bào thu sau sử dụng TrypLE phân tách khoảng thời gian 5, 30, 60 120 phút 28 Hình 3.10 Số tế bào UC-MSC sống (%) sau sử dụng TrypLE phân tách mốc thời gian 5, 30, 60 120 phút 29 Hình 3.11 Hình ảnh nhuộm biệt hóa tế bào gốc trung mô sau xử lý với trypsin TrypLE mốc thời gian khác 30 Hình 3.12 Mức độ biểu kháng nguyên bề mặt tế bào sau xử lý với trypsin 34 Hình 3.13 Mức độ biểu kháng nguyên bề mặt tế bào sau xử lý với TrypLE .37 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu chứng minh liệu pháp tế bào gốc có phát triển vượt bậc nghiên cứu in vitro in vivo Nhờ đặc điểm bật tế bào gốc có khả trì đặc tính gốc thời gian dài khả biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác điều kiện định, nên tế bào gốc có khả thay tế bào bị tổn thương nhờ có khả điều trị số bệnh Đặc điểm giúp tế bào gốc sử dụng điều trị bỏng sâu, rộng, khôi phục hệ thống máu bệnh nhân bị bệnh rối loạn máu, chữa trị tổn thương gan não Đồng thời mở triển vọng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư [1] Cho đến nay, loại tế bào gốc tế bào gốc phôi bao gồm tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc trung mô tế bào gốc biể mô ứng dụng y học thành công tiềm chúng nhiều bị hạn chế so với tế bào gốc phôi Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell - MSC) loại tế bào sử dụng nhiều cho y học tái tạo Trong thập kỷ qua, MSC sử dụng nghiên cứu tiền lâm sàng để điều trị nhiều bệnh lý khác nhau, bao gồm rối loạn thần kinh, thiếu máu cục tim, tiểu đường bệnh xương sụn [2] Khi nhu cầu MSC ngày lớn cho phương pháp điều trị đó, nhiệm vụ cấp bách cần phải sản xuất lượng lớn để đáp ứng nhu cầu Lượng tế bào cho liều điều trị nằm khoảng từ 1,5 đến 120 x 106 MSC [3] Trong quy trình tăng sinh tế bào gốc, tế bào sản xuất phải thu hoạch loại bỏ khỏi bình phản ứng với số lượng lớn khả sống sót cao Q trình thu hoạch tế bào ảnh hưởng đến chất lượng tế bào thu Do đó, việc đánh giá ảnh hưởng phương pháp tách đến MSC điều cần thiết Hiện nay, phịng thí nghiệm sử dụng phương pháp nuôi cấy phân tách khác nhau, chưa có quy chuẩn riêng cho quy trình ni cấy MSC tiêu chuẩn Do đó, cần có quy trình riêng cho phịng thí nghiệm để đảm tốin ưu cho việc nuôi cấy thu hoạch MSC [4] Trên giới có nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp tách khác lên MSC Tuy nhiên, Việt Nam nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng phương tách MSC Hiện có hai loại enzyme sử dụng phổ biến nuôi cấy tế bào trypsin TrypLE Trong đó, trypsin protease serine tuyến tụy với tính đặc hiệu cho liên kết peptide liên quan đến nhóm carboxyl axit amin bản, arginine lysine, TrypLE Express protease tái tổ hợp tạo trình lên men Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng enzyme lên UC-MSC Xuất phát từ vấn đề trên, em tiến hành thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng trypsin TrypLE đến đặc điểm MSC Mục đích nghiên cứu đánh giá hiệu hai chất phân tách tế bào gốc trung mô khoảng khoảng thời gian khác Trên sở đó, “Nghiên cứu ảnh hưởng chất phân tách tế bào tới sống biểu kháng nguyên bề mặt tế bào gốc trung mô” tiến hành với mục tiêu nghiên cứu cụ thể sau:  Đánh giá hiệu hai chất phân tách thành huyền phù tế bào UC-MSC  Đánh giá ảnh hưởng hai chất phân tách đến khả biệt hóa (differentiation) UC-MSC  Đánh giá ảnh hưởng hai chất phân tách đến biểu kháng nguyên bề mặt tế bào sau phương pháp phân tích dịng chảy (flow cytometry) 39 tế bào, đặc biệt tế bào gốc Do đó, điều quan trọng phải đánh giá tác động chất phân tách khác thời gian xử lý biểu kháng nguyên bề mặt chức tế bào để thiết lập quy trình chuẩn cho liệu pháp tế bào tương lai Mục tiêu nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng enzyme phân tách đến MSC điều kiện phịng thí nghiệm UC-MSC chọn làm đối tượng nghiên cứu dịng tế bào phân lập, có sẵn địa điểm nghiên cứu tế bào sử dụng phương pháp trị liệu tế bào MSC từ người nói chung tế bào kết dính mạnh, sau phân lập tế bào gốc trung mô thường phải nuôi cấy điều kiện nhân tạo trước sử dụng chúng mục đích lâm sàng [62] Vì tế bào sản phẩm tồn quy trình nghiên cứu nên việc thu tế bào cần thực nhẹ nhàng hiệu để thu số lượng tế bào nhiều Trong nghiên cứu này, em tầm quan trọng việc lựa chọn phương pháp tách tế bào phù hợp cho tế bào gốc trung mơ có nguồn gốc từ dây rốn Em sử dụng loại enzyme phổ biến trypsin TrypLE để đánh giá ảnh hưởng chúng lên MSC mốc thời gian khác phút, 30 phút, 60 phút 120 phút (trong mốc thời gian phút coi đối chứng với mốc thời gian khác) Để đánh giá khả sống UC-MSC sau xử lý với chất phân tách, em sử dụng phương pháp nhuộm trypan blue Kết cho thấy trypsin nhanh chóng phân tách hầu hết tế bào vòng phút, TrypLE cần 30 phút để phân tách hết tế bào Số lượng tế bào thu sử dụng trypsin cao gấp lần so với việc sử dụng TrypLE để phân tách Kết hợp với kết hình thái tế bào, sau phút trypsin cịn phân tách lớp đơn tế bào thành tế bào riêng rẽ đó, TrypLE xử lý phút phân tách tế bào khỏi bề mặt nuôi cấy tế bào bị phân tách thành cụm tế bào Như vậy, trypsin dễ dàng phân tách tế bào phân tách nhanh so với TrypLE Tuy nhiên đối tượng MSC bao hoạt dịch [59], khả phân tách trypsin TrypLE phút tương tự 40 (trypsin: 1,84 ± 0,74 x 105, TrypLE: 1,61 ± 0,59 x 105) Sự khác biệt đến từ khả bám dính MSC nguồn phân lập khác khơng giống Nghiên cứu cho thấy, sau xử lý với trypsin, tỷ lệ phần trăm số tế bào sống giảm dần theo thời gian, nhóm phút cao (95,3%) Sau 30 phút ủ với trypsin, khả sống tế bào giảm 10% (Hình 3.8) Đối với TrypLE, tỷ lệ phần trăm số tế bào sống khơng có chênh lệch lớn mốc thời gian, TrypLE khơng ảnh hưởng nhiều đến khả sống tế bào kể tế bào xử lý với TrypLE 120 phút Kết thống kê nhóm khơng cho thấy khác biệt (P > 0,05) (Hình 3.9) Một số nghiên cứu khác có kết tương tự nghiên cứu này, cho thấy khả sống tế bào sụn ngựa giảm mạnh tiếp xúc với trypsin 20 phút (trypsin phút: > 95%, trypsin 20 phút khoảng 85%) Đồng thời, tác giả khẳng định trình trypsin hóa phút với 0,25% trypsin-EDTA khơng có tác động bất lợi đáng kể màng tế bào khả sống tế bào phương pháp tốt để tách tế bào sụn ngựa nguyên vẹn khỏi bề mặt ni cấy Cịn nghiên cứu năm 2017 David Fong cộng cho thấy tỷ lệ sống tế bào sau trypsin phút > 98% Đồng thời, Abhilok Garg cộng [62] lại cho thấy TrypLE ảnh hưởng đến khả sống MSC (98,38%) Tương tự với kết trên, Tsuji cộng [59] cho thấy nhóm xử lý trypsin phút có tỷ lệ sống tế bào cao so với TrypLE (cụ thể trypsin: 98%, TrypLE: 95%) Như vậy, hai enzyme khoảng phút gây độc làm chết tế bào, tác động enzyme phân tách phụ thuộc vào thời gian xử lý Trong đó, tỷ lệ tế bào sống trypsin cao TrypLE Để kiểm tra tác động chất phân tách tế bào thời gian xử lý biểu kháng nguyên bề mặt UC-MSC, em phân tích biểu CD73, CD90 phương pháp tế bào học dịng chảy, chúng dấu hiệu đại diện cho tế bào gốc trung mô Các kết kháng nguyên bề mặt tế bào bị ảnh hưởng phương pháp tách Kết âm tính kháng nguyên bề mặt CD14, CD19, CD34, CD45 41 HLA tất các nhóm thời gian sau ủ với chất phân tách phù hợp với đặc điểm MSC Trong số kháng nguyên kiểm tra (CD73 CD90), số lượng tế bào dương tính với CD73 sau xử lý enzyme trypsin giảm vòng 30 phút (giảm 0,2%) (Hình 3.12) giảm dần theo thời gian Tương tự, số lượng tế bào dương tính với CD90 giảm dần theo thời gian, nhiên mức độ giảm mạnh so với CD73 Điều cho thấy kháng nguyên bề mặt CD90 nhạy cảm với trypsin kháng nguyên bề mặt CD73 Kết tương tự với nghiên cứu Tsuji cộng (2017) [59] TrypLE enzyme tái tổ hợp có hoạt tính giống với trypsin khơng có nguồn gốc từ động vật Kết em hoạt tính trypsin TrypLE giống ảnh hưởng lên UC-MSC không giống Đối với TrypLE, số lượng tế bào dương tính với kháng ngun bề mặt CD90 khơng có chênh lệch lớn nhóm thời gian Tuy nhiên, nhóm TrypLE 120 phút, tỷ lệ phần trăm CD73 từ 99,11% (nhóm TrypLE xử lý phút) giảm cịn 98,32% (nhóm TrypLE xử lý 120 phút) (Hình 3.13) Chứng tỏ kháng nguyên bề mặt CD90 nhạy cảm với TrypLE so với CD73 Trong số hai chất phân tách, trypsin dường ảnh hưởng tới kháng nguyên bề mặt mạnh so với TrypLE Tương tự, phân tích Western blot David Fong [63] cho thấy trypsin 0,25% làm giảm đáng kể kháng nguyên bề mặt Vì vậy, ông kết luận trypsin 0,25% nồng độ đủ cao để gây tác động lên marker bề mặt tế bào Các kết nghiên cứu cho thấy, tế bào sau tiếp xúc với trypsin 0,25% phút có khả đáp ứng với tín hiệu hóa học so với nhóm tiếp xúc với TrypLE phút Việc sử dụng trypsin thời gian xử lý phù hợp phương pháp tách MSC tối ưu Trong đó, Tsuji cộng [59] cho xử lý TrypLE vòng 30 phút quy trình tách tế bào MSC bao hoạt dịch tốt dựa số lượng tế bào thu được, khả sống bảo toàn kháng nguyên bề mặt [59] Ngoài đặc điểm protein bề mặt tế bào, khả biệt hóa MSC chức tế bào gốc Khả biệt hóa đa dịng giúp cho MSC ứng dụng liệu pháp tái tạo Vì vậy, 42 phạm vi nghiên cứu này, MSC sau xử lý với enzyme ni cấy biệt hóa thành nguyên bào xương Em nhận thấy khả biệt hóa thành nguyên bào xương UC-MSC sau xử lý với trypsin TrypLE giống (Hình 3.11) Trong nghiên cứu Tsuji công [59] đánh giá đại diện nhóm TrypLE phút trypsin 60 phút, kết hình ảnh cho thấy tỷ lệ tế bào bắt màu thuốc nhuộm hai nhóm giống Tương tự, Abhilok Garg cộng [62] cho thấy, TrypLE không ảnh hưởng đến khả biệt hóa MSC Những liệu cho thấy tác động trình tách tế bào đến khả biệt hóa UC-MSC hạn chế Điều tính linh động MSC, tế bào tạm thời chịu thay đổi bề mặt tế bào để trì chức tế bào gốc Tóm lại, kết nghiên cứu cho thấy trypsin TrypLE có ảnh hưởng đến khả sống biểu protein bề mặt UC-MSC tùy thuộc vào thời gian tiếp xúc tế bào với enzyme Tuy nhiên, nghiên cứu phân tử điều cần thiết để giải thích cụ thể cho phản ứng tế bào enzyme phân tách Hiện nghiên cứu giới tập trung vào phân tích ảnh hưởng loại enzym trình phân tách tế bào gốc, để phát triển công nghệ y học tái tạo (regenerative medicine) tương lai Các nghiên cứu so sánh tác động số loại enzyme lên việc phân tách tế bào Vì vậy, kết nghiên cứu đóng góp phần vào tình hình nghiên cứu chung giới Đặc biệt, với gia tăng phụ thuộc vào công nghệ in 3D lĩnh vực y học tái tạo, việc tìm phương pháp hiệu để tách loại tế bào gốc thách thức lớn 43 KẾT LUẬN Trypsin có khả phân tách UC-MSC khỏi bề mặt nuôi cấy nhanh (5 phút) so với TrypLE (30 phút) Tế bào phân tách trypsin tạo thành tế bào riêng lẻ Số lượng tế bào thu sau phân tách trypsin (trung bình 2,45 x 106 ± 0.11 tế bào) cao TrypLE (trung bình 0,77 x 106 ± 0,15 tế bào) Trypsin TrypLE không ảnh hưởng đến khả biệt hóa thành nguyên bào xương UC-MSC Qua mốc thời gian khác biệt hóa thành ngun bào xương Phân tích đếm dòng chảy tế bào cho thấy trypsin (CD73: phút: 99,11%; 30 phút: 98,69%; 60 phút: 97,76%; 120 phút 96,28%, CD90: phút: 99,73; 30 phút: 99,30%; 60 phút: 99,26% 120 phút: 98,32% ) ảnh hưởng đến kháng nguyên bề mặt CD73, CD90 mạnh so với TrypLE (CD73: 5phút: 98,92; 30 phút: 98,72%; 60 phút: 98,34%; 120 phút 97,92%, CD90: phút 95,07%; 30 phút 94,10%; 60 phút 92,95%; 120 phút: 92,95%) CD90 nhạy cảm với enzyme phân tách so với CD73 44 KIẾN NGHỊ Cần đánh giá thêm kháng nguyên bề mặt khác thiết kế, sử dụng để phân tích tồn diện (ví dụ CD105, marker cho qPCR stemness markers, CD markers) 45 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Parekkadan B., Milwid J M., 2010, Mesenchymal Stem Cells as Therapeutics, Annual review of biomedical engineering, 12, p 87 doi: 10.1146/ANNUREV-BIOENG-070909-105309 Řehořová M., Vargová I., Forostyak S., Vacková I., Turnovcová K., Kupcová Skalníková H., Vodička P., Kubinová Š., Syková E., & Jendelová P., 2019, A Combination of Intrathecal and Intramuscular Application of Human Mesenchymal Stem Cells Partly Reduces the Activation of Necroptosis in the Spinal Cord of SOD1G93A Rats, Stem Cells Translational Medicine, 86,, pp 535-547 doi: 10.1002/SCTM.18-0223 Cierpka K., Elseberg C.L., Niss K., Kassem M., Salzig D., & Czermak P., 2013, hMSC Production in Disposable Bioreactors with Regards to GMP and PAT, Chemie Ingenieur Technik, 851-2,, pp 67-75 doi: 10.1002/CITE.201200151 Fernandez T de S., Fernandez C.deS., 2016, Mesenchymal Stem Cells: Biological Characteristics and Potential Clinical Applications for Haematopoietic Stem Cell Transplantation, Pluripotent Stem Cells From the Bench to the Clinic doi: 10.5772/63772 Friedenstein Alexander J., Chailakhyan, Ruben K., Latsinik, Nataly V., Panasyuk Andrey F., Keiliss-Borok I V : I 4-p no date, Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues, Cloning In Vitro and Retransplantation In Vivo, 17, pp 331340 Simmons P.J., Torok-Storb B., 1991, Identification of Stromal Cell Precursors in Human Bone Marrow by a Novel Monoclonal Antibody, STRO-1, Blood, 781,, pp 55-62 doi: 10.1182/BLOOD.V78.1.55.55 Andrzejewska A., Lukomska B., Janowski M., 2019, Concise Review: Mesenchymal Stem Cells: From Roots to Boost, Stem cells Dayton, Ohio,, 377,, pp 855-864 doi: 10.1002/STEM.3016 Anjos-Afonso F., Bonnet D., 2007, Nonhematopoietic/endothelial SSEA-1+ cells define the most primitive progenitors in the adult murine bone marrow mesenchymal compartment, Blood, 1093,, pp 1298-1306 doi: 10.1182/BLOOD-2006-06-030551 46 Nakamura Y., Miyaki S., Ishitobi H., Matsuyama S., Nakasa T., Kamei N., Akimoto T., Higashi Y., & Ochi M., 2015, Mesenchymal-stem-cellderived exosomes accelerate skeletal muscle regeneration, FEBS letters, 58911,, pp 1257-1265 doi: 10.1016/J.FEBSLET.2015.03.031 10 Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F C., Krause D S., Deans R J., Keating A., Prockop D J., & Horwitz, E M., 2006, Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy, 84,, pp 315-317 doi: 10.1080/14653240600855905 11 Berebichez-Fridman R., Gómez-García R., Granados-Montiel J., Berebichez-Fastlicht E., Olivos-Meza A., Granados J., Velasquillo C., & Ibarra C., 2017, The Holy Grail of Orthopedic Surgery: Mesenchymal Applications, Stem Cells-Their Stem cells Current Uses international, and Potential 2017 doi: 10.1155/2017/2638305 12 Pittenger M F., Martin B J., 2004, Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics, Circulation research, 951,, pp 9-20 doi: 10.1161/01.RES.0000135902.99383.6F 13 Shi C., 2012, Recent progress toward understanding the physiological function of bone marrow mesenchymal stem cells, Immunology, 1362,, pp 133-138 doi: 10.1111/J.1365-2567.2012.03567.X 14 Kuo T K., Ho J H., and Lee O K., 2009, Mesenchymal stem cell therapy for nonmusculoskeletal diseases: emerging applications, Cell transplantation, 189,, pp 1013-1028 doi: 10.3727/096368909X471206 15 Kim N., Cho S G., 2013, Clinical applications of mesenchymal stem cells, The Korean Journal of Internal Medicine, 284,, p 387 doi: 10.3904/KJIM.2013.28.4.387 16 Atoui R., Chiu R C J., 2012, Concise Review: Immunomodulatory Properties of Mesenchymal Stem Cells in Cellular Transplantation: Update, Controversies, and Unknowns, Stem Cells Translational Medicine, 13,, p 200 doi: 10.5966/SCTM.2011-0012 47 17 Kollet O., Shivtiel S., Chen Y.Q., Suriawinata J., Thung S.N., Dabeva M D., Kahn J., Spiegel A., Dar A., Samira S., Goichberg P., Kalinkovich A., Arenzana-Seisdedos F., Nagler A., Hardan I., Revel M., Shafritz D.A., & Lapidot T., 2003, HGF, SDF-1, and MMP-9 are involved in stress-induced human CD34+ stem cell recruitment to the liver, The Journal of clinical investigation, 1122,, pp 160-169 doi: 10.1172/JCI17902 18 Sackstein R., 2005, The lymphocyte homing receptors: gatekeepers of the multistep paradigm, Current opinion in hematology, 126,, pp 444450 doi: 10.1097/01.MOH.0000177827.78280.79 19 Zuk P A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J W., Katz A J., Benhaim P., Lorenz, H P., & Hedrick M H., 2001, Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies, Tissue engineering, 72,, pp 211-228 doi: 10.1089/107632701300062859 20 Friedenstein A.J., 1976, Precursor cells of mechanocytes, International review of cytology, 47C,, pp 327-359 doi: 10.1016/S0074769608,60092-3 21 L.R Rilo H., Cagliani J., Grande D., P Molmenti E., & J Miller E., 2017, Immunomodulation by Mesenchymal Stromal Cells and Their Clinical Applications, Journal of stem cell and regenerative biology, 32,, pp 1-14 doi: 10.15436/2471-0598.17.022 22 Liras A., 2010, Future research and therapeutic applications of human stem cells: general, regulatory, and bioethical aspects, Journal of translational medicine, doi: 10.1186/1479-5876-8-131 23 Choudhery M S., Badowski, M., Muise A., Pierce J., & Harris D T., 2014, Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation, Journal of translational medicine, 121, doi: 10.1186/1479-5876-12-8 24 Gronthos S., Mankani M., Brahim J., Robey P G., & Shi, S., 2000, Postnatal human dental pulp stem cells DPSCs, in vitro and in vivo, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 9725,, pp 13625-13630 doi: 10.1073/PNAS.240309797 48 25 Ishkitiev N., Yaegaki K., Calenic B., Nakahara T., Ishikawa, H., Mitiev, V., & Haapasalo M., 2010, Deciduous and permanent dental pulp mesenchymal cells acquire hepatic morphologic and functional features in vitro, Journal of endodontics, 363,, pp 469-474 doi: 10.1016/J.JOEN.2009.12.022 26 Joo S., Ko I K., Atala A., Yoo J J., & Lee S J., 2012, Amniotic fluidderived stem cells in regenerative medicine research, Archives of pharmacal research, 352,, pp 271-280 doi: 10.1007/S12272-0120207-7 27 Koike C., Zhou K., Takeda Y., Fathy M., Okabe M., Yoshida T., Nakamura, Y., Kato, Y., & Nikaido, T 2014, Characterization of amniotic stem cells, Cellular reprogramming, 164,, pp 298-305 doi: 10.1089/CELL.2013.0090 28 Pipino C., Shangaris P., Resca E., Zia S., Deprest J., Sebire N J., David A L., Guillot P V., & De Coppi P., 2013, Placenta as a reservoir of stem cells: an underutilized resource?, British medical bulletin, 1051,, pp 43-67 doi: 10.1093/BMB/LDS033 29 Tondreau T., Meuleman N., Delforge A., Dejeneffe M., Leroy R., Massy M., Mortier C., Bron D., & Lagneaux L., 2005a, Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized peripheral blood and cord blood: proliferation, Oct4 expression, and plasticity, Stem cells Dayton, Ohio,, 238,, pp 1105-1112 doi: 10.1634/STEMCELLS.2004-0330 30 Tondreau T., Meuleman N., Delforge A., Dejeneffe M., Leroy R., Massy M., Mortier C., Bron D., & Lagneaux L., 2005b, Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized peripheral blood and cord blood: proliferation, Oct4 expression, and plasticity, Stem cells Dayton, Ohio,, 238,, pp 1105-1112 doi: 10.1634/STEMCELLS.2004-0330 31 Kern S., Eichler H., Stoeve J., Klăuter H., Klăuter K., & Bieback K., 2006, Comparative Analysis of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Umbilical Cord Blood, or Adipose Tissue, STEM CELLS, 245,, pp 1294-1301 doi: 10.1634/STEMCELLS.2005-0342 49 32 Thaweesapphithak S., Tantrawatpan C., Kheolamai P., Tantikanlayaporn D., Roytrakul S., & Manochantr., S.2019, Human serum enhances the proliferative capacity and immunomodulatory property of MSCs derived from human placenta and umbilical cord, Stem Cell Research and Therapy, 101,, pp 1-18 doi: 10.1186/S13287019-1175-3/FIGURES/9 33 Zhao L., Chen S., Yang P., Cao H., & Li L., 2019, The role of mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation: prevention and treatment of graft-versus-host disease, Stem cell research & therapy, 101, doi: 10.1186/S13287-019-1287-9 34 Amable P R., Teixeira M V T., Carias R B V., Granjeiro J M., & Borojevic R., 2014, Protein synthesis and secretion in human mesenchymal cells derived from bone marrow, adipose tissue and Whartons jelly, Stem Cell Research and Therapy, 52, pp 1-13 35 Kfoury Y., and Scadden D T., 2015, Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche, Cell stem cell, 163,, pp 239-253 doi: 10.1016/J.STEM.2015.02.019 36 Kidd S., Spaeth E., Dembinski J L., Dietrich M., Watson K., Klopp A., Battula V L., Weil M., Andreeff M., & Marini F C., 2009, Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging, Stem cells Dayton, Ohio,, 2710,, pp 2614-2623 doi: 10.1002/STEM.187 37 Van Pham P., Thi-My Nguyen P., Thai-Quynh Nguyen A., Minh Pham V., Nguyen-Tu Bui A., Thi-Tung Dang L., Gia Nguyen K., & Kim Phan, N., 2014, Improved differentiation of umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells into insulin-producing cells by PDX-1 mRNA transfection, Differentiation; research in biological diversity, 875,, pp 200-208 doi: 10.1016/J.DIFF.2014.08.001 38 Hmadcha A., Martin-Montalvo A., Gauthiez B R., Soria B., & CapillaGonzalez, V 2020, Therapeutic Potential of Mesenchymal Stem Cells for Cancer Therapy, Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 8, p 43 doi: 10.3389/FBIOE.2020.00043/BIBTEX 50 39 Jager L D., Canda C M A., Hall C A., Heilingoetter C L., Huynh J., Kwok, S S., Kwon J H., Richie J R., & Jensen M B., 2016, Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells, Advances in Medical Sciences, 611,, pp 78-84 doi: 10.1016/J.ADVMS.2015.09.005 40 Nowak-Terpiłowska A., Śledziński P., and Zeyland J., 2021, Impact of cell harvesting methods on detection of cell surface proteins and apoptotic markers, Brazilian journal of medical and biological research = Revista brasileira de pesquisas medicas e biologicas, 542,, pp 1-7 doi: 10.1590/1414-431X202010197 41 Uccelli A., Moretta L., Pistoia V., 2008, Mesenchymal stem cells in health and disease, Nature reviews Immunology, 89,, pp 726-736 doi: 10.1038/NRI2395 42 Merten O.-W., 2010, Cell Detachment, Encyclopedia of Industrial Biotechnology, pp 1-22 doi: 10.1002/9780470054581.EIB195 43 Peralta Soler A., Knudsen K A., Tecson-Miguel A., McBrearty F X., Han A C., & Salazar H., 1997, Expression of E-cadherin and Ncadherin in surface epithelial-stromal tumors of the ovary distinguishes mucinous from serous and endometrioid tumors, Human Pathology, 286,, pp 734-739 doi: 10.1016/S0046-817797,90184-2 44 Bekaii-Saab T., Williams N., Plass C., Calero M V., & Eng C., 2006, A novel mutation in the tyrosine kinase domain of ERBB2 in hepatocellular carcinoma, BMC Cancer, 61,, pp 1-5 doi: 10.1186/1471-2407-6-278/FIGURES/1 45 Lai T Y., Cao J., Ou-Yang P., Tsai C Y., Lin C W., Chen C C., Tsai M K., & Lee, C Y., 2022, Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of Fas receptor and Fas ligand, Scientific Reports 2022 12:1, 121,, pp 1-8 doi: 10.1038/s41598-022-09605-y 46 Kim J Y., Kim Y G., and Lee G M., 2012, CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential, Applied microbiology and biotechnology, 933,, pp 917-930 doi: 10.1007/S00253-011-3758-5 51 47 48 49 50 Nagamori E., Ngo T X., Takezawa Y., Saito A., Sawa Y., Shimizu T., Okano, T., Taya M., & Kino-oka M., 2013, Network formation through active migration of human vascular endothelial cells in a multilayered skeletal myoblast sheet, Biomaterials, 343,, pp 662-668 doi: 10.1016/J.BIOMATERIALS.2012.08.055 Higuchi A., Hamamura A., Shindo Y., Kitamura H., Yoon B O., Mori T., Uyama, T., & Umezawa, A.2004, Photon-modulated changes of cell attachments on polyspiropyran-co-methyl methacrylate, membranes, Biomacromolecules, 55,, pp 1770-1774 doi: 10.1021/BM049737X Zheng Q., Iqbal S M., Wan Y., 2013, Cell detachment: Post-isolation challenges, Biotechnology Advances, 318,, pp 1664-1675 doi: 10.1016/J.BIOTECHADV.2013.08.013 Guillaume-Gentil O., Akiyama Y., Schuler M., Tang C., Textor M., Yamato M., Okano T., & Vörös J., 2008, Polyelectrolyte Coatings with a Potential for Electronic Control and Cell Sheet Engineering, Advanced Materials, 203,, pp 560-565 doi: 10.1002/ADMA.200700758 51 Inaba R., Khademhosseini A., Suzuki H., & Fukuda J., 2009, Electrochemical desorption of self-assembled monolayers for engineering cellular tissues, Biomaterials, 3021,, pp 3573-3579 doi: 10.1016/J.BIOMATERIALS.2009.03.045 52 Cindy Santangelo., James Zacka P T., 2016, Tissue Dissociation Guide, Worthington Biochemical Corporation 53 Cruz H J., Dias E M., Moreira J L., & Carrondo M J T., 1997, Celldislodging methods under serum-free conditions, Applied microbiology and biotechnology, 475,, pp 482-488 doi: 10.1007/S002530050960 54 Brown M A., Wallace C S., Anamelechi C C., Clermont E., Reichert W M., & Truskey G A., 2007, The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces, Biomaterials, 2827,, pp 39283935 doi: 10.1016/J.BIOMATERIALS.2007.05.009 55 Amano H., Kurosaka R., Ema M., & Ogawa Y., 1996, Trypsin promotes C6 glioma cell proliferation in serum- and growth factor-free medium, Neuroscience research, 253,, pp 203-208 52 56 Shibeshi W., Abraham G., Kneuer C., Ellenberger C., Seeger J., Schoon H A., & Ungemach F R., 2008, Isolation and culture of primary equine tracheal epithelial cells, In vitro cellular & developmental biology Animal, 447,, pp 179-184 doi: 10.1007/S11626-008-9099-8 57 Hosick H L., Strohman R C., 1971, Changes in ribosomepolyribosome balances in chick muscle cells during tissue dissociation, development in culture, and exposure to simplified culture-medium, Journal of cellular physiology, 772,, pp 145-155 doi: 10.1002/JCP.1040770204 58 Lori Nestler, Ethel Evege, Jennifer McLaughlin, Donald Munroe,Teresa Tan, Kate Wagner, and B S., no date, TrypLE TM Express: A Temperature Stable Replacement for Animal Trypsin in Cell Dissociation Applications, Gibco, 11, Available at: https://www.researchgate.net/publication/268293142_TrypLE_Express _A_Temperature_Stable_Replacement_for_Animal_Trypsin_in_Cell_ Dissociation_Applications 59 Tsuji K., Ojima M., Otabe K., Horie M., Koga H., Sekiya I., & Muneta T., 2017, Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells, Cell Transplantation, 266,, p 1089 doi: 10.3727/096368917X694831 60 Weiss L., 1958, The effects of trypsin on the size, viability and dry mass of Sarcoma 37 cells, Experimental Cell Research, 141,, pp 80-83 doi: 10.1016/0014-482758,90214-3 61 Dettmer K., Nürnberger N., Kaspar H., Gruber M A., Almstetter M F., Oefner, P J., 2011, Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols Analytical and Bioanalytical Chemistry, 399(3), p 1127-1139 https://doi.org/10.1007/S00216-010-4425-X 62 Garg A., Houlihan D.D., Aldridge V., Suresh S., Li K.K., King A.L., Sutaria R., Fear, J., Bhogal R H., Lalor P.F., & Newsome P.N., 2014, 53 “Non-Enzymatic Dissociation of Human Mesenchymal Stromal Cells Improves Chemokine-Dependent Migration and Maintains Immunosuppressive Function.” Cytotherapy 16(4), pp 545-59 doi: 10.1016/J.JCYT.2013.10.003 63 Fong D., Duceppe N., and Hoemann C D., 2017, Mesenchymal stem cell detachment with trace trypsin is superior to EDTA for in vitro chemotaxis and adhesion assays, Biochemical and biophysical research communications, 4843,, pp 656-661 doi: 10.1016/J.BBRC.2017.01.171