luận án tiến sĩ nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn

Với biát hóa bằng chuyển gen, các tế bào gan cÁm āng induced hepatocytes- iHeps đã đ°ÿc công bá trong mát sá báo cáo gần đây cho thấy sự biểu hián phong phú cÿa các gen liên quan đến chā

Bà GIÁO DĀC

VÀ ĐÀO T¾O VIàN HÀN LÂM KHOA HàC VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM

HâC VIàN KHOA HâC VÀ CÔNG NGHà

M ĀC LĀC

Trang

L àI CAM ĐOAN ii

L àI CÀM ¡N i

M ĀC LĀC iii

DANH M ĀC CÁC KÝ HIàU, CÁC CHĀ VI¾T TÂT vi

DANH M ĀC CÁC BÀNG vii

DANH M ĀC CÁC HÌNH VẼ, Đâ THà viii

M â ĐÄU 1

CH¯¡NG 1 TäNG QUAN NGHIÊN CĄU 4

1.1 Ngu ãn t¿ bào gác trung mô, tiÁm nng biát hóa và ąng dāng 4

1.1.1 Nguồn tế bào gác trung mô 4

1.1.2 Tiềm năng biát hóa cÿa tế bào gác trung mô 5

1.1.3 Āng dāng cÿa tế bào gác trung mô 6

1.2 C Ãu t¿o cuáng rán, °u điểm căa t¿ bào gác trung mô tć cuáng rán 10

1.2.1 Cấu t¿o cuáng rán 10

1.2.2 ¯u điểm cÿa tế bào gác trung mô từ cuáng rán 11

1.3 Tình hình nghiên c ąu 12

1.3.1 Tình hình nghiên cāu tế bào gác ng°ßi 12

1.3.2 Tình hình nghiên cāu biát hóa t¿o tế bào gan 15

Ch°¢ng 2 VÀT LIàU VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU 27

2.1 S¢ đã nghiên cąu 27

2.2 V Át liáu, hóa chÃt nghiên cąu 28

2.2.1 Mẫu nghiên cāu 28

2.2.2 Đßa điểm nghiên cāu 28

2.2.3 Hóa chất và các bá kit sử dāng 28

2.2.4 Thiết bß nghiên cāu 29

2.2.5 Môi tr°ßng thao tác, nuôi cấy, bÁo quÁn 29

2.3 P h°¢ng pháp nghiên cąu 29

2.3.1 Thu nhận, phân lập và nhân nuôi tế bào 29

2.3.2 Ph°¡ng pháp cấy chuyển tế bào 30

2.3.3 Ph°¡ng pháp đông l¿nh và giÁi đông tế bào 30

2.3.4 Ph°¡ng pháp nhuám nhißm sắc thể 31

2.3.5 Ph°¡ng pháp đánh giá tiềm năng biát hóa cÿa tế bào phân lập đ°ÿc 31

2.3.6 Ph°¡ng pháp đánh giá đặc tr°ng tế bào gác cÿa tế bào phân lập đ°ÿc 32

2.3.7 Ph°¡ng pháp đánh giá tác đá tăng tr°áng tế bào 34

2.3.8 Ph°¡ng pháp biát hóa t¿o tế bào có chāc năng gan 35

2.3.9 Ph°¡ng pháp đánh giá các chỉ thß cÿa tế bào sau xử lý biát hóa 38

2.3.10 Ph°¡ng pháp xử lý sá liáu 40

CH¯¡NG 3 K¾T QUÀ VÀ THÀO LUÀN 41

3.1 Thu nhÁn, phân lÁp, nhân nuôi in vitro TBGTM tć m¿u cuáng rán 41

3.1.1 Thu nhận, phân lập tế bào gác từ mÁnh mô cuáng rán 41

3.1.2 Nhân nuôi in vitro, bÁo quÁn l¿nh tế bào gác cuáng rán 43

3.1.3 Đánh giá tác đá tăng tr°áng cÿa tế bào 47

3.2 Đánh giá tính ån đánh, tiÁm nng biát hóa và khÁ nng duy trì nguãn TBGTM trong điÁu kián nuôi in vitro 50

3.2.1 Đánh giá tính ổn đßnh di truyền cÿa TBG phân lập đ°ÿc 50

3.2.2 Đánh giá tiềm năng biát hóa cÿa tế bào gác 52

3.2.3 Đánh giá đặc tr°ng tế bào gác trung mô 55

3.3 Bi át hóa TBGTM cuáng rán thành t¿ bào có biểu hián các chß thá đặc tr°ng t ¿ bào gan 63

3.3.1 Biát hóa bằng DMSO 63

3.3.2 Biát hóa bằng tổ hÿp cÿa HGF, DEX và OSM 67

3.3.3 Biát hóa bằng tổ hÿp HGF, TSA và OSM 70

3.3.4 Biát hóa bằng chuyển gen HNF4α 73

K ¾T LUÀN VÀ KI¾N NGHà 92

DANH M ĀC CÔNG TRÌNH CÔNG Bà LIÊN QUAN Đ¾N LUÀN ÁN 94

DANH MĀC TÀI LIàU THAM KHÀO 95

PH Ā LĀC 1 PHI¾U TÌNH NGUYàN THAM GIA NGHIÊN CĄU 112

PH Ā LĀC 2 BÀN CUNG CÂP THÔNG TIN NGHIÊN CĄU 113

PH Ā LĀC 3 DANH SÁCH CÁ NHÂN TÌNH NGUYàN THAM GIA NGHIÊN C ĄU&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&116 PH Ā LĀC 4 THI¾T Bà NGHIÊN CĄU 117

PH Ā LĀC 5 MÔI TR¯àNG DÙNG TRONG NGHIÊN CĄU 121

PH Ā LĀC 6 TRÌNH TĂ CDS CĂA GEN HNF4α 124

DANH M ĀC CÁC KÝ HIàU, CÁC CHĀ VI¾T TÂT

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimethyl sulfoxide

Dox Doxycycline

ECM Extra Cellular Matrix Chất nền ngo¿i bào

EGF Epidermal Growth Factor Yếu tá tăng tr°áng tế bào biểu

bì FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh thai bò

FGF Fibroblast Growth Factor Yếu tá tăng tr°áng nguyên bào

sÿi

HGF Hepatocyte Growth Factor Yếu tá tăng tr°áng tế bào gan

HNF Hepatocyte Nuclear Factors Những yếu tá nhân tế bào gan

HNF-4 Hepatocyte nuclear factor 4

HNF- 4α Hepatocyte nuclear factor 4 alpha

OSM Oncostatin M

PAS Periodic Acid-Schiff Bá kit Periodic Acid-Schiff PBS Phosphate Buffered Saline

TGF Transforming Growth Factor Yếu tá tăng tr°áng chuyển d¿ng TSA Trichostatin A

dây rán

DANH M ĀC CÁC BÀNG

B Áng 2.1 Thành phần phÁn āng RT-PCR&&&&&&&&&&&&&& 34

B Áng 2.2 Trình tự oligonucleotide các mồi đ°ÿc sử dāng để đánh giá đặc

tr°ng TBG và chỉ thß chāc năng tế bào gan &&&&&&&&& 34

B Áng 2.3 Các cặp mồi đ°ÿc thiết kế để chuẩn bß vector mang gen

B Áng 2.6 Các đo¿n mồi đ°ÿc sử dāng trong qPCR&&&&&&&&&& 39

B Áng 3.1 Kết quÁ đếm tế bào và tỷ lá sáng tế bào&&&&&&&&&&& 45

B Áng 3.2 Sự tăng sinh TBGTM cÿa mẫu mô cuáng rán t°¡i và mô cuáng

rán đông l¿nh từ giai đo¿n cấy chuyển 2 đến giai đo¿n cấy chuyển 5 49

B Áng 3.3 Biểu hián cÿa các chỉ thß TBGTM qua các lần cấy

chuyển&& 59

B Áng 3.4 Tỷ lá tế bào biểu hián các chỉ thß TBG tr°ớc và sau đông

l¿nh&& 59

B Áng 3.5 Kết quÁ đo mật đá quang (OD) cÿa các mẫu RNA tách chiết& 60

BÁng 3.6 Biểu hián các chỉ thß bề mặt trong quá trình nuôi in vitro……… 61

B Áng 3.7 Biểu hián cÿa các chỉ thß phân tử á tế bào sau biát hóa bằng

DMSO&&& 64

DANH M ĀC CÁC HÌNH VẼ, Đâ THà

Hình 1.1 Tiềm năng biát hóa cÿa TBGTM &&&&&&&&&&& 4

Hình 1.2 Triển váng āng dāng cÿa công nghá tế bào

gác&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 7

Hình 1.3 Āng dāng cÿa TBGTM đ°ÿc thử nghiám trên lâm sàng (phân

lo¿i theo ca bánh)&&&&&&&&&&&&&&&&& 8

Hình 1.4 Āng dāng cÿa TBGTM đ°ÿc thử nghiám trên lâm sàng (phân

lo¿i theo pha)&&&&&&&&&&&&&&& 9

Hình 1.5 Sá l°ÿng và tỷ lá các thử nghiám lâm sàng về điều trß

TBGTM cho bánh gan&&&&&&&&&&&&&& 9

Hình 1.6 Mặt cát ngang cấu trúc cÿa dây rán&&&&&&&&&& 10

Hình 1.7 Mô hình sử dāng tế bào gan biát hóa từ tế bào gác&&& 17

Hình 1.8 Các phân tử nhß t¿o tế bào có chāc năng gan hoặc thúc đẩy

sự tr°áng thành cÿa tế bào giáng với tế bào gan& 22

Hình 2.1 S¡ đồ nghiên cāu&&&&&&&&&&&&&&&&& 27

Hình 2.2 Cấu trúc vector pTRE-HNF4α-ON 37

Hình 3.1 Phân lập tế bào gác cuáng rán từ mÁnh mô&&&&&&& 41

Hình 3.2 Tế bào mác sau khi phân lập bằng ph°¡ng pháp nuôi mÁnh

mô 42

Hình 3.3 Quá trình phát triển in vitro cÿa tế bào phân lập đ°ÿc 44

Hình 3.4 Ành h°áng cÿa nhiát đá bÁo quÁn TBGTM đến khÁ năng tăng

tr°áng cÿa tế bào sau giÁi đông&&&&&&&&&&& 46

Hình 3.5 Tế bào tr°ớc khi đông l¿nh (P4) (trái) và sau khi giÁi đông

(P6) (phÁi)&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 46

Hình 3.6 Các tế bào phát triển từ mô cuáng rán t°¡i (A) và mô cuáng

rán đông l¿nh (C), TBGTM che kín bề mặt đĩa nuôi á giai đo¿n cấy chuyển lần 2 từ mô t°¡i (B) và mô đông l¿nh (D) 47

Hình 3.7 Biểu đồ tác đá tăng tr°áng cÿa tế bào P4 tr°ớc đông l¿nh và

tế bào P4 sau đông l¿nh 48

Hình 3.8 Tổng sá tế bào tăng sinh đ°ÿc ghi l¿i mßi ngày trong 7 ngày

nuôi cấy á 2 nhóm thí nghiám: mô cuáng rán t°¡i và mô cuáng rán đông l¿nh&&&&&&&&&&&&&&&& 50

Hình 3.9 Quan sát nhißm sắc thể trên kính hiển vi (A) và nhißm sắc thể

đồ (B) cÿa tế bào nuôi á lần cấy chuyển thā 2&&&&&& 51

Hình 3.10 Quan sát nhißm sắc thể trên kính hiển vi và nhißm sắc thể đồ

cÿa tế bào nuôi á lần cấy chuyển thā 10 (A), (B) và thā 15 (C),(D)&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 51

Hình 3.11 Kết quÁ biát hóa TBGTM thành tế bào mỡ&&&&&&& 53

Hình 3.12 Các tế bào giát mỡ bắt màu đß khi nhuám với thuác nhuám

Oil red xuất hián sau biát hóa á nhóm mô cuáng rán t°¡i (A)

và mô cuáng rán đông l¿nh (B)&&&&&&&&& 53

Hình 3.13 Kết quÁ biát hóa TBGTM thành nguyên bào x°¡ng&&& 54

Hình 3.14 Các tế bào bắt màu đß khi nhuám với thuác nhuám Alizarin

red á nhóm mô cuáng rán t°¡i (A) và mô cuáng rán đông l¿nh (B)&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 55

Hình 3.15 Biểu hián các chỉ thß bề mặt TBGTM cÿa mẫu tế bào phân

lập từ mô cuáng rán á lần cấy chuyển 4 phân tích bằng flow cytometry&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 56

Hình 3.16 Tỷ lá tổ hÿp các chỉ thß đặc tr°ng không biểu hián trong

TBGTM cÿa các mẫu á lần cấy chuyển 4 phân tích bằng flowcytometry&&& 56

Hình 3.17 Biểu hián các chỉ thß bề mặt TBGTM cÿa mẫu cuáng rán

t°¡i á lần cấy chuyển 2 &&&&&&&&&&&&&& 57

Hình 3.18 Biểu hián các chỉ thß bề mặt TBGTM cÿa mẫu cuáng rán

đông l¿nh á lần cấy chuyển 2 &&&&&&&&&&&& 57

Hình 3.19 Kết quÁ đián di với các chỉ thß á lần cấy chuyển

20&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 62

Hình 3.20 Kết quÁ đián di với các chỉ thß CD105, CD90, CD73 cÿa mẫu

tế bào tr°ớc đông l¿nh, nuôi cấy sau 33 ngày và 21 ngày từ lúc phân lập (A), mẫu tế bào sau giÁi đông (B)&&&&&& 63

Hình 3.21 Hình thái cÿa tế bào tr°ớc và khi xử lý bằng DMSO 1% sau

30 ngày và so sánh với tế bào HepG2&&&&&&&&& 64

Hình 3.22 Biểu hián chỉ thß phân tử cÿa tế bào biát hóa bằng DMSO 1%

sau 30 ngày và so sánh với tế bào HepG2&&&&&&&& 65

Hình 3.23 Kết quÁ nhuám PAS&&&&&&&&&&&&&&&& 67

Hình 3.24 Hình thái tế bào biát hóa bằng tổ hÿp HGF, DEX và OSM

sau 1 tuần (A) và 2 tuần (B)&&&&&&&&&&&&& 68

Hình 3.25 Kết quÁ sÁn phẩm RT-PCR tế bào nuôi cấy 4 tuần sau biát

hóa bằng tổ hÿp cÿa HGF, DEX và OSM&&&&&&& 69

Hình 3.26 Kết quÁ nhuám PAS&&&&&&&&&&&&&&&& 69

Hình 3.27 Hình thái tế bào xử lý biát hóa bằng tổ hÿp HGF, TSA và

OSM sau 1 tuần (A) và 2 tuần (B)&&&&&&&&&&& 70

Hình 3.28 Đián di đồ RT-PCR mẫu nuôi cấy 4 tuần sau biát hóa bằng

tổ hÿp cÿa HGF, TSA và OSM&&&&&&&&&&& 71

Hình 3.29 Kết quÁ nhuám PAS&&&&&&&&&&&&&&&& 72

Hình 3.30 Đián di đồ kiểm tra sÁn phẩm PCR khuếch đ¿i CDS gen

HNF4 α&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 73

Hình 3.31 Kết quÁ tinh s¿ch sÁn phẩm HNF4α và pTRE-Tight-BI cắt

bằng enzyme NheI và PacI 74

Hình 3.32 Đĩa biến n¿p sÁn phẩm nái pTRE-Tight-BI-HNF4α vào

E.coli DH5 α (A) và đián di kiểm tra sÁn phẩm PCR khuẩn

Hình 3.35 Kết quÁ tinh s¿ch sÁn phẩm cắt pTRE-Tight-BI-HNF4α và

sÁn phẩm cắt pTet-DualON bằng 2 enzyme NsiI +

PacI&&&&&& 77

Hình 3.36 Đĩa biến n¿p sÁn phẩm nái pTRE-HNF4α-ON vào E.coli

DH5 α (A) và đián di kiểm tra sÁn phẩm PCR khuẩn l¿c (B) 77

Hình 3.37 Kết quÁ kiểm tra sÁn phẩm cắt plasmid pTRE-HNF4α-ON

bằng enzyme&&&&&&&&&&&&&&&&&& 78

Hình 3.38 Tác đá tăng tr°áng cÿa TBGTM sau khi đ°ÿc chuyển nhißm 79

Hình 3.39 Biểu đồ sinh tr°áng cÿa tế bào sau chuyển gen ho¿t hóa bằng

Doxycycline&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 81

Hình 3.40 Sự phát huỳnh quang xuất hián trong tế bào chất cÿa tế bào 2

ngày sau chuyển gen và ho¿t hóa bằng Doxycycline &&& 82

Hình 3.41 Trong quá trình chuyển gen hình thái tế bào có sự biến đổi& 83

Hình 3.42 Biểu hián cÿa các chỉ thß tr°ớc và sau khi chuyển gen&& 84

Hình 3.43 Hình Ánh tế bào nhuám mißn dßch huỳnh quang sau 2 tuần

biát hóa&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 85

Hình 3.44 Kết quÁ qPCR xác đßnh māc đá biểu hián mRNA cÿa các gen

HNF4α (A), CYP3A4 (B), ALB (C) và AFP (D) t¿i các thßi điểm khác nhau&&&&&&&&&&&&&&&&&& 87

Hình 3.45 Kết quÁ nhuám PAS cÿa nhóm tế bào chuyển gen HNF4α sau

2 tuần 90

M â ĐÄU

Lý do chãn đÁ tài:

Tế bào gác (TBG) là những tế bào có khÁ năng tự t¿o mới và có tiềm năng biát hoá thành nhiều lo¿i tế bào khác nhau Khác với các tế bào khác, TBG ch°a có chāc năng chuyên môn hóa cā thể Viác sử dāng TBG đa năng trong cuáng rán cÿa trẻ s¡ sinh đ°ÿc xem là mát khám phá quan tráng trong nghiên cāu TBG vì khÁ năng cung cấp dồi dào với sá l°ÿng lớn và có tiềm năng biát hóa cao từ nguồn TBG này

Tế bào có chāc năng gan biát hóa từ tế bào gác đang là mát h°ớng đ°ÿc các nhà khoa hác quan tâm Chúng có nhiều tiềm năng āng dāng trong trß liáu tế bào hay trong nghiên cāu thử nghiám sàng lác các ho¿t chất hoặc thuác á d¿ng tế bào chāc năng riêng lẻ hoặc phái hÿp để t¿o d¿ng vi c¡ quan (organoids) [1], [2]

Để biát hóa tế bào gác thành tế bào có chāc năng gan có thể sử dāng các tác nhân nh° các cytokine và các nhân tá tăng tr°áng, hoặc chuyển gen Mát sá cytokine

và các nhân tá tăng tr°ángđ°ÿc biết là có tác dāng nhất đßnh đái với sự biát hóa và

phát triển tế bào gan trong điều kián in vitro, bao gồm HGF (Hepatocyte Growth

Factor), OSM (Oncostatin M), EGF (epidermal growth factor), các nhân tá tăng tr°áng bFGF (basic fbroblast growth factor), insulin, IGF (insulin-like growth factor), nhân tá āc chế b¿ch cầu LIF (leukemia inhibitory factor) Ngoài ra, các hÿp chất hóa hác chẳng h¿n nh° dexamethasone và dimethylsulfoxide (DMSO) có thể đóng vai trò trong viác thúc đẩy quá trình biát hóa thành tế bào gan [3], [4] Tuy nhiên, viác sử dāng các tác nhân này trong các nghiên cāu hián nay vẫn có những khác biát và vẫn còn thiếu mát ph°¡ng thāc để đ¿t hiáu quÁ nh° trông đÿi.

Với biát hóa bằng chuyển gen, các tế bào gan cÁm āng (induced hepatocytes-

iHeps) đã đ°ÿc công bá trong mát sá báo cáo gần đây cho thấy sự biểu hián phong phú cÿa các gen liên quan đến chāc năng trao đổi chất cÿa tế bào gan, kết quÁ ho¿t hóa biểu hián các gen hay nhóm gen khác nhau liên quan đến sự tr°áng thành về chāc năng gan cÿa tế bào sau biát hóa [5] Trong viác tái biát hóa t¿o tế bào giáng tế

bào gan, gen HNF- 4α đã đ°ÿc chāng minh có vai trò và lÿi thế trong mát sá công

bá gần đây [1] KhoÁng 100 gen trong đó có hepatocyte factor 1-alpha, mát yếu tá phiên mã điều hòa sự biểu hián cÿa mát gen liên quan đến gan đ°ÿc biểu hián do sự

kiểm soát cÿa Protein đ°ÿc mã hóa bái gen HNF-4α Trong sự phát triển cÿa gan,

thận và tuyến ruát, mát trong những gen đóng vai trò quan tráng đ°ÿc biết đến là

gen HNF- 4α Trong quá trình đßnh h°ớng biát hóa thành tế bào gan, Gen HNF-4α đã

đ°ÿc chāng minh có thể ho¿t đáng nh° mát gen chi phái trong các tác nhân phiên

mã [6] Ngoài ra, HNF- 4α đóng vai trò vai trò quan tráng trong quá trình biát hóa

gan và trong nhiều chāc năng cÿa gan, bao gồm chuyển hóa lipid và glucose [7]

HNF‑4α cũng Ánh h°áng đến sự biểu hián và tổng hÿp cÿa Globulin liên kết với

hormone giới tính, mát glycoprotein quan tráng đ°ÿc chÿ yếu đ°ÿc sÁn xuất bái gan [6]

Các nghiên cāu tr°ớc đây có sử dāng ph°¡ng pháp chuyển n¿p gen thông qua

há tháng lenti-virus để biát hóa tế bào gác thành tế bào gan sử dāng tác nhân

HNF-4α So với các há tháng biểu hián gen đ°ÿc điều hòa khác đ°ÿc biết, thì há tháng

Tet-On đã đ°ÿc chāng minh h¡n hẳn á mát sá °u điểm[1] Há tháng biểu hián gen Tet-On đ°ÿc kiểm soát bá tetracycline đ°ÿc sử dāng để điều chỉnh ho¿t đáng cÿa gen trong nhân tế bào nhân chuẩn trong các môi tr°ßng khác nhau, từ nghiên cāu sinh hác c¡ bÁn đến āng dāng công nghá sinh hác và liáu pháp gen Há tháng này dựa trên các yếu tá điều hòa kiểm soát ho¿t đáng cÿa operon kháng tetracycline á vi khuẩn Há tháng Tet-On cho phép kích ho¿t biểu hián gen bằng doxycycline (dox) Các °u điểm cÿa há tháng này đã đ°ÿc chāng minh nh°: sự điều hòa chặt chẽ, tính đặc hiáu cao, khÁ năng đáp āng cao và thßi gian đáp āng nhanh, māc đá biểu hián tuyát đái cao, không gây đác tế bào (catalog PT3898-1 Clontech) [8], [9]

Nhằm góp phần bổ sung thêm thông tin khoa hác và điều kián biát hóa mới, cũng nh° má ra khÁ năng nghiên cāu āng dāng sÁn xuất tế bào gan cho các māc tiêu trên, chúng tôi tiến hành thực hián đề tài <Nghiên cāu biệt hóa tạo tế bào có chāc

năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn= Các tác nhân đ°ÿc chúng tôi sử dāng

để đánh giá bao gồm: DSMO, tổ hÿp HGF + DEX + OSM, tổ hÿp HGF + TSA

+OSM và há tháng TetON kích ho¿t thể hián quá māc gen HNF4để biát hóa tế bào gác trung mô cuáng rán thành tế bào có mát sá chāc năng cÿa tế bào gan

M āc tiêu nghiên cąu:

1. Phân lập và nhân nuôi in vitro thành công TBGTM thu từ cuáng rán làm

vật liáu để biát hóa tế bào và có thông tin về các điều kián liên quan đến tính ổn đßnh,

tiềm năng biát hóa và khÁ năng duy trì nguồn TBGTM trong điều kián nuôi in vitro

2 Biát hóa TBGTM cuáng rán thành tế bào có biểu hián mát sá chāc năng

cÿa tế bào gan

N ội dung nghiên cąu:

1. Thu nhận, phân lập và nhân nuôi in vitro TBGTM từ mẫu cuáng rán

2 Nghiên cāu đánh giá tính ổn đßnh, tiềm năng biát hóa và khÁ năng duy trì

nguồn TBGTM trong điều kián nuôi in vitro

3 Nghiên cāu biáthóa TBGTM cuáng rán thành tế bào có biểu hián các chỉ

thß đặc tr°ng tế bào gan bằng các tác nhân khác nhau trong điều kián in vitro

C¢ sã khoa hãc và thăc tißn căa đÁ tài:

Nhiều nghiên cāu sự biát hóa t¿o tế bào gan trong điều kián in vitro từ tế bào

gác bao gồm cÁ tế bào gác t¿o máu, tế bào gác trung mô đã đ°ÿc thử nghiám và công bá Các nghiên cāu biát hóa thành tế bào gan vẫn sử dāng chÿ yếu là tế bào gác trung mô từ các nguồn khác nhau (ví dā: tÿy x°¡ng, mô mỡ, máu dây rán, nhau thai và cuáng rán) Mát sá cytokine và các nhân tá tăng tr°áng bao gồm HGF, OSM,

Các hÿp chất hóa hác chẳng h¿n nh° DMSO, TSA và gen HNF-4α đã đ°ÿc đánh giá

là mát yếu tá có khÁ năng biát hóa tế bào gác thành tế bào gan Đề tài tiếp tāc thực hián, phát triển các nghiên cāu sâu h¡n các nghiên cāu đã thực hián t¿i vián Công nghá sinh hác cũng nh° h°ớng nghiên cāu đang đ°ÿc nhiều phòng thí nghiám trên thế giới quan tâm

Đề tài hoàn thián sẽ cung cấp những thông tin có giá trß trong lĩnh vực nghiên cāu TBGTM cuáng rán, từ ph°¡ng pháp thu thập, phân lập và đánh giá tiềm năng tế bào đến khÁ năng biát hóa cÿa chúng Qua đó cho thấy tiềm năng āng dāng kết quÁ vào đßnh h°ớng t¿o tế bào gan phāc vā thử nghiám, sàng lác các chất có ho¿t tính

sinh hác, cũng nh° xây dựng các mô hình để thử nghiám các lo¿i thuác mới

Nhāng đóng góp mßi căa luÁn án:

Luận án đã cung cấp đầy đÿ các thông tin về khÁ năng biát hóa t¿o tế bào có chāc năng gan từ nguồn TBGTM phân lập từ cuáng rán trẻ s¡ sinh Đề tài là nghiên

cāu đầu tiên sử dāng há tháng Tet-ON kích ho¿t thể hián quá māc gen HNF4α để

biát hóa TBGTM cuáng rán thành tế bào có mát sá chāc năng cÿa tế bào gan

CH¯¡NG 1 TäNG QUAN NGHIÊN CĄU 1.1 Ngu ãn t¿ bào gác trung mô, tiÁm nng biát hóa và ąng dāng

1.1.1 Ngu ồn tế bào gốc trung mô

Trong nhiều mô khác nhau cÿa c¡ thể ng°ßi đều có mặt cÿa tế bào gác trung

mô (TBGTM) Nguồn TBGTM c¡ bÁn đ°ÿc biết đến là tÿy x°¡ng, tuy nhiên trong

những phát hián về sau cho thấy nhiều nguồn tách TBGTM với sá l°ÿng lớn h¡n

tÿy x°¡ng nhiều lần nh° mô mỡ, máu ngo¿i vi, răng sữa, máu cuáng rán, màng dây

rán, màng nhau, nái m¿c tử cung, màng ái&trong sá những nguồn cung cấp TBGTM này, thì dây rán đ°ÿc xem là nguồn khá lý t°áng [10], [11]

TBGTM có thể thu thập đ°ÿc từ c¡ x°¡ng, tÿy x°¡ng, dây chằng, mô mỡ, nhau thai, dây rán và máu dây rán TBGTM có tiềm năng biát hóa thành tế bào có nguồn gác trung mô nh° nguyên bào x°¡ng, sān, tế bào mỡ và các tế bào thần kinh

từ lớp ngo¿i bì, các mô há tuần hoàn, các tế bào gan, c¡ tim&(Hình 1.1) [11]

Hình 1.1. Tiềm năng biát hóa cÿa TBGTM [11]

TBGTM có nguồn gác từ các mô khác nhau nh°ng có cùng mát sá đặc tính t°¡ng tự nhau Tuy nhiên, mát sá công trình nghiên cāu đã công bá cho rằng TBGTM có nguồn gác khác nhau cũng có mát sá khác biát nh° khÁ năng tăng

sinh, biểu hián dấu hiáu bề mặt, tính đa tiềm năng và mát sá dấu hiáu cā thể khác

Những đặc điểm này có thể đ°ÿc sử dāng trong viác tìm các nguồn TBGTM tát h¡n có chất l°ÿng để āng dāng trong lĩnh vực y hác tái t¿o [12]

Trong các nguồn cung cấp TBGTM, nguồn thu thập từ các mô nhau thai,

cuáng rán có nhiều °u điểm đáng kể nh° tránh đ°ÿc thÿ thuật xâm lấn mà

th°ßng đi kèm với nguy c¡ nhißm trùng so với các nguồn TBGTM từ các mô

tr°áng thành TBGTM từ dây rán có khÁ năng cấy ghép tát h¡n có khÁ năng tăng sinh m¿nh h¡n so với TBGTM từ tÿy x°¡ng [13]

So với TBGTM từ các mô tr°áng thành, TBGTM á trẻ s¡ sinh có khÁ năng

āc chế mißn dßch m¿nh mẽ h¡n và tính sinh mißn dßch thấp h¡n Vì vậy, đây nh° là mát nguồn cung cấp tế bào rất hÿp lý cho các āng dāng điều trß [14], [15]

Nh° vậy, TBGTM có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau, tuy nhiên viác

sử dāng cuáng rán trẻ s¡ sinh để phân lập đã có nhiều °u điểm nh° thu đ°ÿc sá l°ÿng lớn, tỷ lá phân lập thành công cao, khÁ năng āc chế mißn dßch cao, không vi

ph¿m đ¿o đāc và vẫn có tiềm năng biát hóa cÿa TBG Cuáng dây rán chính là nguồn

để phân lập TBGTM sử dāng trong nghiên cāu này

1.1.2 Tiềm năng biệt hóa cÿa tế bào gốc trung mô

Mßi lo¿i tế bào đ°ÿc biát hóa khi mát sá l°ÿng gen nhất đßnh cÿa genome

biểu hián và mßi mát lo¿i tế bào đ°ÿc hình thành qua mát kiểu biểu hián riêng cÿa các gen đ°ÿc điều hòa Vì vậy quá trình biát hóa tế bào là sự chuyển đổi từ mát

lo¿i tế bào nguồn thành mát lo¿i khác và nó liên quan đến mát <công tắc= đóng mát

sá gen đang ho¿t đáng và má mát sá gen ch°a ho¿t đáng Những thay đổi này dẫn đến tế bào biến đổi theo chiều h°ớng phù hÿp với các yếu tá kích thích và sẽ t¿o thành mát kiểu tế bào chuyên biát nào đó [16]

KhÁ năng tăng sinh m¿nh mẽ là mát °u điểm cÿa TBGTM, ngoài ra TBGTM còn có tiềm năng biát hóa t¿o thành nhiều lo¿i tế bào khác nhau nh° các tế bào nguyên bào x°¡ng, tế bào sān, tế bào c¡, tế bào mỡ, tế bào thần kinh, tế bào gan,&Ngoài ra TBGTM chính là nguồn cung cấp tế bào để bù đắp l¿i sự thiếu

hāt mô vì TBGTM chính là các tế bào tiền thân tr°áng thành đa tiềm năng Khi xuất

hián các vết th°¡ng, ổ gãy x°¡ng, ổ viêm, hay chỉ là các điều kián vi môi tr°ßng

từ mát vß trí đặc biát nào đó trong c¡ thể, d°ới tác dāng cÿa các tín hiáu trên, các

TBGTM sẽ đ°ÿc huy đáng và biát hóa thành các tế bào có chāc năng chuyên biát [17]

Mát nghiên cāu đã chāng minh tiềm năng tăng sinh to lớn cÿa TBGTM khi nuôi cấy TBGTM in vitro, sau 70 lần phân chia các tế bào này cho thấy chúng

vẫn không thay đổi tiềm năng biát hóa [17]

1.1.3 Āng dụng cÿa tế bào gốc trung mô

Nghiên cāu về TBG có thể có thêm những hiểu biết về quá trình biát hóa tế bào, bÁn chất cÿa quá trình biát hóa Hiểu rõ về quá trình này ta có thể kiểm soát và chÿ đáng tác đáng để t¿o ra các lo¿i tế bào nh° mong muán hoặc có thêm thông tin trong viác tìm kiếm các ph°¡ng thāc sàng lác và điều trß các bánh di truyền

Trên c¡ sá các TBG ch°a hoàn tất quá trình biát hóa và khÁ năng tăng sinh m¿nh mẽ cÿa chúng, các nhà khoa hác có thể chÿ đáng t¿o ra các tế bào giáng hát nhau và á các giai đo¿n bánh lý, sinh lý khác nhau rất gần với thực tế lâm sàng Điều này rất có ý nghĩa trong viác nghiên cāu đác tính cũng nh° c¡ chế tác dāng cÿa các lo¿i chế phẩm sinh hác hay các lo¿i thuác [18]

Trong nghiên cāu c¡ bÁn, nghiên cāu phát triển thuác cũng nh° āng dāng vào điều trß trên lâm sàng thì các TBG có rất nhiều triển váng āng dāng Trong nghiên cāu phát triển thuác thì cần có những mô hình thử nghiám thuác (cÁ tác

dāng lẫn đác tính) càng giáng với mô hình bánh lý và có đá lặp l¿i cao qua các lần

thử thì càng chính xác Thí dā, muán khÁo sát tác dāng cÿa mát thuác mới có khÁ

năng chữa bánh Alzheimer thì viác t¿o ra đ°ÿc hàng ho¿t tế bào thần kinh giáng

hát nhau để làm mô hình thử thuác sát với bánh Alzheimer nhất cần sử dāng công nghá TBG Tuy nhiên vẫn cần có thêm nhiều thử nghiám tiền lâm sàng và lâm sàng với ph°¡ng pháp điều trß này [19]

Āng dāng lâm sàng qua trß liáu TBG (Stem cell therapy) đ°ÿc xem là tiềm

năng āng dāng quan tráng nhất cÿa TBG Từ TBG có thể t¿o ra các lo¿i tế bào mới,

mô mới để bổ sung hoặc thay thế cho các tế bào và mô c¡ quan bß tổn th°¡ng hay

mất chāc năng Cho tới nay bián pháp hữu hiáu nhất để điều trß những tr°ßng hÿp này là ghép mô, c¡ quan – nh°ng nhu cầu ghép mô và t¿ng l¿i cao h¡n rất nhiều

so với nguồn cung cấp

Trên c¡ sá các TBG có thể biát hóa thành nhiều lo¿i tế bào khác nhau, chúng

ta có thể chÿ đáng nuôi cấy TBG trong áng nghiám sau đó biát hóa chúng thành các

tế bào nh° tế bào c¡, tế bào x°¡ng, tế bào thần kinh, tế bào sān, tế bào tuyến tāy,

tế bào c¡ tim (Hình 1.2) Do đó, để điều trß mát sá bánh thì viác ghép TBG vào c¡ thể ng°ßi bánh có thể hß trÿ điều trß mát sá bánh nh° bánh lý tim m¿ch, tiểu đ°ßng,

chấn th°¡ng tuỷ sáng, điều trß bánh Alzheimer, điều trß Parkinson, đát quỵ não, trong lĩnh vực thẩm mỹ hay thúc đẩy quá trình liền x°¡ng&[20]

Hình 1.2.Triển váng āng dāng cÿa công nghá tế bào gác [21]

Trên lâm sàng, TBG tr°áng thành đã đ°ÿc thử nghiám trong điều trß các bánh nh° các bánh suy giÁm mißn dßch, tai biến m¿ch máu não, tự kỷ, tự mißn, nhißm virus Ebstein-Barr, thiếu máu, các bánh máu, bánh Parkinson, tổn th°¡ng tÿy sáng,

tổn th°¡ng giác m¿c, t¿o x°¡ng không hoàn chỉnh, các bánh gan, liền vết th°¡ng

da, điều trß ung th° kết hÿp với tia x¿ và hóa chất (ung th° tinh hoàn, ung th° buồng

trāng, các khái u đặc, u nguyên bào võng m¿c, u não, đa u tÿy, ung th° vú,

l¡-xê-mi, u lympho Non-Hodgkin, u nguyên bào thần kinh, carcinoma tế bào thận), tiểu đ°ßng type I, tái t¿o c¡ tim sau nhồi máu c¡ tim, tổn th°¡ng x°¡ng và sān, [17]

Trong những năm gần đây, trong các lo¿i TBG đ°ÿc sử dāng thì TBGTM là mát trong lo¿i TBG đ°ÿc sử dāng nhiều trên lâm sàng và đ°ÿc xem nh° mát mô hình điều trß mới cho mát lo¿t các các bánh vì có thể phân lập và tăng sinh với mát

sá l°ÿng lớn Đã có ít nhất thử nghiám lâm sàng trên 12 lo¿i bánh lý khác nhau dựa trên TBGTM đã đ°ÿc thực hián, trong đó có nhiều thử nghiám đã hoàn thành và

chāng minh đ°ÿc tính hiáu quÁ và an toàn Āng dāng lâm sàng cÿa TBGTM dựa trên những thuác tính sinh hác quan tráng đó là có tiềm năng biát hóa thành nhiều

lo¿i tế bào khác nhau, tiết ra nhiều phân tử có ho¿t tính sinh hác có khÁ năng phāc

hồi kích thích các tế bào bß tổn th°¡ng và āc chế viêm và để thực hián chāc năng điều hòa mißn dßch

Các thử nghiám lâm sàng đầu tiên sử dāng nuôi cấy tăng sinh TBGTM đ°ÿc công bá vào năm 1995 và 10 bánh nhân dß tật khớp giÁ x°¡ng chày

bẩm sinh đ°ÿc điều trß bằng tế bào tự thân [22] Từ thử nghiám này, mát sá

thử nghiám lâm sàng khác đã đ°ÿc tiến hành để kiểm tra tính khÁ thi và hiáu quÁ cÿa liáu pháp ghép bằng TBGTM Ngày 12/12/2011, c¡ sá dữ liáu về thử nghiám

lâm sàng (http://clinicaltrials.gov) đã đ°ÿc thành lập do Vián y tế quác gia Hoa Kỳ

tập hÿp Tính đến năm 2020, sau 10 năm, sá liáu công bá đã có h¡n 1000 thử nghiám lâm sàng có sử dāng TBGTM với ph¿m vi rất ráng cho các āng dāng điều trß khác nhau (Hình 1.3) Hầu hết những thử nghiám này trong pha I (30,79%), (nghiên cāu

an toàn), pha II (61,02%) (đánh giá về hiáu quÁ á bánh nhân) Chỉ có mát sá ít những

thử nghiám này trong pha III (7,53%) (so sánh ph°¡ng pháp điều trß mới với các

ph°¡ng pháp điều trß tiêu chuẩn hoặc đã đ°ÿc biết đến) và mới chỉ có 6 thử nghiám

á pha IV (0,66%) (hiáu quÁ đã đ°ÿc chấp thuận và thử nghiám trên nhóm ráng) (Hình 1.4) Nói chung, TBGTM đ°ÿc dung n¿p tát, với hầu hết các thử nghiám đã đ°ÿc công bá các tác dāng phā á māc đá trung bình, mặc dù mát sá cho thấy māc đá

nhẹ và thoáng qua [23], [24]

Hình 1.3. Āng dāng cÿa TBGTM đ°ÿc thử nghiám trên lâm sàng

(phân lo¿i theo ca bánh) [23]

Hình 1.4. Āng dāng cÿa TBGTM đ°ÿc thử nghiám trên lâm sàng

(phân lo¿i theo pha) [24]

Năm 2020, Yang và cáng sự đã thu thập tổng cáng 23 bài báo thử nghiám lâm sàng đã hoàn thành và 56 thử nghiám lâm sàng đang dißn ra về điáu trß TBGTM cho bánh gan đ°ÿc công bá từ năm 2007 đến 2018 (Hình 1.5) Biểu đồ cho phần

lớn thử nghiám trong sá đó là về liáu pháp TBGTM cho bánh x¡ gan Viác phát triển các ph°¡ng pháp thay thế để điều trß bánh gan là rất cần thiết Liáu pháp TBG

và y hác tái t¿o đang đ°ÿc nghiên cāu để cÁi thián tiên l°ÿng cÿa những bánh nhân

mắc bánh gan Hàng chāc các bài báo liên quan đều cho thấy sự an toàn và hiáu quÁ

cÿa viác cấy ghép TBGTM trên ng°ßi [25]

Hình 1.5. Sá l°ÿng và tỷ lá các thử nghiám lâm sàng về điều trß TBGTM cho bánh

gan: A) thử nghiám đã hoàn thành; B) thử nghiám đang dißn ra [25]

1.2 C Ãu t¿o cuáng rán, °u điểm căa t¿ bào gác trung mô tć cuáng rán

1.2.1 C ấu tạo cuống rốn

Trong quá trình phát triển cÿa phôi thì vào khoÁng tuần thā 5 cuáng rán (dây rán) đ°ÿc hình thành Để thực hián quá trình trao đổi chất giữa thai nhi và c¡ thể

mẹ, thì viác đÁm bÁo sự liên tāc giữa thai nhi với bánh nhau đ°ÿc thực hián qua dây rán [26]

Dây rán là bá phận kết nái giữa mẹ và thai nhi, giữ vai trò quan tráng trong vận chuyển chất dinh d°ỡng từ c¡ thể mẹ sang thai nhi, đÁm bÁo sự sinh tr°áng cÿa thai nhi trong suát thai kỳ Chất dinh d°ỡng đ°ÿc vận chuyển qua đ°ßng máu Máu

từ thai nhi đ°ÿc chuyển qua dây rán sang nhau thai để tiếp xúc với máu ng°ßi mẹ, lấy oxy và các chất dinh d°ỡng, sau đó l¿i qua dây rán chuyển về thai nhi

Dây rán đ°ÿc bác bái màng ái và có cấu t¿o gồm có hai đáng m¿ch và mát tĩnh m¿ch, bao quanh là các mô nhầy hay gelatin, còn gái là lớp Wharton’s jelly (WJ) Dây rán th°ßng có đ°ßng kính khoÁng 2 cm và có chiều dài khoÁng 50 cm à lớp

WJ, có thể xác đßnh ba vùng khác nhau bao gồm: lớp mô bao quanh các m¿ch máu, vùng chất nền Wharton và vùng d°ới màng ái Trong các khoÁng không gian có hình d¿ng giáng nh° rãnh thuác vùng chất nền Wharton là các phân tử collagen lo¿i I, III,

VI Các phân tử heparin sulfate proteoglycan laminin và collagen lo¿i VI nằm xung quanh rãnh này Các tế bào chất nền là các nguyên bào c¡ mÁnh có d¿ng áng biểu hián actin c¡ tr¡n, desmin và vimentin bao quanh các khoÁng không gian chāa đầy chất nền Wharton d¿ng rãnh Chỉ có vimentin và desmin á dây rán trong giai đo¿n phát triển sớm Các m¿ch máu đ°ÿc bÁo vá khßi bß nén là nhß thành phần và cấu trúc cÿa dây rán và chính cấu trúc này hß trÿ cho quá trình trao đổi chất giữa dßch ái và máu dây rán (Hình 1.6) [27]

Hình 1.6.Mặt cắt ngang cấu trúc cÿa dây rán [27]

1.2.2 ¯u điểm cÿa tế bào gốc trung mô từ cuống rốn

Cuáng rán là mát trong những nguồn TBGTM phong phú nhất các TBG t¿o máu (Hematopoietic Stem Cell) và TBGTM đ°ÿc tìm thấy trong máu dây rán, trong khi các TBGTM và các TBG biểu mô (Epithelial Stem Cell) đ°ÿc tìm thấy á màng bao dây rán chāa [28], [29] Gần đây, đã có nhiều nghiên cāu chāng minh dây rán chāa mát sá l°ÿng TBG rất dồi dào, °ớc tính 1 cm2 màng bao dây rán có thể cung cấp 2 triáu TBGTM [26] Nh° vậy đây có thể coi là nguồn TBGTM vô tận Hián nay, các nhà khoa hác chāng minh rằng dây rán là nguồn cung cấp TBG lý t°áng nhất, sá dĩ nh° vậy vì TBG này có rất nhiều °u điểm v°ÿt trái [30]:

1 Dß thu ho¿ch và xử lý TBG, không gây bất kỳ Ánh h°áng gì đến sāc khße cÿa cÁ mẹ và con

2 Có thể chÿ đáng kiểm soát tình tr¿ng các bánh truyền nhißm nh° HIV, viêm gan B, viêm gan C& đái với các mẫu nghiên cāu bằng các xét nghiám tr°ớc sinh đái với sÁn phā

3 Về ph°¡ng dián tuổi phát triển, TBG dây rán là TBG nhũ nhi, còn rất trẻ nên khÁ năng phân chia tát và sá l°ÿng tế bào thu đ°ÿc trực tiếp hoặc sau tăng sinh

in vitrolà rất lớn Các TBG dây rán không còn là các TBG phôi do vậy không còn khÁ năng t¿o ra khái u ác tính nh° TBG phôi Đồng thßi có thể thu đ°ÿc nhiều lo¿i TBG bao gồm các TBG trong máu dây rán (chāa nhiều TBG t¿o máu) và các TBGTM và TBG biểu mô từ màng dây rán, lớp WJ [31]

4 TBG từ dây rán có thể l°u trữ lâu dài để sử dāng điều trß cho chính ng°ßi

có dây rán ấy hoặc ng°ßi thân trong gia đình há hoặc cho ng°ßi khác Xác đßnh tr°ớc đ°ÿc kháng nguyên b¿ch cầu ng°ßi (human leukocyte antigen– HLA) và các đặc điểm khác cÿa mẫu TBG từ tr°ớc để há xem có phù hÿp với ng°ßi bánh cần điều trß bằng TBG hay không, từ đó có thể lấy ngay ra để sử dāng cho điều trß mà không mất thßi gian tìm kiếm và xét nghiám cho tế bào [32]

5 Các TBG thu đ°ÿc từ dây rán và nhau thai biểu hián HLA á māc thấp và

ít bß đào thÁi trong cấy ghép Các nghiên cāu đã chỉ ra rằng các tế bào này có tính sinh mißn dßch thấp do có chāa ít kháng nguyên hòa hÿp mô HLA lớp II đồng

thßi còn tồn t¿i các kháng nguyên hòa hÿp mô cÿa thai (HLA-G) có tác dāng āc

chế mißn dßch nên dß đ°ÿc c¡ thể nhận chấp nhận khi cấy ghép từ ng°ßi này sang

ng°ßi khác [33] Đây là nguồn TBG quan tráng trong viác thay thế tÿy x°¡ng khi không thể tìm đ°ÿc ng°ßi cho có HLA phù hÿp [34]

6 Cuái cùng, có thể kết luận dây rán là nguồn TBG lý t°áng vì xét về khÁ năng biát hóa, TBG dây rán thuác lo¿i đa tiềm năng, chúng có thể biát hóa thành các lo¿i tế bào nh°: tế bào máu, tế bào x°¡ng, tế bào c¡ tim, tế bào sān, tế bào mỡ, tế bào gan, [35]

1.3 Tình hình nghiên c ąu

1.3.1 Tình hình nghiên cāu tế bào gốc ng°ời

Kể từ khi TBG phôi v¿n năng đ°ÿc phát hián năm 1981, với đặc tính chúng

có thể tự làm mới vô thßi h¿n và biát hóa thành các tế bào đặc tr°ng cÿa ba lớp mầm nái bì, trung bì và ngo¿i bì [36] Tuy nhiên, những nghiên cāu sau đó đã cho thấy những mái quan tâm về đ¿o đāc và kỹ thuật, cũng nh° nguy c¡ hình thành các mô

ung th° nếu sử dāng TBG phôi cấy ghép in vivo [37] Điều này đã thúc đẩy h°ớng

nghiên cāu tìm kiếm các TBG đa năng thay thế TBG phôi từ các nguồn tế bào tr°áng thành [38]

Các TBG tr°áng thành cÿa con ng°ßi là TBG đa năng nh° TBG t¿o máu và TBGTM, th°ßng đ°ÿc đánh giá không Ánh h°áng về đ¿o đāc và an toàn h¡n so với TBG phôi [39] TBG t¿o máu có thể biát hóa thành tất cÁ các dòng tế bào máu và tế bào mißn dßch, chúng đã đ°ÿc sử dāng để điều trß các bánh b¿ch cầu và rái lo¿n máu [40] TBGTM đ°ÿc phân lập từ nhiều nguồn mô từ các cá thể đã tr°áng thành [38] Hián nay, đã có nhiều các báo cáo về sự biát hóa cÿa các tế bào này thành các dòng khác nhau nh° tế bào mỡ, tế bào x°¡ng và tế bào thần kinh [41]

Tuy nhiên, viác sử dāng các các TBGTM trong điều trß cũng không phÁi hoàn thoàn thuận lÿi và dß dàng, mà nó cũng có những cÁn trá và khó khăn do mát sá lý

do nhất đßnh [38] Đầu tiên, viác phân lập TBG từ các nguồn tr°áng thành bao gồm các can thiáp xâm lấn và th°ßng gây đau đớn cho ng°ßi hiến, cùng với mát tỷ lá biến chāng có thể xÁy ra đái với ng°ßi hiến Thā hai, mặc dù chúng có khÁ năng tăng sinh

và biát hóa khác nhau, nh°ng tiềm năng này th°ßng bß giÁm khi nuôi cấy trong điều

kián in vitro [42] Thā ba, tiềm năng tự đổi mới và biát hóa cÿa TBG bß Ánh h°áng

nghiêm tráng bái tuổi cÿa ng°ßi hiến, đặc tính di truyền và những yếu tá môi tr°ßng

tiếp xúc với tế bào [43]

Năm 2005, Phan Toàn Thắng và cáng sự thuác tr°ßng Đ¿i hác Quác Gia Singapore đã thành công trong viác xác đßnh và phân lập TBG từ màng dây rán (lining membrane of umbilical cord) Lÿi thế cÿa nguồn TBG từ màng dây rán là đáp āng đ°ÿc cÁ hai yêu cầu là sá l°ÿng tế bào và không vi ph¿m y đāc Mßi dây rán có đ°ßng kính 2 cm và dài 55 cm thì dián tích bề mặt t°¡ng đ°¡ng 330 cm2 với

sá l°ÿng tế bào đ°ÿc phân lập trong 3 tuần sẽ đ¿t đ°ÿc 6 tỷ tế bào, đây thực sự là

sá l°ÿng lý t°áng cho các āng dāng khác nhau trong y hác tái t¿o và công nghá

mô Điều quan tráng nữa cÿa công nghá này liên quan đến chuyên ngành vết th°¡ng

và vật liáu thay thế Các TBG từ màng dây rán bao gồm TBGTM và TBG biểu mô Các dấu hiáu đặc tr°ng TBGTM đ°ÿc xác đßnh bao gồm: d°¡ng tính với CD13,

CD44, CD90 và CD166 và âm tính với CD14, CD34, CD45 và HLA-DR [44]

Trong nghiên cāu cÿa Salehinejad và cáng sự năm 2012, nhóm tác giÁ đã phân lập TBGTM có nguồn gác từ dây rán ng°ßi bằng 4 ph°¡ng pháp khác nhau: 3 nhóm phân lập bằng enzyme: trypsin (Trp), collagenase/trypsin (CT) và collagenase/hyaluronidase/trypsin (CHT), và mát nhóm phân lập bằng phân tách các mÁnh mô nhß (Exp) Sau đó kết quÁ phân lập bằng các ph°¡ng pháp khác nhau đ°ÿc

so sánh, sử dāng kỹ thuật nhuám Trypan blue, nhuám hóa mô mißn dßch và kỹ thuật đếm tế bào qua dòng chÁy (flow cytometry) để kết luận ph°¡ng pháp phân lập thích hÿp nhất [45]

à cÁ 4 nhóm trên cho kết quÁ khác nhau thể hián á khÁ năng tăng sinh sá l°ÿng tế bào biểu hián chỉ thß cÿa các TBGTM phân lập đ°ÿc Phân tích bằng kỹ thuật đếm tế bào qua dòng chÁy cho thấy trong tất cÁ các nhóm đều biểu hián các chỉ thß

CD105, CD90, CD73, và CD44 , trong khi không thể hián CD45 và CD34 Trong các nhóm khác nhau, các chỉ thß cÿa TBGTM nh° CD90, CD73, đ°ÿc biểu hián khác nhau: á nhóm Exp chỉ thß CD73 biểu hián cao nhất; còn á nhóm CT và Exp chỉ thß

CD90biểu hián cao nhất

KhÁ năng tăng sinh cao nhất á nhóm phân lập bằng phân tách các mÁnh mô nhß, 60 ngày là thßi gian có thể theo dõi tăng sinh tế bào Trong khi đó sau khoÁng

30 ngày nuôi cấy á các nhóm phân lập bằng enzyme, các tế bào không tiếp tāc tăng sinh với tác đá đáng kể

à ph°¡ng pháp phân lập bằng enzyme, chỉ sau 2 – 3 giß TBG đã có thể phân lập đ°ÿc, trong khi phÁi mất đến 2 – 3 tuần mới quan sát thấy có tế bào mác ra á

ph°¡ng pháp nuôi cấy mÁnh mô Sá l°ÿng tế bào ban đầu thu đ°ÿc ít nhất á nhóm Trp (1 × 103 tế bào/cm lớp WJ), nhiều h¡n á nhóm CHT (0,25 × 104 tế bào/cm lớp WJ) và nhiều nhất á nhóm CT (0,5-1 × 104 tế bào/cm lớp WJ

Nhóm tác giÁ cũng quan sát thấy có sự khác nhau về hình thái tế bào giữa nhóm phân lập bằng enzyme và Các tế bào giáng nguyên bào sÿi chiếm °u thế và có tính đồng nhất cao trong nhóm phân lập bằng nuôi cấy mÁnh mô Trong khi không

có sự đồng nhất á quần thể tế bào trong ph°¡ng pháp enzyme, xuất hián các tế bào tròn nhß xen lẫn với các tế bào giáng nguyên bào sÿi với đá ngắn, dài khác nhau Kết quÁ phân lập TBG đ¿t hiáu quÁ cao nhất khi sử dāng ph°¡ng pháp phân lập bằng nuôi cấy mÁnh mô tuy nhiên sẽ tán nhiều thßi gian h¡n Tùy vào māc đích phân lập khi phân lập TBG bằng ph°¡ng pháp sử dāng enzyme thì cần lựa chán hßn hÿp enzyme thích hÿp [45]

à mát nghiên cāu khác Karahuseyinoglu và cáng sự đã chỉ ra có thể thu đ°ÿc

sá l°ÿng lớn TBGTM từ cuáng rán trẻ s¡ sinh, cā thể thu đ°ÿc 4x105tế bào mßi mẫu, hoặc 10x105 đến 15x105 tế bào cho 1 cm cuáng rán [46] Ngoài ra, mát nguồn

TBGTM dồi dào có thể thu đ°ÿc trong chất nền WJ cÿa cuáng rán Các tế bào stromal giáng nguyên bào sÿi có rất nhiều trong WJ bÁn chất là mát mô gelatin trong dây rán [47] Khi tiến hành phân lập và nuôi cấy TBGTM từ màng WJ và từ toàn bá dây rán,

từ ngày 11 và ngày 13 có thể quan sát các tế bào bắt đầu mác ra Trong suát quá trình phân lập và nuôi cấy từ 2 lo¿i này thì trong môi tr°ßng nuôi cấy đều không có yếu tá tăng tr°áng đ°ÿc thêm vào Mật đá tế bào bắt đầu tăng và phát triển chiếm 2/3 đĩa nuôi sau khoÁng 15 ngày nuôi cấy Tuy nhiên khi so sánh bằng kính hiển vi đÁo ng°ÿc pha, á nhóm phân lập nuôi cấy từ màng WJ thì mật đá tế bào cao h¡n so với nhóm phân lập nuôi cấy từ toàn bá dây rán [48]

Nghiên cāu TBG á Viát Nam đ°ÿc thực hián từ năm 1995, trên các TBG dòng tÿy Gần đây, viác nghiên cāu TBG phát triển m¿nh với nhiều lo¿i tế bào đ°ÿc nghiên cāu nh° TBG máu cuáng rán Các nghiên cāu đ°ÿc thực hián từ c¡ bÁn nh° đánh giá chất l°ÿng, đo đếm thành phần tế bào trong mẫu thu thập đ°ÿc [49]

Ghép TBG máu để chữa bánh về khái u ác tính về huyết hác đã có mát lßch sử lâu dài á Viát Nam với ca ghép đầu tiên đ°ÿc thực hián cách đây h¡n 20 năm [50]

Mặc dù đã có mát sá tr°ßng hÿp sử dāng TBG máu tinh khiết với CD34+, hầu hết

các tr°ßng hÿp đã sử dāng phần TBG từ tÿy x°¡ng, máu cuáng rán hoặc máu ngo¿i

vi do nhu cầu về sá l°ÿng TBG cần huy đáng Cho đến nay, hián có h¡n 750 tr°ßng hÿp ghép TBG máu để điều trß các khái u ác tính t¿o máu khác nhau, bao gồm bánh b¿ch cầu tÿy cấp tính, bánh b¿ch cầu dòng tÿy mãn tính, thiếu máu và beta thalassemia [51] Những āng dāng này là mát phần cÿa điều trß th°ßng quy t¿i Viát Nam Hiáu quÁ điều trß đã thay đổi giữa các bánh vián khác nhau [50]

Đái với nguồn TBGTM (chÿ yếu là TBG làm giàu từ tÿy x°¡ng) đã đ°ÿc sử dāng để điều trß các tình tr¿ng x°¡ng khác nhau, chẳng h¿n nh° điều trß lâm sàng bao gồm các ca phāc hồi gãy x°¡ng chi, gãy x°¡ng chày, khắc phāc ho¿i tử đầu x°¡ng Tất cÁ các ph°¡ng pháp điều trß hián đang đ°ÿc nghiên cāu trong các thử nghiám lâm sàng thí điểm hoặc pha I/ II Mát sá báo cáo cho thấy liáu pháp này là khÁ thi, nh°ng cho đến nay, không có ph°¡ng pháp điều trß nào đ°ÿc Bá Y tế phê duyát nh° mát ph°¡ng pháp điều trß thông th°ßng Điều này khác với ghép TBG có nguồn gác từ

mô mỡ, đã cho thấy tác đáng đáng kể đái với viêm x°¡ng khớp gái và đ°ÿc chấp thuận nh° là mát điều trß tiêu chuẩn trong bánh vián [50] Thành công cÿa ca ghép TBG có nguồn gác từ mô mỡ là kết quÁ cÿa thử nghiám lâm sàng đa trung tâm, với

sự tham gia cÿa Bánh vián V¿n H¿nh (Tp Hồ Chí Minh) và Bánh vián Nguyßn Tri Ph°¡ng (Tp Hồ Chí Minh) Cho đến nay, khoÁng 1000 bánh nhân đã đ°ÿc điều trß viêm x°¡ng khớp gái bằng liáu pháp này; con sá này tiếp tāc tăng hàng ngày [51] Ngoài ra, ghép TBG cũng đã đ°ÿc ghi nhận có kết quÁ trong điều trß thử nghiám các bánh tự kỷ, b¿i não&[52]

1.3.2 Tình hình nghiên c āu biệt hóa tạo tế bào gan

1.3.2.1 Tình hình nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào gan

Hián nay, các bánh về gan là vấn đề sāc khße nghiêm tráng trên toàn thế giới Bánh về gan là mát trong những bánh dẫn đến tỷ lá tử vong cao và cũng là mát trong những bánh có chi phí điều trß cao [53] Hàng năm có hàng triáu bánh nhân chết do bánh lý về gan trên toàn thế giới [54] Sử dāng TBG để chữa trß bánh gan đã đ°ÿc chāng minh có lÿi trong hầu hết các tr¿ng thái bánh về gan Các nghiên cāu khoa hác cho thấy vai trò cÿa TBG trong điều trß và chữa khßi các bánh khác nhau nh° x¡ gan, x¡ gan mất bù [55], bánh di truyền liên quan đến gan [56], bánh ung th° gan [53] Bái vì TBG có khÁ năng biát hóa t¿o thành bất kỳ lo¿i mô, tế bào nào trong c¡ thể, do đó nó có tiềm năng rất lớn trong điều trß bánh khác nhau Liáu pháp TBG có thể đ°ÿc coi nh° là mát liáu pháp thay thế cho ghép gan, vì nó có tiềm năng to lớn

trong phāc hồi bánh suy gan Liáu pháp TBG có thể đ°ÿc thự hián ghép TBG trực tiếp hoặc qua mát hoặc hai b°ớc trung gian bằng cách biát hóa đßnh h°ớng tế bào

chāc năng in vitro [53]

Nghiên cāu cÿa Mattiucci và cáng sự (2018) đã chāng minh rằng, TBGTM dây rán có thể biát hóa và điều trß bánh về gan Trong nghiên cāu này, nhóm tác giÁ

đã sử dāng TBG màng dây rán đ°ÿc phân lập và nhân nuôi trong môi tr°ßng in vitro

và tiến hành biát hóa t¿o thành tế bào có chāc năng cÿa tế bào gan Các tế bào đ°ÿc cấy ghép cho chuát mô hình với bánh gan đặc tr°ng, sau đó tiến hành theo dõi đánh giá chuát sau cấy ghép Kết quÁ cho thấy, tế bào đã khu trú vào khu vực gan chuát

bß bánh và quá trình cấy ghép tế bào đã góp phần vào phāc hồi chāc năng cÿa chuát thí nghiám Nghiên cāu cũng chỉ ra rằng, kết quÁ ghép TBG màng dây rán cho hiáu quÁ t°¡ng tự ghép tế bào gan t°¡i [43]

Để tìm giÁi pháp điều trß các bánh liên quan đến gan, mát sá mô hình đã đ°ÿc phát triển để dự báo khÁ năng bß tổn th°¡ng gan á ng°ßi [57] Tế bào gan t°¡i đ°ÿc phân lập từ ng°ßi hiến đ°ÿc công nhận là "tiêu chuẩn vàng" để đánh giá quá trình chuyển hóa trao đổi chất trong gan và đác tính cÿa thuác [58] Tế bào gan t°¡i thể hián rất nhiều các enzyme chuyển hóa khi thử nghiám các lo¿i thuác trong nhiều ngày nuôi cấy mô sau phân lập Tuy nhiên, biểu hián enzyme giÁm đi rõ rát trong

quá trình nuôi cấy tế bào, nguyên nhân có thể do tế bào nuôi in vitro không thể đáp

āng đ°ÿc các phÁn āng sinh hác ngày càng phāc t¿p Ngoài sự không ổn đßnh, tế bào gan t°¡i khó có thể sử dāng ráng rãi đ°ÿc vì khan hiếm nguồn cung tế bào có chất l°ÿng [42]

Ng°ÿc l¿i với tế bào gan t°¡i, các tế bào ung th° gan có khÁ năng nhân nuôi tăng sinh để duy trì, giá thành rẻ và dß dàng để xử lý [59] Tuy nhiên, ngoài những lÿi thế trên, do sự thiếu hāt mát sá con đ°ßng tín hiáu tế bào quan tráng nên kiểu hình tế bào ung th° th°ßng không biểu hián chính xác kiểu hình nh° tế bào gan bình th°ßng [60] Ví dā, các tế bào Huh7.5 đ°ÿc sử dāng để nghiên cāu virus viêm gan

C (HCV) có khÁ năng nhân ráng nh°ng không lý t°áng để nghiên cāu sự t°¡ng tác với virus tế bào chÿ do khiếm khuyết trong con đ°ßng gen 1 cÁm āng retinoic [61] Ngoài ra, các dòng tế bào ung th° gan h¿n chế hiển thß năng lực trao đổi chất trong

với mát sá lo¿i thuác do biểu hián gen Cytochrome P450 (CYP) kém Với sự ra đßi

cÿa công nghá TBG đa năng, hián nay các dòng tế bào gan có nguồn gác di truyền

rõ ràng có thể sÁn xuất á māc đá đáp āng đ°ÿc nhu cầu cÿa các nghiên cāu thử nghiám Đây là h°ớng nghiên cāu có tiềm năng mang tính cách m¿ng cho y hác hián đ¿i cÿa TBG đ°ÿc khai thác phāc vā nghiên cāu bánh và thử nghiám các lo¿i thuác mới [60]

Hình 1.7. Mô hình sử dāng tế bào gan biát hóa từ tế bào gác [59]

Hián nay, có mát sá dòng tế bào gan đ°ÿc biát hóa từ TBG đa năng cÿa ng°ßi

đã đ°ÿc th°¡ng m¿i hóa Các công ty cung cấp lớn đều á Mỹ và Nhật BÁn (Yokohama; iCell; Otsu), các công ty này cung cấp các lo¿i tế bào có đặc điểm và

có chāc năng phāc vā cho những thí nghiám cā thể Mát yếu tá quan tráng đái với các dòng tế bào biát hóa sÁn xuất th°¡ng m¿i là chúng sẽ đ°ÿc đßnh h°ớng cho viác

sử dāng để kiểm soát chất l°ÿng thuác và các xét nghiám sàng lác các chất có ho¿t tính sinh hác và thử nghiám đác tính cÿa các ho¿t chất cā thể [62] Chi phí cÿa mát đĩa 24 hoặc 96 giếng chāa tế bào khoÁng 2500 USD đái với đ¡n đặt hàng cÿa các nhà nghiên cāu Hàn Quác từ các nhà cung cấp từ cÿa Mỹ, và có thể mất 3-6 tháng

để nhận đ°ÿc đĩa tế bào gan biát hóa theo yêu cầu đang nuôi trên đĩa mô hình thử nghiám [60] Thông tin về quá trình đánh giá gen biểu hián, chuyển hóa enzyme hoặc khÁ năng kháng thuác cÿa các dòng tế bào gan biát hóa không đ°ÿc cung cấp

rõ ràng, do đó viác sử dāng các tế bào có sẵn trên thß tr°ßng th°ßng bß bó hẹp, thiếu linh ho¿t và thay đổi māc đích sử dāng các dòng tế bào đặt hàng th°ßng gặp khó khăn Theo thông tin từ Cellular Dynamics International (CDI), tổ chāc đ°ÿc thành

lập bái James Thomson, báo cáo rằng dòng tế bào gan iCell® cÿa há biểu hián 1936

vß trí hấp thā, phân bá, chuyển hóa, và đánh dấu bằng h¡n 200 gen chỉ thß, trong đó bao gồm tất cÁ các gen đ°ÿc giám sát cÿa Cāc QuÁn lý Thực phẩm và D°ÿc phẩm Hoa Kỳ (FDA) Tuy nhiên các gen biểu hián đặc tr°ng cÿa dòng tế bào l¿i không đ°ÿc báo cáo Do đó, vào thßi điểm này, viác sử dāng tế bào gan biát hóa để dự đoán

và sàng lác các đác tá cÿa các lo¿i thuác mới đ°ÿc sử dāng song song với các dòng

tế bào gan ng°ßi [60]

Hián nay, Công ty Takara Bio Europe AB mua Cellectis Europe vào năm

2014 và Fujifilm Holdings Corp mua CDI-Mỹ, do đó các công ty Nhật BÁn (ReproCell, Takara Bio Inc, và Fujifilm Holdings Corp) thực hián đầy đÿ các nhu cầu cung cấp tế bào gan biát hóa á châu Á, Mỹ và châu Âu [62] Nói chung, mang mát lo¿i thuác mới ra thß tr°ßng chi phí khoÁng 800 triáu USD với khoÁng 10% thß tr°ßng tăng tr°áng mßi năm Công ty d°ÿc phẩm đầu t° khoÁng 1,5 tỷ USD để phát triển mát lo¿i thuác mới, và nó th°ßng mất 10-15 năm tr°ớc khi thuác cÿa há đ°ÿc đ°a ra thß tr°ßng; 9 trong sá 10 lo¿i thuác á giai đo¿n lâm sàng sẽ không v°ÿt qua kiểm soát chất l°ÿng tr°ớc khi ra thß tr°ßng [63] KhoÁng 20% các lo¿i thuác đ°ÿc l°u hành mà không qua bất kỳ thử nghiám nào trên tế bào gan hoặc thử nghiám đác tính với tim trong thßi gian thử nghiám tiền lâm sàng [64] Cuái cùng, khoÁng 5% các lo¿i thuác āng cử viên trong quá trình phát triển có thể trá thành sÁn phẩm đ°ÿc cấp phép [65] Nghiên cāu và chi phí phát triển cao đang dẫn đến giá thuác cao, vì vậy điều quan tráng để phát triển các ph°¡ng pháp để tái °u hóa sự biát hóa thành thāc chāc năng cÿa tế bào gan biát hóa là h°ớng nghiên cāu đ°ÿc nhiều phòng thí nghiám nổi tiếng trên thế giới quan tâm Đồng thßi, chúng ta nên má ráng kiến thāc

về c¡ chế biát hóa và những sai khác giữa các dòng tế bào gan biát hóa và các dòng

tế bào gan phân lập từ ng°ßi sử dāng trong điều kián in- vitro và in vivo, cũng nh°

āng dāng lâm sàng

1.3.2.2 Các hướng biệt hóa tạo tế bào gan

a Nghiên cứu in vivo và in vitro

Năm 2013, nhóm khoa hác Nhật BÁn, t¿i Đ¿i hác quác gia Yokohama thực hián cấy ghép các TBG đa năng đ°ÿc phân lập từ da và máu ng°ßi vào gan chuát Sau đó há nhận thấy các m¿ch máu cÿa TBG ng°ßi kết nái đ°ÿc với các m¿ch máu

trên c¡ thể chuát thí nghiám, và bắt đầu thực hián nhiều chāc năng cÿa các tế bào gan á ng°ßi tr°áng thành [66]

Tháng 10 năm 2015 các nhà khoa hác t¿i Đ¿i hác Jerusalem Hebrew (Israel) t¿o ra b°ớc đát phá mới khi nuôi cấy thành công tế bào gan ng°ßi có chāc năng Kết quÁ nghiên cāu đ°ÿc công bá trên t¿p chí Nature Biotechnology Thành công này có thể thúc đẩy mát lo¿t nghiên cāu và āng dāng liên quan đến gan, từ nghiên cāu đác tính thuác đến viác t¿o ra gan sinh hác nhân t¿o hß trÿ cho bánh nhân chß ghép Đáng tiếc là trong khi gan có thể tái sinh nhanh chóng trong c¡ thể, thì khÁ năng này nhanh chóng mất đi khi các tế bào gan đ°ÿc lấy khßi c¡ thể Đến nay, những nß lực

để tăng sinh tế bào gan ng°ßi trong phòng thí nghiám đã t¿o ra các tế bào ung th° bất tử có chāc năng chuyển hóa kém Nguồn cung cấp tế bào gan ng°ßi khá hiếm hoi và rất khó để tăng sinh chúng mà không làm mất chāc năng Đây là mát trá ng¿i lớn cho phát triển khoa hác, lâm sàng và d°ÿc phẩm Cần có các nghiên cāu tiếp theo giÁi quyết vấn đề này [67]

Cũng trong năm 2015, nhóm nghiên cāu cÿa tiến sĩ Roel Nusse - Đ¿i hác Stanford - Mỹ đã xác đßnh đ°ÿc mát quần thể phát triển h¿t nhân và các tế bào tự đổi mới tiếp giáp với các tĩnh m¿ch trung tâm trong gan Những tế bào ngo¿i vi biểu

hián chỉ thß Tbx3 (T-box 3), là l°ỡng bái, và do đó khác với tế bào gan tr°áng thành,

mà chÿ yếu là đa bái Các tế bào con cháu cÿa các tế bào Tbx3 biát hóa thành tế bào

gan đa bái có thể thay thế tất cÁ các tế bào gan dác theo gan trong quá trình đổi mới cân bằng nái môi (Biological homeostasis) Quần thể cÿa các TBG gan đ°ÿc duy trì

bái các tín hiáu Wnt (các gen cấu trúc liên quan mã hóa tiết ra các protein truyền tín

hiáu) đ°ÿc cung cấp bái các tế bào nái mô trong tĩnh m¿ch trung tâm liền kề [68]

Mặc dù đã có nhiều yếu tá làm tác nhân biát hóa TBGTM thành tế bào gan

đã đ°ÿc khÁo sát C¡ chế chính xác cÿa quá trình biát hóa thành tế bào gan vẫn ch°a đ°ÿc hoàn toàn sáng tß

b Sử dụng hóa chất cảm ứng biệt hóa

Mát sá hormone, cytokine, vitamin, các ion Ca2+ mát sá hóa chất hay sử dāng trong cÁm āng biát hóa tế bào nh° Dexamethason, Indomethacin,

Hydrocortison, TGF- β&với mát hàm l°ÿng và tỷ lá nhất đßnh tùy thuác vào mßi

mát lo¿i tế bào Các hóa chất tác đáng lên tế bào làm tế bào thay đổi sự biểu hián cÿa gen, hoặc đóng mát sá gen đang ho¿t đáng và má mát sá gen ch°a ho¿t đáng

Những thay đổi này dẫn đến tế bào biến đổi theo chiều h°ớng phù hÿp với kích thích,

và sẽ t¿o thành mát kiểu tế bào chuyên biát nào đó Ngoài ra, các nhân tá tăng tr°áng thu nhận từ các dßch mô cũng đ°ÿc xem là chất biát hóa đßnh h°ớng [69]

Tác dāng DMSO đã đ°ÿc đánh giá là mát yếu tá có khÁ năng biát hóa TBG thành tế bào gan Tuy nhiên, viác sử dāng DMSO vẫn có những khác biát trong mát

sá nghiên cāu Đái với TBG phôi, theo Pal và cáng sự (2012), hình thái tế bào có thể thay đổi đáng kể và mát sá gen đặc tr°ng cÿa tế bào gan đ°ÿc biểu hián khi tiến hành sử dāng DMSO nh° mát tác nhân biát hóa [70] Điều đáng chú ý là khi sử dāng kết hÿp DMSO với mát sá yếu tá phiên mã thì sau 21 ngày xử lý thì mát sá chỉ thß đặc tr°ng cÿa tế bào gan đã biểu hián [71] Tuy nhiên cho đến nay vẫn còn thiếu mát ph°¡ng thāc đ¿t hiáu thích hÿp nhất trong viác sử dāng DMSO nh° là mát tác nhân

để biát hóa thành tế bào gan từ TBG cuáng rán

c Biệt hóa bằng các chất nền

Biát hóa bằng các chất nền dựa vào sự t°¡ng tác giữa tế bào và chất nền trong

nuôi cấy tế bào in vitro Tế bào ho¿t đáng nằm trong chất nền ngo¿i bào ECM (Extra

cellular matrix) ECM có chāa các hÿp chất cao phân tử nh° collagen, laminin, fibronectin Ngoài vai trò làm cấu trúc nh° mát giá thể cho các tế bào, ECM còn có vai trò sinh lý nh° mát vi môi tr°ßng cÿa các tế bào Mßi mô khác nhau có thành

phần ECM cÿa riêng nó Do đó, viác bổ sung ECM thích hÿp vào nuôi cấy in vitro

giúp các TBG có thể biát hóa thành các tế bào mong muán [72]

Trong phát triển gan, mát sá yếu tá tăng tr°áng (Grow Factor – GF) và các thành phần cÿa chất nền ngo¿i bào ECM dẫn đến sự biát hóa cÿa tế bào nhu mô gan Nhóm nghiên cāu cÿa Suzuki và cáng sự đã tiến hành các thí nghiám để kiểm tra tác đáng trực tiếp cÿa GF và ECM trong biát hóa TBG thành tế bào gan Kết quÁ cho

thấy các yếu tá tăng tr°áng tế bào gan gây ra quá trình chuyển đổi albumin (ALB),

biát hóa TBG thành tế bào tiền thân gan Sau đó oncostatin M (OSM) đẩy m¿nh sự biát hóa để tryptophan 2-3 dioxygenase (TO) biểu hián trong tế bào gan tr°áng thành Trong quá trình chuyển đổi này, ECM là cần thiết để biát hóa các TBG và tiền chất, nh°ng hiáu āng cÿa chúng chỉ là hß trÿ [73]

Chất nền ngo¿i bào ECM qua trung gian sự khác biát biát hóa TBG phôi ng°ßi thành các tế bào beta tuyến tāy, đã thu đ°ÿc các tế bào chāc năng mà tiết ra insulin đáp āng glucose trong mô hình chuát bß tiểu đ°ßng Tuy nhiên ch°a sáng tß những

tín hiáu sinh hóa và c¡ chế dẫn đến sự biát hóa [74]

T°¡ng tác giữa TBG và chất nền ngo¿i bào ECM là điều kián tiên quyết để gây ra biát hóa t¿o dòng tế bào cā thể và duy trì chāc năng sinh hác cÿa các TBGTM

bằng cách cung cấp mát tập hÿp các chất hóa hác và các tín hiáu cấu trúc Các tế bào trung mô tÿy x°¡ng đ°ÿc nuôi cấy trên há tháng ECM cho thấy mát hình d¿ng trāc

có khÁ năng tăng sinh m¿nh mẽ và mát māc đá āc chế cÿa các lo¿i oxy phÁn āng trong tế bào Những kết quÁ này chāng minh rằng ECM có thể là mát ph°¡ng pháp hiáu quÁ để t¿o thuận lÿi cho sự tr°áng thành cÿa gan

d Biệt hóa bằng tổ hợp các cytokine và hóa chất

Nguồn tế bào gan biát hóa từ các TBG cÁm āng hoặc TBGTM, nguồn TBG hián dián trong các mô dß tiếp cận nh° mô mỡ, máu và tÿy x°¡ng Chúng có các đặc tính giáng nh° TBG, có khÁ năng tự đổi mới và đa d¿ng hóa, bao gồm cÁ các tế bào

gan biát hóa in vitro [75] Trong hầu hết các ph°¡ng pháp biát hóa, TBGTM có thể

đ°ÿc đßnh h°ớng biát hóa thành tế bào có chāc năng gan thông qua các giai đo¿n biát hóa (quá trình biát hóa gây ra bái các tác nhân FGF, HGF và các thành phần khác) và giai đo¿n tr°áng thành tế bào gan (gây ra bái OSM và dexamethasone) để t¿o thành mát kiểu hình đặc tr°ng cÿa tế bào gan ch°a tr°áng thành [76]

Trong điều kián in vitro, các tác nhân trong tr°ßng hÿp tế bào đ°ÿc biát hóa

bái các cytokine chẳng h¿n nh° yếu tá tăng tr°áng tế bào gan (HGF), yếu tá tăng tr°áng tế bào biểu bì (EGF), yếu tá tăng tr°áng nguyên bào sÿi (FGF), OSM, yếu tá tăng tr°áng biến đổi (TGF), yếu tá tăng tr°áng giáng insulin (IGF), bFGF, yếu tá āc chế b¿ch cầu (LIF) và protein hình thái x°¡ng (BMP), có thể ho¿t hóa tế bào để biát hóa TBGTM thành tế bào gan [77] Vì các lo¿i cytokine và các hÿp chất hóa hác đã cho thấy những tác đáng nhất đßnh đái với sự biát hóa cÿa TBGTM, mát sá c¡ chế cÿa cytokine và sự kết hÿp các giao thāc cÿa cytokine đã đ°ÿc khám phá, trong khi những lo¿i khác vẫn ch°a rõ ràng [78]

Yếu tá tăng tr°áng tế bào gan (HGF) đóng vai trò là tín hiáu khái đầu cÿa quá trình tái t¿o gan, HGF liên quan đến sự phát triển nái tiết trong quá trình phát triển phôi thai [77]

Oncostatin M (OSM) là thành viên phân há cÿa IL-6, OSM h¿n chế ho¿t đáng cÿa các tế bào u ác tính A375 và có khÁ năng kích thích sự tr°áng thành cÿa các tế bào nhu mô gan và chấm dāt chāc năng gan phôi thai

Yếu tá āc chế b¿ch cầu (LIF) là mát thành viên khác cÿa IL-6, liên quan đến viác thu nhận các đặc điểm tế bào gan trong quá trình biát hóa từ tế bào trung mô tÿy x°¡ng nh° protein và biểu hián gen cÿa các dấu hiáu gan Protein hình thái x°¡ng đ°ÿc xác nhận là có liên quan đến sự điều hòa tế bào cÿa sự tăng tr°áng, sinh sÁn,

biát hóa và apoptosis cÿa tế bào gan Mát thành phần khác là BMP-2,7 đóng vai trò quan tráng trong viác giúp TBGTM t¿o ra các yếu tá phiên mã nh° Runx-2 và Osterix

[78]

Mát hÿp chất hóa hác quan tráng là dexamethasone (DEX), t¿o ra sự biểu hián cÿa yếu tá h¿t nhân 4 và CCAAT chất tăng c°ßng protein alpha, hai yếu tá này thuác về yếu tá h¿t nhân tế bào gan và là yếu tá phiên mã quan tráng giúp tế bào biát hóa thành tế bào có chāc năng gan [78] Sự biểu hián cÿa các phân tử āc chế tăng

tr°áng tế bào gan nh° thā thể chemokine CXC, cyclooxygenase 2 và yếu tá gây thiếu

oxy bß āc chế bái DEX Quá trình ho¿t hóa TBGTM b°ớc vào con đ°ßng biát hóa t¿o thành tế bào gan đ°ÿc mô tÁ á hình 1.11 Mát sá phân tử nhß có thể thúc đẩy sự biát hóa cÿa TBGTM thành tế bào giáng tế bào gan đ°ÿc ho¿t hóa bái các chất có cấu trúc phân tử nhß, các cytokine Sau đó, các chất nh° HGF, và OSM& tiếp tāc thúc đẩy quá trình thành thāc tế bào gan Cuái cùng các thành phần nh° DAPT và A8301 ngăn chặn sự biát hóa cÿa tế bào tiền thân gan thành các tế bào chāc năng gan [79]

Hình 1.8. Các phân tử nhß t¿o tế bào có chāc năng gan hoặc thúc đẩy sự tr°áng

thành cÿa tế bào giáng với tế bào gan [78]

Trong sá tất cÁ các cytokine và các yếu tá tăng tr°áng này, HGF, EGF, TGF

và aFGF là những cytokine đ°ÿc sử dāng nhiều nhất để nghiên cāu biát hóa t¿o tế bào gan Tuy nhiên, HGF đ°ÿc xem là cytokine quan tráng cho quá trình biát hóa trong giai đo¿n phát triển sớm cÿa TBGTM ng°ßi thành tế bào gan [75] Các loài khác nhau, nguồn phân lập khác nhau cÿa cÿa TBGTM cũng đ°ÿc đánh giá là tiếp nhận các tín hiáu biát hóa khác nhau [80] Viác kích thích cytokine tái °u, liều l°ÿng, thßi gian và sự kết hÿp để có hiáu quÁ biát hóa cao nhất từ các TBGTM nên đ°ÿc tổ chāc khÁo sát theo các nguồn và lo¿i TBG (nh° TBG phôi, TBGTM tÿy x°¡ng hoặc TBG gan) [75] Hián nay công thāc các yếu tá tăng tr°áng cytokine/tăng tr°áng tái

°u đ°ÿc kết hÿp nhau t¿o ra tế bào gan vẫn còn á giai đo¿n phát triển ch°a hoàn thián [79]

e Đồng nuôi cấy với các tế bào đã biệt hóa

Khi thực hián đồng nuôi cấy, TBG và tế bào đã biát hóa t°¡ng tác mật thiết với nhau, dẫn đến sự truyền các tín hiáu phân tử mát cách hiáu quÁ gây ra sự biát hóa á TBG [72] Nhóm nghiên cāu cÿa Stecklum đã sử dāng TBG máu cuáng rán đồng nuôi cấy với tế bào alpha gan chuát AML12 [81] So sánh hiáu quÁ mẫu mô tế bào bằng cách t°¡ng tác tế bào trực tiếp hoặc bái các yếu tá hòa tan (soluble factors)

trong tế bào gan Nhóm nghiên cāu đã bắt ch°ớc in vitro cấy ghép tiền lâm sàng sử

dāng tế bào cÿa con ng°ßi trong chuát Kết quÁ không có sự thay đổi lớn trong tế bào nh° các hình thái tế bào ngo¿i trừ có sự hián dián cao h¡n mát sá cấu trúc quan

sát Đồng nuôi cấy dẫn đến sự biát hóa, tăng biểu hián cÿa SOX17, Cx32 và Cx43, cũng nh° CK8 biểu mô và CM19 Nhóm tác giÁ cũng chỉ ra rằng để từng b°ớc nghiên

cāu cÁm āng biát hóa tế bào có thể sử dāng ph°¡ng pháp đồng nuôi cấy [81]

f Biệt hóa bằng phương pháp chuyển gen

Ph°¡ng pháp này th°ßng đ°ÿc sử dāng để điều hòa sự biát hóa TBG phôi Đ°a gen cần chuyển vào tế bào nhằm bổ sung mát sá gen ho¿t đáng vào há gen cÿa TBG phôi, khái đáng sự biát hóa TBG theo con đ°ßng t¿o thành tế bào chuyên hóa mong muán

Mát sá nghiên cāu biát hóa các TBG cuáng rán thành tế bào gan đã má ra hy váng cho hàng trăm triáu bánh nhân x¡ gan và ung th° gan [82], [83] Đã có công

bá biát hóa thành tế bào gan từ TBGTM phân lập từ cuáng rán do Ren và cáng sự tiến hành (2010) [39], [84] Mặc dù vậy, vẫn còn có nhiều điều ch°a rõ về c¡ chế

biát hóa thành tế bào gan từ TBGTM cuáng rán Gen HNF4α là mát trong sá các

yếu tá phiên mã đang đ°ÿc tập trung nghiên cāu bên c¿nh viác thay đổi môi tr°ßng biát hóa sử dāng mát sá tác nhận nh° yếu tá sinh tr°áng nh° FGF (Fibroblast Growth Factor) hoặc DEX,&

Hầu hết trong c¡ thể đáng vật, từ đáng vật biển cho đến c¡ thể ng°ßi đều tìm

thấy HNF4, đây là mát trong những receptor có tính bÁo thÿ rất cao trong nhân tế

bào [85], [86] Trong tuyến tāy, ruát kết, ruát non, gan, thận đều thấy biểu hián Protein HNF4α, tuy nhiên biểu hián cÿa protein này chiếm đa sá trong gan [87]

KhoÁng 100 gen trong đó có hepatocyte factor 1-alpha, mát yếu tá phiên mã điều hòa

sự biểu hián cÿa mát gen liên quan đến gan đ°ÿc biểu hián do sự kiểm soát cÿa Protein

đ°ÿc mã hóa bái gen HNF-4α Trong sự phát triển cÿa gan, thận và tuyến ruát, mát trong những gen đóng vai trò quan tráng đ°ÿc biết đến là gen HNF-4α Trong quá trình đßnh h°ớng biát hóa thành tế bào gan, Gen HNF-4α đã đ°ÿc chāng minh có thể

ho¿t đáng nh° mát gen chi phái trong các tác nhân phiên mã [6]

Mát sá nghiên cāu cho thấy sự biểu hián quá māc cÿa HNF4α trong há tháng

nuôi cấy TBG có thể đÁm bÁo cho sự cÁm āng biát hóa thành tế bào gan và các chāc năng cÿa tế bào giáng nh° tế bào gan Nhß đó, các tế bào có biểu hián tổng hÿp

HNF4α sẽ kích ho¿t các gen đặc hiáu đßnh h°ớng tế bào gan khác và tăng c°ßng

tr¿ng thái biát hóa cÿa TBGTM [88] Tuy nhiên, ch°a có công bá chính thāc nào về

viác āng dāng tác nhân HNF4α để biát hóa TBG cuáng rán thành tế bào gan cho đến

nay

1.3.2.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc trong biệt hóa và điều trị các bệnh lý về gan tại Việt Nam

T¿i Viát Nam, năm 2013, Đoàn Chính Chung và cáng sự đã biát hóa TBGTM

từ màng cuáng rán thành tế bào gan sử dāng ph°¡ng pháp biát hóa dựa vào sự thay đổi môi tr°ßng nuôi cấy Nhóm tác giÁ đã chāng minh tế bào gác từ màng cuáng rán

có khÁ năng biát hóa thành tế bào có chāc năng gan, cā thể tế bào sau biát hóa biểu hián các chỉ thß ALB, AFP, CK18, CK19 và có khÁ năng dự trữ glycogen sau 21 ngày Tuy nhiên, sự lựa chán các yếu tá bổ sung vào môi tr°ßng và thßi gian cÁm āng cần đ°ÿc xem xét để tăng hiáu quÁ biát hóa [89]

Năm 2014, Nguyßn Thß Kim Nguyền và cáng sự khÁo sát khÁ năng biát hóa

cÿa TBGTM bằng cách bổ sung hóa chất vào môi tr°ßng biát hóa, nhóm nghiên cāu

đã biát hóa đ°ÿc tế bào giáng tế bào gan in vitro từ TBG thu nhận từ mô mỡ

(Adipose-Derived Stem Cells-ADSCs) Kết quÁ là tế bào giáng tế bào gan với những biểu hián giáng tế bào nhu mô gan về mặt hình thái có thể đ°ÿc biát hóa từ ADSCs, ngoài ra

các tế bào này cũng có khÁ năng dự trữ glycogen và biểu hián các gen: CK18, CK19,

albumin, α-fetoprotein khác biát so với nhóm đái chāng [90]

Năm 2015, Tr°¡ng Thß HÁi Nhung cùng nhóm nghiên cāu t¿i Đ¿i hác Khoa hác Tự nhiên – Đ¿i hác Quác gia Thành phá Hồ Chí Minh đã nghiên cāu điều trß thực nghiám bánh x¡ gan trên mô hình chuát bß x¡ gan sử dāng liáu pháp TBG TBGTM đ°ÿc phân lập và tăng sinh từ mô mỡ chuát, sau đó đ°ÿc cÁm āng và biát hóa thành tế bào gan bằng hóa chất và dßch chiết tế bào gan Kết quÁ cho thấy, TBGTM phân lập từ mô mỡ chuát có khÁ năng biát hóa thành tế bào giáng tế bào gan, sử dāng TBGTM với liều 5x105 tế bào/con cho hiáu quÁ điều trß x¡ gan trên chuát [91] Tiếp theo kết quÁ nghiên cāu này, Nguyßn Minh Th° và cáng sự (2021) cũng đã tiến hành thí nghiám tiêm TBGTM từ dây rán với liều 5x105 tế bào/con trên chuát tổn th°¡ng gan do tắc mật Sau 12 ngày điều trß, so với nhóm đái chāng tiêm PBS, chuát tiêm TBGTM có tỷ lá sáng cao (100%), giÁm tổn th°¡ng gan, giÁm dián tích x¡ gan thông qua dián tích ho¿i tử trung bình là 7,529%, sự tích lũy collagen trong gan trung bình là 1,968% và tỷ lá d°¡ng tính cÿa protein α-SMA là 1,427% [92]

Trong nghiên cāu lâm sàng, năm 2021, nhóm tác gỉÁ Đào Tr°ßng Giang t¿i hác vián quân y cùng các bác sĩ bánh vián Trung °¡ng quân đái 108 đã đánh giá kết quÁ cÿa ghép tế bào gác tÿy x°¡ng tự thân để điều trß x¡ gan mất bù do viêm gan B

á 29 bánh nhân và điều trß phác đồ chung cho bánh nhân x¡ gan Thu thập 300ml dßch tÿy x°¡ng, sau đó lác khái tế bào đ¡n nhân, truyền vào qua qua đáng m¿ch gan Các bánh nhân đ°ÿc theo dõi trong 12 tháng và đánh giá kết quÁ dựa trên xét nghiám cận lâm sàng và thang điểm theo dõi tình trang x¡ gan (Child- Pugh, MELD ) t¿i thßi điểm 6 và 12 tháng Kết quÁ ghép tế bào gác á bánh nhân x¡ gan b°ớc đầu cÁi thián chāc năng gan, điểm Child- Pugh, có thể mang l¿i hiáu quÁ á bánh nhân x¡ gan mất

bù do virus viêm gan B Tuy nhiên vẫn cần những nghiên cāu sâu h¡n để cân bằng hiáu quÁ sự an toàn với sự đổi mới cÿa nghiên cāu cấy ghép tế bào gác nhằm điều trß hiáu quÁ bánh gan giai đo¿n cuái [93]

Với những °u điểm cÿa tế bào gác trung mô cuáng rán mang l¿i và những lÿi thế cÿa há tháng Tet-On so với các há tháng biểu hián gen đ°ÿc điều hòa khác Đề tài nghiên cāu này cÿa chúng tôi sẽ cung cấp đầy đÿ các thông tin về khÁ năng biát hóa t¿o tế bào có chāc năng gan từ nguồn TBGTM phân lập từ cuáng rán trẻ s¡ sinh

Đồng thßi đề tài là nghiên cāu đầu tiên biểu hián quá māc gen HNF4α bằng viác sử

dāng há tháng Tet-ON để biát hóa TBGTM cuáng rán thành tế bào biểu hián mát sá đặc tr°ng cÿa tế bào gan Kết quÁ cÿa đề tài sẽ góp phần cung cấp thông tin về khÁ năng biát hóa t¿o tế bào có chāc năng gan để từ đó có thể āng dāng kết quÁ vào h°ớng t¿o tế bào gan, thử nghiám d°ÿc phẩm cũng nh° má ráng nghiên cāu á māc đá cao

h¡n về c¡ chế cÿa quá trình biát hóa này, để sử dāng trong điều kián in vitro và in

vivo, cũng nh° āng dāng lâm sàng

Ch°¢ng 2 VÀT LIàU VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU

2.1 S¢ đã nghiên cąu

Hình 2.1.S¡ đồ nghiên cāu