Phân tích trình tự Đoạn gen coi Ở một số loài côn trùng Đặc hữu việt nam Định hướng xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch adn

Phân tích trình tự Đoạn gen coi Ở một số loài côn trùng Đặc hữu việt nam Định hướng xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch adn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Ngọc Ly

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN COI

Ở MỘT SỐ LOÀI CÔN TRÙNG ĐẶC HỮU VIỆT NAM

ĐỊNH HƯỚNG XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU MÃ VẠCH ADN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Ngọc Ly

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN COI

Ở MỘT SỐ LOÀI CÔN TRÙNG ĐẶC HỮU VIỆT NAM

ĐỊNH HƯỚNG XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU MÃ VẠCH ADN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Nguyễn Văn Sáng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu thực tế của cá nhân tôi, được

thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Văn Sáng

Trong luận văn, những thông tin tham khảo từ những công trình nghiên cứu

khác đã được tác giả chú thích rõ nguồn

Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là

trung thực và chưa từng được công bố dưới bất cứ hình thức nào Tôi xin chịu trách

nhiệm về công trình nghiên cứu của mình

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

HỌC VIÊN

Hà Ngọc Ly

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Sáng –

giảng viên tại Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học Tự

nhiên, ĐHQGHN - người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp tôi tiếp thu được

nhiều kiến thức về kỹ thuật chuyên môn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình thực hiện luận văn này Những chỉ dẫn của thầy là định hướng

quan trọng giúp tôi hoàn thành tốt luận văn cao học và bước đi tự tin trên con đường

khoa học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn Sinh học

thực nghiệm nói chung, các thầy cô trong Bộ môn Di truyền học nói riêng và các

thầy cô công tác tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Cảm ơn

các thầy cô đã hết lòng giảng dạy những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt

hai năm học vừa qua

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn Thị Thu Huyền, các

anh chị và các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử tế bào đã dành nhiều

kinh nghiệm nghiên cứu của mình để giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn

thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân – những

người đã luôn bên cạnh, tạo điều kiện và động viên, cho tôi động lực để phấn đấu

trong quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này

Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi đề tài “Xây dựng cơ sở dữ liệu về phân loại

học, phân bố của một số loài côn trùng đặc hữu ở Việt Nam phục vụ bảo tồn đa

dạng sinh học và phát triển bền vững” của bộ Khoa học và Công nghệ với mã số

ĐTĐL.CN-65/19

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

HỌC VIÊN

Hà Ngọc Ly

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC 1

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC BẢNG BIỂU 4

DANH MỤC HÌNH ẢNH 5

MỞ ĐẦU 6

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 Phân loại học 8

1.1.1 Giới thiệu về phân loại học 8

1.1.2 Phân loại học truyền thống và phân loại học hiện đại 9

1.2 Chỉ thị phân tử trong phân loại học 11

1.2.1 Tổng quan về mã vạch ADN 11

1.2.2 Ứng dụng của mã vạch ADN trong tìm kiếm và định danh loài 11

1.2.3 Tổng quan về gen COI – mã vạch trong phân loại động vật 14

1.2.4 Ứng dụng gen COI là mã vạch trong phân loại côn trùng 14

1.3 Tổng quan thực trạng nghiên cứu côn trùng 15

1.3.1 Tình hình nghiên cứu phân loại côn trùng trên thế giới 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu phân loại côn trùng ở Việt Nam 16

1.3.3 Tình hình nghiên cứu bộ Cánh màng ở Việt Nam 18

1.4 Cơ sở phương pháp phân tích cây phát sinh chủng loại 19

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu, thiết bị, hoá chất 23

2.1.1 Vật liệu 23

2.1.2 Thiết bị và hoá chất 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số 25

2.2.2 Thiết kế mồi đặc hiệu nhân một phần đoạn gen COI của côn trùng 26

2.2.3 Khuếch đại gen COI bằng phản ứng PCR 27

2.2.4 Tinh sạch và giải trình tự đoạn gen COI 28

2.2.5 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1.Kết quả thiết kế mồi 31

3.2 Kết quả điện di ADN tổng số 31

3.3 Kết quả đo quang phổ hấp phụ 33

3.4 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR 34

3.5 Kết quả giải trình tự 36

3.6 Kết quả phân tích và xây dựng cây chủng loại phát sinh 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

COI Chocytochrome c oxidase subunit I

Nad5 NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 5

RbcL Ribulose-bisphosphate carboxylase gene

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1: Danh sách 21 mẫu côn trùng thuộc bộ Hymenoptera 23

Bảng 2: Thiết bị và dụng cụ 24

Bảng 3: Thành phần Mastermix 2X cho phản ứng PCR 28

Bảng 4: Trình tự một số các cặp mồi tham khảo trong nghiên cứu 31

Bảng 5: Bảng số liệu đo quang phổ hấp phụ của các mẫu nghiên cứu 33

Bảng 6: Kết quả BLAST trình tự gen COI của 21 loài côn trùng đặc hữu

trong nghiên cứu 37

Bảng 7: Sự phân loại trên cây phát sinh họ Hymenoptera 41

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1: Phân loại các loài Kiến 8

Hình 2: Phân loại lớp Bò sát dựa vào đặc điểm hình thái 10

Hình 3: Ứng dụng của mã vạch ADN trong tìm kiếm và định danh loài 13

Hình 4: Phân loại một số loài côn trùng ở Việt Nam 17

Hình 5: Phân loại một số loài Cánh màng ở Việt Nam 19

Hình 6: Một cây phát sinh chủng loại các dòng chính của Chrysidoidea

xây dựng từ trình tự bộ gen ty thể 20

Hình 7: Quy trình nghiên cứu mẫu côn trùng trong PTN sinh học phân tử 25

Hình 8: Sơ đồ thiết kế mồi 27

Hình 9: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 28

Hình 10: Kết quả điện di ADN tổng số 11/21 mẫu thuộc bộ thuộc bộ

Hymenoptera 32

Hình 11: Kết quả điện di ADN tổng số 10/21 mẫu thuộc bộ thuộc bộ

Hymenoptera 32

Hình 12: Kết quả nhân đoạn gen COI của 4/21 mẫu nghiên cứu với cặp mồi LCO1490/HCO2198 34

Hình 13: Kết quả nhân đoạn gen COI của 3/21 mẫu nghiên cứu với cặp mồi MLepF/HCO2198 35

Hình 14: Kết quả nhân đoạn gen COI của 6/21 mẫu nghiên cứu với cặp mồi ColeLCO1490/ColeHCO2198 35

Hình 15: Kết quả nhân đoạn gen COI của 8/21 mẫu nghiên cứu với cặp mồi ColeLCO1490/HCO2198 36

Hình 16: Kết quả gióng hàng trình tự của 21 mẫu côn trùng thuộc

Bộ Cánh màng 40

Hình 17: Cây phát sinh chủng loại của 21 mẫu côn trùng thuộc họ Vespidae,

Bộ Cánh màng 42

MỞ ĐẦU

Theo ước tính, trên trái đất có khoảng 5,5 triệu loài côn trùng [1] Tuy nhiên, cho đến nay, chỉ khoảng 20% các loài côn trùng đã được các nhà khoa học trên thế giới mô tả [1] Điều này chỉ ra rằng, việc phân loại và mô tả theo các phương pháp truyền thống gặp phải rất nhiều khó khăn, thiếu chuyên gia, thời gian phân loại mẫu lâu dài Điều này càng thúc đẩy việc hiện nay phải phát triển mạng lưới phân loại học toàn cầu để đồng bộ dữ liệu hình thái, sinh thái, phân bố… với dữ liệu sinh học phân tử của loài Ứng dụng thành tựu của sinh học phân tử, phân loại học cũng đề xướng một phương pháp phân loại mới: Xác định các loài dựa trên đặc điểm trình tự ADN nucleotide của một đoạn gen đặc trưng Trong đó, ở động vật phổ biến nhất là

gen Cytochrome oxidase I (COI) được coi như dấu hiệu đặc trưng cho loài (có thể

coi như “dấu vân tay” của loài) [31] Đây là vùng gen liên quan đến quá trình trao đổi chất của tất cả các loài sinh vật, nhưng nó lại có trình tự ADN biến đổi đặc trưng ở mỗi loài khác nhau Bằng phương pháp này, việc xác định các loài trở nên nhanh, chính xác và ít tốn kém hơn phương pháp hình thái

Việt Nam là điểm nóng về đa dạng sinh học vì vậy vẫn còn rất nhiều loài côn trùng chưa được phát hiện và nghiên cứu Trên khắp vùng lãnh thổ của Việt Nam từ trên cạn đến nước nội địa ra tới vùng biển, đảo các kiểu hệ sinh thái tự nhiên rất đa dạng Do có tính chất đặc thù về hệ sinh thái nên khu hệ động, thực vật Việt Nam chứa đựng nhiều loài đặc hữu Mặc dù vậy cho đến nay ở Việt Nam các số liệu, các thông tin về các loài đặc hữu, nhất là các loài côn trùng đặc hữu chỉ xuất hiện trong các công bố riêng lẻ, tản mạn, chưa có nghiên cứu nào đánh giá tổng thể về các loài đặc hữu Mặt khác, các thông tin trước đây về phân loại về các loài côn trùng đặc hữu chủ yếu dựa vào các chỉ tiêu hình thái và sinh thái, có rất ít hoặc hoàn toàn không có các thông tin về các chỉ thị phân tử và đặc biệt là mã vạch ADN Trong xu thế phát triển mạng lưới phân loại học toàn cầu hiện nay các thông tin về phân loại học, từ hình thái đến sinh học phân tử, phân bố,…là rất cần thiết Đặc biệt các yếu

tố loài đặc hữu sẽ khẳng định tính đa dạng sinh học của quốc gia, bên cạnh đó loài đặc hữu có thể góp phần trong việc khẳng định chủ quyền quốc gia Trên cơ sở kết

quả của nghiên cứu dữ liệu về các loài côn trùng đặc hữu sẽ là mô hình mở rộng phạm vi đối với nhiều nhóm sinh vật khác để góp phần xây dựng được bộ cơ sở dữ liệu về toàn bộ nguồn tài nguyên đa dạng sinh học của Việt Nam Do vậy, cần phải

có các công trình nghiên cứu về chỉ thị sinh học phân tử của các loài côn trùng đặc hữu của Việt Nam

Bộ Cánh màng (Hymenoptera) là một trong những bộ côn trùng lớn nhất tham gia vào hầu hết các hệ sinh thái trên cạn, và có tầm quan trọng sinh thái lớn

Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về chỉ thị gen COI cho các loài côn

trùng đặc hữu thuộc bộ Cánh màng Chính vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài “Phân tích trình tự đoạn gen COI ở một số loài côn trùng đặc hữu Việt Nam định

hướng xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch ADN” Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân tích mẫu vật của một số loài côn trùng đặc hữu của Việt nam được phân loại hình thái thuộc bộ Cánh màng (Hymenoptera) với các nội dung sau:

- Thu thập 21 mẫu côn trùng đặc hữu thuộc bộ Hymenoptera ở Việt Nam được thu ngoài thực địa hoặc đã được lưu trữ tại các Viện, Bảo tàng của Việt Nam

- Tách chiết và lưu trữ ADN tổng số của 21 mẫu côn trùng đặc hữu thuộc bộ Hymenoptera ở Việt Nam

- Thiết kế khoảng 3-4 cặp mồi nhân đoạn gen COI cho các mẫu côn trùng

thuộc bộ Hymenoptera

- Phân tích trình tự gen, xây dựng và đánh giá cây phát sinh chủng loại của

21 mẫu côn trùng thuộc bộ Hymenopreta

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Phân loại học

1.1.1 Giới thiệu về phân loại học

Phân loại học là quá trình các nhà khoa học nhóm các sinh vật sống dựa trên mức độ giống nhau của chúng nhằm phản ánh sự liên quan tiến hóa của các sinh vật

và các nhóm sinh vật Phân loại học động vật gắn liền với lịch sử phát triển của toàn

bộ tri thức về động vật của con người, xuất phát từ nhu cầu phân loại và nhận biết động vật để sử dụng trong đời sống Trong lịch sử, sự giống nhau được xác định bằng cách kiểm tra các đặc điểm vật lý, hóa học Theo truyền thống những đặc điểm này có thể quan sát bằng hình thái nhưng với sự ra đời và phát triển của giải trình tự gen, trình tự ADN và các dấu hiệu phân tử cũng được sử dụng để phân loại, định danh các loài

Hình 1: Phân loại các loài Kiến [10]

Nhiệm vụ cơ bản của phân loại học là phát hiện, mô tả, đặt tên và sắp xếp sinh vật thành hệ thống phân loại, giúp chúng ta nắm được một cách hệ thống các đặc điểm của sinh vật trong khối lượng rất lớn các sinh vật [3] Cũng nhờ hệ thống phân loại, chúng ta có thể dự đoán được vị trí của sinh vật trong hệ thống phân loại, giúp nghiên cứu và tìm hiểu được con đường tiến hóa của từng nhóm sinh vật Một

ý nghĩa thực tiễn quan trọng khác là nhờ có hệ thống phân loại với hệ thống danh pháp khoa học đặt cho sinh vật đã giúp tránh được nhầm lẫn vì nhiều sinh vật mang tên dân gian, được gọi tên khác nhau ở các vùng khác nhau

1.1.2 Phân loại học truyền thống và phân loại học hiện đại

Phân loại học hình thái là phương pháp phân loại học truyền thống dựa trên

sự tương đồng rõ ràng nhất giữa các loài và đã được đưa ra từ rất lâu trước khi ý tưởng về sự tiến hóa xuất hiện Phân loại học này chủ yếu dựa trên sự khác biệt đặc điểm hình thái các cơ quan, bộ phận, mô của loài Phương pháp phân loại học hình thái có lịch sử lâu đời và nhờ vào phương pháp này mà hệ thống phân loại động vật được hoàn thiện khá đầy đủ Ưu điểm của nó là có thể phân biệt các loài dựa trên sự quan sát các đặc điểm bên ngoài, dễ ứng dụng và thân thiện với nhiều đối tượng Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là sẽ gặp khó khăn khi phân loại các mẫu đang trong giai đoạn phát triển hoặc có các đặc điểm hình thái giống nhau do cùng sinh trưởng và phát triển trong cùng một điều kiện môi trường địa lý hay có nhiều điểm tương đồng do ở mức độ phân loại thấp như loài và dưới loài Không chỉ vậy, phương pháp này thường được sử dụng bởi các chuyên gia hình thái và cần một khoảng thời gian tương đối dài và tốn nhiều công sức Dù còn tồn tại nhiều nhược điểm nhưng không thể phủ nhận tầm quan trọng của phân loại học hình thái trong lĩnh vực phân loại học hiện nay [10]

như bóng bầu dục, ấu

trùng loài muỗi này

 Trứng muỗi Anophel dài khoảng 1mm và

có phao ở hai bên

Sau 2 đến 3 ngày, trứng nở thành ấu trùng nằm song song với mặt nước

Muỗi Culex

Đặc điểm:

 Chiều dài cơ thể từ 4 đến 10mm, có màu nâu sậm tối

 Hai cánh trước của muỗi nằm ngang trên vùng bụng khi ở trạng thái nghỉ

 Trứng của muỗi Culex màu nâu, dài và có hình trụ, nằm thẳng đứng so với mặt nước

và kết thành bè gồm có

300 trứng

Hình 2: Phân loại các loài Muỗi phổ biến dựa vào đặc điểm hình thái [2]

Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp phân loại học truyền thống, hiện nay các nhà khoa học đã xây dựng nhiều phương pháp phân loại học mới, trong đó đặc biệt là phân loại học phân tử

Với sự phát triển của sinh học phân tử vào những năm 1990 cùng với thành công của việc giải trình tự hệ gen, phân loại học phân tử được hình thành Phương pháp phân loại này dựa trên việc phân tích các dữ liệu về gen (ADN) trong hoặc ngoài nhân hoặc cả hệ gen hay các sản phẩm của chúng như protein, enzyme từ đó

giúp định danh và xây dựng mối quan hệ tiến hóa và di truyền giữa các loài [13] Tùy vào mục đích nghiên cứu, có thể lựa chọn một trong các công cụ ADN hay protein Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng gồm: giải trình tự ADN, đa hình các đoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA) đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) hay kỹ thuật nghiên cứu đa hình (isozyme),… Các kỹ thuật này đã được ứng dụng thành công trong việc phân loại, định danh và xác định mối quan hệ tiến hóa của nhiều loài sinh vật và ngày càng cho thấy những lợi ích thiết thực [11] So với phân loại học truyền thống thì phương pháp này giúp quá trình xác định các loài trở nên nhanh, chính xác và ít tốn kém hơn Mục tiêu chính của phân loại học phân tử là: (i) Xác định mối quan hệ phân cấp giữa các loài hiện có theo mối quan hệ tiến hóa của chúng Các sinh vật có cùng một tổ tiên chung tập hợp lại thành nhóm gần gũi hơn so với những sinh vật có tổ tiên chung xa (ii) Ước tính thời gian phân kỳ giữa các loài, tức là thời gian tồn tại của tổ tiên chung gần nhất

1.2 Chỉ thị phân tử trong phân loại học

1.2.1 Tổng quan về mã vạch ADN

Mã vạch ADN là phương pháp xác định nhanh các loài sinh vật dựa trên sự

đa dạng về trình tự nucleotit của các vùng gen ngắn, được chuẩn hóa [5-7] Để định danh loài cũng như phân tích mối quan hệ di truyền và tiến hóa, các nhà khoa học thường sử dụng chỉ thị phân tử như dấu vân tay ADN (DNA fingerprinting), PCR RFLP (sử dụng enzyme giới hạn kết hợp với lai ADN) và đặc biệt là mã vạch ADN (DNA barcode) [12,14] Nguyên lý chung của các phương pháp này đều dựa trên sự khác biệt của trình tự nucleotide (base nitơ) trong cấu trúc hóa học của ADN để xác định loài

1.2.2 Ứng dụng của mã vạch ADN trong tìm kiếm và định danh loài

Mã vạch ADN được ứng dụng và có tiềm năng trong nhiều ngành khoa học như phân loại học, công nghệ sinh học, công nghệ thực phẩm, pháp y, giúp nhận diện và định danh nhiều mẫu vật [12] DNA Barcode hay mã vạch ADN lần đầu tiên được đề xuất là phương pháp định danh loài bởi Paul Hebert (Đại học Guelph – Cananda) vào năm 2003 [9,4] Mã vạch ADN có thể là vùng gen trong nhân hay ngoài nhân mã hóa hoặc không mã hóa protein Mã vạch này tương tự như mã vạch

sọc đen dán vào các sản phẩm trong siêu thị Tuy nhìn hai sản phẩm bên ngoài giống nhau và không thể phân biệt được bằng mắt thường nhưng khi quét mã vạch lại có thể xác định được chúng

Đến nay, các mẫu sinh vật vẫn thường được nhận diện bằng các đặc tính hình thái bên ngoài hoặc các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hư hỏng các bộ phận ngoài, hoặc mẫu vật chết

đã khiến quá trình nhận diện mẫu vật trở nên khó khăn thậm chí là không thể Trong những trường hợp này mã vạch ADN đã giúp giải quyết bài toán trên vì trình tự ADN dễ dàng thu nhận từ một mẫu mô nhỏ Hơn nữa, mã vạch ADN còn đóng góp thêm một ý nghĩa khác ngoài ý nghĩa giúp định danh mẫu vật, nó còn giúp quá trình phân tích tiến hóa sinh học của loài vật đó trong tự nhiên Những ứng dụng của mã vạch ADN không chỉ nhận diện nhanh các mẫu mà còn mở rộng nghiên cứu sắp xếp theo nhóm những bí ẩn, còn mơ hồ hoặc những loài phức tạp [34] Trong hệ sinh thái, mã vạch ADN rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu mặc dù chúng hầu như không giống nhau về hình thái Phân tích sinh thái học ở thực vật đang diễn ra mạnh mẻ để hiểu được chế độ dinh dưỡng hoặc hướng di cư của động vật Mã vạch ADN giúp xác định loài nhanh chóng và hỗ trợ phân loại hình thái chứ không thay thế hay phủ nhận phân loại hình thái

Mã vạch ADN lại rất hiệu quả trong việc định danh các loài; hơn 95% các loài động vật khác nhau có các trình tự gen mã vạch ADN đặc trưng [22,26] Trong một số trường hợp mà mức độ phân loại chưa được hoàn thiện ở một số loài rất gần nhau trong thang tiến hóa thì việc sử dụng mã vạch kết hợp với các chỉ thị hình thái

đã được nghiên cứu kỹ sẽ giúp phát hiện ra các phân ly mã vạch ADN giữa các loài này và giúp phát triển được các thuật toán cho mã vạch ADN nhằm phát hiện và phân loại các loài trong nhóm nghiên cứu [18] Việc mã vạch ADN liên kết và hiển thị trực tiếp các dữ liệu khác của các chuyên gia phân loại đã xây dựng và mô tả như tên loài, vị trí phát hiện loài, ngày phát hiện, các chỉ thị hình thái, hình ảnh và đặc điểm của loài sinh vật có trên cơ sở dữ liệu càng làm cho việc tra cứu trở lên đơn giản đối với tất cả mọi người, đặc biệt là những người không phải là chuyên gia

về phân loại [27]

Hình 3: Ứng dụng của mã vạch ADN trong tìm kiếm và định danh loài

Để trở thành một mã vạch ADN, cần đáp ứng những yêu cầu sau: (i) Tồn tại phổ biến (có mặt trong nhiều loài sinh vật); (ii) Trình tự có hiệu suất khuếch đại cao

và đặc hiệu; (iii) Khả năng phân biệt được nhiều loài Hiện nay thì nhiều mã vạch ADN ngày càng được sử dụng phổ biến, có thể kể đến chỉ thị nằm trong hệ gen

nhân như: ITS hoặc hệ gen ty thể như: Cytb, COI hay hệ gen lục lạp như: matK, trnK, rbcL Đặc điểm chung của những chỉ thị này là đều có tính đặc hiệu cao và dễ

sử dụng [3,4] Chúng có những đặc tính lý tưởng bao gồm: đủ độ bảo thủ để xác định những sinh vật cùng loài nhưng cũng đủ đột biến để phân biệt các loài; có độ dài thích hợp (không quá ngắn để xuất hiện vị trí đa hình giữa các taxon, không quá dài để thuận lợi trong quá trình giải trình tự); vị trí mồi bảo tồn cao, ADN được khuếch đại và giải trình tự có độ tin cậy cao

Vào tháng 4 năm 2004, Hiệp hội Mã vạch sự sống (CBOL) được thành lập với sự hỗ trợ từ Quỹ Sloan, một tổ chức từ thiện do General Motors thành lập Nghiên cứu mã vạch ADN đã được hỗ trợ bởi Hệ thống Dữ liệu Mã vạch sự sống (BOLD) Đây là một nguồn tài nguyên trực tuyến có sẵn cho cộng đồng khoa học, cho phép nhà nghiên cứu thực hiện liên hết giữa các thông tin khác nhau trên toàn thế giới, lưu trữ thông tin về các nhóm khác nhau được nghiên cứu và xác định khi

có cùng chung một đơn vị phân loại [21]

1.2.3 Tổng quan về gen COI – mã vạch trong phân loại động vật

Ở động vật, vùng ADN được sử dụng làm mã vạch phổ biến nhất là vùng gen

mã hóa chocytochrome c oxidase subunit I gọi tắt là COI, đây là vùng gen liên quan

đến quá trình trao đổi chất của tất cả các loài sinh vật, nhưng nó lại có trình tự ADN biến đổi đặc trưng ở mỗi loài khác nhau [17] Ở hầu hết các loài động vật có mối

quan hệ họ hàng gần gũi với nhau thì mức độ khác biệt về trình tự gen COI thường

lớn hơn 4% [2] Điều này tạo ra khoảng cách mã vạch giữa các cá thể cùng loài và các cá thể khác loài, giúp phân biệt và định danh chính xác khi sử dụng mã vạch

vùng gen COI Sau này, các kết quả nghiên cứu trên nhiều nhóm sinh vật cho thấy

có những vùng gen khác cũng có thể được lựa chọn làm mã vạch ADN như vùng

gen rbcL, matK, ITS ( thường được sử dụng trên thực vật, nấm )

Việc lựa chọn những đoạn gen đặc trưng để làm mã vạch và kết hợp các đoạn mã vạch ADN với nhau là rất cần thiết, giúp phân biệt các loài tốt hơn, đặc biệt là các loài có quan hệ họ hang gần gũi với nhau Do có tính bảo thủ cao, vùng

gen COI đã đạt được nhiều thành công lớn trong việc phân loại các loài sinh vật Bên cạnh đó, kích thước đoạn trình tự gen COI được sử dụng khoảng 659 bp là đủ

ngắn để có thể giải trình tự một cách nhanh chóng với giá thành rẻ, nhưng cũng đủ

dài để xác định đa dạng di truyền giữa các loài sinh vật Vùng gen COI ở động vật

hội tụ nhiều ưu điểm cần thiết cho một mã vạch ADN tiêu chuẩn “vàng” [1], do vậy

nó được cho là mã vạch lý tưởng không chỉ động vật mà còn cho nhiều loài sinh vật khác [30,25]

1.2.4 Ứng dụng gen COI là mã vạch trong phân loại côn trùng

Ở côn trùng, mã vạch COI cũng được ứng dụng mạnh mẽ trong hàng loạt các hướng nghiên cứu khác nhau Mã vạch ADN của gen COI được sử dụng để xác

định các loài côn trùng ký sinh trong nông nghiệp Smith và cộng sự (2006) đã sử

dụng mã vạch COI để phát hiện các loài côn trùng ký sinh ở vùng đông bắc Costa

Rica trong đó phát hiện ra 17 loài ruồi ký sinh có thể phân biệt bằng hình thái và 15

loài ruồi ký sinh khó phân biệt dựa trên hình thái Mã vạch ADN của gen COI cũng

được sử dụng hiệu quả trong việc phát hiện các loài côn trùng xâm lấn Scheffer và

cộng sự (2006) đã sử dụng mã vạch ADN của gen COI để nghiên cứu sự bùng phát

của loài ruồi xâm lấn ở Philippins và phát hiện sự có mặt của ba loài Liriomyza Ở côn trùng, việc xác định loài cực kỳ phức tạp do chúng phải trải qua các giai đoạn phát triển rất khác nhau, nhiều khi không thể xác định được về mặt hình thái do thiếu các đặc điểm hình thái đặc trưng và tin cậy Trong những trường hợp này, mã

vạch ADN của gen COI tỏ ra đặc biệt hiệu quả Edwards và cộng sự (2008) đã sử dụng mã vạch của gen COI để phân biệt thành công ba loài côn trùng cánh vảy ăn

kiwi ở New Zealand và có đặc điểm hình thái rất giống nhau Zhang và cộng sự

(2008) đã sử dụng mã vạch ADN của gen COI để nghiên cứu thành công các giai

đoạn phát triển của rệp vừng Việc định loài nhanh các ấu trùng của các loài côn trùng gây hại đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong kiểm soát và khống chế côn trùng gây hại Doskocil và cộng sự (2008) nghiên cứu thành phần loài và sự xuất hiện của

ấu trùng bọ hung (Coleoptera: Scarabaeidae) sử dụng mã vạch ADN của gen COI và

đã đưa ra chiến lược kiểm soát hiệu quả dựa trên kết quả nghiên cứu này

1.3 Tổng quan thực trạng nghiên cứu côn trùng

1.3.1 Tình hình nghiên cứu phân loại côn trùng trên thế giới

Trong thế giới tự nhiên, côn trùng là nhóm động vật thu hút sự quan tâm đặc biệt của con người Theo số liệu điều tra từ 1999-2006 của IUCN: Côn trùng trên thế giới có số loài đã được mô tả là 950.000 loài, chiếm 76,06% tổng số loài động vật và 60,79% tổng số các loài động thực vật, có 1192 loài đã được đánh giá, trong

đó có 623 loài bị đe doạ

Ba ngàn năm trước công nguyên, ở Trung Quốc đã bắt đầu nuôi tằm Gần

400 năm trước công nguyên, Aristote (người Hy Lạp) đã viết về 60 loài côn trùng trong tác phẩm của mình Vào thế kỉ 18 đã có nhiều học giả và công trình nghiên cứu về côn trùng học Năm 1735, Carl Linne (1707-1778) xuất bản cuốn sách nổi tiếng “Systema naturae” đề cập đến 3 lĩnh vực quan trọng của tự nhiên là khoáng vật, thực vật và động vật Ông là người đầu tiên phân loại động vật, trong đó có côn trùng một cách hiện đại Lần xuất bản thứ 10 của sách “Hệ thống tự nhiên” ông đã đưa vào cách gọi tên khoa học các loài sinh vật Trong các công trình của mình, Lamarck (1744-1829) đã có những đóng góp đáng kể cho khoa học côn trùng, đặc biệt trên lĩnh vực phân loại Cuối thế kỉ 18, Pallas (Viện sĩ người Nga) đã nghiên

cứu và viết về thành phần loài côn trùng [13] Vào thế kỉ 19, cùng với sự phát triển của các ngành khoa học khác, côn trùng học đã trở thành một môn khoa học Có rất nhiều người chuyên sâu về côn trùng học và hàng loạt các “Hội côn trùng” được thành lập ở các nước, như ở Pháp (năm 1832), Anh (1833), Nga (1859) Các hội côn trùng giữ vai trò chỉ đạo phát triển côn trùng học ở mỗi nước [13] Từ thế kỉ 20 các lĩnh vực côn trùng học thực nghiệm ra đời, trong đó có côn trùng nông nghiệp, côn trùng lâm nghiệp Ngoài ra, ở Trung Quốc môn “côn trùng Lâm nghiệp” đã chính thức được giảng dạy trong trường đại học Lâm nghiệp từ năm 1952 từ đó việc nghiên cứu về côn trùng được đẩy mạnh [33]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu phân loại côn trùng ở Việt Nam

Trong số các loài côn trùng đã được xác định ở Việt Nam, có khá nhiều loài được xem là loài đặc hữu Nhưng trong thực tế, rất ít công trình nghiên cứu đề cập đến loài đặc hữu theo một cách hệ thống mà các loài đặc hữu thường được thể hiện bằng việc lồng ghép trong các nghiên cứu về khu hệ hoặc đa dạng côn trùng Theo điều số 3 khoản 16 của Luật đa dạng sinh học số 32/VBHN-VPQH thì loài đặc hữu

là loài sinh vật chỉ tồn tại, phát triển trong phạm vi phân bố hẹp và giới hạn trong một vùng lãnh thổ nhất định của Việt Nam mà không được ghi nhận là có ở nơi khác trên thế giới trên cơ sở đó, dựa vào các tài liệu đã công bố, kết quả tổng hợp ban đầu cho đến nay đã có khoảng 485 loài côn trùng được xác định là loài đặc hữu, các loài đặc hữu giữa các bộ côn trùng có sự khác nhau [28]

Trong những năm gần đây, đã có một số nghiên cứu côn trùng ở Việt Nam

sử dụng mã vạch ADN, trong đó hầu hết đều sử dụng gen COI làm mã vạch cho

việc nghiên cứu và phát hiện một số loài côn trùng Các nhà khoa học Mỹ gồm

Wesley và cs đã kết hợp với nhà khoa học Việt Nam sử dụng COI để phát hiện loài

côn trùng cánh dài mới Neopanorpa cucullata [32] Các nhà khoa học Pháp và Việt

Nam đã sử dụng mã vạch ADN nhân (ITS1-5.8S-ITS2) và mã vạch ADN ty thể (cox1, nad5) để nghiên cứu muỗi vằn Aedes albopictus ở Việt Nam [23] Các nhà khoa học Bồ Đào Nha và Việt Nam đã sử dụng ADN (vùng giữa gen tRNAleu-cox2

và gen 16S rRNA) để định loài ong mật châu Á (Apis cerana) và ong mật châu Âu (Apis mellifera) [17]

Bọ rùa – Coccinella septempunctata Bướm trắng – Pieris melete

Nhặn xanh – Lucilia sericata Gián xám – Periplaneta fuliginosa

Hình 4: Phân loại một số loài côn trùng ở Việt Nam [19]

Năm 1897 đoàn nghiên cứu tổng hợp người Pháp tên là “Mission Parie” đã điều tra côn trùng Đông Dương, đến năm 1904 kết quả đã được công bố Về côn trùng đã phát hiện được 1020 loài trong đó có 541 loài thuộc Bộ Cánh cứng, 168 loài Bộ Cánh vảy, 139 loài Chuồn chuồn, 59 loài mối, 55 loài Bộ Cánh màng, 9 loài

Bộ 2 cánh và 49 loài thuộc các bộ khác [8] Năm 1921 Vitalis de Salvza chủ biên tập “Faune Entomologi que de Lindochine” đã công bố thu thập 3612 loài côn trùng [15] Riêng miền Bắc Việt Nam có 1196 loài Sau đó từ năm 1904 - 1942 có rất nhiều công trình nghiên cứu về côn trùng ra đời như Bou-tan (1904), Bee-nier (1906), Braemer (1910), A.Magen (1910), L Duport (1913 - 1919), Nguyễn Công Tiễu (1922 - 1935) [15] Về cây lâm nghiệp chỉ có công trình của Bou-ret (1902) Phạm Tư Thiên (1922) và Vieil (1912) nghiên cứu về côn trùng trên cây bồ đề, giẻ, sồi Từ năm 1954 sau khi hoà bình được lập lại, xuất phát từ nhu cầu sản xuất nông lâm nghiệp việc điều tra cơ bản về côn trùng mới được chú ý Năm 1961 và

1965, năm 1967 và 1968 Bộ nông nghiệp đã tổ chức các đợt điều tra cơ bản xác định được 2962 loài côn trùng thuộc 223 họ và 20 bộ Ngoài ra trong những năm 70 của thế kỉ, nhiều nhà côn trùng học trẻ tuổi được bồi dưỡng, đào tạo ở trong và ngoài nước và đã có những công trình khoa học có giá trị về côn trùng học theo các

hướng khác nhau Trong đó, về hệ thống phân loại học có công trình về mối của Nguyễn Đức Khảm (1971); về bọ rùa của Hoàng Đức Nhuận (1971); về họ Cánh kiến đỏ Laccifridae của Lê Đình Thái (1979), về ong kí sinh họ Scelionidae của Lê Xuân Huệ (1984),…

1.3.3 Tình hình nghiên cứu bộ Cánh màng ở Việt Nam

Bộ Cánh màng (danh pháp khoa học: Hymenoptera) bao gồm các loài như

ong, kiến Tên gọi này là do đặc điểm các cánh màng của chúng, và có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp cổ Các cánh sau của chúng được nối với các cánh trước bằng một chuỗi các móc bám Trên thế giới đã định danh được 150.000 loài thuộc bộ này, và nhiều loài nữa chưa được biết đến Các loài thuộc bộ Cánh màng thường sống trên cây, trong đất và trong cơ thể các loài côn trùng Trong tự nhiên, chúng có nhiều giá trị sử dụng: Một số loài có vai trò thụ phấn cho hoa và cho các sản phẩm quý như mật ong, sáp ong Nhiều loài ký sinh ăn thịt các loài côn trùng khác giúp cho con người phòng trừ sâu hại Tuy nhiên vẫn có một số loài ăn lá, đục thân phá hoại cây cối trong lâm nông nghiệp Chính vì vậy, đã có nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học trên toàn thế giới về Bộ Cánh màng đã được công bố

Trong những năm gần đây, những nghiên cứu về thành phần loài của Bộ Cánh màng được tiến hành ở nhiều khu vực khác nhau trên cả nước, đặc biệt là ở các khu vực Vườn Quốc gia, Khu Bảo tồn thiên nhiên, khu Dự trữ sinh quyển…

Hàng loạt các loài mới cho Việt Nam đã được công bố trong những nghiên

cứu gần đây Có 46 loài ong bắt mồi thuộc 9 giống của họ Ong vàng Vespidae được ghi nhận ở các tỉnh thuộc khu vực Đông Bắc nước ta Trong đó 6 loài Polistes nipponensis, Ropalidia artifex, Ropalidia nigrita, Parapolybia nodosa, Provespa bathelemyi và Vespa ducalis là những ghi nhận mới cho khu vực Đông Bắc Nhóm loài Parapolybia varia gồm 3 dạng loài tạm thời được định danh dưới tên loài Parapolybia varia Có 4 loài Polistes sp 12, Ropaldia sp.2, Vespula sp.1 và Vespula sp.2 chưa được định danh đến tên loài Tổ của loài Polistes nippoensis lần

đầu tiên được phát hiện [20] Năm 2011 đến 2012 có 21 loài ong bắt mồi thuộc họ

Ong vàng Vespidae được ghi nhận ở Vườn Quốc gia Kon Ka Kinh, Gia Lai, trong

đó phân họ Stenogastrinae có hai loài thuộc hai giống, phân họ Polistinae có l4 loài

thuộc bốn giống và phân họ Vespinae có năm loài thuộc hai giống Loài Polybioides gralicis van der Vecht được ghi nhận lại ở Việt Nam sau gần nửa thập

kỷ kể từ lần được ghi nhận đầu tiên Tám loài Polistes sagittarius, Polistes tenebricosus, Ropalidia mathematica, Ropalidia modesta, Ropalidia rufocollaris, Parapolybia indica, Polybioides gralicis, Provespa barthelemyi lần đầu tiên được

ghi nhận ở khu vực Tây Nguyên Ở tại Vườn Quốc gia Cát Bà, Hải Phòng đã xác định được tên của 26 loài kiến trong tổng số 31 dạng loài thuộc 21 giống 5 phân họ

Có 29 loài thu được vào mùa mưa và mùa khô thu được 24 loài Tại Vườn Quốc gia Phong Nha - Kẻ Bàng, cũng đã xác định được 63 loài, trong đó bộ Cánh màng có

16 loài, bộ cánh nửa có 47 loài, đã bổ sung cho khu hệ côn trùng Việt Nam 3 loài:

Melipona vidua thuộc họ Ong mật (bộ Cánh màng), loài Coptosoma signaticolle thuộc họ Plataspidae, loài Momoeocerus impictus thuộc họ Coreidae (bộ Cánh nửa)

Ong bầu – Xylocopa virginica Ong vò vẽ - Vespa orientalis

Hình 5: Phân loại một số loài Cánh màng ở Việt Nam [19]

1.4 Cơ sở phương pháp phân tích cây phát sinh chủng loại

Cây phát sinh chủng loại là một mô hình giả thuyết sử dụng phần mềm để

mô tả mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật, hay mối quan hệ di truyền của một số nhóm loài gần gũi Nó được xây dựng dựa trên sự so sánh các đặc điểm tương đồng

về hình thái hoặc sự tương đồng của các trình tự phân tử giữa các nhóm sinh vật Các nhánh rẽ của cây phản ánh sự tiến hóa của các loài từ loài tổ tiên Bằng cách liên tục đưa ra các giả thuyết, các nhà khoa học cũng đồng thời xây dựng các thuật toán khác nhau cho cây mô hình để mô tả lịch sử tiến hóa thực sự của một nhóm trình tự hoặc sinh vật Tuy vậy, cây mô hình xây dựng được sẽ có những ưu nhược điểm riêng tùy thuộc vào cách lựa chọn mô hình tiến hóa, các phương pháp xây

dựng cây của mỗi phần mềm Có hai dạng: cây không gốc (phản ánh mối liên hệ

giữa các trình tự) và cây có gốc (phản ánh hướng thời gian tiến hóa) [24] Hai chỉ số

quan trọng khi xây dựng cây phát sinh chủng loại bất kỳ:

Chỉ số bootstrap: là tần số xuất hiện của một nhóm (cluster) trên số lần giản

đồ được thiết lập Đơn vị tính là % (phần trăm) Theo Felsenstein (1985) bootstrap

là một công cụ hỗ trợ cho việc xây dựng cây phát sinh loài Chỉ số bootstrap nói lên

độ tin cậy của sự gần gũi các thành viên của nhóm của cây phả hệ

Hình 6: Một cây phát sinh chủng loại các dòng chính của Chrysidoidea

xây dựng từ trình tự bộ gen ty thể [35]

Chỉ số CI (Consistency Index): là tỉ số đo tương thích giữa một cây bất kỳ nào đó trong tổng số các cây được phân tích có tổng số nhánh ít nhất Giá trị CI biến động trong khoảng 1.0 (tương thích tối đa) tiệm cận đến 0 (ít tương thích nhất) Giá trị CI càng lớn thì kết quả có mức độ tin cậy càng cao

• RI (Retention Index): chỉ số thể hiện số lượng tính trạng tương đồng của 2 hay nhiều giống cùng tổ tiên trên cây phân loại

Cây phát sinh chủng loại phân tử nói riêng không thể thực hiện được từ nghiên cứu trực tiếp nên chỉ có thể phỏng đoán dựa vào các dữ liệu trình tự hoặc các dữ liệu phân tử khác Hai phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại phân

tử chính: dựa trên khoảng cách (distance-based method) hoặc dựa trên ký tự (character - based method ) [8] Với các phương pháp ma trận khoảng cách thì khoảng cách giữa mỗi cặp trình tự được tính toán, và tập hợp thành một ma trận (distance matrix) sử dụng để xây dựng cây mô hình Trong khi đó, phương pháp xây dựng cây phát sinh dựa trên ký tự lại cùng lúc so sánh tất cả các trình tự được sắp xếp và chỉ xem xét một ký tự (vị trí dóng hàng) tại đúng thời điểm tính toán để đưa

ra điểm thay đổi cho mỗi mô hình cây phát sinh [30] Theo lý thuyết, cây được xây dựng dựa trên sự xem xét tất cả các con đường tiến hóa có thể xảy ra và chọn ra cây phù hợp nhất Phương pháp này mất nhiều thời gian và khá khó áp dụng trong các trường hợp giả định không phù hợp với dữ liệu phân tử, hơn nữa đặc điểm hay dữ liệu phân tử được sử dụng phải có mức độ biến đổi phản ánh được sự tiến hóa của loài, tốc độ tiến hóa của gen phải như nhau theo cùng một hướng Các phương pháp được sử dụng chính:

Phương pháp hợp lý tối đa (Maximum likelihood): Thuật toán đầu tiên xây dựng cho phân tích sự hợp lý tối đa của dữ liệu trình tự ADN được phát triển bởi Felsenstein Dựa vào phương pháp thống kê trong đó xác suất thay thế được xem xét cho từng cặp nucleotide trong tất cả chuỗi trình tự được so sánh Từ đó có thể xác định chiều dài cành, cây tiến hóa có xác suất cao nhất là cây cuối cùng được chọn Đây là phương pháp tốn nhiều thời gian nhưng có độ tin cậy cao

Bayesian: là một phương pháp thống kê tương tự như Maximum likelihood, tuy nhiên ở đây thông số trong mô hình được xem xét như các biến số ngẫu nhiên

có xác suất thống kê được tính toán dựa trên định lý Bayes Quá trình suy luận sự phân bố hậu nghiệm của cây phân loại sử dụng phương pháp tính toán thống kê của chuỗi Markov (Marko chain Monte Carlo) Phương pháp xây dựng cây cũng dựa trên mô hình thế nucleotide giống như Maximum likelihood

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại: Maximum likelihood để xây dựng cây có tiến hóa phù hợp nhất Để kiểm tra sự tin cậy của cây phát sinh được xây dựng nghiên cứu này sử dụng phương pháp Bootstrap [28] Đây là phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên từ một bộ trình tự, xây dựng lại cây từ các bộ dữ liệu đó và kiểm tra tần suất những phần của cây được lặp lại Giá trị của bootstrap biểu thị mức độ tin cậy của cây được xuất ra Giá trị này lớn hơn hoặc bằng 70% thì được coi là có ý nghĩa thống kê và trên 95% được xem là có độ tin cậy cao [16]

Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) là phần mềm được phát triển để so sánh, phân tích các trình tự ADN và protein, từ đó suy ra cây tiến hóa phân tử dựa trên trình tự một đoạn gen hoặc toàn bộ hệ gen Phần mềm được tích hợp nhiều phương pháp so sánh (clustalW), tính toán khoảng cách, xây dựng cây phát sinh chủng loại (Maximum parsimony, Maximum Likelihood, Distance) phù hợp với nghiên cứu này Hơn nữa, MEGA7 đạt hiệu quả cao trong hoạt động và dung lượng nhớ So sánh 765 trình tự dài 2000bp chỉ mất 43 phút và 1GB dung lượng nhớ

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, thiết bị, hoá chất

2.1.1 Vật liệu

Các mẫu cơ thể nguyên vẹn và các bộ phận cơ thể (đặc biệt là mô cơ các chi của côn trùng) sẽ được thu từ các khu vực Tây bắc, Đông Bắc, Bắc Trung Bộ, Trung Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Nam Bộ và được xử lý nhanh tại chỗ và bảo quản trong cồn tuyệt đối trước khi được vận chuyển về phòng thí nghiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên để bảo quản lâu dài ở tủ lạnh sâu -80 ºC Đây là điều kiện bảo quản mẫu được đánh giá là tốt nhất trong việc đảm bảo chất lượng mẫu cho tất cả các phân tích các đại phân tử sinh học Nghiên cứu này tập trung vào

21 mẫu thuộc bộ Cánh Màng (Hymenopreta) Thông tin chi tiết 21 mẫu trong nghiên cứu được trình bày tại bảng 1 dưới đây

Bảng 1: Danh sách 21 mẫu côn trùng thuộc bộ Hymenoptera

ở Việt Nam thực hiện trong nghiên cứu

2 IEBR-Ves-79 Polistes (Polistella) communalis Nguyen, Vu&Carpenter, 2017

4 IEBR-Ves-83 Zethus angulatus Nguyen & Carpenter, 2017

5 IEBR-Ves-86 Polistes (Polistella) brunus Nguyen & Carpenter, 2017

6 IEBR-Ves-89 Polistes brunetus Nguyen & Kojima, 2014

7 IEBR-Ves-92 Polistes curcipunctum Nguyen, Kojima & Saito, 2011

8 IEBR-Ves-95 Eustenogaster vietnamensis Saito, 2009

9 IEBR-Ves-97 Polistes longus Nguyen & Carpenter, 2019

10 IEBR-Ves-98 Stenodyneriellus capillus Nguyen, 2019

12 IEBR-Ves-119 Pseudozumia cucphuongensis Nguyen, 2020

14 IEBR.Ves 201 Euodynerus dantici violaceipennis Giordani Soika, 1973

15 IEBR.Ves 202 Antodynerus limbatus (de Sausure, 1852)

16 IEBR.Ves 203 Eumenes labiatus sinicus Giordani Soika, 1941

17 IEBR.Ves 204 Calligaster himalayensis (Cameron, 1904)

18 IEBR.Ves 205 Symorphus laoticus Guisenleitner, 2010

19 IEBR.Ves 206 Delta conoideum (Gmelin, 1790)

20 IEBR.Ves 207 Pseumenes d.depressus (de Saussure, 1855)

21 IEBR.Ves 208 Phimenes flavopictus continentalis (Zimmermann, 1931)

2.1.2 Thiết bị và hoá chất

Tất cả các thiết bị , máy móc đều được thực hiện tại Trung tâm Khoa học Sự sống, Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Phòng thí nghiệm Di truyền, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Bảng 2: Thiết bị và dụng cụ

Bể điện di ngang Mupid-exU Advance, Nhật Bản

Hóa chất trong nghiên cứu được cung cấp bởi các hãng uy tín: Qiagen, iNtRON, Sigma… bao gồm:

 Tách chiết ADN: Proteinase K (20 mg/ml) (Qiagen), Tris-base (Sigma), SDS, NaCl, EDTA (Merk), Phenol, Chloroform, Isoamyalcohol, NaOAC, Nước vô trùng và Ethanol 100% (Merk)

 Phản ứng PCR: 2x PCR Master mix Solution (i-Taq) (iNtRON), DDW…

 Phương pháp điện di: Agarose, Tris-base (Sigma), EDTA (Merk), Maker 100bp, Red safe solution, và 6X Loading Buffer

 Làm sạch các sản phẩm PCR: MEGAquick-spin TM Total Fragment DNA Purification Kit (iNtRON)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 7: Quy trình nghiên cứu mẫu côn trùng trong PTN sinh học phân tử

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số

Mẫu tách chiết ADN tổng số được lấy ra từ phần chân của các cá thể côn trùng thu thập từ thực địa và bảo quản trong dung dịch cồn 70% Cắt nhỏ mẫu để bay hết cồn ở nhiệt độ phòng trước khi chuyển sang một ống eppendorf mới đã ghi nhãn Mẫu sau đó được ly giải bằng dung dịch lysis bufer bao gồm các thành phần: 0,5% SDS; 0,01 M Tris HCl pH 8; 0,1 M EDTA pH 8; 0,05 M NaCl, chú ý buffer lấy ra khỏi tủ 4 độ để tan hoàn toàn trước khi bổ sung vào mẫu Bổ sung thêm 15 μl Proteinase K (20 mg/ml) vào dung dịch và trộn đều rồi ủ ở nhiệt độ 56ºC ít nhất 2 giờ cho đến khi mẫu tan hết, 30 phút kiểm tra và đảo mẫu một lần

Dung dịch sau khi ly giải sử dụng phương pháp tách chiết phenol – chloroform (Sambrook, 2001) Bổ sung 300 μl phenol vào dung dịch ly giải đảo đều hỗn hợp khoảng 3 phút sau đó chờ cho dung dịch tách lớp Protein và các thành phần hữu cơ cần loại bỏ bị hòa tan trong lớp dung dịch phenol ở pha bên dưới, đem ly tâm 13000 rpm, 5 phút thu phần dung dịch chứa ADN (ở pha trên) chuyển sang 1 ống eppendorf 1.5 ml mới đã ghi nhãn tương ứng Thêm 300 μl dung dịch cloroform : Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) vào ống chứa dịch vừa thu được để loại bỏ sự có mặt của phenol

cũng như protein còn thừa (nếu có), đảo đều hỗn hợp khoảng 3 phút đem ly tâm

13000 rpm, 5 phút thu phần dịch nổi chuyển vào ống eppendorf mới khác

Cuối cùng sử dụng muối trợ tủa NaOAc 3 M, pH 4 bổ sung vào dung dịch (tỷ lệ 0.1V so với mẫu) đem trộn đều Thêm isopropanol với thể tích bằng thể tích mẫu Hỗn hợp được đảo đều nhẹ nhàng tránh làm đứt gãy ADN và mẫu được giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút Tiếp tục ly tâm 13000 rpm/15 phút, 4 ºC, loại bỏ dịch nổi, chú ý quan sát tủa đáy ống tránh đổ hoặc hút mất tủa ADN tủa bám ở đáy ống được rửa 2-3 lần với 500 μl ethanol 70% để loại muối, loại bỏ dung dịch và để tủa khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Hòa tan tủa với 50μl đệm TE (10 mM Tris HCl pH 8, 0,1

mM EDTA) trộn đều để kết tủa tan hoàn toàn ADN hệ gen thu được sẽ được đánh giá về mức độ đứt gãy sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose hàm lượng 0.8% Các mẫu ADN có chất lượng tốt, ít đứt gãy sẽ được đánh giá hàm lượng và

độ tinh sạch theo phương pháp đo quang phổ hấp thụ (OD) ở bước sóng 260 nm (OD 260 ) và 280 nm (OD 280) Mẫu ADN đã tách chiết được bảo quản ở -20 ºC

sử dụng cho các thí nghiệm sau

2.2.2 Thiết kế mồi đặc hiệu nhân một phần đoạn gen COI của côn trùng

Để khuếch đại chính xác đoạn gen COI của 21 mẫu côn trùng đặc hữu Việt

Nam thì cần phải có các cặp mồi xuôi và ngược đặc hiệu nằm ở hai vùng biên của

đoạn gen COI Các trình tự mồi xuôi phải đảm bảo nằm ở vùng bảo thủ ở biên trái của trình tự gen COI Các trình tự mồi ngược phải đảm bảo nằm ở vùng trình tự bảo thủ ở biên phải của gen COI của các loài côn trùng Đã có rất nhiều các nghiên cứu trên thế giới tiến hành phân loại các mẫu côn trùng dựa trên trình tự gen COI Do

đó, trước khi tiến hành thiết kế các cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen COI đích của

21 mẫu côn trùng đặc hữu trong nghiên cứu, chúng tôi đã tham khảo một số tài liệu tiêu biểu về nghiên cứu mã vạch ADN côn trùng để tìm kiếm các cặp mồi phù hợp

cũng như vùng trình tự cần nhân lên của gen COI Chúng tôi sẽ sử dụng một số trình tự mồi đã tham khảo phù hợp trong các thử nghiệm ban đầu để nhân gen COI

từ các loài côn trùng đặc hữu Việt Nam Do sự đa dạng và tiến hoá đặc thù của gen

COI mà ngay cả các mồi đã công bố trước đây cũng không nhân được đoạn gen

mong muốn Sau khi tham khảo các tài liệu nghiên cứu trước đây về vùng gen mã