VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian tiến hành: Khóa luận được tiến hành từ 15/01/2012 đến ngày 30/07/2012
Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Gen động vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ – 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
Vật liệu nghiên cứu
Mẫu máu lợn nhiễm PRRSV từ các địa phương (do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, Đại học Cần Thơ và Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh cung cấp).
Bảng 3.1 Ký hiệu và địa điểm thu mẫu của các mẫu ORF5 được phân lập
STT Tên mẫu Địa điểm Năm phân lập
24 Vắc xin JAX1-R Vắc xin Trung Quốc 2012
Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này được thiết kế nhằm mục đích nhân đoạn gen có kích thước 720 bp trong đó chứa toàn bộ gen ORF5 có kích thước 603 bp như sau:
Hình 3.1 Sơ đồ vị trí vùng gen ORF5
Trong đó, cặp mồi tiến hành nhân đoạn gen kích thước 720 bp có trình tự như bảng sau:
Bảng 90394.2 Trình tự để giải trình tự ORF5
STT Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’)
3.2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất và các dung dịch đệm cần pha dùng trong các thí nghiệm của đề tài được trình bày trong các bảng sau:
Bảng 3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
STT Thiết bị, dụng cụ Hãng sản xuất (nước)
1 Bộ cối chày sứ Việt Nam
2 Cân phân tích Mettler (Đức)
3 Đèn chiếu tia UV Probe Shimadzu (Nhật Bản)
4 Hệ thống chụp ảnh gel Biolabs (Mỹ)
5 Hệ thống điện di ADN Mupid - ex (Nhật)
6 Lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc)
7 Máy chu trình nhiệt PCR Applied Biosystems (Mỹ)
8 Máy PCR – 96 Mastercycler – eppendorf (Mỹ)
9 Nồi khử trùng và tủ sấy Nhật Bản
10 Pipettman, đầu côn các loại Eppendorf (Đức)
11 Tủ cấy vô trùng Sanyo (Nhật Bản)
12 Tủ lạnh sâu –20 º C, tủ lạnh 4 º C Sanyo (Nhật Bản)
13 Tủ ổn nhiệt OSI (Pháp)
Bảng 3.4 Các dung dịch đệm
STT Dung dịch Thành phần
1 Đệm TBE 10x 1M Tris HCl; 830 nM axit boric; 1 nM EDTA; pH = 8,0
2 Dung dịch agarose 0,5% 0,5 g agarose hòa tan vào trong 100 ml dung dịch đệm TBE
3 Ethidium bromide (1%) 1 g Ethidium bromide trong 100 ml H2O
4 Đệm PE 40 ml cồn tuyệt đối và 50 ml đệm PE với tỷ lệ 4:5
Bảng 3.5 Các hóa chất sử dụng
STT Tên hóa chất Hãng sản xuất
2 Bộ hóa chất tách mARN Invitrogen (Mỹ)
3 Bộ hóa chất chạy PCR Fermentas (Mỹ)
5 Hóa chất điện di ADN Biolads (Mỹ)
6 Chỉ thị ADN 100 bp Fermentas (Mỹ)
7 Chỉ thị ADN 1 kb Fermentas (Mỹ)
8 Bộ Kit tách chiết và tinh sạch ADN từ gel QIAGen (Anh)
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp này dựa trên phương pháp của Chomcynski và Sacchi (1987) có cải tiến
Giai đoạn kết tủa ARN
Hỳt 100 àl mẫu mỏu lợn, 100 àl H2O và 600 àl Trizol, trộn đều bằng pipet vào mỗi ống Sau đó, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Cho 200 àl chloroform vào, lắc mạnh bằng tay trong 15 giõy Ủ từ 2 đến
15 phút trong nhiệt độ phòng
Ly tâm 12.000 vòng trong 15 phút ở nhiệt độ 4 o C Sau đó, hút dịch phía trên cùng.
Cho 500 àl Isopropanol vào mỗi ống Ủ trong 15 phỳt ở nhiệt độ phũng hoặc để trong tủ – 20 º C trong 30 phút
Ly tâm 12.000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ 4 o C Sau đó, đổ phần dịch trên để thu tủa
Thờm 500 àl ethanol 70% và trộn đều vào mỗi ống để rửa tủa.
Vortex mẫu nhanh, ly tâm 12.000 vòng trong 5 phút ở nhiệt độ 4 o C sau đó bỏ dịch.
Làm khô nhanh tủa ARN trong không khí trong khoảng 5 đến 10 phút.
Thờm 30 àl H2O khụng chứa Ribonuclease vào mỗi ống
Tổng hợp cDNA từ khuôn ARN sử dụng enzym sao chép ngược (reverse transcriptase): Sử dụng First-strand cDNA synthesis System for RT – PCR (Fermentas) để tổng hợp sợi ADN bổ sung với khuôn ARN theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Quá trình này được chia làm hai bước:
Thêm các thành phần phản ứng vào các ống eppendorf như bảng 3.6.
Bảng 3.6 Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA
STT Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
Thêm các chất theo thứ tự sau vào ống eppendorf thứ 2 như bảng 3.7.
Bảng 3.7 Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA
STT Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
2 Ribolook TM ức chế Ribonuclease 1,0
Trộn đều hai hỗn hợp với nhau và tiến hành ly tâm nhanh Thể tích tổng số của hỗn hợp là 20 àl sau đú ủ ở nhiệt độ như bảng 3.8.
Bảng 3.8 Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA
Bước Giai đoạn Nhiệt độ ( o C) Thời gian (phút)
Bước 2: PCR khuếch đại cDNA
Quy trình nhân đoạn cDNA đã tổng hợp từ các giai đoạn trước.
Thành phần phản ứng được trình bày như trong bảng 3.9.
Bảng 3.9 Thành phần của phản ứng khuếch đại cDNA
STT Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
Quy trình khuếch đại cDNA
Các thành phần của phản ứng được trộn trong ống eppendorf 0,5 ml Sau đó, ống eppendorf chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứng được xếp vào máy PCR và chạy theo chu kỳ nhiệt như bảng 3.10.
Bảng 3.10 Chu trình phản ứng khuếch đại cDNA
Bước Chu trình Giai đoạn Nhiệt độ ( o C) Thời gian (phút)
Hoàn tất kéo dài mạch 72 10,00
3.3.3 Tinh sạch đoạn ORF5 gửi mẫu giải trình tự
Quy trình này được sử dụng dựa trên tài liệu “Current Protocols in Molecular Biology” Fred M Ausubel và cộng sự (1991).
Quy trình tinh sạch ADN và giải trình tự
Thờm 500 àl đệm QG và ly tõm trong một phỳt.
Thêm 0,75 ml đệm PE, sau 2 đến 5 phút tiến hành li tâm 12.000 vòng trong một phút.
Chuyển QIAquick vào trong một ống eppendorf 1,5 ml sạch.
Cho 50 àl H2O khử ion nhỏ vào chớnh giữa ống Sau đú, li tõm trong một phỳt, thờm 30 àl H2O và ly tõm tiếp trong một phỳt.
Kiểm tra lại bằng cách điện di.
Sau đó tiến hành gửi mẫu giải trình tự Trình tự được đọc trên máy đọc tự động của công ty Macrogen Korea 908 World Meridian Venture Center, #60-24, Gasan-dong, Geumchun-gu, Seoul 153-781, Korea.
3.3.4 Phân tích trình tự gen và axít amin tương ứng của các chủng PRRSV
Sau khi thu nhận được chuỗi gen cần nghiên cứu với bộ mã di truyền (xem phụ lục 2), sử dụng phần mềm BioEdit version 7.0.9.0 để xử lý Truy cập Ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) để thu nhận trình tự nucleotit của gen
ORF5 trên một số mẫu được lựa chọn để so sánh với các chủng phân lập được trong nghiên cứu này
Thành phần axít amin của kháng nguyên virus được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (bộ mã vi khuẩn – bacterial code) có trong Ngân hàng gen và so sánh thông qua chương trình BioEdit version 7.0.9.0
Xây dựng cây phả hệ di truyền (Phylogenetic tree) để đánh giá mức độ và xu hướng biến đổi di truyền giữa các chủng virus đang lưu hành tại Việt Nam và trên thế giới Cây phả hệ được thiết lập bằng phần mềm MEGA 5.50 sử dụng phương pháp so sánh khoảng cách và sử dụng Neighbor – Joinning với giá trị tin cậy 1000 lần lặp lại.
Bảng 3.11 Danh sách các chủng lựa chọn so sánh với các mẫu phân lập tại Việt Nam
STT Ký hiệu chủng Số đăng ký
Ngân hàng gen Năm công bố Nước phân lập
1 07QN-VN FJ394029 2008 Việt Nam
8 HUB1-CN EF075945 2006 Trung Quốc
9 LMY-KR DQ473474 2006 Hàn Quốc
PHẦN V: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả tách ARN
Hình 4.1 Kết quả điện di ARN tổng số
1: Chỉ thị phân tử 1 kb 3: HG2012.RV1
Kết quả hình 4.1 cho thấy, ARN tổng số là phần hiển thị thành vệt sáng trên agarose 1 % sau khi điện di Hình ảnh điện di cho thấy các băng gọn, đẹp, phân tách thành hai băng riêng biệt Đây là hai băng tương ứng với rARN 28S và 18S Điều này chứng tỏ đã tách thành công ARN tổng số Như vậy, ARN tổng số đã tách chiết có độ tinh sạch cao, sẽ được sử dụng làm khuôn để thực hiện phản ứng RT – PCR.
Kết quả thực hiện phản ứng RT – PCR
Trước khi tiến hành giải trình tự cDNA, các mẫu thu được sau khi hoàn thành quá trình RT – PCR phải được tiến hành kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp điện di trên gel agarose Kết quả trình bày trong hình 4.1.
Hình 4.2 Kết quả diện di sản phẩm RT – PCR gen ORF5
M: Chỉ thị phân tử 100bp 4: Mẫu DN2009.88
Hình 4.2 cho thấy, ADN sau khi tách chiết cho các băng gọn, rõ ràng, không bị đứt gãy, tập trung thành một phân đoạn có kích thước khoảng 720 bp Chứng tỏ toàn bộ quy trình phản ứng RT – PCR là chính xác từ việc thiết kế mồi, chu trình nhiệt, tiến trình thực hiện và kết quả phản ứng hoàn toàn đặc hiệu.
Kết quả giải trình tự gen ORF5 của các mẫu phân lập
Quá trình đọc trình tự được thực hiện trên máy đọc tự động của công tyMacrogen Korea 908 World Meridian Venture Center Kết quả được biểu thị bằng chương trình BioEdit version 7.0.9.0 như hình 4.3
Hình 4.3 Giản đồ giải trình tự tự động (chromatogram) thành phần nucleotit của gen ORF5 mẫu HG2012.RV1
Các nucleotit hấp thụ thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye), khi đọc bằng tia laser cho hiển thị Adenine có màu xanh lá cây, Thymine có màu đỏ, Guanine có màu đen và Cytosine có màu xanh nước biển.
Hình 4.3 Giản đồ giải trình tự tự động (chromatogram) thành phần nucleotit của gen ORF5 mẫu HG2012.RV1
Hình 4.3 cho thấy mỗi đỉnh màu của giản đồ đều xác nhận một loại nucleotit, chứng tỏ chuỗi nucleotit của vùng gen chứa ORF5 thu nhận sau quá trình giải tình tự có chất lượng tốt.
Kết quả giải trình tự gen ORF5 của các mẫu phân lập
Để nghiên cứu cụ thể hơn mức độ biến đổi thành phần nucleotit và phần trăm tương đồng của gen ORF5 giữa các mẫu đã phân lập, chúng tôi đã sử dụng phần mềm BioEdit version 7.0.9.0 thể hiện ở hình 4.3.
Hình 4.4 So sánh trình tự nucleotit chuỗi gen ORF5 của PRRSV phân lập tại Việt Nam với một số chủng trên thế giới
Các sai khác về trình tự của các chủng đã phân lập so với chủng VR2332 biểu thị bằng chính ký hiệu nucleotit; (.): Nucleotit giống với nucleotit của chủng VR2332.
Hình 4.4 So sánh trình tự nucleotit chuỗi gen ORF5 của PRRSV phân lập tại Việt Nam với một số chủng trên thế giới
Bảng 4.1 Phần trăm tương đồng về nucleotit của gen ORF5 giữa các chủng PRRSV phân lập tại Việt
Nam với một số chủng thế giới
1 VR2332; 2 Lelystad; 3 JXA1 – R; 4 DN2008.444; 5 DN2008.452; 6 DN2008.460; 7 DN2008.499; 8 DN2008.694; 9 DN2009.42; 10.DN2009.44; 11 DN2009.59; 12 DN2009.88; 13 DN2009.153; 14 DN2009.292; 15 DN2009.1107; 16 DN2009.1155; 17 DN2010.1; 18.DN2010.4; 19 DN2010.5.2; 20 DN2010.11; 21 HCM2010.CC3; 22 HCM2010.D06; 23 BD2010.R1; 24 CT2012.HS1; 25 DT2012.DT8; 26.HG2012.RV1, 27 MLV; 28 BSL – PS100.
Sau khi phân tích kết quả giải trình tự, chúng tôi thu được toàn bộ gen ORF5 có độ dài 603 bp Mặt khác, kết quả cũng cho thấy, khi so sánh giữa các mẫu đã phân lập tại Việt Nam và các chủng VR2332, MLV, JXA1 – R, BSL – PS100 thì số điểm đột biến và sự thay thế các nucleotit là khác nhau.
So sánh với chủng nguyên thủy dòng châu Âu Lelystad:
Phần trăm tương đồng về trình tự nucleotit của 23 mẫu phân lập được so với chủng Lelystad là từ 61,0% đến 62,1%
So sánh với chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332:
Có tất cả 104 vị trí sai khác về nucleotit giữa 23 chủng phân lập khi so sánh với chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332 Điều đặc biệt là trong số 23 chủng phân lập được, chủng HG2012.RV1 có trình tự hoàn toàn giống với chủng VR2332.
Sự đột biến về nucleotit của 22 mẫu còn lại được trình bày như sau:
Bảng 4.2 Vị trí và nucleotit đột biến của 22 mẫu phân lập so với chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332
Vị trí nucleotit đột biến
Nucleotit biến đổi STT Vị trí nucleotit đột biến
Các vị trí và thành phần nucleotit được đánh dấu trong nền xám là những vị trí đột biến làm sai khác thành phần axít amin suy diễn
Như vậy, các mẫu phân lập tại Việt Nam trong nghiên cứu này trừ mẫuHG2012.RV1 có mức độ thay đổi trình tự nucleotit cao so với chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332.
So sánh giữa các mẫu phân lập:
Có tất cả 104 vị trí sai khác về nucleotit giữa 23 chủng phân lập tương tự như bảng 4.2 Kết quả phân tích cho thấy 23 mẫu phân lập có sự tương đồng với nhau từ 87,5% đến 100,0% về trình tự nucleotit.
So sánh với chủng vắc xin JXA1 – R:
Vaccin JXA1 – R là vắc xin sống có nguồn gốc từ virus JXA1 Virus JXA1 phân lập từ lợn chết tại tỉnh Jiangxi (Giang Tây) Trung Quốc, là một dạng tiến hóa từ các chủng độc lực cao đầu tiên (Tian et al., 2007) HUB1 chính là một trong những PRRSV có độc lực cao đầu tiên gây ra sự bùng nổ dịch PRRS tại Trung Quốc vào năm 2006 HUB1 lần đầu tiên được phát hiện tại tỉnh Hubei (Hồ Bắc) vào năm 2006 và nhanh chóng lan ra khắp các tỉnh của Trung Quốc vào năm 2007.
Kết quả phân tích cho thấy 23 mẫu phân lập có sự tương đồng về trình tự nucleotit từ 89,2% đến 98,6% so với chủng vắc xin JXA1 – R và tương đồng từ 89,2% đến 99,3% so với chủng virus JXA1, tương đồng từ 93,2% đến 100,0% so với chủng độc lực cao HUB1 và từ 92% đến 95,1% so với chủng Ch-1a Trong đó, chủng Ch-1a là PRRSV đầu tiên phân lập tại Trung Quốc vào năm 1995. Đối với mẫu HG2012.RV1 có 49 vị trí sai khác về nucleotit khi so sánh với chủng vắc xin JXA1 – R.
Bảng 4.3 Vị trí và nucleotit đột biến của 22 mẫu phân lập so với chủng vắc xin JXA1 – R
STT Vị trí nucleotit đột biến
Nucleotit đột biến STT Vị trí nucleotit đột biến
Các vị trí và thành phần nucleotit được đánh dấu trong nền xám là những vị trí đột biến làm sai khác thành phần axít amin suy diễn Đối với 22 mẫu còn lại: Có tất cả 58 vị trí sai khác về nucleotit giữa 23 chủng phân lập khi so sánh với chủng vắc xin JXA1 – R.
Bảng 4.4 Vị trí và nucleotit đột biến của mẫu HG2012.RV1 so với chủng vắc xin JXA1 – R
STT Vị trí nucleotit đột biến
Nucleotit đột biến STT Vị trí nucleotit đột biến
Các vị trí và thành phần nucleotit được đánh dấu trong nền xám là những vị trí đột biến làm sai khác thành phần axít amin suy diễn
So sánh với chủng vắc xin MLV, vắc xin BSL – PS100:
Trong đó, MLV là một trong những vắc xin sống có nguồn gốc từ chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332 MLV là một trong những vắc xin hiệu quả nhất chống lại các virus có sự tương đồng lớn đối với virus VR2332 Vắc xin BSL – PS100 do Singapo sản xuất cũng đang là một trong những vắc xin được sử dụng rộng rãi tại Việt Nam và có hiệu quả rất cao đối với những virus thuộc dòng Bắc Mỹ
Phần trăm tương đồng về trình tự nucleotit so với chủng vắc xin MLV là từ 87,2% đến 99,6%, so với chủng vắc xin BSL – PS100 là từ 86,8% đến 99,3%. Đối với 22 mẫu còn lại, khi so sánh với cả hai chủng vắc xin đều có 104 sự biến đổi nucleotit tương tự như bảng 4.2. Đối với mẫu HG2012.RV1 chỉ có hai vị trí biến đổi khi so sánh với chủng vắc xin MLV như sau: Vị trí số 38 ( A G), vị trí số 252 (T C); trong khi đó, khi so sánh với chủng vắc xin BSL – PS100 có bốn vị trí biến đổi như sau: Vị trí số
Sự biến đổi của nuclotide của các mẫu phân lập được so với chủng JAX1 mang tính ngẫu nhiên Mỗi điểm đột biến thường chỉ xảy ra ở một số mẫu Trong khi đó, sự biến đổi nucleotit ở các mẫu thu được khi so sánh với chủng gốc VR2332 và các chủng vắc xin còn lại thường mang tính đồng loạt.
Như vậy, về thành phần nucleotit, ngoài trình tự nucleotit của gen ORF5 mẫuHG2012.RV1 có sự tương đồng 100% giống chủng gốc, các mẫu phân lập tại ViệtNam còn lại trong nghiên cứu này có sự tương đồng cao nhất so với chủng vắc xinJXA1 – R của Trung Quốc sau đó là các vắc xin MLV và BSL – PS100.
Kết quả so sánh trình tự và sự tương đồng axít amin giữa 23 mẫu phân lập với nhau và với một số chủng trên thế giới
Từ kết quả so sánh thành phần nucleotit, sử dụng phần mềm BioEdit version7.0.9.0, chúng tôi đã tiến hành so sánh thành phần axít amin suy diễn Kết quả so sánh thành phần axít amin được trình bày ở hình 4.5.
Hình 4.5 So sánh thành phần axít amin gen ORF5 của 23 mẫu phân lập tại Việt Nam với một số chủng của thế giới
Bảng 4.5 Phần trăm tương đồng về axít amin của gen ORF5 giữa các chủng PRRSV phân lập tại Việt
Nam với một số chủng thế giới
1 VR2332; 2 Lelystad; 3 JXA1 – R; 4 DN2008.444; 5 DN2008.452; 6 DN2008.460; 7 DN2008.499; 8 DN2008.694; 9 DN2009.42; 10. DN2009.44; 11 DN2009.59; 12 DN2009.88; 13 DN2009.153; 14 DN2009.292; 15 DN2009.1107; 16 DN2009.1155; 17 DN2010.1; 18 DN2010.4;
19 DN2010.5.2; 20 DN2010.11; 21 HCM2010.CC3; 22 HCM2010.D06; 23 BD2010.R1; 24 CT2012.HS1; 25 DT2012.DT8; 26 HG2012.RV1, 27. MLV; 28 BSL – PS100.
Những sai khác về nucleotit của bộ ba mã hoá có thể dẫn đến những sai khác về thành phần axít amin nhưng cũng có thay đổi về nucleotit mà ít dẫn đến thay đổi về axít amin, do một số axít amin có thể do nhiều bộ ba mã hoá Kết quả ở bảng 4.2 và hình 4.5 cho thấy có nhiều trường hợp sự sai khác về nucleotit không làm biến đổi về thành phần và trình tự axít amin
Mặt khác kết quả ở hình 4.5 cho thấy:
Chuỗi polypeptide do gen ORF5 của các mẫu phân lập tại Việt Nam trong nghiên cứu này quy định mã hoá cho 200 axít amin bằng số axít amin của chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332
Có sự sai khác rất ít về axít amin của chuỗi polypeptide ORF5 của các mẫu đã phân lập được tại Việt Nam so với các chủng vắc xin JXA1 – R, MLV, BSL – PS100 và chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332.
So sánh giữa các mẫu phân lập:
Kết quả phân tích cho thấy 23 mẫu phân lập có sự tương đồng với nhau từ 86,5% đến 100,0% về trình tự axít amin.
So sánh với chủng nguyên thủy dòng châu Âu Lelystad:
Phần trăm tương đồng về trình tự nucleotit của 23 mẫu phân lập được so với chủng Lelystad là từ 55,5% đến 57,0%
So với chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332:
23 mẫu phân lập được trong nghiên cứu này có phần trăm tương đồng về trình tự axít amin suy diễn là từ 87,0% đến 100,0%.
Mẫu HG2012.RV1 không có bất kỳ sự sai khác nào về thành phần và trình tự axít amin suy diễn.
22 mẫu còn lại có sự thay đổi thành phần axít amin suy diễn như sau:
Bảng 4.6 Vị trí và axít amin đột biến của 22 mẫu phân lập so với chủng VR2332
STT Vị trí axít amin đột biến
Axít amin đột biến STT Vị trí axít amin đột biến
Như vậy, dù có 104 vị trí đột biến của nucleotit nhưng chỉ có 41 axít amin suy diễn bị thay đổi.
Phần trăm tương đồng về trình tự axit amin suy diễn của 23 mẫu phân lập so với chủng vắc xin JXA1 – R là từ 87,5% đến 98,0%, so với chủng virus JXA1 là từ 88,0% đến 99,5% và so với chủng độc lực cao HUB1 là 88,5% đến 100,0%, so với chủng Ch-1a là từ 91,0% đến 93,5%.
Mẫu HG2012.RV1 có 19 sự sai khác về thành phần axít amin suy diễn như bảng 4.7.
22 mẫu còn lại có sự thay đổi thành phần axít amin suy diễn ở 22 vị trí như
Bảng 4.7 Vị trí và axít amin đột biến của mẫu HG2012.RV so với chủng vắc xin
STT Vị trí axít amin đột biến
Axít amin đột biến STT Vị trí axít amin đột biến
Bảng 4.8 Vị trí và axít amin đột biến của 22 mẫu phân lập so với chủng vắc xin
Vị trí axít amin đột biến
Axít amin đột biến STT Vị trí axít amin đột biến
Như vậy, rõ ràng các chủng phân lập được chủng nghiên cứu này có sự tương đồng về thành phần axít amin so với chủng vắc xin JXA1 – R lớn hơn rất nhiều so với chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332.
So với chủng vắc xin MLV, chủng vắc xin BSL – PS100
Phần trăm tương đồng về trình tự axít amin suy diễn so với chủng vắc xin MLV là từ 85,5% đến 99,0% Bên cạnh đó, phần trăm tương đồng đối với trình tự axít amin suy diễn so với chủng vắc xin BSL – PS100 là từ 85,0% đến 98,5%.
Mẫu HG2012.RV1 có sự biến đổi axít amin suy diễn đối với chủng vắc xin MLV ở 2 vị trí axít amin là: Vị trí axít amin số 13 (Q R), vị trí axít amin số 151 (G
R); đối với vắc xin BSL – PS100 có 3 vị trí axít amin bị thay đổi đó là: Vị trí axít amin số 13 (Q R), vị trí axít amin số 151 (G R), vị trí axít amin số 175 (N D).
Ngoài ra, 22 mẫu còn lại có sự thay đổi thành phần axít amin suy diễn tương tự như bảng 4.8
Như vậy, sự sai khác của chuỗi polypeptide ORF5 của các mẫu phân lập được với chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332 và chủng vắc xin MLV, chủng vắc xin BSL – PS100 cao hơn nhiều so với chủng vắc xin JXA1 – R.
Do đó, kết quả phân tích so sánh về thành phần axít amin của chuỗi polypeptide ORF5 ở trên cũng cho thấy các chủng phân lập được tại Việt Nam có sự sai khác rất ít so với các chủng của Trung Quốc và đặc biệt là các chủng độc lực cao HUB1, chủng virus JXA1 và có sự khác biệt tương đối lớn so với chủng nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332, vắc xin MLV và vắc xin BSL – PS100 Kết quả này cũng phù hợp với kết quả phân tích so sánh về thành phần nucleotit của gen ORF5 ở trên.
Như vậy, không có sự sai khác nhiều về trình tự và sự sắp xếp nucleotit và axít amin giữa các chủng phân lập ở Việt Nam so với chủng vắc xin Trung Quốc JXA1 –
R, chủng MLV, chủng BSL – PS100, chủng độc lực cao HUB1 Tuy nhiên, sự sai khác này cũng đủ để tạo nên sự đa dạng về chủng loại trong quần thể PRRSV và làm phức tạp hơn về mặt dịch tễ học của PRRSV Điều đó cũng cho thấy rằng tác nhân gây PRRS có tại Việt Nam rất có thể có nguồn gốc từ các chủng PRRSV của Trung Quốc. Ngoài mẫu HG2012.RV1 qua phân tích, rõ ràng gen ORF5 của các mẫu còn lại đã có sự tiến hoá xa hơn rất nhiều so với với chủng gốc VR2332 của Bắc Mỹ.
Kết quả phân tích cây phả hệ của gen ORF5 trên các mẫu phân lập
Sử dụng phần mềm MEGA 5.50 để xây dựng cây phả hệ được xây dựng bằng phương pháp liền kề Neighbour-Joining, với hệ số kiểm định (bootstrap) là 1000 bootstrap.
Hình 4.6 Phân tích phả hệ và nguồn gốc của các chủng PRRSV của Việt Nam và một số chủng khác trên thế giới sử dụng thành phần nucleotit gen ORF5
Dựa vào sơ đồ cây phả hệ chúng tôi khẳng định một lần nữa các mẫu phân lập tại Việt Nam trong giai đoạn 2008 – 2010 và năm 2012 đều thuộc dòng PRRSV Bắc Mỹ 23 mẫu phân lập được tạo thành 10 haplotype Trong đó 22 mẫu tạo thành 9 haplotype, mẫu HG2012.RV1 tạo thành 1 haplotype như bảng 4.9.
Bảng 4.9 Haplotype của 23 mẫu phân lập ST
Tên mẫu Haplotype STT Tên mẫu Haplotype
Bên cạnh đó, các mẫu phân lập tại các tỉnh khác nhau thì đều có sự sai khác về trình tự nucleotit, tạo ra các haplotype Tuy nhiên, sự khác nhau này không đáng kể. Điều này chứng tỏ khoảng cách địa lý không có sự tác động lớn đến sự phân hóa và đa dạng di truyền của các chủng PRRSV.
Kết quả phân tích cây phả hệ cho thấy các mẫu phân lập tại Việt Nam từ năm
2008 – 2012 có mỗi quan hệ rất gần gũi với các chủng vắc xin tại Trung Quốc JXA1 –
R và vắc xin MLV, vắc xin BSL – PS100 cũng như chủng gốc VR2332 Đặc biệt là mẫu HG2012.RV1 có trình tự nucleotit hoàn toàn tương đồng với chủng gốc VR2332.
Kết quả phân tích trình tự cây phả hệ so sánh với các chủng trên thế giới 52 4.8 Đăng ký trình tự vào Ngân hàng gen
Do các chủng phân lập tại Đồng Nai từ năm 2008 đến 2010 có trình tự nucleotit hoàn toàn giống nhau và tạo thành 1 haplotype như đã trình bày ở trên nên chúng tôi chỉ sử dụng mẫu DN2010.4 làm mẫu đại diện Ở đây, chúng tôi đã sử dụng hệ thống phân loại của Mang Shi và cộng sự
(2010) như đã trình bày ở phần trước để so sánh, đánh giá và xây dựng cây phả hệ. Đây là một trong những hệ thống phân chia mới nhất và chính xác nhất dựa trên trình tự gen ORF5 của 8264 mẫu nghiên cứu Dựa vào hệ thống phân loại này, chúng tôi có thể đánh giá và phân loại các mẫu phân lập trong nghiên cứu này với các chủng trên thế giới một cách chính xác và khoa học.
Sử dụng phần mềm MEGA 5.50 để xây dựng cây phả hệ được xây dựng bằng
55 phương pháp liền kề Neighbour-Joining, với hệ số kiểm định (bootstrap) là 1.000 bootstrap.
Các mẫu sử dụng để so sánh trong nghiên cứu này được trình bày như bảng 4.10.
Bảng 4.10 Tên và mã số đăng ký trên Ngân hàng gen của các mẫu lựa chọn so sánh
STT Tên chủng Tên đăng ký trên
Ngân hàng gen Nước và năm phân lập Phân loại
1 07QN-VN FJ394029 Việt Nam – 2008 Dòng phụ 8.7
5 BD2010.R1 JQ860381 Việt Nam – 2010 Dòng phụ 8.7
6 BSL – PS100 GU187014 Singapore – 2009 Dòng phụ 5.1
7 Ch-1a AY032626 Trung Quốc – 1995 Dòng phụ 8.7
8 CT2012.HS1 JQ860384 Việt Nam – 2012 Dòng phụ 8.7
9 DN2009.153 JQ860371 Việt Nam – 2009 Dòng phụ 8.7
10 DN2009.292 JQ860372 Việt Nam – 2009 Dòng phụ 8.7
11 DN2010.1 JQ860375 Việt Nam – 2010 Dòng phụ 8.7
12 DN2010.11 JQ860378 Việt Nam – 2010 Dòng phụ 8.7
13 DN2010.4 JQ860376 Việt Nam – 2010 Dòng phụ 8.7
14 DT2012.DT8 JQ860388 Việt Nam – 2012 Dòng phụ 8.7
15 HCM2010.CC3 JQ860379 Việt Nam – 2010 Dòng phụ 8.7
16 HCM2010.D06 JQ860380 Việt Nam – 2010 Dòng phụ 8.7
17 HG2012.RV1 JQ860390 Việt Nam – 2012 Dòng phụ 8.7
18 HLV013 EF150361 Mỹ – 2006 Dòng phụ 8.9
19 HUB1 EF075945 Trung Quốc – 2006 Dòng phụ 8.7
20 JXA1 EF112445 Trung Quốc – 2007 Dòng phụ 8.7
21 JXA1 - R Trung Quốc - 2012 Dòng phụ 8.7
22 LMY-KR DQ473474 Hàn Quốc – 2006 Dòng phụ 5.2
23 MD-001 AF121131 Đài Loan – 1998 Dòng 3
24 Miyagi08-2 AB546105 Nhật Bản – 2011 Dòng 4
25 MLV AF066183 Mỹ – 2005 Dòng phụ 5.1
27 Prime Pac DQ779791 Mỹ – 2006 Dòng 7
29 PRRSV55 AF176476 Mỹ – 2000 Dòng phụ 8.1
30 SDSU73 AY656993 Mỹ – 2005 Dòng phụ 8.5
31 VR2332 AY150564 Mỹ – 2003 Dòng phụ 5.1
Hình 4.7 Cây phả hệ của các chủng PRRSV của Việt Nam và một số chủng khác trên thế giới sử dụng thành phần nucleotit của gen ORF5
Từ cây phả hệ ở hình 4.7 chúng tôi có những nhận xét sau đây:
Mẫu HG2012.RV1 thuộc dòng phụ 5.1 chung phân nhóm với các chủng có độc lực thấp, chủng gốc VR2332 và chủng vắc xin MLV, chủng vắc xin BSL – PS100.
22 mẫu còn lại có mối quan hệ gần gũi với chủng Ch-1a, đều thuộc dòng số
8 Mặt khác 22 chủng phân lập thuộc nhóm 2 có sự tương đồng rất lớn đối với chủng 07QN-VN từ 96,3% đến 98,5% 07QN-VN là PRRSV được phân lập tại tỉnh Quảng Nam vào năm 2007 và có sự tương đồng về trình tự nucleotit lên tới 99% so với các chủng độc lực cao phân lập tại Trung Quốc vào năm 2006 Ngoài ra, 22 mẫu đều thuộc dòng phụ số 8.7, trong đó, hầu hết các chủng động lực cao của Trung Quốc đều thuộc phân nhóm này, mà tiêu biểu trong đó là chủng HUB1 và virus JXA1
Không có bất cứ một mẫu nào phân lập được thuộc về các dòng 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9.
Như vậy, mặc dù có một số sai khác nhất định nhưng các chủng PRRSV phân lập ở Việt Nam mà chúng tôi nghiên cứu và các chủng PRRS của Trung Quốc phân lập những năm 2006 – 2007 cùng với chủng VR2332 của Bắc Mỹ có chung nguồn gốc tiến hoá
Kết quả phân tích phả hệ một lần nữa cho thấy các chủng của Việt Nam cùng nguồn gốc với các chủng xuất hiện tại các tỉnh phía Nam Trung Quốc
So sánh về nucleotit gen ORF5 cho thấy chủng vắc xin của MLV có độ tương đồng cao (99%) so với chủng VR2332 (Bắc Mỹ) thuộc nhóm độc lực thấp, nhưng chủng vắc xin MLV lại có sự sai khác lớn so với các chủng mới xuất hiện tại Trung Quốc và Việt Nam (87 – 88%)
Kết quả nghiên cứu sinh học phân tử gen ORF5 của các chủng độc lực cao phân lập tại Việt Nam cho thấy cho đến nay, tại nước ta, chưa có sự trộn lẫn nhiều dòng PRRSV, sự biến đổi nucleotit và axít amin giữa các chủng so sánh là hoàn toàn theo quy luật tự nhiên.
4.8 Đăng ký trình tự vào Ngân hàng gen
Chúng tôi đã giải trình tự hoàn chỉnh và đã gửi trình tự lên Ngân hàng gen với ký hiệu như bảng 4.11.
Bảng 4.11 Ký hiệu chủng và số đăng ký Ngân hàng gen của các mẫu phân lập
STT Ký hiệu chủng Số đăng ký Địa điểm Năm Phân loại
1 HG2012.RV1 JQ860390 Hậu Giang 2012 Dòng phụ 8.7
2 CT2012.HS1 JQ860384 Cần Thơ 2012 Dòng phụ 8.7
3 DT2012.DT8 JQ860388 Đồng Tháp 2012 Dòng phụ 8.7
4 BD2010.R1 JQ860381 Bình Dương 2010 Dòng phụ 8.7
5 HCM2010.CC3 JQ860379 Tp HCM 2010 Dòng phụ 8.7
6 HCM2010.D06 JQ860380 Tp HCM 2010 Dòng phụ 8.7
7 DN2010.1 JQ860375 Đồng Nai 2010 Dòng phụ 8.7
8 DN2010.4 JQ860376 Đồng Nai 2010 Dòng phụ 8.7
9 DN2010.5.2 JQ860377 Đồng Nai 2010 Dòng phụ 8.7
10 DN2010.11 JQ860378 Đồng Nai 2010 Dòng phụ 8.7
11 DN2009.42 JQ860367 Đồng Nai 2009 Dòng phụ 8.7
12 DN2009.44 JQ860368 Đồng Nai 2009 Dòng phụ 8.7
13 DN2009.59 JQ860369 Đồng Nai 2009 Dòng phụ 8.7
14 DN2009.88 JQ860370 Đồng Nai 2009 Dòng phụ 8.7
15 DN2009.292 JQ860372 Đồng Nai 2009 Dòng phụ 8.7
16 DN2009.1107 JQ860373 Đồng Nai 2009 Dòng phụ 8.7
17 DN2009.1155 JQ860374 Đồng Nai 2009 Dòng phụ 8.7
18 DN2009.153 JQ860371 Đồng Nai 2009 Dòng phụ 8.7
19 DN2008.444 JQ860362 Đồng Nai 2008 Dòng phụ 8.7
20 DN2008.452 JQ860363 Đồng Nai 2008 Dòng phụ 8.7
21 DN2008.460 JQ860364 Đồng Nai 2008 Dòng phụ 8.7
22 DN2008.499 JQ860365 Đồng Nai 2008 Dòng phụ 8.7
23 DN2008.694 JQ860366 Đồng Nai 2008 Dòng phụ 8.7