Phân tích gene và enzyme sqr Ở một số chủng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh phân lập tại việt nam

Phân tích gene và enzyme sqr Ở một số chủng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh phân lập tại việt nam Phân tích gene và enzyme sqr Ở một số chủng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh phân lập tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG THANH HIẾU

PHÂN TÍCH GEN VÀ ENZYME SQR Ở MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN

OXY HÓA LƯU HUỲNH PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG THANH HIẾU

PHÂN TÍCH GEN VÀ ENZYME SQR Ở MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN

OXY HÓA LƯU HUỲNH PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Đỗ Thị Phúc

Hà Nội - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được bảo vệ trước bất kỳ hội đồng nào trước đây

Tác giả

Hoàng Thanh Hiếu

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các thầy cô của Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đỗ Thị Phúc, người cô đã

hết lòng tận tình chỉ bảo em trong quá trình làm luận văn

Em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Bảo Yên – Phòng Trọng điểm công nghệ Protein – Enzyme và TS Nguyễn Minh Phương, Khoa Môi trường, cùng các bạn sinh viên Trịnh Thị Ngọc Ánh, Hà Phương Anh, Lê Đàm Bạch Liên đã và đang

hoạt động tại phòng thí nghiệm trọng điểm Protein – Enzyme đã hỗ trợ em trong quá trình thực hiện luận văn và các thầy cô khoa Sinh học, khoa Môi trường - Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện luận văn này

Bên cạnh đó, sự quan tâm, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và người thân đã luôn là nguồn động lực lớn lao, tạo điều kiện tốt nhất để em có thể tập trung nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Trong quá trình làm luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót Em mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô, các chuyên gia, những người quan tâm đến đề tài để đề tài được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn! Học viên

Hoàng Thanh Hiếu

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

1.1.1 Chu trình sinh địa hóa của lưu huỳnh 2

1.1.2 Vai trò của vi khuẩn trong chu trình sinh địa hóa lưu huỳnh 3

1.2 Vi khuẩn tía oxy hóa lưu huỳnh 7

1.2.1 Chuyển hóa lưu huỳnh ở vi khuẩn tía 7

1.2.2 Các quá trình và hệ thống enzyme oxy hóa hợp chất lưu huỳnh ở vi khuẩn tía 10

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu và các thiết bị máy móc 21

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.1.2 Các thiết bị máy móc 21

2.1.3 Các hóa chất và dung dịch sử dụng 22

2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn 24

2.2.2 Phương pháp định danh chủng vi khuẩn 25

2.2.3 Phương pháp tách chiết ADN 26

2.2.4 Phương pháp PCR khuếch đại gen sqr 27

2.2.5 Phương pháp phân tích tin sinh học 28

2.2.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả định danh chủng vi khuẩn 30

3.1.1 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn từ mẫu nước thải sông Kim Ngưu 30

3.1.3 Kết quả phân tích trình tự 16S rRNA và định danh loài 32

3.2 Kết quả phân tích trình tự gen sqr 34

3.2.1 Kết quả PCR khuếch đại đoạn DNA chứa gen sqr 34

3.2.2 Kết quả giải trình tự gen sqr 35

3.3 Phân tích sự có mặt của enzyme SQR ở vi khuẩn R capsulatus PAM 34 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

PHỤ LỤC 58

Danh mục hình ảnh

Hình 1 Mô hình chu trình sinh địa hóa của lưu huỳnh [55] 3Hình 2 Mô hình đề xuất về các quá trình oxy hóa lưu huỳnh trong vi khuẩn 12Hình 3 Cơ chế đề xuất của nửa xúc tác khử bởi SQR [38] 16Hình 4 So sánh các trình tự protein SQR với các gốc cysteine bảo thủ ở nhiều loại sulfie:quinone oxidoreductases [66] 18Hình 5 Vị trí lấy mẫu nước thải tại sông Kim Ngưu 21Hình 6 Đĩa cấy trải mẫu làm giàu nước thải sông Kim Ngưu sau 7 ngày nuôi cấy 30Hình 7 Kết quả cấy trải phân lập chủng đơn 31Hình 8 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc khuếch đại đoạn 16S rRNA 32Hình 9 Kết quả BLAST trình tự gen 16S rRNA của chủng MSM_TT_3.1 trên NCBI 33Hình 10 Cây phát sinh chủng loại dựa trên đoạn gen 16S rRNA 34

Hình 11 Kết quả điện di kết quả PCR gen sqr trên agarose 1% 35Hình 12 Kết quả giải trình tự (trên) và so sánh trình tự gen sqr của PAM 34, PAM36

trên NCBI (dưới) 36Hình 13 Cây phát sinh dựa vào trình tự axit amin SQR đại diện cho 6 nhóm SQR khác nhau 37

Hình 14 Kết quả so sánh trình tự gen sqr R capsulatus PAM 34 với CSDL NCBI

39Hình 15 Ba motif gắn FAD bảo tồn trong SQR loại VI 40Hình 16 Các gốc cysteine, glutamic acid tham gia quá trình xúc tác được bảo toàn ở SQR loại VI 41

Hình 17 Cấu trúc 3D của SQR PAM 34 dựa trên mô phỏng từ cấu trúc SQR tương đồng có sẵn trên cơ sở dữ liệu AlphaFold 43Hình 18 Kết quả điện di SDS PAGE của protein SQR trong các phân đoạn tế bào khác nhau 43

Danh mục các bảng

Bảng 1 Ví dụ về các SOB thuộc các nhóm dinh dưỡng khác nhau 5

Bảng 2 Tóm tắt các cơ chế hoạt động của enzyme SQR 16

Bảng 3 Tổng hợp các vùng và các các axit amin đặc trưng ở 6 loại SQR 18

Bảng 4 Thông tin cặp mồi PCR khuếch đại gen sqr 22

Bảng 5 Các môi trường được sử dụng trong phân lập, tuyển chọn vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh 23

Bảng 6 Thành phần và chu trình phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA 25

Bảng 7 Thành phần và chu trình phản ứng PCR khuếch đại gen sqr chủng R capsulatus PAM34 & R palustris PAM36 27

MỞ ĐẦU

Lưu huỳnh là một trong những nguyên tố phổ biến trên trái đất và chu trình sinh địa hóa của lưu huỳnh có nhiều tác động qua lại với con người và môi trường tự nhiên của sinh vật Do có nhiều mức oxy hóa khử khác nhau, các hợp chất vô cơ của lưu huỳnh tồn tại trong môi trường cũng vô cùng đa dạng, chúng có thể có nguồn gốc từ các quá trình tự nhiên hoặc do sản xuất của con người Một trong các dạng đó là H2S, do có ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe và chất lượng sống của con người, với nồng độ H2S cao có thể dẫn tới tử vong

Từ bản chất của lưu huỳnh, trong tự nhiên tồn tại một nhóm lớn, đa dạng các vi sinh vật có khả năng sử dụng hợp chất của lưu huỳnh như là nguồn điện tử, năng lượng để phục vụ cho quá trình tổng hợp, đồng hóa các chất Trong những thập kỷ trở lại đây, các vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh được giới khoa học trong và ngoài nước đặc biệt quan tâm do có tiềm năng lớn sử dụng cho công cuộc xử lý các chất thải chứa hợp chất độc hại của lưu huỳnh, bao gồm các vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh

Ở vi sinh vật, khả năng oxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh có thể có nhiều enzyme tham gia SQR được chỉ ra là enzyme mấu chốt tham gia chuyển hóa H2S thành lưu huỳnh nguyên tố không độc Vì vậy những hiểu biết về SQR có ý nghĩa quan trọng trong khả năng ứng dụng xử lý H2S hiệu quả Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu về vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh ở Việt Nam đang tập trung vào phân lập và thử nghiệm khả năng xử lý chất thải, chưa nhiều nghiên cứu tập trung vào đặc điểm và cơ chế của enzyme SQR ở vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh Vì vậy, nghiên cứu “PHÂN TÍCH GEN VÀ ENZYME SQR Ở MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN OXY HÓA LƯU HUỲNH PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM” được thực hiện với mục tiêu:

- Phân lập và định danh một số chủng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh tại Việt Nam

- Khuếch đại và xác định trình tự gen mã hóa cho enzym SQR tham gia con đường oxy hóa lưu huỳnh

- Xác định sự có mặt của enzym SQR ở một số chủng vi khuẩn phân lập

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chu trình sinh địa hóa lưu huỳnh và vị trí của vi khuẩn trong chu trình

1.1.1 Chu trình sinh địa hóa của lưu huỳnh

Lưu huỳnh (S) đứng thứ 10 trong số những nguyên tố dồi dào nhất trên trái đất và là nguyên tố phổ biến thứ 6 trong sinh khối vi sinh vật [53] Nguyên tố lưu huỳnh có công thức phân tử S8, được tìm thấy ở ba dạng tự nhiên khác nhau: alpha (vàng), beta (nâu) và gamma (vàng nhạt) và nó hòa tan trong dung môi hữu cơ ở nhiều mức độ khác nhau nhưng không hòa tan trong nước [35] Các cồn muối, các chất bốc hơi phân lớp và các trầm tích núi lửa đều là những nơi có thể tìm thấy lưu huỳnh tự nhiên Nó cũng có thể được liên kết với các khoáng chất sulfatee như anhydrit, barit và thạch cao, cũng như các sunfide như chalcopyrite, pyrrhotite, sphalerite, galena, và pyrite (FeS2) Lưu huỳnh cũng có trong khí tự nhiên, dầu, than đá, cát bitum, đá phiến pyrobitum và dưới dạng hydrogen sulfide (H2S) trong đất thiếu oxy, cũng như sản phẩm phụ của các hoạt động công nghiệp [35] Khoáng chất tự nhiên FeS2 là nguồn cung cấp lưu huỳnh chính trong đất Lưu huỳnh dễ bị khử và bị oxy hóa, gây ra nhiều phản ứng trong đất [79]

Chu trình sinh địa hóa của lưu huỳnh cũng là một trong số các chu trình sinh địa hóa lớn nhất trong tự nhiên, bên cạnh chu trình nước, carbon, ni-tơ, phốt-pho, sắt [92] Chu trình sinh địa hóa của S liên quan đến một số phản ứng oxy hóa và khử [92] Các con đường chính liên quan đến chu trình S là sự khoáng hóa S hữu cơ thành S vô cơ, quá trình oxy hóa của S0, SO32- và S2O32- thành SO42-, sự khử SO42- thành H2S và sự cố định các hợp chất S bởi các vi sinh vật và các quá trình đồng hóa sau đó của S thành dạng chất hữu cơ Tóm tắt các con đường tạo nên chu trình sinh địa hóa của S được tóm tắt và minh họa như Hình 1 [55] Các hợp chất lưu huỳnh vô cơ dưới trạng thái oxy hóa được ước tính chiếm gần một nửa trong toàn bộ chu trình lưu huỳnh trên hành tinh này Vi khuẩn và cổ khuẩn giữ vai trò hình thành các dạng oxy hóa của

lưu huỳnh từ các hợp chất khử; chúng thuộc nhóm các sinh vật hóa dưỡng vô cơ hoặc

quang dưỡng vô cơ [29],[48] [97]

Hình 1 Mô hình chu trình sinh địa hóa của lưu huỳnh [55]

1.1.2 Vai trò của vi khuẩn trong chu trình sinh địa hóa lưu huỳnh

Các phản ứng khử lưu huỳnh có thể được diễn ra theo hai cách: đồng hóa hoặc dị hóa Trong con đường khử đồng hóa, S dạng khử thường được dùng cho các phản sinh tổng hợp axit amin và protein, trong khi đó với con đường khử trong dị hóa, sulfate bị khử thành sulfide vô cơ bởi các vi khuẩn khử sulfate kỵ khí bắt buộc Quá trình khử sulfur diễn ra thông qua hệ thống sulfur reductase dị hóa, tồn tại ở cả các loài vi khuẩn và cổ khuẩn khử sulfate (Wagner, 1998) Vi khuẩn và cổ khuẩn thuộc

nhóm này có thể kể đến, tương ứng gồm Desulfurella, Desulfuromonas, Geobacter,

Pelobacter,v.v… và Thermoproteales, Thermococcales, Sulfolobales, Pyrodictales,,

v.v…

Oxy hóa lưu huỳnh là một trong những phản ứng phổ biến nhất trong môi trường[30] và là phản ứng quan trọng trong đất để tránh cho thực vật bị thiếu hụt lưu

huỳnh và tránh ô nhiễm môi trường Cổ khuẩn và vi khuẩn có tham gia vào các phản ứng oxy hóa lưu huỳnh Phần lớn các nhóm vi sinh vật này dùng CO2 là nguồn carbon chính và S là chất cho điện tử [30] [14] Các hợp chất lưu huỳnh được sử dụng bởi nhóm vi sinh vật này gồm sulfides (S2-, HS-, H2S), polysulfides (-S-Sn-S-), S nguyên tố (S0), tetrathionate (S4O62-), sulfite (SO32-), và thiosulfate (S2O32-) [59]

Tất cả các cổ khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa lưu đều là sinh vật hiếu

khí và thuộc Bộ Sulfolobales [32] [54], được đặc trưng bởi các vi khuẩn ưa axit (các

vi khuẩn cực trị cần pH thấp để phát triển) và các vi khuẩn ưa nhiệt (các vi khuẩn cực trị cần nhiệt độ cao để phát triển) Các loài được nghiên cứu nhiều nhất là chi

Sulfolobus, một cổ khuẩn hiếu khí, và Acidianus, một nhóm kỵ khí tùy tiện

Trong khi đó, vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh (SOB) là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí hoặc tùy tiện, và hầu hết chúng là sinh vật tự dưỡng, có thể sử dụng CO2 hoặc các hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon [27] SOB phong phú và được nghiên cứu nhiều

nhất thuộc họ Thiobacilliaceae trong môi trường trên cạn và họ Beggiatoaceae trong

môi trường nước [27]

SOB hiếu khí chủ yếu là vi khuẩn ưa nhiệt, phát triển ở nhiệt độ và pH vừa phải, mặc dù một số là ưa nhiệt và/hoặc ưa axit Ngoài các họ này, các SOB khác

được mô tả thuộc về chi Acidithiobacillus [47], Aquaspirillum [28], Aquifex [41],

Bacillus [9], Methylobacteria [49], Paracoccus, Pseudomonas [28], Starkey, Thermithiobacillus [47] và Xanthobacter [28] Mặt khác, sợi khuẩn đa bào thuộc họ Desulfobulbaceae (Deltaproteobacteria) với các đại diện là hai chi ứng viên

Electronema và Electrothrix [95] không thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

SOB kỵ khí chủ yếu là quang tự dưỡng ưa pH trung tính/nhiệt độ trung bình, lấy năng lượng từ ánh sáng nhưng sử dụng các hợp chất lưu huỳnh dạng khử làm chất cho hydro hoặc điện tử để quang hợp (thay vì nước) SOB kỵ khí bao gồm một số vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (Chlorobiaceae), cũng như vi khuẩn lưu huỳnh màu tía

(Chromatiaceae), như Allochromatium [43] và vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía

(Rhodospirillaceae) [14] và một số vi khuẩn lam Cyanobacteria [27] Vi khuẩn lam kỵ khí oxy hóa lưu huỳnh chỉ có khả năng oxy hóa sunfua thành lưu huỳnh nguyên

tố và đã được xác định là Oscillatoria, Lyngbya, Aphanotece, Microcoleus và

Phormidium [19] [34] Một số SOB kỵ khí khác như các loài kỵ khí tùy tiện Thiobacillus spp., và Thermothrix sp., là các vi sinh vật hóa tự dưỡng, lấy năng lượng

từ quá trình oxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh, sau đó được sử dụng để cố định CO2 Những loại khác, chẳng hạn như một số vi khuẩn màu lục dạng sợi (Chloroflexaceae), là vi khuẩn hỗn hợp Trong số tất cả SOB, nhóm duy nhất oxy hóa trực tiếp sunfua thành sulfate trong lượng oxy dồi dào mà không tích lũy lưu huỳnh

nguyên tố là Thiobacilli Các nhóm khác tích lũy lưu huỳnh nguyên tố, chúng có thể

oxy hóa thành sulfate khi sunfua bị hạn chế hoặc cạn kiệt [27]

Tổng hợp một số đại diện vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh theo các nhóm nhu cầu dinh dưỡng và năng lượng được tóm tắt trong Bảng 1 [76]

Bảng 1 Ví dụ về các SOB thuộc các nhóm dinh dưỡng khác nhau

1

Quang dưỡng vô vơ (GSB)

Năng lượng – Ánh sáng Nguồn Carbon – CO2

Chlorobium limicola Chlorobium tepidum Chromatium

Chloroherpeton, Prosthecochloris, Pelodictyon, Ancalochloris Ectothiorhodospira spp Cgloroflexus aurantiacus Oscillatoria sp Lynbya spp Microcoleus spp Phormidium spp Aphanothece spp

Rhodopseudomonas spp

2

Quang dưỡng vô cơ tùy tiện (vi

khuẩn tía lưu huỳnh - PSB) Năng lượng – Ánh sáng

Allochromatium, Thioalkalicoccus Thioradococcus

Nguồn Carbon – CO2 hoặc hợp chất hữu cơ

Thiococcus Thiocysts Thiospririllum Ectothiorhodospira Halorhodospira Thiorhodospira

3

Hóa dưỡng vô cơ

Năng lượng – các hợp chất khử của lưu huỳnh và nito/sắt reduced sulfur and nitrogen/iron compounds

Nguồn Carbon - CO2

Thiobacillus thioparus Thiobacillus novellas Thiobacillus termophilic Thiobacillus denitrificans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus thiooxidans Acidithiobacillus albertensis Thiomicrospira denitrificans Thiosphaera pantotropha Acidianus brierleyi Thermothrix azorensis

4

Hóa dưỡng vô cơ tùy tiện

Năng lượng — hợp chất khử của lưu huỳnh hoặc hợp chất hữu cơ

Nguồn Carbon - CO2 hoặc hợp chất hữu cơ

Sulfolobus acidocaldarius Sulfolobus metallics Thermothrix thiopara Pseudomonas denitrificans Paracoccus denitrificans

5

Hóa dị dưỡng (mixotrophs)

Năng lượng – các hợp chất khử của lưu huỳnh

Nguồn Carbon – các hợp chất hữu cơ

Beggiatoa alba Thiobacillus intermedius Paracoccus versutus Thiobacillus organoparus Pseudomonas spp

6

Hóa dưỡng hữu cơ

Năng lượng – chất hữu cơ Nguồn Carbon – các hợp chất hữu cơ

Thiobacterium spp Thiomonas permetabolis Pseudomonas acidovorans

1.2 Vi khuẩn tía oxy hóa lưu huỳnh

Vi khuẩn tía oxy hóa lưu huỳnh có thể được chia thành vi khuẩn tía lưu huỳnh (gammaproteobacteria) và vi khuẩn tía không lưu huỳnh (alpha- hoặc betaproteobacteria); chúng là các vi khuẩn gram âm Sắc tố quang hợp điển hình là

BChl a hoặc b và các carotenoid chính bao gồm spirilloxanthin, spheroidene,

lycopene, rhodopsin, và các dẫn xuất của chúng; sắc tố khiến huyền phù tế bào có màu đặc trưng như tím, tím-đỏ, tím violet, đỏ, cam, nâu, vàng nâu (các loài chứa BChl

a) hoặc xanh lục, vàng (các loài chứa BChl b) Sắc tố được sắp xếp dưới dạng các túi,

ống, bó ống hoặc xếp chồng bên trong lớp màng sinh chất bên trong Vi khuẩn tía lưu huỳnh cơ bản chia thành 2 họ chính, gồm Chromatiaceae, có tích lũy lưu huỳnh nguyên tố (S0) bên trong tế bào và Ectothiorhodospiraceae sinh S0 ở bên ngoài tế bào Nhiều đại diện trong nhóm vi khuẩn tía lưu huỳnh là các vi khuẩn ưa cực trị, phát triển tốt nhất trong môi trường muối/pH cao [64] Vi khuẩn tía không lưu huỳnh có thể chia thành 7 họ với tổng cộng khoảng 20 chi đã được ghi nhận Các loài

Rhodobacter và Rhodopseudomonas là đối tượng chính cho các nghiên cứu trong

phòng thí nghiệm về quang hợp thiếu oxy Nhiều loài có một hoặc nhiều đặc điểm trao đổi chất khác thường cũng được biết đến Ví dụ, các loài cực trị sống ở môi trường nóng, lạnh, mặn, kiềm, axit [64]

1.2.1 Chuyển hóa lưu huỳnh ở vi khuẩn tía

Tương đối dễ dàng để có thể nuôi cấy vi khuẩn tía trong phòng thí nghiệm, cơ bản yêu cầu là môi trường kị khí với các khoáng chất và bổ sung hoặc sulfide, bicarbonate (nếu là mô hình quang tự dưỡng), hoặc bổ sung chất hữu cơ (nếu là mô hình quang dị dưỡng) Vì lẽ đó, và cũng bởi quang hợp không oxy là dạng quang hợp đơn giản hơn quang hợp có oxy, vi khuẩn tía là một hệ thống mô hình lý tưởng để

nghiên cứu sinh lý học, hóa sinh học, sinh học phân tử của quá trình quang hợp cũng như quá trình oxy hóa lưu huỳnh

Vi khuẩn tía lưu huỳnh

Trong số các hợp chất khử của lưu huỳnh, sulfide có vai trò mật thiết với sự phát triển của vi khuẩn tía lưu huỳnh, với số lượng lớn các loài thuộc nhóm này đã được ghi nhận ở các môi trường có ánh sáng và có tồn tại sulfide [71][72] [73] Trong trường hợp sinh trưởng dạng quang tự dưỡng, nguồn cho điện tử có thể là sulfide, thiosulfate hoặc H2 [12] [97] Các loài thuộc Chromatium như Chromatium okenii,

Chromatium weissei, và Thiospirillum [96], hay các loài ưa nhiệt như Thermochromatium (Tch.) tepidum [63] đòi hỏi sulfide một cách nghiêm ngặt để có

thể sinh trưởng phát triển Một số ít loài vi khuẩn tía lưu huỳnh có thể sử dụng Fe2+

hoặc NO2- là chất cho điện tử [26] Tuy nhiên ngoài quang tự dưỡng, vi khuẩn tía lưu huỳnh cũng có thể sử dụng carbon hữu cơ là nguồn năng lượng trong một số trường hợp Nhóm vi khuẩn tía lưu huỳnh quang dị dưỡng này gồm đại diện của chi

Allochromatium, có thể khử sulfate thành sulfide và do đó không yêu cầu sulfide từ

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh thường khá linh hoạt trong các con đường tổng hợp năng lượng, có thể phát triển tốt trong điều kiện quang dưỡng hoặc trong tối Sự

phát triển của một số vi khuẩn tía không lưu huỳnh như Rhodobacter capsulatus có

thể diễn ra bằng cách quang hợp với CO2 hoặc carbon hữu cơ, hoặc trong tối bằng

cách hô hấp, lên men hoặc hóa dưỡng vô cơ Điều này khiến Rhodobacter capsulatus

cực kỳ linh hoạt trong các con đường chuyển hóa [62]

Dưới điều kiện quang quang dưỡng không oxy, vi khuẩn tía không lưu huỳnh điển hình có thể quang tự dưỡng với H2 hoặc sulfide (hàm lượng thấp) là chất nhận điện tử, một số ít có thể cũng sử dụng thiosulfate hoặc Fe2+ làm chất cho điện tử [26] Tuy vậy, phần lớn vi khuẩn tía không lưu huỳnh phát triển tốt nhất khi quang dị dưỡng trong môi trường có sẵn nguồn hữu cơ như axit hữu cơ, axit amin, axit béo, carbohydrate hoặc pyruvate, còn NH3 là nguồn ni-tơ (Sojka, 1978) Một số vi khuẩn tía không lưu huỳnh quang đồng hóa các hợp chất thơm như benzoate, dẫn xuất hydroxy của benzoate và cyclohexane carboxylate Nuôi cấy làm giàu sử dụng

benzoate như là nguồn carbon thường thu được các chủng Phaeospirillum fulvum hoặc R palustris [36] Nhiều hợp chất hữu cơ được đồng hóa bởi vi khuẩn tía không

lưu huỳnh sau quá trình quang hợp cũng có thể được sử dụng như là chất cho điện tử và nguồn carbon khi sinh trưởng bằng hô hấp trong tối Khả năng chịu đựng oxy giữa

các loài là khác nhau nhưng một số loài thuộc Rhodobacter có thể phát triển trong

môi trường hiếu khí mạnh [61] Pyruvate [39] hoặc một số đường [60] cũng có thể hỗ trợ sự phát triển dưới hình thức lên men hoặc hô hấp kị khí (dưới điều kiện trong

tối), tiêu biểu là ở Rhodospirillum rubrum và R capsulatus

Một công bố trước đó vào năm 2004 về trình tự hệ gen hoàn chỉnh đầu tiên

của một loài vi khuẩn tía không lưu huỳnh, Rhodopseudomonas palustris, thể hiện rõ

đặc tính cực kỳ linh hoạt trong các con đường chuyển hóa năng lượng [58] Hệ gen của loài này chứa các gen cho phép tế bào chuyển đổi giữ quang dưỡng và hóa dưỡng, tự dưỡng hoặc dị dưỡng và thu nhận năng lượng từ hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ Thật

vậy, dưới điều kiện kị khí, có sánh sáng, R palustris có thể sử dụng lực khử thu được

từ các hợp chất hữu cơ như các axit hữu cơ hay các hợp chất có vòng thơm, hoặc sử dụng điện tử từ các hợp chất vô cơ như hydro hoặc thiosulfate[25] Khi phát triển dưới hình thức hóa dưỡng hiếu khí hoặc quang dưỡng kị khí, quá trình hô hấp xảy ra và lực khử có thể thu được từ các hợp chất vô cơ và hữu cơ Khi không có ánh sáng và oxy, quá trình hô hấp kị khí có thể diễn ra, sử dụng NO3- hoặc N2O làm chất nhận

điện tử cuối cùng [67] Điều này thể hiện vi khuẩn tía nói chung và vi khuẩn tía không lưu huỳnh nói riêng là nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm thú vị, có khả năng thích nghi ở các dạng sinh thái đa dạng [42] [44] và đóng góp rất tích cực vào chu trình lưu huỳnh tại môi trường sinh sống của chúng

1.2.2 Các quá trình và hệ thống enzyme oxy hóa hợp chất lưu huỳnh ở vi khuẩn tía

1.2.2.1 Hấp thụ lưu huỳnh từ môi trường ngoài

Nhiều vi khuẩn tía lưu huỳnh và một số vi khuẩn tía không lưu huỳnh có thể oxy hóa lưu huỳnh nguyên tố rắn, không hòa tan được cung cấp từ ngoài Đây là một quá trình sinh hóa đòi hỏi khắt khe vì nguyên tố lưu huỳnh cực kỳ kỵ nước và thực tế không tan trong nước Việc sử dụng lưu huỳnh nguyên tố rắn phải bao gồm liên kết, kích hoạt lưu huỳnh và vận chuyển nội bào Ngoài ra, lưu huỳnh nguyên tố không thể bị tấn công bởi các phản ứng oxy hóa khi không có O2 trong điều kiện kị khí Tuy nhiên, người ta biết rất ít về sự hấp thụ và biến đổi lưu huỳnh nguyên tố ở vi khuẩn lưu huỳnh quang dưỡng Các enzyme xúc tác quá trình hấp thụ và oxy hóa lưu huỳnh nguyên tố (được cung cấp từ bên ngoài) vẫn chưa được phân lập từ các sinh vật quang

dưỡng Ở các loài oxy hóa lưu huỳnh ưa axit như Acidithibacillus và Acidiphilium đã

có ý tưởng rằng lưu huỳnh nguyên tố ngoại bào được số định bởi các nhóm thiol của các protein đặc biệt ở màng ngoài rồi được chuyển vào khoang chu chất [78]; thật vậy, đã có bằng chứng bước đầu về sự tồn tại của protein màng đó [75] Một ý tưởng khác là sự hình thành các sản phẩm trung gian như sulfide hay polysulfide trong quá trình hấp thụ S0 vẫn chưa được hỗ trợ qua ghi nhận thực tế Trong khi vi khuẩn tía

lưu huỳnh như Alc vinosum chứa các protein DSR có liên quan đến quá trình oxy

hóa lưu huỳnh do chính các sinh vật sản sinh [21] hoàn toàn không rõ vi khuẩn tía

không lưu huỳnh thiếu gen dsr sẽ oxy hóa lưu huỳnh nguyên tố như thế nào Một khả

năng có thể xảy ra là hệ thống enzyme SOX

1.2.2.2 Quá trình oxy hóa polysulfide

Ở một số loài vi khuẩn tía (và cả vi khuẩn lục oxy hóa lưu huỳnh), sản phẩm chính của quá trình oxy hóa sunfide là polysulfide Việc sử dụng polysulfide bổ sung

từ bên ngoài đã được nghiên cứu ở Allochromatium vinosum và Thiocapsa

roseopersicina Cả hai sinh vật đều dễ dàng sử dụng các hợp chất này làm chất cho

điện tử [91][101] Hiện tại con đường mà polysulfide được chuyển đổi thành các hạt lưu huỳnh vẫn chưa được biết rõ Về mặt lý thuyết, quá trình này có thể xảy ra ngẫu nhiên, hoàn toàn về mặt hóa học vì polysulfide ở trạng thái cân bằng với lưu huỳnh nguyên tố [91]

1.2.2.3 Sự oxy hóa H2S (sulfide) thành S0

Một số enzyme đã được đề xuất cho quá trình oxy hóa sulfide Chúng bao gồm SQR, flavorcytochrome c và hệ thống Sox

Hệ thống enzyme Sox Ở Rhodovulum sulfidophilum, một vi khuẩn tía không

lưu huỳnh thuộc họ Rhodobacteraceae, hệ thống enzyme Sox xúc tác cho phản ứng

oxy hóa thiosulfate thành sulfate cũng là không thể thiếu được đối với quá trình oxy

hóa sulfide in vivo [8] Điều này được suy luận là cũng sẽ đúng ở các vi khuẩn tía không lưu huỳnh có các gen sox Tuy nhiên ở loài Allochromatium vinosum, với đột biến thiếu gen flavocytochrome c, sox hoặc thiếu cả hai nhóm gen, việc oxy hóa

sulfide diễn ra với tốc độ tương đương như chủng không đột biến Điều này cho thấy rằng SQR thể hiện vai trò chính trong oxy hóa sulfate Sự xuất hiện của gen sox vi khuẩn lưu huỳnh màu tía và xanh cho thấy mối tương quan với khả năng oxy hóa thiosulfate [77]

Flavocytochrome c (FCC) là một enzyme hòa tan tồn tại tại ở khoảng gian

chu chất; enzyme này cấu thành từ các dưới đơn vị lớn FccB flavoprotein có chức năng bám sulfure và các dưới đơn vị FccA cytochrome c nhỏ hơn Trong phòng thí nghiệm, phản ứng chuyển điện tử từ H2S sang các cytochrome nhỏ có thể được xúc tác bởi flavocytochrome, và các điện tử này có thể được sử dụng sau đó trong các trung tâm phản ứng quang tổng hợp Tuy nhiên trong thực tế, vài trò của

flavocytochrome chưa được rõ ràng vì một số lý do [56] Một trong các lý do có thể kể đến, ví dụ như một số vi khuẩn trong nhóm vi khuẩn tía (và cả vi khuẩn lưu huỳnh màu xanh) oxy hóa H2S mà không tổng hợp enzyme này Đó là bởi vì cả 2 họ có một con đường oxy hóa khác, và đó là sulfide:quinone oxidoreductase [7] [70]

Hình 2 Mô hình đề xuất về các quá trình oxy hóa lưu huỳnh trong vi khuẩn

Sơ đồ được chỉnh sửa bởi nhóm của Thomas Weissgerber [104] từ công bố của

Frigaar và cộng sự [31]

Sulfide:quinone oxidoreductase (SQR) xúc tác phản ứng oxy hóa H2S bởi isoprenoid quinones đã được phát hiện ở cả vi khuẩn hóa dưỡng và quang dưỡng, và ty thể của nhân thực [37] [93] SQR là một enzyme bám màng với hoạt tính hóa sinh đã được xác định ở vi khuẩn xanh lưu huỳnh và vi khuẩn tía lưu huỳnh và có lẽ còn cung cấp điện tử cho dòng điện tử của hệ thống quan hợp sử dụng một phức hệ Rieske FeS protein và cytochrome b oxy hóa quinone [77] [86] Thử nghiệm thêm-mất đoạn

trên gen sqr của vi khuẩn R capsulatus cho thấy chủng đột biến không có khả năng

sinh trưởng quang tự dưỡng, không còn khả năng tích tụ lưu huỳnh nguyên tố bên ngoài tế bào dưới điều kiện dị dưỡng, không tiêu thụ sulfide trong môi trường; hoạt tính SQR cũng không được phát hiện thấy qua phân tích Western blot đối với mẫu xử lý màng tế bào Ngược lại, biểu hiện quá mức SQR dẫn đến tăng hoạt tính oxy hóa sulfide ở màng tế bào tăng cấp 6 – 7 lần so với chủng dại [33] Điều này có thể cho phép nhận định SQR là enzyme duy nhất thực hiện hoạt động oxy hóa sulfide ở vi

sinh vật này

1.2.2.4 Sự oxy hóa sulfite thành sulfate

Hai con đường cơ bản khác nhau cho quá trình oxy hóa sulfite đã được mô tả khá rõ ở một số vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh quang dưỡng và hóa dưỡng [46]: (a) quá trình oxy hóa trực tiếp bởi sulfite dehydrogenase (EC 1.8.2.1) – enzyme có thể chứa molypden; và (b) quá trình oxy hóa gián tiếp, AMP-dependent oxidation via the intermediate adenylylsulfate ( adenosine-5´-phosphosulfate, APS) Cho đến nay, không có bằng chứng nào cho thấy sự xuất hiện của dạng oxy hóa sulfite của con đường APS reductase ở Alpha- và Betaproteobacteria hoặc ở Ectothiorhodospiraceae Dahl và cộng sự (2008) trước đó đã trình bày chi tiết hơn về quá trình oxy hóa sulfite ở vi khuẩn tía lưu huỳnh [20]

1.3 Sulfide:Quinone Oxidoreductase (SQR) 1.3.1 Một số đặc tính hóa sinh và cấu trúc của SQR

Việc tìm kiếm yếu tố cảm ứng cho phép diễn ra quá trình oxy hóa sulfide trong

quang hợp ở vi khuẩn lam Oscillatoria limnetica đã dẫn tới phát hiện về

sulfide-quinone reductase (E.C.1.8.5.’) [83] SQR dạng hoạt động sau khi được phân lập là một enzyme bám màng, kị nước, bao gồm một chuỗi polypeptide có trọng lượng phân tử khoảng 57 kDa dựa theo phương pháp điện di biến tính SDS-PAGE Enzyme này có ái lực cao với sulfide (Km = 8 mM) và quinone (Km = 31 mM với plastoquinone-1 [PQ-1]), được hỗ trợ bởi một flavin cofactor và nhảy cảm với các đồng phân

quinone và KCN [10] [86] SQR từ R capsulatus cũng từng được phân lập gồm 427

axit amin và có trọng lượng phân tử khoảng 47 kDa, mang tích điện +1; trình tự axit

amin đầu N có sự tương đồng cao (72%) với trình tự đầu N của O Limnetica [10], bao trùm domain bám FAD tại phần trình tự này Bên cạnh đó, enzyme từ R

capsulatus cũng khác với O limnetica về vị trí bám quinone, kéo theo ái lực cao với

ubiquinone ở R capsulatus thay vì plastoquinone ở O Limnetica [80]

Cả SQR và FCC đều là các enzyme thuộc họ flavin disulfide reductases (FDR) Nhóm I, mang hoạt tính glutathione & thioredoxin reductases và dihydrolipoamide dehydrogenases Thành viên thuộc họ enzyme này đã được xác định là có 2 trung tâm oxy hóa-khử, một trong đó là trung tâm bám cofactor FAD Trung tâm oxy-hóa khử còn lại định vị gần flavin, có thể là một cặp gốc cysteine, một axit cysteine-sulfenic hoặc một cầu disulfide hỗn hợp Cys-S-S-CoA [105] SQR ở các loài khác nhau đặc trưng ở kiểu bám FAD, các kênh để sulfide tiếp cận và vị trí oxy hóa sulfide Các enzyme thuộc FDR Nhóm I thường liên kết không cộng hóa trị với FAD, tuy nhiên SQR đã được ghi nhận là có liên kết cộng hóa trị với cofactor này [40] Đặc trưng giữa các SQR sẽ là vị trí của gốc cysteine liên kết với vòng isoalloxazine của FAD, cũng như độ dài liên kết giữa cysteine đó với nguyên tử C8M Ví dụ, gốc cysteine đó

là Cys124 ở SQR của A aeolicus và Cys129 của A Ambivalens [65] Ở các enzyme

FDR Nhóm I điển hình, một cặp cysteine khác tạo thành cầu disulfide tại trung tâm oxy hóa khử thứ hai; hai cysteine nằm gần FAD thường bảo thủ và một trong hai cysteine liên kết cộng hóa trị với nguyên tử C4M của FAD trong chu kỳ phản ứng Trái lại, FAD không liên kết cộng hóa trị với cả hai gốc cysteine của SQR do chúng thường nằm xa nhau và đều có khoảng cách khá lớn để có thể duy trì liên kết cộng hóa trị với FAD [65]

Đặc trưng tiếp theo của SQR là các vùng cản trở NAD(P)H, hay còn gọi là “capping loop” Thông thường ở FDR nhóm I, vòng isoalloxazine của FAD đã liên kế có thể tiếp cận được với dung môi và bám NAP(P)H mà không bị cản trở về không gian Trong khi đó ở SQR của vi khuẩn tía, đây là đoạn polypeptide giúp đảm bảo rằng chỉ có duy nhất sulfide tiếp cận được trung tâm phản ứng Capping loop có thể

là Gly154-Cys178 như ở A ambivalens hay Val294-Lys312 ở A aeolicus Hệ quả là

nếu sulfide không thể trực tiếp tiếp cận tới vị trí xúc tác, chúng phải đi qua “kênh” mà các kênh này có thể cũng chứa các gốc axit amin đặc trưng theo loài [65]

Vùng chức năng tiếp theo của các phân họ FDR là vùng trình tự đầu C hay “interface domain” Trong trường hợp enzyme SQR, interface domain hỗ trợ cho sự tương tác với chất nhận điện tử - ở đây là các quinone Interface domain có thể cũng

khác biệt giữa các loài có SQR cùng họ SQR của A aeolicus có 2 vòng xoắn lưỡng

tính (vừa ưa nước, vừa kị nước) gồm các axit amin 376–412, cần thiết cho việc hình thành kênh để quinone đi vào; 18 axit amin tiếp theo ở đầu C (gốc 413–430) hỗ trợ sự hình thành trimer và có thể tạo ra độ “cứng” cần thiết để có được sự tương tác màng ổn định và đặc hiệu

Không giống như FCC khi vận chuyển điện tử từ sulfide tới cytochrome c (C pool) hòa tan trong khoang chu chất, enzyme SQR khử các quinone (Q pool) có mặt trên màng quang hợp hoặc màng sinh chất của tế bào Tùy thuộc vào loại vận chuyển điện tử mà các loại quinone thực tế tham gia và các thông số sinh hóa của các phản ứng được xúc tác, các con đường trao đổi chất mà SQR tham gia có thể rất đa dạng,

như quang dưỡng kị khí ở vi khuẩn tía không lưu huỳnh (R capsulatus) [85], vi khuẩn tía lưu huỳnh (A vinosum) [86], vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (Chlorobium) [84], và khi khuẩn không lưu huỳnh màu lục (C aurantiacus) [86], hóa tự dưỡng không quang hợp như P denitrificans [80], Wolinella succinogens, và Aquifex aeolicus; và ở ty thể của giun biển chịu lưu huỳnh Arenicola marina [80]

1.3.2 Cơ chế xúc tác của SQR

SQR xúc tác quá trình oxy hóa sulfide thành lưu huỳnh nguyên tố bằng cách truyền hai electron từ một ion sulfide, thông qua FAD cofactor, tới bể quinone trên màng Tuy nhiên quá trình xúc tác enzyme hai bước này chưa được hiểu cặn kẽ Phần khử của phản ứng xúc tác enzyme đã được nghiên cứu bởi một số nhóm tác giả [13][18][38][66] Đặc điểm chung của các cơ chế đã được đề xuất là một ion sulfide ban đầu khử cầu disulfide ở trung tâm hoạt động oxy hóa khử; sau đó một trong các gốc cysteine bị khử, trong trạng thái của một thiolate hoặc một disulfide, sẽ tấn công kiểu ái nhân nguyên tử mục tiêu trên vòng isoalloxazine của FAD và hình thành một

sản phẩm cộng hóa trị Gốc cysteine còn lại như là một thiol hoặc disulfide tấn công liên kết mới hình thành của sản phẩm cộng và giải phóng cofactor đã khử Hệ quả là FAD nhận hai electron từ một ion sulfide, trong khi đó ion sulfide bị oxy hóa thành lưu huỳnh nguyên tử, để tiếp theo kết hợp thành chuỗi polysulfur kết nối với một hoặc hai gốc cysteine xúc tác Chuỗi polysulfur phát triển sau mỗi chu kỳ oxy hóa khử cho đến khi nó không thể vừa với vị trí hoạt động nữa, sản phẩm polysulfur (có thể ở dạng octasulfur) được giải phóng Đề xuất về nửa phản ứng khử được minh họa trong hình 3 [38] Trong một số cơ chế, các gốc cysteine xúc tác khác nhau được đề xuất là tác nhân ái nhân (nucleophile); chúng tấn công các nguyên tử mục tiêu khác nhau trong FAD, C4A hoặc C8M Sự khác biệt giữa các cơ chế được đề xuất đã được tóm tắt trong Bảng 2 [17] Hiểu biết về phần oxy hóa của phản ứng bao gồm việc chuyển electron từ FAD sang quinone cần nhiều nghiên cứu chuyên sâu hơn

Bảng 2 Tóm tắt các cơ chế hoạt động của enzyme SQR

Hình 3 Cơ chế đề xuất của nửa xúc tác khử bởi SQR [38]

Dạng oxy hóa của SQR (trạng thái 1) ở trạng thái cân bằng với trạng thái 2 bằng cách trao đổi disulfide Phản ứng với phân tử sunfide tạo ra persulfide ở C353 và thiol ở C127 (trạng thái 3) Bằng sự tấn công ái nhân của phân tử sunfide thứ hai lên persulfide, nhóm thiol ở C353 được phục hồi và phân tử persulfide tự do là sản phẩm chính được giải phóng khỏi enzyme Base của vị trí hoạt động E165 tách proton từ nhóm thiol của C159, dẫn đến phức chất truyền điện tích với thiolate của C159 là chất cho và FAD bị oxy hóa làm chất nhận, như được mô tả ở trạng thái 4 Sự khử FAD xảy ra thông qua cộng hóa trị cộng giữa flavin C(4a) và C159 (trạng thái 5), dẫn đến khử flavin và tạo cầu nối disulfide giữa C159 và C127 (trạng thái 6) [38]

1.3.3 Phân loại SQR

Ở các SQR khác nhau, FAD có thể liên kết cộng hóa trị với một cysteine bảo

thủ và quan trọng về mặt xúc tác (ví dụ Cys128 ở A ferrooxidans) hoặc liên kết không cộng hóa trị như SQR từ A ferrooxidan [66] SQR cũng chứa một cầu poly sulfide

có hoạt tính oxy hóa khử hình thành giữa hai gốc cysteine xúc tác đặc trưng theo loài Ba gốc cysteine và FAD cofactor hình thành vị trí hoạt động của SQR

Do tính đa dạng của các enzyme SQR, đã có nhiều nỗ lực để phân loại chúng Theissen và cộng sự đã nghiên cứu SQR ở sinh vật nhân chuẩn và xác định ra ba nhóm có một số điểm không chắc chắn [93] Phạm Vĩnh Hòa và cộng sự đã thiết lập sáu lớp dựa trên các trình tự giống Sqr được khuếch đại từ các trầm tích khác nhau [74], với độ phân giải chủng loại phát sinh gen sâu hơn trước Tập hợp thông tin trình

tự có sẵn được công khai ngày càng nhiều và các cấu trúc 3D của SQR loại I của A

aeolicus (ID PDB: 3HYW) [65] và Acidithiobacillus ferrooxidans (ID PDB: 3T2Z)

[18] và SQR loại V của Acidianus ambivalens (ID PDB: 3H8I) [13] đã tạo điều kiện

cho việc thiết lập một cách phân loại mới cho SQR thành sáu nhóm sử dụng các dấu vân tay trình tự dựa trên cấu trúc [66] Sự phân loại này và dấu vân tay phân tử tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu về sự tương tác cofactor, con đường mà sulfide tiếp cận đến vị trí xúc tác phản ứng, sự liên kết của cơ chất quinone cũng như cơ chế phân tử chi tiết của phản ứng enzyme, cùng nhiều cơ chế khác Dựa trên sự tương đồng của các đặc điểm này trong mỗi nhóm, có thể dự đoán được đặc tính sinh

hóa tổng quan và hành vi chức năng tương tự Các thông tin tổng quan được tóm tắt trong Bảng 3 và Hình 4, tham khảo đề xuất phân loại của Marcia và cộng sự [66]

Bảng 3 Tổng hợp các vùng và các các axit amin đặc trưng ở 6 loại SQR

Dựa trên cấu trúc của A Aeolicus và A ambivalens SQR và A vinosum FCSD

Hình 4 So sánh các trình tự protein SQR với các gốc cysteine bảo thủ ở

nhiều loại sulfie:quinone oxidoreductases [66]

(đánh số theo trình tự của Aquifex aeolicus và Thiocapsa roseopersicina) Các cấu

trúc minh họa (ngoài cùng bên phải) chỉ ra vị trí gần đúng của các cystein bảo thủ so với vòng isoalloxazine của FAD, dựa trên cấu trúc của các loại sulfie:quinone oxyoreductase khác nhau [22]

Để làm ví dụ về tính xác thực và sức mạnh của dự đoán này, Nagy và cộng sự

đã chỉ ra rằng SQR loại I của Synechocystis PCC6803 cung cấp điện tử cho chuỗi vận

chuyển điện tử quang hợp khi có mặt sunfide, phù hợp với quá trình quang hợp không

tạo oxy, dựa trên sunfide, đã được báo cáo đối với Oscillatoria limnetica (Shahak Y

A., 1987), một loại vi khuẩn lam khác có cùng SQR loại I [10] Sự biểu hiện cảm ứng theo sulfide của gen mã hóa cũng là một dấu hiệu của chức năng liên quan đến sulfide, trong khi ngược lại, biểu hiện liên tục đã được báo cáo đối với các enzyme SQR của

Allochomatium vinosum [20] [77], Rhodobacter capsulatus [81] [82] và Aquiflex aeolicus [66] [69] Tuy nhiên, điều đáng chú ý là bộ gen của một số vi khuẩn chứa

nhiều hơn một bản sao gen mã hóa các enzyme sulfide oxyase thuộc các lớp khác

nhau Ví dụ, Allochomatium vinosum chứa hai enzyme SQR thuộc các nhóm riêng biệt, loại IV và VI [103] Ở loài Chlorobaculum tepidum, bốn gen sqr tiềm năng đã

được xác định, và trong số này, hai gen mã hóa chức năng sulfide:quinone oxidoreductases [16] Cấu hình biểu hiện phụ thuộc sulfide của các chủng này cũng

được phân tích bằng các phương pháp hiệu suất cao, và trong khi ở A vinosum, sự biểu hiện của gen sqr hầu như không nhạy cảm với sự hiện diện của sulfide [103] [104], ở C tepidum, biểu hiện gen CT1087 sqr phản ứng nhanh với sulfide [24]

1.4 Tính hình nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh tại Việt Nam

Trong hơn hai thập kỷ qua, tại Việt Nam, các nhà nghiên cứu đã dần quan tâm hiều hơn đến các vi sinh vật oxy hóa các hợp chất khử vô cơ của lưu huỳnh, bắt đầu từ những nghiên cứu phân loại Nhiều nghiên cứu sau đó tập trung vào việc thu thập, tuyển chọn các vi khuẩn có khả năng xỷ lý lưu huỳnh trong các mẫu nước thải sinh hoạt, nước thải nhà máy và đã đạt được những kết quả hứu hẹn Cũng từ năm 1997, vi khuẩn tía quang hợp đã được nhóm tác giả Đỗ Thị Tố Uyên và Trần Văn Nhị nghiên cứu ứng dụng xử lý chất thải hữu cơ đậm đặc tại nội thành Hà Nội, giúp giảm

80% nhu cầu oxy hóa sinh (BOD) từ 870 mg/L đầu vào, trong đó sulfide giảm 70%, sử dụng một hệ thống bể phản ứng quang sinh liên tục [1] Tiếp nối công việc đó, nhóm tác giả này (1999) tiếp tục thử nghiệm ứng dụng các vi khuẩn tía để xử lý các mẫu nước thải chăn nuôi hay nước thải sản xuất bia, bột giấy… cho khả năng loại bỏ 85 – 94% BOD từ mẫu nước thải đầu vào 618 - 1423 mg/L BOD; thời gian xử lý kéo dài 5 ngày [5] Năm 2007, tác giả Đinh Thị Thu Hằng đã tuyển chọn và phát hiện hoạt tính enzyme benzoate-CoAligase từ các chủng vi khuẩn tía không quang hợp, cho phép chúng có tiềm năng xử lý các chất thải hữu cơ mạch vòng khó phân hủy như benzoate và 4-hydroxybenzoate [4] Ở Việt Nam cũng đã có những nghiên cứu từ rất sớm nhằm ứng dụng vi khuẩn tía để thu một số hoạt chất sinh học như Ubiquinone [2] hay aminolevulinic acid [3]; sinh khối các chủng vi khuẩn này cũng đã được ứng dụng để làm thức ăn cho luân trùng và các loài thủy hải sản 2 mảnh vỏ

Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu tại Việt Nam công bố có liên quan đến đặc tính hóa sinh của các enzyme được cho là tham gia vào quá trình oxy hóa lưu huỳnh Những nghiên cứu cơ bản như vậy có thể mang lại hiểu biết sâu hơn về cơ chế một số phản ứng và cách mà các vi khuẩn mô hình phản ứng, thích nghi với các điều kiện tự nhiên và nhân tạo, qua đó có tiềm năng tạo ra các chủng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh hiệu quả, kinh tế hơn Với mục tiêu đó, chúng tôi thực hiện đề tài

nghiên cứu “PHÂN TÍCH GEN VÀ ENZYME SQR Ở MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN OXY HÓA LƯU HUỲNH PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM”.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và các thiết bị máy móc

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu phân lập vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh: mẫu nước được thu thập từ sông Kim Ngưu có dòng nước thải sinh hoạt từ khu vực đông dân cư đổ ra; theo ghi nhận nguồn nước tại nơi lấy mẫu có màu đen, có nhiều phản ánh về vấn đề bốc mùi hôi thối, trong đó có mùi trứng thối đặc trưng của H2S

Hình 5 Vị trí lấy mẫu nước thải tại sông Kim Ngưu

- Chủng vi khuẩn tía không lưu huỳnh Rhodobacter capsulatus PAM 34 và

Rhodopseudomonas palustris PAM36 được cung cấp bởi GREENLAB – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.1.2 Các thiết bị máy móc

Các máy móc và thiết bị sử dụng trong quá trình thí nghiệm thuộc về Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Protein - Enzyme (KLEPT) và Phòng Thí nghiệm Nghiên cứu Môi trường (LER), trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội:

• Máy lắc ổn nhiệt Eppendorf Innova 44

• Máy đo pH Hanna Instruments HI2211, Hoa Kỳ • Sigma 3k30 Centrifuge, Sartorius, Đức

• Máy ly tâm lạnh Eppendorf 5417R, Đức • Tủ an toàn sinh học cấp độ II

• Máy đo quang phổ Thermo Scientific BioMate 3, Hoa Kỳ • Bể ổn nhiệt Julabo ED-5, Đức

• Máy PCR Thermal Cycler Gen Atlas, Bio Astec, Nhật Bản • Bộ điện di Biorad, Hoa Kỳ

2.1.3 Các hóa chất và dung dịch sử dụng

- Hóa chất tách ADN: Tris (Bio Basic, Canada), HCl, Na2EDTA, NaCl (Merck, Đức), Lysozyme (Sigma, Đức), Proteinase K (Bioneer, Hàn Quốc), Isopropanol (Merck, Đức), cồn tuyệt đối (EMSURE, Merck, Đức), EDTA (Bio Basic, Canada), Chloroform (Thermo Fisher Scientific, Mỹ), Isoamyl alcohol (Thermo Fisher Scientific, Mỹ), nước không chứa nuclease (Thermo Fisher Scientific, Mỹ)

- Hóa chất PCR: DreamTaq PCR Master Mix (2X) và nước không chứa nuclease (Thermo Fisher Scientific, Mỹ), mồi PCR 100 µM (Công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa, Việt Nam) Trình tự cặp mồi khuếch đại 16S rRNA [57], [90], các cặp mồi

khuếch đại gen sqr từ PAM34 và PAM36 được cho trong bảng 4

Bảng 4 Thông tin các cặp mồi PCR

Tên mồi

Khuếch đại

Kích cỡ sản phẩm trên

- Hóa chất tách protein vi khuẩn: Tris-HCl 0.01M, pH 7.3 và MgCl2 0.03M (Buffer I); 0.1M potassium phosphate buffer (Buffer II) pH = 7.5 gồm: 12,813g K2HPO4 và 3,598g KH2PO4; chloroform (Thermo Scientific, Mỹ); cồn tuyệt đối (EMSURE, Merck, Đức)

2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường nuôi cấy sử dụng trong quá trình bao gồm hai môi trường cơ bản phân lập, tuyển chọn vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh (Rodina và MSM):

Bảng 5 Các môi trường được sử dụng trong phân lập, tuyển chọn vi khuẩn

oxy hóa lưu huỳnh

K2HPO4

NH4Cl MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O Na2S2O3.5H2O Agar

3 g/L 2 g/L 0.5 g/L 0.136 g/L 10 g/L 15 g/L

KNO3

NH4Cl KH2PO4

NaHCO3

MgSO4.7H2O Na2S2O3

2 g/L 1 g/L 2 g/L 2 g/L 0.8 g/L 5 g/L

H2O Trace element solution

Agar H2O

1 mL/L 15 g/L

15 g bột agar được thêm vào các môi trường lỏng (mỗi lít) để thu được môi trường thạch rắn dùng cho các bước cấy trải

- Môi trường nuôi cấy R capsulatus PAM 34 và Rhodopseudomonas palustris

PAM36 được chuẩn bị với thành phần (g/l): KH2PO4 - 0,33; MgSO4.7H2O - 0,588; NaCl - 0,33; NH4Cl - 0,5; CaCl2 - 0,038; (CH2COOH)2 - 2; cao nấm men - 1,02; agar - 16 (không bổ sung đối với môi trường lỏng); pH=7

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn

* Phương pháp lấy mẫu nước thải:

Dụng cụ lấy mẫu bao gồm ống falcon 50ml đã khử trùng, dụng cụ chuyên dụng cho việc lấy mẫu nước và hộp đá giữ nhiệt Dụng cụ lấy mẫu được cho xuống độ sâu khoảng 20-30 cm dưới bề mặt nước rồi đưa lên Năm mươi ml nước thải được thu vào ống falcon và giữ lạnh trong đá Các ống falcon này sau đó được đưa về phòng thí nghiệm để nuôi làm giàu

* Phương pháp phân lập vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh trong phòng thí nghiệm

Các mẫu nước thải được làm giàu bằng cách nuôi tăng sinh trong các bình tam giác 250ml với tỉ lệ 10 ml mẫu nước và 90 ml môi trườngRodina vàMSM Các mẫu nuôi tăng sinh được nuôi lắc trong tủ lắc ổn nhiệt ở 30℃, 140 vòng/phút trong tối thiếu 7 ngày

Sau 7 ngày nuôi, các bình nuôi được kiểm tra pH và cấy trải ra đĩa thạch với môi trường tương ứng Dịch nuôi cấy được pha loãng ra các nồng độ và trải đều từ 50-100 µL lên các đĩa thạch Rodina và MSM Các đĩa thạch sau đó được bọc parafilm

và nuôi ở nhiệt độ 30℃ trong tối thiếu 7 ngày Khi trên các đĩa đã có xuất hiện khuẩn lạc, sàng lọc ra các khuẩn lạc có hình thái khác nhau và cấy riêng rẽ ra các đĩa thạch mới với cùng loại môi trường của đĩa trải Các đĩa này được cấy chuyển và tinh sạch mỗi 7 ngày cho tới khi thu được khuẩn lạc có hình thái đồng nhất

* Tuyển chọn vi khuẩn

Đánh giá khả năng làm giảm pH: Thí nghiệm được tiến hành ở các mốc thời gian 0, 2, 4, 6, 7 ngày nuôi cấy, thí nghiệm trên mẫu chứa chủng vi khuẩn nuôi cấy và mẫu đối chứng không bổ sung vi khuẩn

2.2.2 Phương pháp định danh chủng vi khuẩn

Lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa thạch và hòa tan 10 µL nước PCR Ly giải ở 96 độ trong 15 phút Sau đó, ly tâm ở 13 000 rpm trong 1 phút, hút dịch trên để làm khuôn cho phản ứng PCR.Các thành phần trong phản ứng PCR cho trong Bảng 6

Bảng 6 Thành phần và chu trình phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA

Thành phần phản ứng Thể tích

- 30 chu kì: 95oC/1 phút, 53oC/45s, 72oC/1 phút); - Tổng hợp cuối cùng: 72oC/7 phút

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel Agarose 1%, nhuộm băng bằng dung dịch bromide ethidium trong 15 phút và soi trên máy Geldoc Sản phẩm khuếch đại bằng PCR được gửi tới công ty 1st BASE để giải trình tự Kết quả giải trình tự gửi về được so sánh với các trình tự đã có trong GenBank sử dụng giao diện tìm kiếm “bp-bp BLAST” của Trung tâm Tin – Công nghệ sinh học Quốc gia Hoa Kỳ (NCBI)

2.2.3 Phương pháp tách chiết ADN

Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng để tăng sinh khối Tiến hành thu ADN của các chủng vi khuẩn theo quy trình: Thu sinh khối bằng cách ly tâm 3-5 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi phía trên Sau đó thêm 200 µL dung dịch đệm Lysis vào, lắc bằng máy vortex trong 30 giây để trộn sinh khối với dung dịch đệm Thêm 20 µL Lysozyme 30 mg/mL, trộn nhẹ nhàng và ủ ở 37°C trong 1 giờ Sau đó thêm 60 µL 10% SDS và 10 µL Protein K, mẫu được ủ ở 55°C trong 2 giờ, mẫu được lắc bằng máy vortex 1 lần/giờ Để loại bỏ protein thêm 300 µL CI (Chloroform: Isoamyl rượu) theo tỷ lệ 24:1 vào mẫu Sau đó ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút, 4°C, trong 10 phút, thu lấy phần dịch nổi phía trên và chuyển sang ống Eppendorf 1,5 mL mới ADN được kết tủa bằng cách thêm 1 lượng bằng nhau thể tích Isopropanol lạnh vào phần dịch nổi phía trên, đảo ngược ống nhẹ nhàng để tránh làm vỡ ADN Sau khi ủ trong tủ đông trong 1 giờ, các ống mẫu được ly tâm ở 12000 vòng/phút, 4°C, trong 10 phút và loại bỏ phần nổi phía trên ADN thu được làm sạch bằng 1 mL EtOH 70% lạnh ADN được làm khô ở nhiệt độ phòng và bảo quản bằng cách thêm 20 µL đệm TE Các mẫu ADN sau đó