Tạo dữ liệu mã vạch coi của một số loài côn trùng Đặc hữu việt nam

Tạo dữ liệu mã vạch coi của một số loài côn trùng Đặc hữu việt nam Tạo dữ liệu mã vạch coi của một số loài côn trùng Đặc hữu việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hồ Thị Yến

TẠO DỮ LIỆU MÃ VẠCH COI CỦA MỘT SỐ LOÀI

CÔN TRÙNG ĐẶC HỮU VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hồ Thị Yến

TẠO DỮ LIỆU MÃ VẠCH COI CỦA MỘT SỐ LOÀI

CÔN TRÙNG ĐẶC HỮU VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Văn Sáng

PGS TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng em Các kết quả

nghiên cứu được đưa ra trong luận văn là trung thực và chưa từng được bảo vệ

trước bất kì hội đồng nào trước đây

Tác giả

Hồ Thị Yến

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm sinh học phân

tử tế bào thuộc Trung tâm Nghiên cứu Khoa học sự sống, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN, em vô cùng biết ơn các thầy cô, các anh chị và bạn bè

đã giúp đỡ, chỉ dạy và động viên em trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Lời đầu tiên em xin được bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn đến TS Nguyễn Văn Sáng Thầy đã tạo điều kiện, môi trường cũng như cho em những ý tưởng, động viên và hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Cảm ơn thầy đã luôn chỉ bảo, trao đổi và đưa ra các lời khuyên quý báu để em có thể hoàn thành tốt luận văn này

Tiếp theo em cũng xin bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn đặc biệt đến thầy đồng hướng dẫn là PGS TS Nguyễn Quang Huy Xin chân thành cảm ơn thầy

đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Vịnh – chủ nhiệm đề tài cùng các thầy cô, anh chị trong bộ môn Động vật học Ứng dụng đã tạo điều kiện về mẫu vật và hình thái mẫu vật để em có thể thực hiện và hoàn thành tốt nghiên cứu này

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô Bộ môn Di truyền học, PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, PGS.TS Đỗ Thị Phúc, TS Trần Đức Long, ThS Trần Thị Thùy Anh, ThS Hoàng Hải Yến đã luôn hỗ trợ và tạo điều kiện cho em thực hiện, hoàn thành tốt cho đề tài luận văn Em cũng xin cảm ơn tập thể các thầy cô Khoa Sinh học, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học sự sống, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN đã quan tâm, tạo điều kiện và môi trường học tập tốt để em có thể thực hiện luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn Thị Thu Huyền, ThS Nguyễn Thị Uyên Hai chị đã luôn hỗ trợ và dành nhiều kinh nghiệm nghiên cứu

giúp đỡ em trong quá trình làm thí nghiệm và hoàn thành luận văn Em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, các em sinh viên trong bộ môn và phòng thí nghiệm sinh học phân tử tế bào 311T2 đã luôn hỗ trợ, cùng nhau tạo một môi trường học tập, làm việc năng động, sôi nổi

Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ở bên động viên tinh thần và cổ vũ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Luận văn cũng hoàn thành với sự hỗ trợ từ đề tài nhiệm vụ xây dựng Địa chí Quốc gia Việt Nam: tập Động vật - Thực vật mã số NVQC19-09

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2023

Học viên

Hồ Thị Yến

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Phân loại học đối với đa dạng sinh học 3

1.1.1 Đa dạng sinh học 3

1.1.2 Phân loại học 4

1.1.3 Phân loại học truyền thống 5

1.1.4 Phân loại học hiện đại 6

1.2 Tổng quan về chỉ thị phân tử trong phân loại học 7

1.2.1 Mã vạch DNA (DNA barcode) 7

1.2.2 Gen COI - mã vạch DNA sử dụng ở động vật 11

1.2.3 Ứng dụng gen COI – mã vạch DNA sử dụng trong phân loại côn trùng 12

1.3 Thực trạng nghiên cứu côn trùng tại Việt Nam 15

1.3.1 Tình hình nghiên cứu phân loại côn trùng ở Việt Nam 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bộ cánh Vảy (Lepidoptera) ở Việt Nam 16

1.4 Cơ sở xây dựng cây phát sinh chủng loại 18

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 25

2.1.3 Hóa chất và môi trường 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 26

2.2.2 Tách chiết DNA tổng số 27

2.2.3 Thiết kế mồi đặc hiệu nhân một phần đoạn gen COI của côn

trùng 28

2.2.4 Phản ứng khuếch đại sử dụng cặp mồi thiết kế đặc hiệu nhân đoạn gen COI của côn trùng 29

2.2.5 Tinh sạch sản phẩm PCR và gửi giải trình tự 31

2.2.6 Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại 32

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Tách chiết DNA tổng số 34

3.1.1 Điện di DNA tổng số 34

3.1.2 Chỉ số đo quang phổ hấp thụ 35

3.2 Thiết kế mồi nhân đoạn gen COI 36

3.3 PCR khuếch đại đoạn gen COI 37

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

STT Các chữ viết

tắt

2 Blast Basic Local Alignment

search Tool

subunit I

Tiểu đơn vị I Chocytochrome

13 TAE Tris - Acetic acid - EDTA Tris - axit acetic - EDTA

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Danh sách 17 mẫu côn trùng thuộc bộ cánh Vảy trong nghiên cứu 24

Bảng 2 Tên thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 26

Bảng 3 Một số cặp mồi tham khảo sử dụng trong nghiên cứu 29

Bảng 4 Thành phần phản ứng PCR 30

Bảng 5 Chu trình nhiệt độ và thời gian phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 30

Bảng 6 Trình tự mồi thiết kế trong nghiên cứu 37

Bảng 7 Kích thước giải trình tự trình tự mẫu thu được trong nghiên cứu 46

Bảng 8 Kết quả BLAST trình tự gen COI của 17 mẫu côn trùng đặc hữu trong nghiên cứu 49

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Hệ thống mã vạch DNA trong tìm kiếm và định danh loài 9Hình 2 Ứng dụng của mã vạch trong sinh thái học, tiến hóa và bảo tồn [16] 10Hình 3 Cấu trúc bộ gen ty thể của côn trùng [28] 13Hình 4 Một cây phát sinh chủng loại thuộc bộ cánh Vảy (Lepidoptera) được xây dựng từ trình tự bộ gen ty thể [8] 18Hình 5: Một số loài côn trùng đặc hữu thuộc bộ côn trùng cánh Vảy

(Lepidoptera) trong nghiên cứu 25Hình 6 Sơ đồ quy trình nghiên cứu mẫu trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử 27Hình 7 Kết quả điện di tổng số 11/17 mẫu nghiên cứu thuộc bộ Lepidoptera 34Hình 8 Kết quả điện di tổng số 6/17 mẫu nghiên cứu thuộc bộ Lepidoptera 35Hình 9 Biểu đồ kết quả đo nồng độ tại bước sóng A260 và A280 của 17 mẫu nghiên cứu 35Hình 10 Biểu đồ kết quả đo nồng độ tại bước sóng A260 và A230 của 17 mẫu nghiên cứu 36

Hình 11 Kết quả nhân đoạn gen COI của 4/17 mẫu nghiên cứu với cặp mồi

Hình 18 Kết quả nhân đoạn gen COI của 1/17 mẫu nghiên cứu với cặp mồi dg

LCO1490/ dg HCO2198 44

Hình 19 Kết quả nhân đoạn gen COI của 2/17 mẫu nghiên cứu với cặp mồi dg

1668F/F-Y-N-2329 45Hình 20 Kết quả gióng hàng trình tự 17 mẫu nghiên cứu thuộc bộ cánh Vảy (Lepidoptera) 48Hình 21 Cây phát sinh chủng loại 17 mẫu nghiên cứu thuộc bộ côn trùng cánh Vảy (Lepidoptera) 51

MỞ ĐẦU

Côn trùng là động vật đa dạng và phong phú nhất trên trái đất với số lượng ước tính lên đến 10 triệu loài Theo số liệu đến năm 2018 của Stock và cộng sự cho thấy có khoảng 20% loài đã được nghiên cứu và mô tả Các phân loại về động, thực vật nói chung và phân loại côn trùng trong các nghiên cứu nói riêng hầu hết dựa trên các chỉ thị về hình thái và sinh thái, rất ít và hầu như không có các chỉ thị về sinh học phân tử Phương pháp phân loại dựa trên hình thái yêu cầu cần có sự tham gia của đội ngũ các chuyên gia phân tích được đào tạo trong thời gian dài Mặt khác

sự tương đồng về mặt hình thái trong vòng đời của một số loài côn trùng trong quá trình phát triển cũng mang lại nhiều mặt hạn chế cho quá trình định danh chính xác đến loài Với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, các phương pháp phân loại dựa trên kĩ thuật phân tích trình tự DNA đã được nghiên cứu và phát triển

sử dụng các đoạn trình tự DNA đặc trưng cho loài, được gọi là mã vạch DNA Phương pháp này đã trở thành một công cụ đắc lực trong phân loại, phát hiện loài mới cũng như có vai trò trong đánh giá đa dạng di truyền cho các nhà khoa học

Hiện nay, các phương pháp sinh học phân tử đã và đang được ứng dụng như

là một phương pháp phân loại mới Theo đó, các loài được phân loại dựa trên trình

tự ADN của gen đặc trưng, thường là gen Cytochrome Oxidase subunit I (COI) ở ty

thể được coi như dấu hiệu đặc trưng của loài Bằng phương pháp này, việc xác định các loài trở nên nhanh chóng, ít tốn kém và chính xác hơn

Trong lớp côn trùng, bộ cánh Vảy (Lepidoptera) là một trong hai bộ có số lượng loài với mức độ đa dạng cao được biết đến Đây là bộ côn trùng có vai trò rất lớn trong hệ sinh thái và là các mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, tham gia vào quá trình phân giải các chất hữu cơ, trả lại môi trường nguồn dinh dưỡng cho các sinh vật khác sử dụng Côn trùng bộ cánh Vảy được đánh giá có vai trò quan trọng trong việc đánh giá các tác động của hoạt động nhân tạo đối với hệ sinh thái Các loài côn trùng, đặc biệt là bộ cánh Vảy và bộ cánh Cứng được cho là rất nhạy với các chỉ số sinh thái, có phản ứng nhanh với những thay đổi của môi trường khi

tiếp xúc gần với các yếu tố độc hại có trong đất và lá rụng Việc sử dụng các loài côn trùng thuộc bộ cánh Vảy trong các nghiên cứu sinh thái cũng tăng lên trong những năm gần đây Chính vì những đặc điểm trên bộ cánh Vảy được lựa chọn cho mục đích nghiên cứu nhằm cung cấp dẫn liệu về DNA cho các loài đặc hữu

Việt Nam là nước nằm ở khu vực Đông Nam Á với diện tích khoảng 330 541

km2 và là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm Dựa trên những đặc điểm khí hậu và địa hình nên Việt Nam được xem là nước có độ đa dạng sinh học cao Theo đó, có rất nhiều loài côn trùng chưa được nghiên cứu, phát hiện

và phân loại Trong số các loài côn trùng đã được xác định ở Việt Nam có khá nhiều loài được xem là loài đặc hữu Tuy nhiên, các nghiên cứu về loài đặc hữu ở Việt Nam được lồng ghép trong các nghiên cứu về đa dạng côn trùng và phân loại chủ yếu dựa trên chỉ thị hình thái, rất ít và hoàn toàn không có thông tin về các chỉ thị phân tử, nhất là mã vạch DNA Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi

đề xuất việc nghiên cứu : “Tạo dữ liệu mã vạch COI của một số loài côn trùng

đặc hữu Việt Nam” với các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Tách chiết và lưu trữ ADN tổng số của 17 mẫu côn trùng thuộc bộ cánh Vảy (Lepidoptera) ở Việt Nam

2 Thiết kế mồi nhân đoạn gen COI cho các mẫu côn trùng thuộc bộ cánh Vảy

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phân loại học đối với đa dạng sinh học

1.1.1 Đa dạng sinh học

Đa dạng sinh học có vai trò quan trọng đối với các hệ sinh thái, giúp duy trì

sự sống của con người và mọi sinh vật khác Cụ thể đa dạng sinh học cung cấp nguồn nguyên liệu công nghiệp, lương thực, thực phẩm, các loại thuốc quý cho sức khỏe con người Bên cạnh đó, đa dạng sinh học cũng là một yếu tố đóng góp lớn vào sự ổn định và khả năng phục hồi của hệ sinh thái Ví dụ như việc làm cân bằng

số lượng cá thể giữa các loài và đảm bảo khống chế sinh học cho các loài với cá thể được tiếp nhận trong hệ sinh thái Hiện nay, tình trạng các loài bị tuyệt chủng rất nhiều bởi ảnh hưởng của biến đổi khí hậu cũng như quá trình đánh bắt trái pháp luật Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, ảnh hưởng của con người hiện đang gây ra sự suy giảm đa dạng sinh học với tốc độ cao có thể được so sánh với sự kiện tuyệt chủng lớn thứ 6 của hành tinh Khác với năm cuộc đại tuyệt chủng lớn trước đây, các nhà khoa học đã đưa ra ý kiến và đồng ý cho rằng sự mất đa dạng sinh học và suy giảm số lượng ở nhiều loài sinh vật đều có liên quan trực tiếp hay gián tiếp bởi hoạt động của con người [25] Các quần thể côn trùng nói chung còn ít được biết đến, chỉ có 70 vụ tuyệt chủng côn trùng được ghi nhận trong 600 năm qua [16] Hầu hết sự tuyệt chủng của côn trùng có thể xảy ra giữa các loài chưa được khoa học phát hiện và ghi nhận về mặt hình thái Hiện trạng này có thể làm ảnh hưởng, giảm khả năng hiểu được các mô hình nghiên cứu tiến hóa và sinh thái Để tạo thuận lợi cho việc nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học côn trùng, yêu cầu đặt ra hiện nay: (i) cần cải thiện khả năng xác định côn trùng, (ii) cải thiện khả năng nhận biết và ghi lại các loài mới

Định loại các sinh vật sống là yếu tố cần thiết để hiểu và bảo tồn đa dạng sinh học Trong nhiều thế kỉ, các nhà phân loại học chủ yếu dựa vào hình thái học

để xác định và phân loại các loài Mặc dù đây là phương pháp phân loại phổ biến nhất nhưng hạn chế của nó trở nên rõ ràng hơn khi sự ra đời của các phương pháp

phân loại dựa trên sinh học phân tử có khả năng phát hiện, nhận dạng loài chính xác

mà trước đây các nhà phân loại chưa biết đến Những năm đầu của thể kỉ 20, các công trình nghiên cứu mang tính chất cách mạng đã đạt được những tiến bộ lớn mở

ra sự hiểu biết về bản chất và chức năng của vật liệu di truyền Sự ra đời của các kỹ thuật nhận dạng dựa trên trình tự DNA vào những năm 50, 60, 70 nhất là phương pháp giải trình tự Sanger và những tiến bộ trong giải trình tự hàng trăm bộ gen đã dẫn đến những bước tiến cho các nhà phân loại học, di truyền học và cả các nhà sinh vật học trong tất cả các lĩnh vực nghiên cứu Vào đầu thế kỉ 21, việc phát triển công nghệ giải trình tự thế hệ mới đã làm tăng số lượng và tốc độ số lượng loài được giải mã hoàn chỉnh bộ gen

1.1.2 Phân loại học

Phân loại học là khoa học phân loại được áp dụng trong sinh học cho tổ chức

có hệ thống và phân cấp của các nhóm động vật và thực vật liên quan đến xác định, đặt tên và phân loại các loài Đây là quá trình mà các nhà khoa học phân nhóm các sinh vật sống dựa trên mức độ giống nhau và khác nhau của đặc điểm hình thái của chúng Qua đó, phản ánh sự liên quan tiến hóa của các sinh vật và nhóm sinh vật Phân loại học là khoa học cung cấp các kiến thức cơ bản về sinh vật và có vai trò ý nghĩa trong các ngành sinh học, khoa học môi trường cũng như nhiều lĩnh vực khác Nhờ vào các hệ thống phân loại học, chúng ta có thể dự đoán được vị trí của sinh vật trong hệ thống phân loại, nghiên cứu được con đường tiến hóa của các loài sinh vật Phân loại học phân loại chủ yếu dựa trên các đặc điểm hình thái của sinh vật với nhiệm vụ cơ bản là phát hiện, mô tả, đặt tên và sắp xếp sinh vật thành hệ thống phân loại Sự đóng góp của phân loại học là một phần không thể thiếu trong các tiến

bộ của khoa học Nhiệm vụ cơ bản của phân loại học là phát hiện, mô tả, đặt tên và sắp xếp sinh vật thành hệ thống phân loại giúp nhận diện được đặc điểm của nhiều sinh vật một cách có hệ thống Dựa trên hệ thống phân loại, các nhà khoa học có thể

dự đoán được vị trí sinh học của sinh vật Từ đó phục vụ cho quá trình nghiên cứu, bảo tồn và tránh nhầm lẫn trong định danh

1.1.3 Phân loại học truyền thống

Phương pháp phân loại học hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được hệ thống phân loại sinh vật cũng như động thực vật tương đối đầy đủ và toàn diện Phương pháp phân loại học truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái của các loài sinh vật [3] Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trong phân loại học với các ưu điểm được biết đến bởi nó có thể phân biệt được các loài dựa trên các đặc điểm hình thái bên ngoài quan sát được Cụ thể phương pháp này rất dễ hiểu

và dễ áp dụng, đặc biệt là đối với các loài sinh vật có kích thước nhỏ hoặc không cần phải sử dụng các kỹ thuật phức tạp Bên cạnh đó, phương pháp này còn giúp chúng ta hiểu rõ hơn về sự đa dạng của các loài sinh vật và cung cấp một cách tiếp cận đơn giản để phân loại chúng Tuy nhiên, thực tế cho thấy phương pháp này còn gặp nhiều khó khăn, nhất là định loại các mẫu đang trong giai đoạn phát triển, mẫu không đầy đủ bộ phận,… Ví dụ đối với các loài thuộc bộ cánh Vảy, giai đoạn phát triển của trứng, sâu, nhộng và bướm Với mỗi giai đoạn khác nhau, chúng lại có hình dạng khác nhau hoặc nơi sống khác nhau Vì vậy, dựa trên các đặc điểm bên ngoài của các loài sinh vật, phương pháp phân loại truyền thống không thể phân loại được các loài sinh vật có sự khác biệt di truyền hoặc sống trong môi trường khác nhau Mặt khác, phương pháp phân loại học truyền thống thường được thực hiện: (i) bởi các chuyên gia phân loại có kinh nghiệm nhiều năm như các nhà phân loại học hoặc kỹ thuật viên được đào tạo mới có thể xác định chính xác các đơn vị phân loại, (ii) thời gian phân loại lâu và tốn nhiều công sức cũng như chi phí thực hiện [7] [28] Vì vậy, việc phân loại chính xác các loài sinh vật cần được đưa ra bởi sự kết hợp giữa phương pháp phân loại học truyền thống và các phương pháp phân tích di truyền, các phương pháp sử dụng các chỉ thị sinh học phân tử Mặc dù còn tồn tại hạn chế, tuy nhiên không thể phủ nhận vai trò quan trọng của phân loại học tuyền thống, vì nó đóng vai trò quan trọng và là tiền đề mà các phương pháp phân loại khác không thể thay thế được

1.1.4 Phân loại học hiện đại

Phân loại học hiện đại là phương pháp phân loại dựa trên các chỉ thị phân tử hay là phương pháp phân loại bằng đặc điểm hệ gen ở mức độ phân tử hay phân loại bằng các dẫn liệu so sánh hóa sinh các phân tử lớn như protein, DNA, RNA Axit nucleic là thành phần cấu tạo của gen, protein là sản phẩm của gen nên kết quả so sánh cung cấp những đặc điểm phân loại ở mức độ phân tử phản ánh chính xác và khách quan mối quan hệ giữa các taxon sinh vật, làm cơ sở xác định và sắp xếp các taxon sinh vật trong hệ thống phân loại tự nhiên Các kỹ thuật sinh học phân tử đã được sử dụng trong phương pháp phân loại bao gồm: giải trình tự DNA, đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) hay

kỹ thuật nghiên cứu đa hình (isozyme),…Bằng phương pháp phân loại này, việc xác định loài trở nên nhanh chóng, thuận tiện, chính xác và tiết kiệm chi phí Mặt khác, các số liệu phân tích và so sánh phân tử có giá trị phân loại sinh học tùy thuộc vào tốc độ tiến hóa của các phân tử khác nhau [5] Đặc biệt, phương pháp này còn hữu ích trong trường hợp các loài đồng hình hay nghiên cứu các biến dị Việc sử dụng chỉ thị phân tử sẽ giúp giảm được sự tranh cãi dựa trên các quan điểm của các chuyên gia về các đặc điểm hình thái Ngoài ra, việc dựa trên chỉ thị sinh học phân

tử cũng giúp giảm được thời gian và chi phí trong việc đào tạo các chuyên gia phân loại hình thái giúp việc xác định loài trở nên dễ dàng, tiết kiệm chi phí và nhanh chóng hơn về mặt thời gian Mặt khác, đối với sinh học phân tử, việc giải trình tự thông tin di truyền có thể được thực hiện bằng bằng phương pháp khuếch đại từ một lượng mẫu rất nhỏ Bên cạnh đó, bằng cách sử dụng hệ gen hoặc nghiên cứu các gen cụ thể, việc so sánh cá thể này với cá thể khác hay xác định mối quan hệ họ hàng trở nên dễ dàng hơn Tuy nhiên, không thể khẳng định phương pháp phân loại dựa trên chỉ thị phân tử có thể thay thế hoàn toàn phương pháp phân loại học truyền thống trong việc phân loại Việc xác định loài bằng chỉ thị phân tử chưa thể hiện được hết các đặc tính về hình thái hay thông tin sinh thái của loài Vì vậy, việc kết

hợp giữa hai phương pháp sẽ có vai trò rất quan trọng trong việc hỗ trợ và giúp cho việc phân loại được dễ dàng, nhanh chóng và chính xác hơn

Mục tiêu chính của phân loại học cũng được xác định rõ ràng như: (i) Xác định mối quan hệ phân cấp giữa các loài hiện có theo mối quan hệ tiến hóa của chúng Các sinh vật có cùng một tổ tiên chung tập hợp lại thành nhóm gần gũi hơn

so với những sinh vật có tổ tiên chung xa (ii) Ước tính thời gian phân kỳ giữa các loài, tức là thời gian tồn tại của tổ tiên chung gần nhất Vì vậy, việc kết hợp cả hai phương pháp sẽ giúp việc xác định và so sánh loài được đầy đủ, khách quan và chính xác hơn [39]

1.2 Tổng quan về chỉ thị phân tử trong phân loại học

Phương pháp phân loại học phân tử được hình thành dưới sự phát triển mạnh

mẽ của sinh học phân tử từ giữa những năm 1990 Đây là phương pháp dựa trên các

dữ liệu thông tin về hệ gen (DNA) trong và ngoài nhân hoặc có thể là sản phẩm của chúng như protein Dựa trên đối tượng và mục đích khác nhau trong nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các trình tự đoạn gen khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen Đối với phân loại, các kĩ thuật phân tử được ứng dụng trong nghiên cứu tính đa dạng sinh học, phân tích mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, xây dựng cây phát sinh chủng loại giúp nhận diện các sinh vật, thậm chí định danh đến cấp độ loài, chi Dưới sự phát triển của sinh học phân tử nhiều chỉ thị phân tử đã được ứng dụng trong các phương pháp phân loại mới Các chỉ thị phân tử được sử dụng như dấu vân tay DNA (DNA fingerprinting), PCR RELP (sử dụng enzyme giới hạn kết hợp với lai DNA và đặc biệt là mã vạch DNA (DNA barcode) – hiện đang là một chỉ thị phân tử đang được quan tâm và ứng dụng nhiều trong các ngiên cứu Nguyên lí chung của các phương pháp này là xác định loài dựa trên sự khác biệt của trình tự nucleotide (base nitơ) trong cấu trúc hóa học của DNA

1.2.1 Mã vạch DNA (DNA barcode)

Mã vạch DNA (DNA barcode) được đề xuất bởi Paul Hebert – nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada vào năm 2003 Trong đó, mã vạch DNA

được mô tả là phương pháp sử dụng trình tự DNA ngắn từ bộ gen ty thể để xác định loài ở cấp độ phân tử Mã vạch được đề xuất như một cách để xác định loài bằng cách sử dụng một đoạn DNA ngắn từ một phần của hệ gen và sử dụng như một máy quét giúp phân biệt các sản phẩm bằng cách nhận diện các sọc màu đen đặc trưng của từng sản phẩm [23] Phương pháp này có thể giúp ta phân biệt được hai mặt hàng nhìn rất giống nhau mà mắt thường khó phân biệt được

Mã vạch DNA là phương pháp xác định nhanh các loài sinh vật dựa trên sự

đa dạng về trình tự nucleotit của các vùng gen ngắn [22] [24] Nó được xem là một công cụ mới, rất hiệu quả cho các nghiên cứu về phân loại, giám định sinh vật bao gồm cả động vật, thực vật, nấm, vi sinh vật và virus Việc xác định loài bằng mã vạch DNA có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài sinh vật trong cả những trường hợp sinh vật được quan sát hình thái và sinh trưởng, phát triển chưa đầy đủ

để có thể định danh hoặc phân biệt loài Mã vạch được ứng dụng tiềm năng trong nhiều ngành khoa học như phân loại học, công nghệ sinh học, công nghệ thực phẩm,… giúp định danh và nhận diện mẫu [38] Trong hệ sinh thái, mã vạch còn có vai trò trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu dù chúng gần như không giống nhau về hình thái Để trở thành một mã vạch DNA, đoạn ADN phải đáp ứng đủ các tiêu chí như sau: (1) có cùng nguồn gốc tổ tiên chung giữa các loài sinh vật; (2) có vùng bảo thủ và vùng dễ thay đổi trong tiến hóa; (3) vùng trình tự phải đảm bảo phân biệt được nhiều loài [26] Các mã vạch DNA tiêu chuẩn cũng được nghiên cứu

ở hầu hết các dạng sống trên trái đất Cụ thể, ở thực vật, các nhà khoa học tìm ra

một số vùng gen ngắn ở lạp thể như vùng rbcL, matK hay vùng ITS của hệ gen

nhân [9] được xem là mã vạch cốt lõi ở thực vật, mặc dù chưa thể hiện rõ ràng sự

phân biệt ở cấp độ loài; ở động vật, mã vạch được sử dụng chủ yếu là vùng gen ty

thể Cytochrome Oxidase I (COI) [50]; ở nấm là gen ITS được sử dụng trong việc

phát hiện và xác định các loài [42] Tất cả các chỉ thị này đều có đặc điểm chung là tính đặc hiệu cao và dễ sử dụng Chúng bao gồm các đặc điểm của một mã vạch lí tưởng như đủ độ bảo thủ để có thể xác định các sinh vật cùng loài nhưng cũng đủ để phân biệt các loài [31], có độ dài phù hợp, không quá ngắn để xuất hiện vị trí đa

hình giữa các taxon và không quá dài để thuận tiện cho việc giải tình tự, vị trí mồi bảo tồn cao

Mã vạch DNA thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội trong các nghiên cứu xác định nhanh các loài Cụ thể, việc tra cứu mã vạch và định danh sơ bộ được xác định nhanh chóng, đơn giản mà không cần các chuyên gia trực tiếp tham gia Như trong Hình 1 mô tả, chỉ cần đưa trình tự mã vạch ADN của mẫu vào trang web tìm kiếm

cơ sở dữ liệu mã vạch của BOLB là có thể xác định được ngay mà không cần mất nhiều thời gian Việc tra cứu không chỉ thuận tiện cho các nhà khoa học và người ứng dụng mà ngay cả những người dân cũng có thể dễ dàng tiến hành tra cứu trên

cơ sở Việc sử dụng mã vạch để nhận diện các loài có ý nghĩa rất lớn không chỉ cho phân loại học Theo The Barcode of Life Data Systems tính đến nay đã lưu trữ được khoảng 14.710 nghìn DNA barcoding từ hơn 252 nghìn đối tượng sinh vật khác nhau Để chuẩn hóa được mức độ quốc tế của việc sử dụng mã vạch DNA, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm trình tự DNA làm mã vạch để phân biệt đồng thời nhiều loài

Hình 1 Sơ đồ sử dụng mã vạch DNA trong tìm kiếm và định danh loài [19]

Ứng dụng của mã vạch

Hiện nay, vai trò của mã vạch ngày càng được quan tâm và ứng dụng nhiều vào đời sống Nghiên cứu của Morgan R Gostel và cộng sự cho thấy vai trò mở

rộng của mã vạch DNA (Hình 2) Mã vạch DNA được đánh giá như một công cụ không thể thiếu cho hệ sinh thái, tiến hóa và bảo tồn Theo đó, các ứng dụng này được hỗ trợ bởi các cơ sở dữ liệu tham chiếu mã vạch như BOLD, CBOL, EBF,…và đóng góp chính vào ngành sinh học [21] Bên cạnh đó, việc thiết lập các yêu cầu liên kết giữa chuỗi mã vạch và nguồn mẫu cũng như tạo môi trường an toàn nhằm lưu trữ, sắp xếp để toàn bộ cộng đồng có thể truy cập được từ các trang như Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia Hoa Kỳ (NCBI), Cơ sở Thông tin Đa dạng Sinh học Toàn Cầu (GBIF), các trung tâm mã vạch lớn và nhiều cở sở

dữ liệu phân loại Ngày nay, mã vạch được sử dụng trong việc hoàn thiện phân loại

và xác định chính xác loài như việc xác định ranh giới loài, đánh giá đa dạng sinh học khu vực Bên cạnh đó, nó cũng được ứng dụng trong việc định lượng đa dạng loài hay xác định cấu trúc quần xã và tương tác của các loài Ngoài ra, mã vạch DNA cũng như một công cụ được sử dụng trong bảo tồn đa dạng sinh học: nó giúp theo dõi chính xác và bảo vệ các loài có nguy cơ tuyệt chủng bị đánh bắt và buôn bán bất hợp pháp, theo dõi được các cuộc xâm lấn sinh học của các loài, đồng thời cung cấp dữ liệu hỗ trợ ước tính đa dạng phát sinh gen thiết lập các chính sách bảo tồn phù hợp

Hình 2 Ứng dụng của mã vạch trong sinh thái học, tiến hóa và bảo tồn [21]

Việt Nam là một trong số các quốc gia có tính đa dạng sinh học cao với nhiều loài động thực vật quý có ý nghĩa lớn cho đa dạng sinh học Vì vậy, việc ứng dụng mã vạch trong các nghiên cứu và ứng dụng thực tế hiện đang được quan tâm rất lớn Theo đó, chính phủ đã có sự quan tâm đến việc quản lí, khai thác, bảo vệ nguồn gen quý hiếm từ những năm 2010 Việc ứng dụng mã vạch DNA để nhận dạng, phân loại các mẫu sinh vật trước khi tiến hành các thử nghiệm nghiên cứu sâu hơn là một trong những điều kiện ưu tiên đảm bảo tính chuẩn mực và thành công của các nghiên cứu khai thác bảo tồn nguồn gen

1.2.2 Gen COI - mã vạch DNA sử dụng ở động vật

Việc lựa chọn và sử dụng mã vạch DNA liên quan đến việc lựa chọn các đoạn trình tự có ý nghĩa thông tin di truyền giúp phân biệt các loài với nhau một cách dễ dàng Đây cũng là vùng thông tin di truyền có ý nghĩa thực sự có thể cung cấp thông tin nhận dạng Trình tự lựa chọn đủ dài để có thể phân biệt được các loài nhưng cũng đủ ngắn để có thể thuận tiện cho việc giải trình tự cho quá trình phân tích

Ở động vật, các loại mã vạch thường được sử dụng như gen ribosome 12S,

16S, các đoạn gen ti thể Cytb (Cytochrome b),… Tuy nhiên mã vạch được sử dụng

phổ biến nhất là gen COI (COX1) mã hóa cho Cytochrome c oxidase subunit I Đây

là vùng gen liên quan đến quá trình trao đổi chất của tất cả các loài sinh vật và có trình tự DNA biến đổi đặc trưng ở mỗi loài khác nhau và đáp ứng đủ các tiêu chí

của một mã vạch Gen COI là một gen đơn bội được di truyền từ mẹ và cho mức độ phân biệt cao COI là một vùng gen mã hóa cho protein có mặt với nhiều bản sao trong mỗi tế bào Ở động vật, gen COI có tính bảo thủ với những vùng đảo ngược nhỏ Những đặc điểm này giúp việc sử dụng gen COI có hiệu quả trong việc phân

biệt, nhận biết các mẫu có cùng tổ tiên hay các mẫu đã bảo quản trong thời gian dài Mặt khác, ở hầu hết các loài động vật có mối quan hệ họ hàng gần gũi với nhau thì

mức độ sai khác về trình tự gen COI thường lớn hơn 4% [45] Điều này tạo ra

khoảng cách mã vạch giữa các cá thể cùng loài và khác loài, giúp cho việc sử dụng

gen COI làm mã vạch có thể phân biệt và định danh chính xác loài Bên cạnh đó, vùng gen COI được biết đến là vùng gen mã hóa protein nên quá trình gióng hàng

và so sánh sự khác nhau về trình tự DNA ở các loài sẽ chính xác và dễ dàng hơn so

với các vùng gen không mã hóa [28] Mặt khác, trình tự đoạn gen COI đủ ngắn

(khoảng 648 bp) giúp giải trình tự một cách nhanh chóng, tiết kiệm chi phí, nhưng cũng đủ dài để xác định đa dạng di truyền giữa các loài sinh vật trong hệ thống phân

loại [22] Như vậy có thể thấy vùng gen COI ở động vật hội tụ đầy đủ các yếu tố

cho một mã vạch lí tưởng không chỉ ở động vật mà còn cho nhiều loài sinh vật khác

1.2.3 Ứng dụng gen COI – mã vạch DNA sử dụng trong phân loại côn trùng

Biến đổi khí hậu hiện đang là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự tiến hóa của nhiều loài côn trùng và sự thích nghi với điều kiện mới hoặc đối mặt với nguy cơ bị tuyệt chủng Hiểu được lịch sử thay đổi của côn trùng đối với những thay đổi của môi trường có thể dự đoán được tác động của môi trường thay đổi Các chỉ thị phân tử là công cụ thúc đẩy sự hiểu biết sâu hơn trong nghiên cứu đa dạng và

hệ sinh thái của côn trùng DNA ty thể (mtDNA) đã được sử dụng rộng rãi như một chỉ thị (marker) trong các nghiên cứu sinh học và sinh thái học tiến hóa DNA ty thể

là một chỉ thị di truyền có ý nghĩa vì nó di truyền từ mẹ, trung tính, không tái tổ hợp

và tốc độ tiến hóa nhanh so với DNA của hệ gen nhân [15]

Bộ gen ty thể của côn trùng (mitogenome) thường có chiều dài 15 -18 kb Nó chứa 37 gen bao gồm 13 gen mã hóa protein ty thể (MPCG), hai gen RNA ribosome (rRNA), 22 gen RNA vận chuyển (tRNA) và một vùng không mã hóa (vùng điều

khiển, CR) có thể kiểm soát sự sao chép và phiên mã Mười ba gen (ND1, ND2,

ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6, COI, COII, COIII, ATP6, ATP8 và Cytochrom b) mã

hóa các tiểu đơn vị từ bốn trong năm phức hợp chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể DNA ty thể có tỉ lệ đột biến tương đối cao do các sản phẩm phụ của quá trình hô hấp trao đổi chất và cũng do cơ chế sửa chữa ít nghiêm ngặt hơn so với sửa chữa DNA hệ gen nhân Gen ty thể đại diện cho một phần kích thước bộ gen của sinh vật,

nhưng nó dễ khuếch đại do có nhiều bản sao trong tế bào Gen được bảo tồn giữa các loài, không có intron và các vùng xen kẽ ngắn (short intergenic) Các vùng biến đổi thường được bao quanh bởi các vùng được bảo tồn cao (ví dụ ribosome), trong

đó các đoạn mồi có thể được thiết kế Hơn nữa ở côn trùng có một ưu điểm nữa là việc sử dụng các dấu hiệu ty thể là nhiều locus có thể dễ dàng được khuếch đại bằng cách sử dụng các đoạn mồi phổ biến được thiết kế từ các gen ty thể được bảo tồn

[11] Bên cạnh đó, sự thay đổi trình tự trong vùng ty thể COI đã được chứng minh

là hữu ích cho việc xác định các loài của nhiều nhóm côn trùng gây hại Để khắc phục những khó khăn liên quan đến phân biệt loài khi các mẫu vật không rõ ràng về mặt hình thái trong các giai đoạn sống chưa trưởng thành hoặc khi không thể kiểm tra hình thái thì nhiều phương pháp phân tử đã được sử dụng như: PCR realtime, RFLP (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn), xét nghiệm microarray, cytochrom c

oxidase ty thể (mtCOI),…Trong đó, mã vạch DNA dựa trên gen COI đã được

chứng minh là phương pháp có độ tin cậy cao và hiệu quả để xác định chính xác loài [35]

Hình 3 Cấu trúc bộ gen ty thể của côn trùng [33]

Ở côn trùng, mã vạch COI cũng được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu khác nhau Mã vạch DNA gen COI được sử dụng trong xác định các loài côn trùng

kí sinh trong nông nghiệp như nghiên cứu của Smith và cộng sự (2006) đã sử dụng

mã vạch COI để phát hiện các loài côn trùng ký sinh ở vùng đông bắc Costa Rica

trong đó phát hiện ra 17 loài ruồi ký sinh có thể phân biệt bằng hình thái và 15 loài ruồi ký sinh khó phân biệt dựa trên hình thái [43] Nghiên cứu của Scheffer và cộng

sự năm 2006 cũng sử dụng mã vạch DNA của gen COI nghiên cứu sự bùng phát của loài ruồi xâm lấn ở Philippins và phát hiện sự có mặt bà loài Liriomyza [29]

Năm 2016, nghiên cứu của Pushparaj Karthika cùng cộng sự đã sử dụng mã vạch DNA để xác định 15 loài côn trùng gây hại tấn công cây trồng trong vườn ở miền nam Ấn Độ [30] Ngoài ra, nghiên cứu của Shelley L Ball và cộng sự (2006) đã thử nghiệm khả năng của mã vạch DNA để xác định các loài bướm đêm gây hại (Lymantriidae), kết quả thu được 100% các mẫu được xác định chính xác bằng gen

COI, cho thấy tiềm năng của phương pháp xác định các loài côn trùng dựa trên chỉ

thị mã vạch DNA [7] Năm 2021, Marion Javal và cộng sự đã ứng dụng mã vạch

DNA để xác định côn trùng gây hại ở Hoa Kỳ, 201 trình tự COI-5P đã được tạo ra

và phân tích về sự phù hợp giữa nhận dạng dựa trên hình thái học và dựa trên DNA [27] Ở côn trùng, việc xác định chính xác loài rất phức tạp và gặp nhiều khó khăn trong việc phân loại dựa trên các chỉ thị hình thái do chúng trải qua các giai đoạn

phát triển khác nhau Để khắc phục những hạn chế này, mã vạch ADN của gen COI

đã được sử dụng Nghiên cứu của Edwards và cộng sự (2008) trong việc sử dụng

mã vạch cả gen COI để phân biệt ba loài côn trùng cánh vảy ăn kiwi ở New Zealand

và có các đặc điểm hình thái rất giống nhau [48] Zhang và cộng sự (2008) đã sử

dụng mã vạch ADN của gen COI nghiên cứu thành công các giai đoạn phát triển

của rệp vừng [46]

1.3 Thực trạng nghiên cứu côn trùng tại Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu phân loại côn trùng ở Việt Nam

Việt Nam là nước được xếp vào nhóm quốc gia có nguồn tài nguyên sinh vật phong phú với sự đa dạng của các khu hệ động thực vật Các nghiên cứu cơ bản đầu tiên về côn trùng ở Việt Nam có từ cuối thế kỉ 19 Trước năm 1945, các công trình nghiên cứu về côn trùng còn khá ít Một số công trình nổi bật như: cuộc điều tra côn trùng Đông Dương của đoàn nghiên cứu người Pháp “Mission pasie” năm 1897 công bố vào năm 1904 đã phát hiện được 1020 loài côn trùng, trong đó 541 loài thuộc Bộ Cánh cứng, 168 loài Bộ Cánh vảy, 139 loài Chuồn chuồn, 59 loài muỗi,

55 loài Cánh màng, 9 loài Bộ 2 cánh và 49 loài thuộc bộ khác [8]

Ở Việt Nam trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu sử dụng mã

vạch DNA Hầu hết các nghiên cứu này đều sử dụng gen COI làm mã vạch cho việc

nghiên cứu và phát hiện một số loài côn trùng Các nhà khoa học Mỹ gồm Wesley

và cộng sự (2017) đã kết hợp với nhà khoa học Việt Nam sử dụng COI để phát hiện loài côn trùng cánh dài mới Neopanorpa cucullata [10] Các nhà khoa học Pháp và Việt Nam đã sử dụng DNA nhân (ITS1-5.8S-ITS2) và mã vạch DNA ty thể (cox1,

nad5) để nghiên cứu muỗi vằn Aedes albopictus ở Việt Nam [49] Các nhà khoa học

Malaysia kết hợp với các nhà khoa học Việt Nam sử dụng gen COI để phát hiện một loài ruồi đen mới thuộc giống Simulium ở Việt Nam [44] Nghiên cứu của

Nguyễn Thị Định về dữ liệu mã vạch DNA và khoảng cách di truyền của bọ cánh cứng (Coleoptera, Chrysomelidase) ở Việt Nam [14] Tại hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 7, nghiên cứu của Huỳnh Vũ Ngọc Quý năm 2015 cũng ghi nhận được 112 loài thuộc 36 họ trong 8 bộ, chiếm 1,5% tổng số loài côn trùng của Việt Nam; bộ Cánh Vảy chiếm ưu thế về số lượng 47 loài, thấp nhất là bộ Bọ ngựa (3 loài) trong các đợt khảo sát ở tỉnh An Giang [2] Một số gen của các loài này nằm trong nhóm gen côn trùng quý hiếm ở sách đỏ, một số có khả năng tăng năng suất cây trồng, duy trì bảo tồn nguồn gen Bên cạnh

đó, trong những năm gần đây, sự đa dạng côn trùng thủy sinh ở các khu vực nước

ngọt cũng được quan tâm và nghiên cứu Hệ sinh thái của nhiều nhóm đã được nghiên cứu sâu do vai trò của chúng là chất chỉ thị sinh học hoặc vật trung gian truyền bệnh [13]

Các công bố đều cho thấy xu hướng nghiên cứu ngày càng sâu của các nhà khoa học về các loài côn trùng đặc hữu Đặc biệt, các nghiên cứu đều chỉ ra các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm tới nghiên cứu và phân loại côn trùng Việt Nam Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu thực hiện lại không được các nhà khoa học Việt Nam đi đầu Do vậy cần phải có các công trình nghiên cứu với quy mô lớn về côn trùng của Việt Nam và được thực hiện bởi chính các nhà khoa học Việt Nam Điều này không chỉ góp phần nghiên cứu và phát hiện đầy đủ nguồn tài nguyên quý về đa dạng côn trùng ở Việt Nam mà còn giúp đưa ra các chính sách khai thác và bảo tồn một cách bền vững các loài đặc hữu và quý hiếm ở nước ta Bên cạnh đó, việc thiếu

dữ liệu mã vạch của các loài côn trùng ở Việt Nam, đặc biệt là dữ liệu về các loài côn trùng đặc hữu sẽ làm cho cơ sở dữ liệu mã vạch thế giới thiếu sự hoàn chỉnh

Để giải quyết vấn đề này, yêu cầu đặt ra cần phải có các công trình nghiên cứu nhằm xây dựng cơ sở mã vạch DNA của các loài côn trùng đặc hữu ở Việt Nam

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bộ cánh Vảy (Lepidoptera) ở Việt Nam

Bộ cánh Vảy (Lepidoptera) là bộ côn trùng lớn thứ 2 xếp sau bộ cánh cứng (Coleoptera) Đây là bộ có độ đa dạng, phổ biến và được công nhận rộng rãi trong lớp côn trùng của ngành (Phylum) Arthropoda Nó được chia làm ba nhóm bởi Linnaeus (1707 – 1778) bao gồm: (1) bướm (butterflies), (2) Skippers và (3) Micro – and macro – moths với 126 họ (Families) và 46 tổng họ (Superfamilies) Có khoảng 500.250 loài được mô tả với 70.820 loài bướm và 3700 ngài trên toàn cầu Cho đến 2017, có khoảng 165.000 loài bướm đêm (Micro – and macro – moths ) được tìm thấy [18] Nhiều nghiên cứu được công bố cùng với khóa phân loại đến loài về các giai đoạn trưởng thành của các loài thuộc bộ này Ở những giai đoạn ấu trùng, chỉ có một số công trình nghiên cứu tiêu biểu như nghiên cứu của Yang và Tian năm 1994 đã đưa ra khóa phân loại đến loài ấu trùng Cánh Vảy Bên cạnh đó,

đây cũng là một trong những bộ côn trùng đóng vai trò là một trong những chỉ thị sinh học quan trọng trong hệ sinh thái bởi chúng rất nhạy cảm với những thay đổi nhỏ nhất của yếu tố môi trường Chúng được sử dụng rộng rãi làm chất chỉ thị sinh học môi trường và kim loại nặng gần các khu công nghiệp và thậm chí là các khu đô thị Bướm rất nhạy cảm với các biến đổi của khí hậu [20, 40] Nhiệt độ tác động đáng kể đến sự thay đổi phạm vi hoạt động của bướm, vị trí đẻ trứng, tỉ lệ trứng, tỉ

lệ sống sót và phát triển của ấu trùng Do vậy, nghiên cứu về bảo tồn và đa dạng di truyền cho bộ côn trùng cánh Vảy mang ý nghĩa quan trọng và cấp thiết, đặc biệt trong tình hình nguy cơ tuyệt chủng của các loài côn trùng đặc hữu dưới tác động của con người và thiên nhiên ngày càng tăng

Ở châu Á, hầu hết các nghiên cứu về bộ Lepidoptera chủ yếu về phân loại học như các nghiên cứu của Rose và Pajni vào năm 1987; nghiên cứu của Munroe năm 1995 Ở Việt Nam, côn trùng cánh Vảy được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỉ XX Công trình đầu tiên nghiên cứu về bướm của Dubois và Vitalis năm

1919 ở Việt Nam được công bố trong “Côn trùng Đông Dương” với danh mục 611 loài Từ những năm 1990, nhiều công trình nghiên cứu về côn trùng cánh Vảy đã được thực hiện ở các vườn quốc gia và các khu bảo tồn thiên nhiên khác nhau ở Việt Nam Một số công trình nghiên cứu điển hình như: nghiên cứu về họ ngài hoàng đế Saturniidae và ngài chim Sphingidae của tác giả Vũ Văn Liên và Bùi Minh Hồng [1] Nghiên cứu của Trần Thiếu Dư với các kết quả nghiên cứu bướm đêm ở Miền Trung và Tây Nguyên Công trình nghiên cứu các loài bướm đêm gây hại cho cây ăn quả và lương thực của Bùi Minh Hồng, Nguyễn Thị Thu Cúc [1, 4]

Tính đến nay, ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về bộ cánh Vảy (Lepidoptera) còn riêng lẻ và chưa có hệ thống rõ ràng, chặt chẽ Hầu hết, các nghiên cứu thường xuất hiện xen kẽ trong các công trình nghiên cứu về đa dạng như các nghiên cứu côn trùng bộ Phù Du của Nguyễn Văn Vịnh năm 2003, 2004, các nghiên cứu của về côn trùng ở vườn quốc gia Bạch Mã của Nguyễn Văn Hiếu năm

2009, Nguyễn Thị Minh Huệ năm 2009

1.4 Cơ sở xây dựng cây phát sinh chủng loại

Hình 4 Cây phát sinh chủng loại thuộc bộ cánh Vảy (Lepidoptera) được xây

dựng từ trình tự bộ gen ty thể [12]

Cây phát sinh chủng loại (Phylogenetics) là mô hình tiếp cận trong việc tìm kiếm sự tiến hóa của các loài Bằng cách nghiên cứu cây phát sinh loài, các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cách thức tiến hóa của các loài, đồng thời giải thích những

điểm tương đồng và khác biệt giữa các loài [36] Cây phát sinh chủng loại là một loại mô hình giả thuyết sử dụng phần mềm để mô tả mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật, hay mối quan hệ di truyền của một số nhóm loài gần gũi Cây được xây dựng dựa trên sự so sánh giữa các đặc điểm tương đồng về hình thái hoặc sự tương đồng giữa các trình tự phân tử của các nhóm sinh vật Các nhánh rẽ của cây phản ánh sự tiến hóa của các loài từ loài tổ tiên chung Bằng cách liên tục đưa ra các giả thuyết, các nhà khoa học cũng đồng thời xây dựng các thuật toán khác nhau cho cây

mô hình để mô tả lịch sử tiến hóa thực sự của một nhóm trình tự hoặc sinh vật Mặc

dù vậy, cây mô hình xây dựng được sẽ có những ưu nhược điểm riêng tùy thuộc vào cách lựa chọn mô hình tiến hóa, các phương pháp xây dựng cây của mỗi phần mềm khác nhau Có hai dạng cây: cây không gốc (phản ánh mối liên hệ giữa các trình tự)

và cây có gốc (phản ánh hướng thời gian tiến hóa)

Để xây dựng cây phát sinh chủng loại, có hai phương pháp xây dựng chính được sủ dụng là phương pháp dựa trên khoảng cách (Distance-based medthod) và phương pháp dựa trên đặc điểm (Character-based medthod) [36] Phương pháp dựa trên khoảng cách sử dụng sự khác biệt giữa hai chuỗi để xây dựng cây Nó chuyên sâu về tính toán nhiều hơn so với phương pháp dựa trên đặc điểm Phương pháp dựa trên khoảng cách chính xác vì nó tính đến các đột biến Các phương pháp dựa trên đặc điểm so sánh tất cả các chuỗi đồng thời và chỉ xem xét một đặc điểm tại đúng thời điểm tính toán để đưa ra điểm thay đổi cho mỗi mô hình cây phát sinh chủng loại Có nhiều loại phân tích cây phát sinh chủng loại khác nhau như: ma trận khoảng cách (Distance Matrix), Tiến hóa tối thiểu (Minimum Evolution), Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony), Hợp lý cực đại (Maximum Likehood), Bayesian Giá trị bootstrap cho biết tỷ lệ phần trăm số lần một nhánh xuất hiện khi các ký tự riêng lẻ trong tập dữ liệu bị loại bỏ ngẫu nhiên và thay thế bằng dữ liệu từ các ký tự khác từ cùng tập dữ liệu và phân tích được thực hiện lại cho một số lần lặp lại cụ thể

Phương pháp tiết kiệm tối đa (Maximum parsimony method) là phương

pháp xây dựng cây tiến hóa thỏa mãn điều kiện là số lượng đặc tính bị biến đổi phải

thấp nhất để giải thích những dữ liệu đã quan sát được Phương pháp tiết kiệm tối

đa (Maximum parsimony) giả định cho rằng cây tiến hóa tốt nhất mô tả tiến trình tiến hóa tốt nhất chính là cây mô tả được các loài ít thay đổi nhất (có ít đột biến nhất), cây vì thế có điểm thấp nhất (tiết kiệm) theo một tiêu chuẩn định sẵn (Hall, 2001) Ưu điểm của phương pháp này đó là thích hợp cho các trình tự rất giống nhau, một số trình tự nhỏ, tốc độ tính toán nhanh Bên cạnh đó phương pháp này cũng có những hạn chế nhất định như mất nhiều thời gian chạy cây vì nó cần kiểm tra tất cả các cây có thể xây dựng Có thể không xây dựng được cây với các trình tự phân kì (diverged sequences) [3]

Phương pháp hợp lí cực đại (Maximum Likelihood methods) là phương

pháp dựa trên một hàm toán học tính toán xác suất khả năng một cây tiến hóa được tạo thành từ dữ liệu đã quan sát Hàm này cho phép việc tích hợp các quá trình tiến hóa của đặc tính thành mô hình xác suất Phương pháp hợp lý cực đại chọn lựa cây tiến hóa tối đa mà khi quan sát các dữ liệu dưới một mô hình nào đó có xác xuất tối

đa (Hall, 2001) Ưu điểm của phương pháp này thích hợp cho các trình tự rất khác nhau, cây phát sinh chủng loại được xây dựng có độ chính xác cao Tuy nhiên thuật toán tìm kiếm chậm và mất rất nhiều thời gian cho bộ dữ liệu xây dựng lớn [36]

Neighbor Joining là một phương pháp phổ biến xây dựng cây phát sinh

chủng loại dựa trên khoảng cách sử dụng kỹ thuật phân cụm giúp tối thiểu độ dài các nhánh được so sánh Phương pháp này được Naruya Saitou và Masatoshi Nei đưa ra vào năm 1987 và dùng phổ biến rộng rãi khi xây dựng cây phát sinh chủng loại ở mức loài Phương pháp này được xây dựng bằng cách tìm ra các cặp đơn vị phân loại bắt đầu bằng cây hình sao Điểm khác biệt của phương pháp này đó là nó xem xét sự thay đổi của tốc độ tiến hóa khi xây dựng cây phát sinh chủng loại

Bayesian là phương pháp thống kê tương tự như phương pháp hợp lí cực đại

Trong phương pháp sử dụng thuật toán dựa trên khoảng cách tối đa cho các mẫu, tính toán dựa trên sự so sánh với các trình tự Tuy nhiên khác với phương pháp Maximum Likelihood thì phương pháp này không tìm thấy đỉnh cao nhất (xác suất tối đa) mà tích hợp các thông số trong không gian dữ liệu

Phần mềm MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis ) là phần mềm phân tích tiến hóa di truyền phân tử, được phát triển để so sánh, phân tích các trình tự DNA và protein Cây tiến hóa phân tử dựa trên trình tự một đoạn gen hoặc toàn bộ hệ gen được xây dựng Phần mềm tích hợp nhiều phương pháp so sánh (Clustal W), tính khoảng cách, xây dựng cây phát sinh chủng loại phù hợp với nghiên cứu này

Sau khi cây phát sinh chủng loại được xây dựng, cần có các thông số để đánh giá và phân tích kết quả cây thu được Một trong những phương pháp đánh giá phổ biến hiện nay là Bootstrapping [34] Đây là phương pháp nhằm đánh giá, kiểm tra

độ chính xác và tin cậy cho từng nhánh trong cây tiến hóa Với phương pháp này, đầu tiên, các vị trí các chuỗi trình tự đã sắp xếp thẳng hàng sẽ được đổi chỗ một cách ngẫu nhiên và xây dựng cây Quá trình này được lặp lại một số lần nhất định

để tính toán giá trị cho một nhánh Do các giá trị này được biễu diễn bằng tỷ lệ % nên ít nhất phải có 100 lần lặp lại (thông thường 1000 lần lặp) Đối với các nhánh được chỉ định một tỷ lệ xuất hiện trong các cây và một nhánh có ý nghĩa nếu xuất hiện hơn 50% hoặc 70% Đơn vị tính là % (phần trăm), nhằm kiểm tra tính chính xác và độ tin cậy chi từng nhánh trong cây tiến hóa Giá trị bootstrap lớn hơn hoặc bằng 70 % thì được coi là có ý nghĩa thống kê và trên 95% được xem là có độ tin cậy cao Bên cạnh đó, các trình tự tương đồng với các trình tự trên ngân hàng gen được xác định cùng với các thông số như: độ bao phủ theo chiều dài của trình tự so sánh (Coverage), độ tin cậy (E-value) và độ tương đồng so với trình tự so sánh (Identity)

Trong xây dựng cây phát sinh, việc bổ sung thêm nhóm đối chứng ngoài (outgroup) có ý nghĩa quan trọng trong định hướng tiến hóa Để tăng độ chính xác, tin cậy cho cây phát sinh chủng loại, nhóm ngoài (outgroup) được chọn thường là nhóm có quan hệ gần nhất với nhóm loài được phân tích Bên cạnh đó, việc tiến hành phân tích mà không có nhóm ngoại nhưng trong trường hợp cây tiến hóa không gốc (unrooted tree) để giúp gia tăng mức tin cậy với các nhánh trung gian

Trong nghiên cứu này, cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phương pháp Maximum likehood dựa trên phần mềm MEGA 7 (Molecular Evolution Genetics Analysis) Quá trình xây dựng cây phát sinh chủng loại được tiến hành thông qua các bước so sánh, phân tích trình tự DNA, cuối cùng lựa chọn và đưa ra cây phát sinh loài phù hợp nhất Phần mềm sử dụng trong nghiên cứu được tích hợp nhiều phương pháp và công cụ phân tích cây phát sinh loài như phương pháp so sánh ClustalW, khoảng cách, Maximum parsimony, Maximum Likehood, Distance method

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn di truyền học, phòng thí nghiệm Sinh học phân tử tế bào (Molecular Cell Biology) thuộc trung tâm khoa học và sự sống, Khoa Sinh học- trường Đại học Khoa học Tự Nhiên- ĐHQGHN

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu vật: Nghiên cứu này tập trung vào 17 mẫu côn trùng đặc hữu thuộc bộ cánh Vảy (Lepidoptera) được thu bắt thực địa và lưu trữ tại Phòng Đa dạng Sinh học, Bộ môn Động vật học Ứng dụng, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN và các bên liên quan Thông tin chi tiết về các mẫu nghiên cứu được trình bày trong Bảng 1

Bảng 1 Danh sách 17 mẫu côn trùng thuộc bộ cánh Vảy trong nghiên cứu

STT Mã mẫu Tên loài hình thái Địa điểm thu mẫu

1 IEBR-Lyc-16 Archigenes miyazakii (Saito & Saito, 2005)

VQG Kon Ka Kinh, Gia Lai

2 IEBR-Nym-17

Aemona simulatrix (Monastyrskii &

Devyatkin, 2003)

VQG Kon Ka Kinh, Gia Lai

3 IEBR-Sat-18 Lemaireia inexspectata (Nässig, 1996)

VQG Chư Yang Sin, Đăk Lăk

4 IEBR-Sph-19 Sphinx centrovietnama (Brechlin, 2015)

VQG Kon Ka Kinh, Gia Lai

Stichophthalma eamesi (Monastyrskii,

Devyatkin & Uémura, 2000)

Bạch Mã

7 VNMN005 Faunis caelestis (Monastyrskii & Lang, 2016) Hà Giang

8 VNMN012 Cynitia lepidea flaminia (Fruhstorfer, 1905) Bạch Mã

Cupha erymanthis melanodotis

10 VNMN015 Appias paulina griseoides (Moulton, 1923) Côn Đảo

Faunis bicoloratus obscurus (Monastyrskii,

Hình 5: Một số loài côn trùng đặc hữu thuộc bộ côn trùng cánh Vảy

(Lepidoptera) trong nghiên cứu

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Tất cả các thiết bị, máy móc sửa dụng được đặt tại phòng thí nghiệm Bộ môn

Di truyền học, phòng thí nghiệm Sinh học phân tử tế bào (Molecular Cell Biology) thuộc trung tâm khoa học và sự sống, Khoa Sinh học- trường Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQGHN

Bảng 2 Tên thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

Bể ổn nhiệt sinh học QH01B010PSH36109 Memmert, Đức

Pipet, ống Eppendorf, đầu

2.1.3 Hóa chất và môi trường

Các hóa chất sử dụng được mua từ các hãng uy tín như BioBasic, Thermo, Sigma, Nghiên cứu sử dụng các hóa chất bao gồm:

– Hóa chất tách chiết DNA: Proteinase K (20mg/ml) (Qiagen), SDS, NaCl, EDTA (Merck), Phenol, Chloroform, Isoamyalcohol, NaOAC, Ethanol 100% (Merck)

– Hóa chất cho phản ứng PCR: 2X PCR Mastermix Phusion (Thermo Scientific)

– Hóa chất điện di: Agarose, Trisbase (Sigma), EDTA (Merck), Redsafe, Marker 100 - 10kb (Cleaver) và 5X Loading Buffer

– Hóa chất tinh sạch và thôi gel sản phẩm PCR: Bộ Kit tinh sạch spin Total Fragment DNA Purification Kit (iNtRON)

MEGAquick-2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Quá trình nghiên cứu được sơ đồ hóa các bước như Hình 6

Hình 6 Sơ đồ quy trình nghiên cứu mẫu trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử 2.2.2 Tách chiết DNA tổng số

Tách chiết DNA tổng số của các mẫu côn trùng được tiến hành theo phương pháp Sambrook 2001 [41] Quy trình tách chiết được mô tả như sau:

Mẫu tách chiết DNA tổng số được thu thập từ phần chân của các cá thể côn trùng trong quá trình thực địa và bảo quản trong dung dịch cồn 70⁰ C Mẫu được loại bỏ cồn, sau đó cắt nhỏ và chuyển vào ống eppendorf mới đã ghi đầy đủ tên nhãn Mẫu sau đó được bổ sung thêm 500 µl lysis buffer (0.5 % SDS, 0.01M Tris HCl pH8, 0.1M EDTA pH8, 0.05M NaCl) và 15 µl Proteinase K (20mg/ml) Trộn đều mẫu bằng máy vortex rồi ủ ở nhiệt độ 56 ⁰ C qua đêm đến khi tan hết mẫu

Hỗn hợp mẫu sau khi ly giải được tiến hành tách chiết ADN sử dụng phenol – Chloroform theo Sambrook (2001) bổ sung thêm 300 µl phenol, đảo đều bằng máy vontex đến khi được dung dịch đồng nhất Mẫu được ly tâm 13000 rpm, 5 phút

ở nhiệt độ phòng Phần dung dịch ở pha trên chứa ADN được chuyển sang ống eppendorf mới Tiếp tục bổ sung 300 µl dung dịch Chloroform : IAA ( tỉ lệ 24 :1 ), mẫu được trộn đều đến khi đồng nhất bằng máy vortex Ly tâm mẫu 13000 rpm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, chuyển phần dịch nổi sang ống eppendorf mới Thêm thể tích Isopropanol với tỉ lệ 1:1, đảo đều mẫu, ủ mẫu trong 10 phút ở -20⁰ C, sau đó li tâm thu tủa Rửa tủa bằng 500 µl Ethanol 70%, ly tâm 5 phút, 13000 rpm ở