Hiện tại vắc xin Sởi sản xuất tại trung tâm công suất chưa cao, cùng với đó nhu cầu cấp thiết về tiêm chủng mở rộng và xuất khẩu lớn cần trên 20 triệu liều/ năm, do đó cần tăng hiệu giá
TỔNG QUAN
Dịch tễ học bệnh sởi
1.1.1 Mầm bệnh vi rút sởi thuộc họ Paramyxoviridae, chi Morbilli vi rút, hình cầu, đường kính 100-250 nm, chứa RNA sợi đơn, trọng lượng phân tử 4,6 x 10 6 dalton, vỏ capsid đối xứng xoắn và có bao ngoài [21]
Hình 1.1: Hình thái và cấu trúc vi rút sởi [4] và hình dạng dưới kính hiển vi điện tử
Cấu trúc vi rút sởi gồm sợi xoắn RNA, nucleocapsid (N), phosphoprotein (P), Larger protein (L), protein Matrix (M), protein C, V và các gai nhú glycoprotein do Hemag-glutinin (H) và Fusion (F) tạo thành [11]
Vi rút sởi có tính đề kháng yếu, ở 56 0 C sau 30 phút vi rút mất khả năng lây nhiễm, tồn tại trên 5 năm ở nhiệt độ lạnh -70 0 C vi rút sởi nhạy cảm với ánh sáng mặt trời và nhiều tác nhân lý hóa, rất nhạy cảm với ether [21]
Hiện nay, tổ chức y tế thế giới đã ghi nhận 24 kiểu gen vi rút sởi bao gồm:
A, B1, B2, B3, C1, C2, D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, D11, E, F, G1, G2, G3, H1 và H2 Năm 2016, có 4.796 báo cáo về trình tự vi rút sởi, trong đó bao gồm 666 mẫu kiểu gen B3 (36 nước), 44 mẫu kiểu gen D4 (4 nước), 1.407 mẫu kiểu gen D8 (43 nước), 87 mẫu kiểu gen D9 (4 nước) và 2.592 mẫu kiểu gen H1 (13 nước) [02], [32]
Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Nguyễn Hạnh Phúc, Vũ Thị Kim Liên và cộng sự cho thấy kiểu gen vi rút sởi gây dịch tại miền bắc Việt Nam giai đoạn 2006-2013 là H1 [29], [39]
1.1.2 Quá trình nhân lên của vi rút Sởi
Quá trình nhân lên của vi rút sởi bao gồm các giai đoạn: vi rút hấp phụ lên thụ thể của tế bào vật chủ, xâm nhập vào bên trong tế bào, cởi vỏ → tổng hợp các thành phần của vi rút (RNA và protein) → lắp ráp các thành phần đã tổng hợp được → giải phóng hạt vi rút ra khỏi tế bào
Hình 1.2: Sự nhân lên của vi rút Sởi [Moss WJ and Griffin DE, 2006]
Sau khi gắn kết với các thụ thể CD46 và CD150 trên tế bào vật chủ, virus hợp nhất màng bọc của chúng với màng tế bào chủ và xâm nhập vào bên trong Trong tế bào, virus bắt đầu sao chép vật liệu di truyền và tổng hợp protein của chính chúng Quá trình đóng gói sau đó tạo ra những hạt virus mới, cuối cùng được giải phóng khỏi tế bào để tiếp tục chu kỳ lây nhiễm.
Trước khi có vắc xin sởi (1963) trung bình mỗi năm có khoảng 2,6 triệu trường hợp tử vong sởi và trung bình cứ 2-3 năm lại xảy ra dịch lớn Giai đoạn 2000-2017, ước tính vắc xin sởi đã ngăn ngừa được khoảng 21,1 triệu trường hợp tử vong do sởi và giảm 80% từ 545.000 trường hợp ước tính của năm 2000 xuống còn 110.000 trường hợp vào năm 2017 trên toàn thế giới Trước những thành tựu đạt được sau khi triển khai tiêm vắc xin sởi, Tổ chức Y tế thế giới đã đặt mục tiêu loại trừ bệnh sởi tại cả 5 khu vực trên thế giới vào năm 2020, nhiều quốc gia trên thế giới đã đạt hoặc đang từng bước thực hiện mục tiêu loại trừ bệnh sởi đã đề ra, tuy nhiên trên thực tế bệnh sởi đã tăng trở lại ở nhiều vùng trên thế giới, bao gồm cả châu Âu, châu Phi, Bắc Mỹ và Nam Á từ năm 2008 tới nay với mức ảnh hưởng rộng khắp toàn cầu [43]
Theo báo cáo của WHO đến ngày 30/9/2019, toàn cầu ghi nhận tổng cộng 423.963 trường hợp mắc sởi (bao gồm cả sởi xác định bởi phòng xét nghiệm, lâm sàng và có liên quan dịch tễ học), tại tất cả các khu vực và vùng lãnh thổ Các khu vực mắc nhiều trong 9 tháng đầu năm 2019 bao gồm: khu vực Châu Phi 186.010 trường hợp, khu vực Châu Âu 97.527 trường hợp, khu vực Đông Nam Châu Á 67.604 trường hợp và khu vực Tây Thái Bình Dương 49.396 trường hợp Khu vực có số trường hợp mắc sởi thấp là khu vực Châu Mỹ 6.506 trường hợp sởi, tuy nhiên khu vực này chỉ công nhận những ca sởi được xác định bởi phòng xét nghiệm, do đó nếu xác định ca sởi dựa trên cả 3 yếu tố như những khu vực khác thì số ca sởi được ghi nhận có thể sẽ lớn hơn nhiều So sánh với cùng kì năm 2018, số mắc sởi toàn cầu trong năm 2019 tăng 2,45 lần, trong đó khu vực Châu Phi tăng gấp 7,91 lần (188.010 ca /23.753 ca), khu vực Tây Thái Bình Dương tăng 2,69 lần (49.396 ca /18.311 ca) và khu vực Châu Âu tăng gần 2 lần (97.527 ca /52.958 ca) [43]
Tại Việt Nam dịch sởi xuất hiện từ những tháng cuối năm của năm 2018 tại một số tỉnh miền Bắc và miền Nam và lan rộng ra toàn quốc vào năm 2019 Tính từ đầu năm 2019 đến hết tháng 10/2019, toàn quốc ghi nhận trên 35.000 trường hợp sốt phát ban (SPB) nghi sởi, 03 trường hợp tử vong (Hòa Bình, Sơn La và Hà Nam) và có gần 10.000 ca Sởi xác định bằng xét nghiệm Bệnh sởi xuất hiện ở tất cả 63 tỉnh/thành phố trên cả nước, trong đó có những tỉnh/thành có số ca SPB/Nghi Sởi cao như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh Đắc Lắc [43]
Người bệnh là nguồn truyền nhiễm duy nhất Thời kỳ lây nhiễm vi rút xuất hiện từ cuối giai đoạn ủ bệnh tương ứng với khoảng thời gian 4 ngày trước đến 4 ngày sau khi xuất hiện ban Thời kỳ tiền triệu với các triệu chứng ho, hắt hơi là giai đoạn lây nhiễm mạnh nhất Do vậy, khi ca sởi được phát hiện, chủ yếu sau xuất hiện ban thì người bệnh đã có thể gây lây nhiễm cho nhiều người khác Không có tình trạng người lành mang vi rút [10], [20]
Bệnh sởi lây bằng những giọt nhỏ từ mũi, họng người bệnh phát tán vào trong không khí trong khi ho và hắt hơi, vi rút xâm nhập vào đường hô hấp trên của người lành, qua niêm mạc vào máu rồi sinh sản ở các tổ chức đường hô hấp và da, sau đó gây bệnh và phát tán [10] vi rút sởi có khả năng lây truyền cao nhất nên dễ gây dịch có quy mô lớn Một ca sởi có thể lây bệnh cho 12-18 người khác Khả năng lây truyền cho các đối tượng cảm nhiễm trong quần thể hẹp là trên 90% [06], [07]
1.1.6 Tính cảm nhiễm và miễn dịch
Tất cả những người chưa có miễn dịch đầy đủ với sởi ở mọi lứa tuổi đều có nguy cơ mắc bệnh Miễn dịch tự nhiên sau mắc sởi sẽ tồn tại suốt đời và có thể thu được qua các con đường như: mẹ truyền sang con, truyền máu, huyết thanh Miễn dịch cũng có thể đạt được thông qua tiêm vắc xin sởi.
Miễn dịch thụ động tự nhiên: Miễn dịch được truyền một cách tự nhiên từ mẹ sang con trong quá trình mang thai hoặc qua sữa mẹ Vì hiệu giá kháng thể do tiêm vắc xin suy giảm nhanh hơn so với nhiễm bệnh tự nhiên nên những trẻ sơ sinh có mẹ chưa từng mắc sởi hoang dã dễ mắc bệnh, cần cân nhắc tiêm chủng cho những đối tượng này ở lứa tuổi sớm hơn [06], [08]
Miễn dịch thụ động nhân tạo: Truyền máu toàn phần, huyết thanh hoặc huyết tương cũng sẽ cung cấp miễn dịch thụ động cho người nhận Sử dụng kháng huyết thanh có hiệu quả phòng bệnh cho khoảng 75% số trường hợp tiếp xúc Sau tiêm nếu vẫn bị mắc sởi thì mức độ bệnh nhẹ hơn [08], [32]
Sau khi cơ thể nhiễm vi-rút sởi, hệ miễn dịch chủ động tự nhiên sẽ sản sinh các kháng thể nhằm chống lại tác nhân gây bệnh Kháng thể này giúp cơ thể hồi phục và tạo ra khả năng miễn dịch lâu dài, bảo vệ cơ thể khỏi tái nhiễm vi-rút sởi trong tương lai.
Các biện pháp phòng chống dịch bệnh sởi
Biện pháp dự phòng không đặc hiệu: đeo khẩu trang, nâng cao sức đề kháng cơ thể bằng ăn uống đủ chất dinh dưỡng, bổ sung hợp lý các vitamin và khoáng chất, cách ly tránh lây lan cho người xung quanh, tiến hành khử trùng, tăng cường thông khí nơi ở, làm việc, giáo dục cộng đồng về bệnh sởi để người dân chủ động phát hiện bệnh
Dự phòng đặc hiệu: tiêm vắc xin là biện pháp phòng bệnh chủ động quan trọng và hiệu quả nhất Mỗi trẻ em cần được tiêm chủng 2 mũi vắc xin sởi cho trẻ từ 12 tháng tuổi trở lên Cần chú trọng tiêm cho trẻ em, nữ tuổi sinh đẻ và nhóm nguy cơ cao, vùng nguy cơ cao, những người đi vào vùng dịch Có thể sử dụng vắc xin đơn hoặc phối hợp [31].
Quá trình phát triển vắc xin sởi
Sau khi Enders và Peebles phân lập, nhân rộng vi rút sởi trong mô tế bào, vắc xin đã được nghiên cứu, phát triển, thử nghiệm và cấp phép nhanh chóng Chủng vi rút sau khi phân lập được đặt tên Edmonston và đã được sử dụng sản xuất vắc xin rộng rãi trên thế giới Nhiều loại vắc xin sống giảm độc lực được phát triển hầu hết có nguồn gốc từ chủng Edmonston [32]
MK/3 HK/8 CAM/35 CEF (36 0 C)/3 CEF (26 0 C)/8
MK/11 GPK/42 CEF/7 MK/1 CEF/2 MK/2
Hình 1.3: Lịch sử các chủng sử dụng sản xuất vắc xin sởi [40]
Phân tích trình tự gen F, H, N và M của các chủng vắc xin từ chủng Edmonston cho thấy sự khác biệt về nucleotid không đáng kể (dưới 0,6%) Các chủng vắc xin như AIK-C, Moraten, Rubeovax, Schwarz và Zagreb đều có nguồn gốc từ chủng Edmonston Ngược lại, các chủng CAM-70, Changchun-47, Leningrad-4 và Shanghai-191 lại có nguồn gốc từ chủng vi-rút hoang dại riêng biệt Hiện nay, tất cả các chủng vắc xin đều thuộc kiểu gen A.
Hiện nay, vắc xin chủng Moraten chỉ được sử dụng ở Mỹ, vắc xin chủng
Schwarz chiếm ưu thế ở các quốc gia khác Một số vắc xin sản xuất từ chủng sống giảm độc lực khác như AIK-C, Schwarz F88, CAM-70 và TD 97 đang được phát triển và sử dụng ở Nhật Bản CAM-70 và TD 97 có nguồn gốc từ chủng Tanabe, chúng cũng được sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc từ năm 1965 Vắc xin chủng Leningrad-16 đã được giới thiệu ở Nga vào năm 1967 và đã là chủng vắc xin chủ yếu ở Đông Âu Vắc xin chủng Edmonston-Zagreb được sử dụng phổ biến ở Nam
Vắc-xin sởi được phát triển vào năm 1969, bắt nguồn từ chủng Edmonston và được nuôi cấy trên tế bào WI-38 Vắc-xin này được sản xuất bởi nhiều đơn vị khác nhau và được sử dụng rộng rãi ở các nước đang phát triển Ở Iran và Trung Quốc, các chủng vắc-xin khác được nuôi cấy trên tế bào lưỡng bội người MRC-5 và R-17.
Năm 2007, được sự giúp đỡ của chính phủ Nhật Bản, Trung tâm POLYVAC đã sản xuất thành công vắc xin sởi MVVAC Quá trình sản xuất vắc xin sởi sống giảm độc lực bán thành phẩm trong dự án hỗ trợ công nghệ từ Công ty Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine (KDSV) của Nhật Bản này được thực hiện bằng gây nhiễm chủng vi rút AIK-C do KDSV cung cấp trên tế bào phôi gà tiên phát Hiệu giá vắc xin bị giảm trong quá trình đông khô và bảo quản là thấp đảm bảo đạt tiêu chuẩn về hiệu giá và tính ổn định nhiệt trong điều kiện bảo quản 24 tháng tại nhiệt độ 2-8 0 C Vắc xin MVVAC tương tự như vắc xin sản xuất ở Nhật Bản, khác biệt chính là sử dụng gelatin đã thủy phân như là chất ổn định Vắc xin sởi sản xuất từ bán thành phẩm và từ chủng AIK-C đều đã được thử nghiệm lâm sàng, đạt tiêu chuẩn về tính an toàn và tính sinh miễn dịch MVVAC đã được đưa vào Chương trình tiêm chủng mở rộng ở nước ta và hiện tại POLYVAC là đơn vị đầu tiên, duy nhất sản xuất vắc xin Sởi tại Việt Nam [12], [13], [41], [3], [45].
Sản xuất vắc xin sởi tại POLYVAC
Bản chất của vắc xin sởi bán thành phẩm được sản xuất dựa trên cơ chế xâm nhập, nhân lên của vi rút trong tế bào vật chủ và giải phóng vi rút ra ngoài môi trường nuôi Hỗn dịch môi trường nuôi chứa vi rút sẽ được thu hồi và bổ sung chất ổn định (là môi trường đóng vai trò ổn định hàm lượng vi rút trong vắc xin bán thành phẩm), hỗn dịch vi rút sau khi bổ sung chất ổn định được gọi là vắc xin bán thành phẩm Cơ chế nhân lên của vi rút sởi được thực hiện như sau: vi rút sởi xâm nhập vào tế bào vật chủ qua hình thức nhập bào Quá trình nhân lên của vi rút được
Trong quá trình sao chép bên trong tế bào vật chủ, virus tiếp tục xâm nhập và tái bản ở các tế bào mới Mặc dù quá trình nhân lên là hữu hạn, nhưng ban đầu số lượng virus sẽ tăng lên và sau đó giảm dần theo thời gian do ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, pH môi trường nuôi cấy và nguồn tế bào vật chủ Xác định thời điểm thu hoạch dịch chứa virus khi hàm lượng virus cao nhất là rất quan trọng trong sản xuất vắc xin.
Trong các bước của quy trình sản xuất vắc xin có nguy cơ nhiễm vi sinh vật vào sản phẩm, để dễ dàng nhận biết thì các nhà sản xuất thường thêm vào môi trường nuôi vi rút thành phần có màu sắc, để dễ dàng quan sát sự đổi màu của môi trường nuôi khi có vi sinh vật xâm nhập Đỏ phenol là một trong những yếu tố chỉ thị được lựa chọn và sử dụng trong quy trình sản xuất từ phía Nhật Bản và đã chuyển giao cho Polyvac Đỏ phenol là chất có nguy cơ gây phản ứng phụ khi tiêm sản phẩm vào người, đỏ phenol và các thành phần gây phản ứng phụ khác được loại bỏ bằng cách thay thế và rửa môi trường nuôi nhằm đưa các thành phần gây hại có nồng độ thấp nhất theo tiêu chuẩn quy định Mặt khác, quy trình theo chuyển giao từ phía Nhật Bản có sử dụng huyết thanh bê mới sinh (New Born Calf Serum
- NBCS) cho quá trình nuôi tế bào và nuôi vi rút Huyết thanh này có giá đắt đỏ và ngày càng tăng qua các năm Hơn nữa, việc sản xuất huyết thanh cũng vấp phải sự phản đối của nhiều cá nhân và tổ chức do liên quan tới vấn đề về đạo đức Do vậy các nhà sản xuất vắc xin định hướng trong tương lai là loại bỏ dần việc sử dụng huyết thanh trong sản phẩm Vắc xin là một chế phẩm sinh học đặc biệt, mỗi nghiên cứu thay đổi và để được áp dụng vào thực tế thì chế phẩm đó phải đảm bảo đạt chất lượng theo tiêu chuẩn GMP của tổ chức Y tế thế giới (WHO) và được cơ quan có thẩm quyền của Việt Nam thẩm định và cấp phép Do vậy loại bỏ hoàn toàn yếu tố có nguy cơ trong vắc xin, nghiên cứu giảm bớt các công đoạn thực hiện nhằm loại bỏ ít nhất lượng vi rút mất đi do việc thay thế môi trường và rửa bề mặt nuôi, đồng thời sản phẩm tạo ra đạt tiêu chuẩn, được cấp phép sử dụng là nhiệm vụ quan trọng và cấp thiết trong sản xuất vắc xin hiện nay Trong đề tài này việc loại bỏ đỏ
11 phenol sớm và giảm bớt lượng NBCS sử dụng trong sản xuất được nghiên cứu và đánh giá
Hỗn dịch vi rút được giữ lạnh 2-8 o C sau khi thu hoạch từ các chai nuôi và sau đó sẽ được lọc qua màng lọc 0,65μm, toàn bộ tế bào và mảnh vụn tế bào sẽ bị giữ lại qua màng lọc và một lượng lớn vi rút còn dính ở bề mặt tế bào chủ sẽ bị mất đi trong quá trình lọc này Do vậy một phương pháp vật lý để phá vỡ sự kết dính giữa vi rút-tế bào và giải phóng vi rút được các nhà sản xuất vắc xin chú trọng, ứng dụng đó là đông băng hỗn dịch vi rút trong tủ âm sâu -75 0 C, sau đó các bình chứa hỗn dịch vi rút lại tiếp tục được làm tan, khi đó sự kết dính của vi rút trên tế bào tiếp tục bị phá vỡ bởi tác động của yếu tố vật lý giải phóng vi rút còn tồn tại ra ngoài môi trường Đây là một biện pháp rất quan trọng và có ý nghĩa rất lớn trong sản xuất vắc xin; tuy nhiên không phải loại vắc xin nào cũng có thể áp dụng Những loại vắc xin mà vi rút có độ nhạy cảm cao với nhiệt độ, dễ bị chết khi có sự thay đổi và biến động về nhiệt độ thì khó áp dụng phương pháp này Bởi qua mỗi lần làm tan nồng độ vi rút trong vắc xin bán thành phẩm sẽ giảm đi, từ đó làm giảm hiệu giá của vắc xin thành phẩm cuối cùng, dẫn tới khó khăn trong việc tính toán và đánh giá chất lượng của vắc xin thành phẩm Do đó việc nghiên cứu cải tiến quy trình đông tan và chia tank bảo quản vắc xin sởi bán thành phẩm cũng sẽ là một mục tiêu cần phải đánh giá
Vắc xin sởi của POLYVAC được sản xuất từ chủng AIK-C Năm 1974, Viện Kitasato đã phát triển vắc xin sởi sống, giảm độc lực chủng AIK-C, được nuôi cấy trong tế bào phôi gà Chủng AIK-C là một chủng vắc xin thích hợp cho Chương trình TCMR, làm tăng tỉ lệ chuyển biến kháng thể ở những trẻ em 6 tháng tuổi có thể đã nhận được đáp ứng miễn dịch từ mẹ Miễn dịch trung gian tế bào đạt được ở trẻ 6 tháng tuổi cũng như trẻ em từ 1 đến 5 tuổi khi tiêm vắc xin Trên 20 triệu liều vắc xin chủng AIK-C đã được dùng chủ yếu ở Nhật Bản và không thấy có biến cố bất lợi nghiêm trọng nào được báo cáo [34], [35], [36]
Chủng AIK-C tạo kích thước ổ hủy hoại trên tế bào nuôi nhỏ hơn so với các chủng sản xuất vắc xin khác Đặc tính này do Leucine ở vị trí 278 của gen F quy định Đặc điểm khác của chủng AIK-C là tính nhạy cảm nhiệt độ do proline ở vị trí 439 của protein P tạo ra [26], [24]
1.4.2 Sản xuất vắc xin sởi bởi chủng AIK-C
Việt Nam có thể tự sản xuất được vắc xin sởi thành công là từ kết quả của dự án “Xây dựng cơ sở sản xuất Vắc xin Sởi đạt tiêu chuẩn GMP” từ năm 2003-
Vào năm 2006, dự án "Tăng cường năng lực sản xuất vắc xin Sởi tại Việt Nam" từ 2006-2010 đã được ký kết giữa Chính phủ Việt Nam và Nhật Bản Dự án này nhận chuyển giao công nghệ sản xuất vắc xin Sởi từ Viện nghiên cứu Kitasato (Nhật Bản), nay là công ty Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine (KDSV) Nguồn vốn của dự án sử dụng ODA không hoàn lại của Chính phủ Nhật Bản.
Năm 2008, cơ sở sản xuất vắc xin Sởi đã được Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế cấp chứng nhận thực hành tốt sản xuất thuốc (GMP), là cơ sở sản xuất vắc xin đầu tiên của Việt Nam được cấp chứng nhận GMP
Vắc xin Sởi do POLYVAC sản xuất đã được thử nghiệm lâm sàng thành công và được Bộ Y tế nghiệm thu năm 2009 và được cấp số đăng ký lưu hành lần đầu tiên QLVX-0295-09 vào ngày 29/12/2009 (theo quyết định số 5184/QĐ-BYT) Đến nay hơn 30 triệu liều vắc xin Sởi đã được cung cấp cho chương trình Tiêm chủng mở rộng Quốc gia và một phần thị trường dịch vụ trong nước Chất lượng của vắc xin sởi do POLYVAC sản xuất đã được chứng minh nhiều năm qua, không có một biến cố bất lợi nào xảy ra do vắc xin.
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi rút sởi
Vi rút sởi tự nhiên có sức đề kháng yếu, chúng bị tiêu diệt ở 56 o C/30 phút, các yếu tố hoá lý như cồn, formalin, tia cực tím đều có thể diệt nhanh vi rút pH thích hợp với vi rút là 5,0 – 10,0; tốt nhất là pH = 7,0 Sức đề kháng của vi rút cao hơn nếu bảo quản ở dạng đông khô, có thêm gelatin và đường glucose [04],
Vi rút giảm độc lực dùng để sản xuất vắc xin được chứng minh là rất nhạy cảm với nhiệt độ, ánh sáng và pH của môi trường nuôi cấy Theo nghiên cứu tại Viện Kitasato, chủng vi rút vắc xin AIK-C có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 33 0 C và sinh trưởng rất kém hay không sinh trưởng ở nhiệt độ 39-40 0 C Khi nuôi cấy vi rút, hiệu giá chủng vi rút sởi đạt cao nhất trong khoảng pH môi trường từ 7,0 – 8,0 Hiệu giá vi rút sởi giảm nhanh ở pH dưới 7,0 và trên 8,0 [25], [40]
Hình 1.4: Ảnh hưởng của pH lên hiệu giá vi rút sởi chủng Edmonston
Một số tác giả nghiên cứu hiệu giá của vi rút sởi ở các pH khác nhau bằng cách trộn 1 thể tích vi rút sởi với 2 thể tích dịch đệm để lạnh với giá trị pH khác nhau và ngâm trong bể đựng nước đá trong 3 giờ Hiệu giá vi rút được xác định bằng phương pháp PFU Kết quả cho thấy vi rút sởi ổn định nhất ở điều kiện pH 7,6 và sẽ bị bất hoạt nhanh chóng ở cả môi trường pH axit và pH kiềm [04], [37],
Hình 1.5: Hiệu gía vi rút sởi ở các giá trị pH khác nhau
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
(*) Vật liệu sử dụng cho sản xuất vắc xin bán thành phẩm:
- Trứng gà SPF (Hãng VALO LOHMANN) - Đức:
Trứng gà sạch đã được kiểm soát các nhân tố gây bệnh, đủ tiêu chuẩn sản xuất vắc xin Sởi theo tiêu chuẩn của tổ chức Y Tế thế giới
- Chủng AIK-C (America-Iran-Kitasato Chick Embryo Cell) -Nhật Bản:
Chủng vi rút Sởi sử dụng để sản xuất vắc xin Sởi do Viện Kitasato phân lập Hiệu giá 5,44lg PFU/0,5 ml
- Huyết thanh bê mới sinh (New Born Calf Serum-Hãng Gibco) -Mỹ:
Huyết thanh là thành phần quan trọng được sử dụng trong nuôi cấy tế bào, có nguồn gốc từ bê 3 đến 10 ngày tuổi, đóng vai trò duy trì và phát triển tế bào Huyết thanh chứa một hỗn hợp phức tạp bao gồm các protein, hormone, khoáng chất và các yếu tố tăng trưởng khác, cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu để hỗ trợ sự tăng sinh và phân hóa của tế bào trong môi trường nhân tạo.
- Môi trường M199/PR (+) Gibco: Là môi trường có chỉ thị đỏ phenol
- Môi trường M199/PR (-) Gibco: Là môi trường không chưa chỉ thị đỏ phenol
Môi trường giúp tế bào duy trì được trạng thái ổn định trong quá trình nuôi
- CMF-Hanks (canxi-magie free Hanks): Môi trường không chứa ion
Ca2 + và Mg2 + (là các ion ức chế hoạt động của enzyme Trypsin)
- Môi trường LH (Lactalbumin hydrolysate) chứa 3% NBCS:
Giúp tế bào bám, phát triển và nhân lên trong quá trình nuôi
- EK: Kháng sinh Erythromycine và Kanamycine để ức chế và diệt khuẩn
- Dung dịch Lactose: đường Lactose cung cấp năng lượng để duy trì tế bào
- Dung dịch NaHCO3 7,5% (Natri bicarbonat): Điều chỉnh pH môi trường
- Methanol tuyệt đối – Trung Quốc
(*) Vật liệu sử dụng cho kiểm định:
- Hóa chất sử dụng cho kiểm tra hiệu giá vắc xin: Nước WFI hồi chỉnh vắc xin (Polyvac), Mẫu chuẩn nội bộ sởi, 7,5% NaHCO3 , kháng sinh P-S (Code No.15140-122, Wako, Nhật Bản), Agarose ME (Code No 50013R, Iwai, Nhật Bản), Eagle MEM (Code No 05901, Nissui, Nhật Bản)…
- Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm xác định mycoplasma: môi trường LM1,
- Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm kiểm tra vô trùng: Thioglycolate (POLYVAC –Việt Nam), Soybean Casein (POLYVAC –Việt Nam), Polypepton (POLYVAC –Việt Nam)
- Hóa chất sử dụng cho kiểm định BSA tồn dư: WFI-U(Polyvac-Việt nam),Kit Bovine Serum Albumin (Cygnus Technologies),
Hóa chất sử dụng cho kiểm định do pH: Dung dịch chuẩn pH 4 (Potassium
Hydrogen Phosphate, Horiba-Nhật Bản), Dung dịch chuẩn pH 7(Potassium Dihydrogen Phosphate/ Potassium dihydrogen phosphate, Horiba-Nhật Bản), Dung dịch chuẩn pH 10 (Sodium Tetraborate Decahydrate, Horiba-Nhật Bản), Dung dịch NaClO 12% (POLYVAC–Việt Nam), Postassium Chloride 3.3 M (Wako - Nhật Bản)
(*) Thiết bị sử dụng cho sản xuất vắc xin bán thành phẩm
- Tủ bảo quản trứng MIR-153 - Sanyo
- Tủ ấp trứng PPS-05 – Showa Furaki
- Lò sấy khô AHO-302-54K-(R/L1)- Airtech
- Auto clave FRD-U21A30WZ Sakura- Nhật Bản
- Safety cabinet NSC-IIA-1800 – Dalton
- Cleanbench (NKBB /NBCM/NFT) – Nika micron
- Water bath TRW 170 – As one
- Máy ly tâm Kokusan HL 7 – Nhật Bản
- Kính hiển vi IX51-71PHP/CKX53+DP22 - Olympus
- Buồng ấm 1 (37,5 o C), Buồng ấm 2 (32 o C), Buồng lạnh 2 (5 0 C)
- Tủ âm sâu MDF U72V Sanyo – Nhật Bản
- Cân điện tử IW2P1-150GF-2/ Entris22021-1S…- Starorius
(*) Thiết bị sử dụng cho kiểm định:
- Máy nén khí (Gast – USA), Water bath (AS ONE - Nhật Bản), Tủ ấm 230C ± 20C (SANYO - Nhật Bản), Tủ ấm 320C ± 2 0C (SANYO - Nhật Bản), Clean bench (NIKKA MICRON- Nhật Bản)
- Tủ ấm CO2 (SANYO- Nhật Bản), Máy nén khí (AS ONE - Nhật Bản)
- Máy đo pH, Máy in
- Máy đọc ELISA (Tecan), Máy rửa ELISA (Asys Hitect), Máy trộn (Mixer,
AS ONE), Máy tính và máy in (DELL)
- Micropipet 20 ~ 100àl, 200 ~ 1000àl (Gilson – Phỏp);
- Đầu tớp 20 ~ 100 àl, 100 ~ 1000àl (Gilson – Phỏp);
- Ống tuyp 2,15, 50 ml (Corning, Mỹ);
- Phiến nuôi tế bào 6 giếng (Corning - Mỹ)
- Kit Elisa (code F030, hãng Cygnus technology) …
- Giá đỡ màng lọc VS (Millipore)
Phương pháp
15 tháng, từ tháng 6/2022 đến tháng 9/2023
Quy trình nghiên cứu sản xuất được thực hiện tại phòng sản xuất vắc xin bán thành phẩm - Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin và Sinh phẩm Y tế
Quy trình kiểm định chất lượng được thực hiện tại phòng Kiểm định - Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin và Sinh phẩm Y tế
2.2.3.1 Xây dựng quy trình thử nghiệm
Mỗi thử nghiệm được thực hiện trên 3 lô vắc xin Sởi bán thành phẩm, mỗi lô được chia thành 2 nhóm nghiên cứu, mỗi nhóm 70 chai roux: o Nhóm 1 nuôi theo quy trình thường quy o Nhóm 2 nuôi theo quy trình cải tiến
Hình 2.1: Quy trình thử nghiệm và lấy mẫu đánh giá hiệu giá
Sau khi hỗn dịch tế bào phôi gà được chia ra các chai roux nuôi cấy theo các nhóm trên sẽ được nuôi ở nhiệt độ 37,5 0 C trong 2 ngày, môi trường nuôi LH 3% huyết thanh bê mới sinh (NBCS) Trước khi gây nhiễm vi rút trên tế bào sẽ thực hiện đánh giá CGI (chỉ số phát triển tế bào) (mục 2.2.4.1) ở tất cả các chai nuôi; loại bỏ những chai tế bào phát triển kém