TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO CHIẾT TỪ ĐẾ NẤM NUÔI ĐÔNG TRÙ
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1 Mục tiêu Đánh giá được hoạt tính sinh học và thành phần hoá học của cao chiết đế nấm trên môi trường bổ sung bột vỏ quả măng cụt
2.2 Nội dung Đánh giá sinh trưởng của nấm C militaris khi bổ sung các tỉ lệ bột vỏ quả măng cụt vào môi trường đặc nuôi nấm Đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết đế nấm bổ sung bột vỏ quả măng cụt, gồm: hoạt tính chống oxi hoá, kháng khuẩn, hoạt tính gây độc tế bào in vitro
Phân tích hàm lượng phenol tổng số, flavonoid tổng số và sự chuyển hoá (nếu có) của một số hợp chất chính trong cao chiết từ đế nấm bổ sung bột vỏ quả măng cụt.
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
Tổng quan về măng cụt
1.1.1 Tổng quan chung về măng cụt
Măng cụt (Garcinia mangostana L.) thuộc họ Bứa (Clusiaceae), được coi là nữ hoàng của các loại trái cây, được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới như Đông Nam Á, Sri Lanka, và Ấn Độ Việt Nam là một trong những quốc gia trồng nhiều măng cụt, phổ biến ở Bình Dương, Trà Vinh, Bến Tre, Vĩnh Long Măng cụt đòi hỏi khí hậu nóng (25-35 o C) và ẩm (khoảng 80%) và điều kiện thổ nhưỡng khắt khe, do vậy, cây măng cụt thường được trồng ở vùng miền Nam Việt Nam
Cây măng cụt có chiều cao khoảng từ 6-25 mét Quả măng cụt non có màu xanh lục nhạt rồi chuyển xanh đậm và đỏ tím khi chín Thịt quả màu trắng ngà, mong nước, mùi thơm đặc trưng và vị chua ngọt thanh mát được coi là “nữ hoàng” của các loại trái cây Ở Việt Nam, với tổng diện tích lên tới 4900 ha, cho sản lượng khoảng măng cụt khoảng 4500 tấn Theo dự án phát triển sản xuất và xuất khẩu rau, hoa quả tươi của Việt Nam, dự kiến phát triển diện tích trồng măng cụt ở vùng đồng bằng sông Cửu Long lên khoảng 11300 ha, cho sản lượng 24000 tấn
Vỏ quả măng cụt được dùng nhiều trong các bài thuốc dân gian trong điều trị tiêu chảy, giảm cân, làm đẹp, chống lão hoá, chữa tàn nhanh, hôi miệng (Đỗ Tất Lợi, 2014; Võ Văn Chi, 1996)
Hình 1 1 Hình ảnh quả măng cụt
1.1.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của vỏ quả măng cụt
Vỏ măng cụt đã được báo cáo là có chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học như axit phenolic (Zadernowski và cộng sự 2009), tannin (Pothitirat và cộng sự
2009), xanthones (Zarena và Udaya, Sankar 2009b), anthocyanin (Palapol và cộng sự 2009) và các hợp chất hoạt tính sinh học khác Các hợp chất phân lập này có nhiều tác dụng sinh học khác nhau như hoạt tính chống oxy hóa (Jung và cộng sự
2006), kháng khuẩn (Suksamrarn và cộng sự 2002) và hoạt tính chống viêm (Chen và cộng sự 2008) (Rizaldy et al., 2022)
Vỏ măng cụt chứa hợp chất phenolic gấp 10 lần và hoạt tính chống oxy hóa cao gấp 20 lần so với cùi măng cụt Chiết xuất vỏ quả măng cụt bằng dung môi hữu cơ đã tách được các hợp chất không phân cực như xanthones và các dẫn xuất benzophenone prenylat hóa Phần phân cực chứa một số hợp chất phân cực của polyphenol và tannin như catechin, procyanidin và anthocyanidin (Rizaldy et al., 2022; Yoshimura et al., 2015)
Trong số các hợp chất thứ cấp của măng cụt thì các hợp chất xanthone là các chất chính Phần vỏ quả là phần chính chứa các hợp chất xanthone Hơn 60 dẫn xuất xanthone đã được phát hiện ở cây măng cụt, trong đó chiếm hàm lượng cao nhất là a-mangostin, khoảng 0,02-0,2% trọng lượng khô Các dẫn xuất khác như b- mangostin và g-mangostin chiếm khoảng 0,016-0,07%, hay garcinone E, một hoạt chất ức chế mạnh sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư đang được quan tâm nghiên cứu chiếm khoảng 0,01-0,035%
Trong nghiên cứu của Yang và cs, 2017, từ cao chiết ethanol của vỏ quả măng cụt đã phân lập được 14 dẫn xuất xanthone, bao gồm: 7-O-demethyl mangostanin, 1,3,7-trihydroxy-2,8-di-(3-methylbut-2-enyl)xanthone, mangostanin, 1,5,8-trihydroxy-3-methoxy-2 [3-methyl-2-butenyl]xanthone, garcinone B, mangostinone, 8- deoxygartanin, gartanin, garcinone E, trapezifolixanthone, padiaxanthone, tovophyllin A,mangostenone D, and 1,7-dihydroxy-2-(3-methylbut-2-enyl)-3-methoxyxanthone (Yang et al., 2017) Ngoài ra, một số anthocyanin như cyanidin- -3-O-sophoroside, chrysanthemum, cyanidin-3-O- glucoside, (Muzykiewicz et al., 2020)
Hình 1 2 Cấu trúc hoá học của một số hợp chất xanthone
Hoạt tính sinh học của vỏ quả măng cụt và ứng dụng
Hoạt tính chống mụn trứng cá
Chiết xuất nhiều loại thảo mộc (G mangostana, Tribulus terrestris L.,
Lithospermum officinale, Houttuynia cordata Thunb) trong công thức sữa rửa mặt đã được thử nghiệm trên 60 bệnh nhân bị mụn trứng cá mức độ từ nhẹ đến trung bình trong 8 tuần Kết quả cho thấy hiệu quả giảm đáng kể mụn trứng cá và kháng viêm Mức giảm trung bình của mụn viêm là 56% so với ngày 0 và mụn không viêm giảm 36% (Yang et al., 2019)
Một nghiên cứu được thực hiện trên 77 bệnh nhân bị mụn trứng cá ở mức độ nhẹ đến trung bình Bệnh nhân được phân ngẫu nhiên thành các nhóm sau đó dùng công thức chiết xuất thảo dược tại chỗ (dầu cây trà, vỏ quả măng cụt, niacinamide 4%) hoặc benzoyl peroxide 2,5% trong 12 tuần Phân tích tổn thương cho thấy mụn trứng cá giảm đáng kể Các hoạt động kháng khuẩn và chống viêm chống lại C
Acnes là do các thành phần terpinen-4-o và xanthone trong dầu cây trà và vỏ măng cụt (Lubtikulthum et al., 2019)
Một nghiên cứu lâm sàng trên 28 bệnh nhân bị mụn trứng cá từ nhẹ đến trung bình cho thấy chiết xuất vỏ măng cụt 0,5% (chứa 94% α-mangostin dựa trên sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC) trong gel nano làm giảm đáng kể khoảng 67% mụn trứng cá và tổn thương viêm sau 12 tuần điều trị Alpha-mangostin có hoạt tính kháng khuẩn mạnh chống lại C acnes (Lueangarun et al., 2019)
Hoạt tính chống lão hóa và chống tăng sắc tố
Sự gia tăng các loại oxy phản ứng (ROS) là nguyên nhân chính gây ra stress oxy hóa dẫn đến lão hóa da và việc áp dụng các chất chống oxy hóa như chiết xuất vỏ quả măng cụt (MPE) có thể trì hoãn sự xuất hiện của lão hóa Lão hóa da cũng liên quan đến việc giảm độ đàn hồi của da và sự thoái hóa của axit hyaluronic, tạo ra tình trạng tăng sắc tố MPE cho thấy tác dụng chống elastase mạnh mẽ Elastase của da người là một quá trình thoái hóa đàn hồi dẫn đến mất độ đàn hồi của da Dựa vào giá trị IC50, hoạt tính ức chế elastase tăng lên như sau: ɣ-mangostin < garcinone
D < α-mangostin < garcinone C < MPE Gamma-mangostin có tiềm năng như một chất chống hyaluronidase giúp duy trì độ ẩm cho da và ức chế tyrosinase để ngăn ngừa tăng sắc tố (Widowati et al., 2020) Các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng alpha- mangostin có khả năng làm giảm nếp nhăn trên da do tiếp xúc với tia cực tím B (UV-B) ở mô hình chuột không có lông với các tế bào HaCaT gây tổn thương do tia UV-B (Im et al., 2017)
Alpha-mangostin có thể là một ứng cử viên tiềm năng để điều trị bệnh Alzheimer (AD), xem xét dựa trên hoạt tính như chống viêm, chống oxy hóa và bảo vệ thần kinh (Chen et al., 2020) Các nghiên cứu in vitro trên mô hình chuột cho thấy rằng α-mangostin với giá trị EC50 là 3,89 nM ức chế sự kết tụ amyloid thông qua việc hạn chế sự hình thành fibril Aβ (Wang et al., 2012)
Hoạt tính ức chế rối loạn lưỡng cực, tâm thần phân liệt và ức chế cholinesterase
Rối loạn lưỡng cực và tâm thần phân liệt được hiểu là có liên quan đến sự gia tăng đáng kể mức độ căng thẳng oxy hóa như các loại oxy phản ứng (ROS), các loại nitơ phản ứng (RNS), các chất phản ứng axit thiobarbituric (TBARS) và malondialdehyd (MDA) Vỏ măng cụt đã được chứng minh là làm giảm đáng kể bốn loại mức độ căng thẳng oxy hóa đó trên mô hình chuột Vì vậy, vỏ măng cụt có vẻ như là một liệu pháp bổ sung có thể điều trị chứng rối loạn lưỡng cực và tâm thần phân liệt (Ashton et al., 2019)
Một nghiên cứu khác tiết lộ rằng chiết xuất methanol của vỏ măng cụt và đài hoa có hoạt tính ức chế mạnh chống lại acetylcholinesterase (AChE) và butyrylcholinesterase (BChE) với giá trị IC50 là 0,90 và 0,37 μg/ml do hợp chất α- mangostin và γ-mangostin (Khaw et al., 2020)
Tổng quan về nấm Cordyceps militaris
1.2.1 Tổng quan chung về nấm C militaris
Nấm C militaris thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps và loài C militaris Loài này được Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris (Kobayasi,
1982) sau đó được đổi tên thành Cordyceps militaris (Kobayasi et al., 1982; Đỗ
Hình 1 3 Quả thể nấm C militaris trong tự nhiên
(Nguồn: https://vikings.vn/nguon-goc-dong-trung-ha-thao)
Hình 1 4 Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thế chứa các bào tử
Nấm C militaris là loài nấm có màu cam, ký sinh sâu bướm hoặc bướm, chiều dài 8 - 10 cm Mặt cắt ngang quả thể màu vàng nhạt (hình 1.4), phía đỉnh đầu quả thể ở giai đoạn trưởng thành có các túi nang chứa túi bào tử hữu tính Túi bào tử hữu tính phân đoạn với các bào tử hữu tính kích thước 3,5 - 6 × 1- 1,5 𝜇m Các bào tử này nảy chồi tạo sợi và sinh bào tử vô tính (Paul et al., 2008)
Chu trình sống của nấm C militaris
Trong chu trình lây nhiễm và phát triển của nấm C militaris, bắt đầu khi bào tử nấm phát tán trong gió dính vào kí chủ Bào tử này mầm, sinh các enzyme protease, chitinase, lipase làm tan vỏ ngoài kí chủ và xâm nhập vào trong cơ thể Hệ sợi phát triển mạnh, làm chết kí chủ, xâm chiếm toàn bộ cơ thể kí chủ Đến cuối hè hoặc thu, phần quả thể hình thành, sinh bào tử hữu tính và phát tán vào trong không khí, đất, nước và tiế tục chu trình lây nhiễm mới (Kobayasi et al., 1982)
Các quả thể C militaris thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam (Zheng et al., 2011) C militaris có các dạng bào tử khác nhau trong chu trình sống của nấm Ở các điều kiên môi trường khác nhau, sự hình thành các dạng bào tử cũng cho thấy sự khác biệt, như việc tạo bào tử tròn trên môi trường nuôi cấy rắn hoặc các chồi bào tử trên môi trường nuôi cấy lỏng
Chu trình sinh sản của nấm C militaris cũng giống như các loài nấm túi khác, bao gồm chu trình sinh sản vô tính và chu trình sinh sản hữu tính
Kí chủ của C militaris trong tự nhiên bao gồm ấu trùng và nhộng của các loài bướm Ngoài ra, còn có các ký chủ khác như các loại côn trùng bộ cánh màng (Hymenoptera), bộ cánh cứng (Coleoptera), và bộ hai cánh (Diptera) Có nhiều loài
Cordyceps có hình thái tương tự loài C militaris, như C Kyusyuensis, C cardinalis, C pseudomilitaris,C roseostromata, C rosea, C washingtonensis
1.2.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của nấm C militaris
Nhiều hoạt tính sinh học có trong nấm C militaris đã được nghiên cứu đánh giá Hai hoạt chất chính trong nấm C militaris là cordycepin và adenosin Hàm lượng cordycepin trong quả thể cao gấp 3 lần so với hàm lượng có trong sinh khối (phần giá thể côn trùng) (0,97% trong quả thể và 0,36% trong giá thể) Đối với hợp chất adenosine, hàm lượng chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong giá thể (Hur,
2008) Các kết quả nghiên cứu cho thấy cordycepin kích hoạt sự kết thúc quá trình tổng hợp DNA hoặc RNA bên trong tế bào (Chen et al., 2008)
Cordycepin (3′-deoxyadenosine) từ nấm C militaris có hoạt tính điều hoà miễn dịch, kháng ung thư, ngăn di căn, và kháng vi sinh vật (Shonkor et al., 2010) Ngoài ra, thử nghiệm hoạt tính của cordycepin đối với tinh trùng lợn cho thấy khả năng tăng số lượng tinh trùng, làm tăng số phần trăm tinh trùng di động và hình dạng bình thường Hiệu quả này được duy trì sau hai tuần ngưng sử dụng chế phẩm (Lin et al., 2007)
Adenosine là 6-amino-9-beta-D-ribofuranosyl 9-H-purine tham gia điều tiết các quá trình sinh lí gồm: bảo vệ tim, giãn nở mạch máu Adenosin là một nucleoside nội sinh hiện diện trong các tế bào của cơ thể con người (Cronstein,
Enzyme nattokinase là enzyme có hoạt tính làm tan sợi fibrin trong hình thành cục máu đông Enzyme này cũng được xác định từ chiết nấm C militaris, có khả năng điều trị làm tan cục máu đông, có hiệu quả trong điều trị bệnh tim mạch ở người già (Sung et al., 2006)
Kết quả phân tích cho thấy sự hiện diện của các hoạt chất sinh học sau trong
C militaris: axit γ-aminobutyric (GABA) và ergothioneine; glycolipids (cerebroside), glycoprotein (lectins), D-mannitol (gọi tắt là axit cordycepic), xanthophylls bao gồm carotenoids (lutein và zeaxanthin), sterol (ergosterol), statin (lovastatin), hợp chất phenolic (bao gồm axit phenolic và flavonoid), vitamin và khoáng sinh học/nguyên tố sinh học (magiê, kali, selen và lưu huỳnh)
Hoạt tính của cao chiết quả thể nấm C militaris ức chế sự phát triển của tế bào ung thư phổi, trực tràng (Li et al., 2015) Bên cạnh đó dịch chiết nấm C militaris còn khả năng kháng bệnh tiểu đường và viêm thận (Lim et al., 2012) Rất nhiều các tác động tích cực khác cũng được báo cáo đối với hệ hô hấp, tuần hoàn, tim mạch (Akaki et al., 2009)
1.2.3 Điều kiện nuôi trồng nấm C militaris
Cordyceps militaris là loài điển hình của chi Cordyceps (Hypocreales,
Ascomycetes), là một loại nấm ký sinh trên ấu trùng hoặc nhộng của côn trùng thuộc bộ cánh vẩy Tương tự như C sinesis, một loại thảo dược của Trung Quốc, C militaris tạo ra nhiều hoạt chất sinh học và được sử dụng rộng rãi làm thuốc truyền thống và thực phẩm tốt cho sức khỏe (Wang et al., 2008) Do giá trị dược liệu và hiện đang được sử dụng rộng rãi trong các hệ thống hiện đại để điều trị nhiều bệnh,
C militaris được coi là mục tiêu của cuộc cách mạng dược phẩm xanh vì thân thiện với môi trường với độ an toàn hợp lý (Das et al., 2010) Từ khi nhân tạo thành công loài C militaris, loài thảo dược này trở thành đối tượng quan trọng để phát triển kinh tế do có giá trị dược liệu và kinh tế cao, nhu cầu sử dụng cao trong xã hội Hiện nay, việc nuôi trồng C militaris ở Việt Nam khá phổ biến, bộ phận lớn người dân tiếp cận với nhiều loại sản phẩm khác nhau từ loại nấm dược liệu này, làm cho nghề trồng nấm ngày càng có xu hướng mở rộng Việc nuôi trồng nấm trên môi trường thể rắn là chủ yếu, và vì vậy phần đế nấm là vấn đề môi trường cần giải quyết
Mặc dù có giá trị kinh tế và y học to lớn của C militaris [2,69,70] nhưng có tương đối ít nghiên cứu đề cập đến hiệu quả canh tác trong các điều kiện khác nhau Ngoài ra, hầu hết họ tập trung vào sản xuất C militaris trong phòng thí nghiệm ở quy mô thấp nhằm kiểm tra các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp cordycepin mà không tập trung vào sản xuất công nghiệp quy mô lớn, trong đó các thông số như hiệu quả chi phí, hiệu quả cơ chất, thời gian nuôi cấy và khả năng mở rộng cũng cần được xem xét (Kontogiannatos et al., 2021)
Tổng quan về lên men dược liệu sử dụng vi sinh vật
Hiện nay, người ta quan tâm nhiều đến việc nghiên cứu các quá trình chuyển hóa sinh học nhờ vi sinh vật Các đối tượng như vi khuẩn, nấm cung cấp thêm enzyme hoặc làm bất hoạt enzyme nào đó của quá trình chuyển hóa Kết quả thúc đẩy quá trình chuyển hóa một hợp chất xác định thành một hợp chất thứ cấp đặc trưng, hạn chế tạo ra các sản phẩm phụ kèm theo, giúp tăng hiệu quả việc sản xuất, dễ dàng tinh sạch hoặc tách chiết các hợp chất thứ cấp, có thể ứng dụng thương mại hóa sản xuất hợp chất thứ cấp trong ngành công nghiệp hóa chất và dược liệu (Hegazy et al., 2015)
Các nghiên cứu về quá trình chuyển hóa sinh học là một hướng nghiên cứu phổ biến của xu hướng “Hóa học xanh” ngày nay, hướng tới sử dụng các quy trình sản xuất quy mô công nghiệp các hóa chất một cách bền vững, tiết kiệm năng lượng và hạn chế tối thiểu lượng phụ chất tạo ra Do đó, những nghiên cứu về quá trình tổng hợp hợp chất, chuyển hóa sinh học được chú trong hiện nay và cả những năm tiếp theo (Hegazy et al., 2015)
Quá trình biến đổi nhờ vi sinh vật có thể hoạt động ở pH gần trung tính, nhiệt độ môi trường và áp suất khí quyển (Collins AM & MJ., 1999) Điều này ưu thế hơn so với phương pháp hoá học thường đòi hỏi những điều kiện cực đoan không thân thiện với môi trường Hơn nữa, đặc tính của enzyme là chất xúc tác rất đặc hiệu do đó tạo ra được cấu trúc hoá học mong muốn, ít khi tạo ra sản phẩm phụ
(Collins AM & MJ., 1999) Nhiều vi sinh vật có thể được sử dụng cơ chất có giá thành thấp làm nguồn năng lượng cho quá trình chuyển hoá (Rozenbaum HF et al.,
Cao chiết lên men thực vật (Fermented plant extract-FPE) là một loại thực phẩm chức năng phổ biến ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và một số quốc gia khác ở châu Á Các loại thực vật khác nhau như ngũ cốc, đậu, rau quả, cây dược liệu đều có thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất FPE (Feng et al., 2017)
FPE được lên men bởi các vi sinh vật khác nhau như nấm men, vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic,… Các sản phẩm FPE có chứa nhiều vitamine, khoáng chất, hợp chất thứ cấp có lợi cho sức khỏe con người như làm sạch đường ruột; giải độc; chống viêm, vi khuẩn, oxi hóa, khối u (Feng et al., 2017)
Gần đây, nhiều nghiên cứu lên men vỏ quả măng cụt như lên men giấm, rượu, lên men lactic, và nước uống giàu probiotic đã được báo cáo Cho thấy sự quan tâm đến việc nghiên cứu sử dụng nguồn vỏ quả măng cụt, chất thải nông nghiệp, giàu hoạt tính sinh học trong công nghiệp thực phẩm, hướng đến phát triển thực phẩm chức năng Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào về sử dụng chủng nấm C militaris trong lên men vỏ quả măng cụt
Các nghiên cứu sử dụng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis lên men chiết xuất thực vật bắt đầu từ năm 2014 Đầu tiên, Zhen-Yuan Zhu và cộng sự công bố điều kiện tối ưu hóa (thời gian lên men, kích thước chất cấy, pH và độ dày chất nền) khi sử dụng nấm C sinensis để lên men phần bã cây đậu ván sau khi đã chiết xuất các polysaccharides Năm 2015, Wei-Nan Wang và cộng sự lần đầu tiên phát hiện ra rằng sử dụng C sinensis lên men cao chiết từ nhân sâm Panax ginseng đã thúc đẩy chuyển đổi sinh học ginsenoside chính (Rb1) thành một ginsenoside hiếm có hoạt tính kháng khối u mạnh hơn (hợp chất K – CK), cho phép thu được lượng
CK dồi dào hơn (Wang et al., 2015) Năm 2016, nghiên cứu của Amira Mira đã công bố báo cáo sử dụng C sinensis lên men chiết xuất methanol của Angelica shikokiana - một loại cây thuốc của Nhật Bản đã làm thay đổi cấu trúc của hoạt chất chính là isoepoxypteryxin làm tăng hoạt tính gây độc tế bào và xuất hiện hoạt tính mới chống lại sự tập kết của tiểu cầu (Mira et al., 2016) Như vậy, việc sử dụng nấm đông trùng hạ thảo C sinensis lên men cao chiết thực vật cho hiệu quả tốt, cho phép thu nhiều hợp chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn và hoạt tính sinh học mạnh hơn
Năm 2018, Mi Rim Lee và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu về tác dụng chống béo phì của chiết xuất từ lá dâu tằm (Morus alba) lên men sử dụng Cordyceps militaris (EmfC) ở chuột béo phì C57BL/6 Kết quả này chỉ ra rằng EMfC có thể ngăn chặn sự tích tụ chất béo ở chuột C57BL/6 béo phì do sự biểu hiện của enzyme lipase triglycerid trong mỡ gia tăng đáng kể, kích thích sự phân giải lipid, giảm sự tích tụ chất béo ("," ; Lee et al., 2019)
Chiết xuất từ quả thể C militaris và cordycepin có thể ức chế đáng kể hoạt động của tyrosinase và làm giảm hàm lượng melanin của tế bào B16F10 được kích thích bởi hormone kích thích tế bào hắc tố α (α-MSH) Cao chiết từ nhân sâm P ginseng có các ginsenosides và polysaccharides có khả năng ức chế sự tổng hợp và chuyển hóa melanin Sự lên men P ginseng sử dụng nấm C militaris đã có tác động hai chiều P ginseng bổ sung trong môi trường nuôi nấm C militaris làm tăng đáng kể lượng cordycepin và tổng lượng đường, trọng lượng phân tử trung bình của polysaccharid trong FPE và sợi nấm của C militaris Đồng thời, C militaris tăng cường sản xuất pseudoginsenoside F11 Nghiên cứu đã cung cấp một quy trình để sản xuất pseudoginsenoside F11 (Li et al., 2021)
Năm 2021, Yiqiang Dai và cộng sự công bố báo cáo nghiên cứu lên men chuyển hóa sinh học váng sữa đậu nành sử dụng C militaris Trong nghiên cứu này, váng đậu nành chưa lên men và váng đậu nành lên men bởi C militaris đã được so sánh về các đặc tính hóa lý, hoạt tính sinh học và xét nghiệm tổn thương DNA Kết quả cho thấy rằng quá trình lên men C militaris làm tăng hàm lượng các amino acid, phenolic, flavonoid và isoflavone aglycones và giảm lượng oligosaccharide trong váng sữa đậu nành; tăng cường đáng kể khả năng loại bỏ gốc ABTS, làm giảm sự khử sắt và giảm gây tổn thương DNA do phản ứng Fenton của váng sữa đậu nành (Dai et al., 2021)
Như vậy, nấm đông trùng hạ thảo C militaris có khả năng lên men cao chiết từ thực vật để thực hiện chuyển hóa sinh học các hợp chất có sẵn thành các hợp chất thứ cấp, tăng cường hoặc thay đổi hoạt tính sinh học của FPE; có tiềm năng sử dụng lớn trong công nghiệp sản xuất thực phẩm, hóa chất và dược phẩm
Do vậy mà trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ đánh giá về mặt hoạt tính sinh học cũng như sự chuyển hoá sinh học của các hợp chất chính trong vỏ quả măng cụt khi được bổ sung vào môi trường rắn nuôi trồng nấm C militaris.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Chủng nấm Cordyceps militaris 69 được cung cấp từ Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam
Vỏ quả măng cụt được thu mua từ các siêu thị, chợ dân sinh.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp nuôi cấy nấm C militaris trên môi trường bổ sung bột vỏ quả măng cụt
Các chủng C militaris bảo quản ở -80 o C sẽ được hoạt hóa bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch khoai tây dextrose (PDA) ở 25 o C trong tối trong 7 ngày và sau đó chuyển sang điều kiện tối/sáng (12h/12h) trong 20 ngày Bào tử vô tính sẽ được chuyển vào PDB (môi trường lỏng dextrose khoai tây) hoặc SDAY (dextrose
40 g, peptone 10 g, cao nấm men 10 g, agar 15 g trong 1L; pH 5,6) trong bình lắc
50 mL và cấy ở 25 o C trong 5 ngày, 120 vòng/phút để nhân giống
Chủng nấm C militaris đã được nhân giống sau thời gian 4 – 5 ngày tiến hành cấy trải 5 ml dịch nuôi lên môi trường gạo lứt bổ sung dịch dinh dưỡng (20 g/L nhộng, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L MgSO4, 2 ml/L vi khuẩn, 5 g/L peptone, nước luộc
(100 g/L giá đỗ và 100 g/L khoai tây), 40 g/L đường saccarose, pH = 6,0) có tỉ lệ khác nhau bột dược liệu đã được hấp tiệt trùng ở 121 o C trong 20 phút theo bảng sau Mỗi công thức được thực hiện trong 10 chai polypropylen và mỗi thí nghiệm sẽ được lặp lại 3 lần
Bảng 2.1 Hàm lượng bột vỏ quả măng cụt được bổ sung vào môi trường nuôi nấm
Công thức Bột vỏ quả măng cụt (g)
Gạo (g) Bột vỏ quả măng cụt/tổng khối lượng
Các công thức môi trường trên được chia thành hai lô, lô thí nghiệm trồng nấm và lô đối chứng tương ứng không trồng nấm
Các hộp nuôi được đóng kín và được nuôi qua ba giai đoạn: Giai đoạn ươm tơ nấm: được tiến hành ở điều kiện tối hoàn toàn 10 ngày, nhiệt độ 20 o C Giai đoạn kích thích mầm: được tiến hành ở nhiệt độ 22 – 24 o C, độ ẩm 80 – 85 %, chiếu sáng
14 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 1000 Lux Giai đoạn chăm sóc quả thể: được tiến hành ở nhiệt độ 20 – 22 o C, độ ẩm 80 – 85%, chiếu sáng 12 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 1000 Lux
2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ bột vỏ măng cụt đến năng suất của nấm C militaris
Môi trường thể rắn nuôi cấy C militaris chứa 35 g gạo lứt trong 70 ml môi trường lỏng (0,5 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4, 20 g nhộng tằm và 1L nước cất) (Le et al., 2021) Thí nghiệm đánh giá tỷ lệ bột vỏ măng cụt thích hợp cho năng suất và hàm lượng cordycepin của nấm C militaris được thiết kế với tỷ lệ bột vỏ măng cụt từ 0% đến 100% so với gạo lứt Năm mL dịch cấy sẽ được cấy vào môi trường đặc, nhiệt độ 20 o C, độ ẩm 70-90%, ánh sáng (500-1000 lux) thời gian 14/24h trong 50-
Sản lượng quả thể nấm sẽ được tính bằng trọng lượng khô của quả thể nấm trên mỗi bình sau 2 tháng nuôi cấy
Công thức môi trường bổ sung bột vỏ quả măng cụt với tỉ lệ thích hợp là môi trường có tỉ lệ bột vỏ quả măng cụt cao nhất mà không ảnh hưởng đến sinh trưởng và năng suất quả thể nấm
2.2.3 Phương pháp chiết xuất ethanol từ đế nấm
Phần đế nấm sẽ được sấy khô ở 60 o C đến khối lượng không đổi rồi nghiền thành bột mịn và bảo quản trong lọ tối màu ở -20 o C cho đến khi sử dụng Bột đế nấm sẽ được chiết xuất bằng các dung môi ethanol 96% với tỷ lệ 1:10 (w/v) trong 2 giờ đun sôi Dịch chiết sẽ được ly tâm cô cạn bằng thiết bị cô quay chân không (IKA-Đức) ở 30-40 o C Dịch chiết thô sẽ được tính năng suất chiết và sau đó được bảo quản ở -20 o C cho đến khi sử dụng (Pintathong et al., 2021)
2.2.4 Đánh giá hoạt tính sinh học
2.2.4.1 Hoạt tính chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá bằng phản ứng khử gốc DPPH (2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl) theo Mohammad et al., 2019 với một số điều chỉnh (Mohammad et al., 2019) Dung dịch DPPH (0,1 mM) được điều chế bằng ethanol tuyệt đối Các chất chiết xuất được hòa tan trong dung môi của nó để thu được dung dịch gốc (1000 àg/mL) và sau đú được pha loóng hai lần trong đĩa 96 giếng để thử nghiệm chất chống oxy hóa Một phần dịch chiết (20 μL) được trộn với 180 μL DPPH trong ethanol trong đĩa 96 giếng Các hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ phòng (RT) trong 30 phút trong tối Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 517nm bằng Microplate Reader (Biotek, USA)
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút ở điều kiện tối Mật độ quang (OD) được đo ở bước sóng 517 nm bằng Microplate Reader (Biotek, Mỹ) Hoạt tính chống gốc tự do được tính toán như sau:
SC%: Phần trăm gốc tự do DPPH bị khử
ODsp: Giỏ trị hấp thụ của mẫu (20 àL mẫu + 180 àL DPPH)
ODbisp: Giỏ trị độ hấp thụ mẫu trắng (20 àL mẫu + 180 àL ethanol)
ODct: Giỏ trị độ hấp thụ dung mụi (20 àL dung mụi + 180 àL DPPH)
ODbict: Giỏ trị độ hấp thụ mẫu dung mụi trắng (20 àL dung mụi + 180 àL ethanol)
Sử dụng excel để tính được trị số SC50% (50% gốc tự do DPPH bị khử) Ascorbic acid được sử dụng làm đối chứng dương
Xét nghiệm hoạt tính kháng khuẩn sẽ được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Le et al., 2014) đối với vi khuẩn Gram dương: Micrococcus luteus KACC 13377, Bacillus subtilis KACC 17047, Staphylococcus aureus subsp aureus KCTC 1916 và vi khuẩn Gram âm: Pseudomonas aeruginosa KACC10232 và Enterobacter cloaceae subsp disolvent KACC 13002 Các chủng vi sinh vật này sẽ được nuôi cấy trong môi trường LB trong 24 giờ Phần chiết xuất đế nấm sẽ được pha loãng trong etthanol 70% Môi trường nuôi cấy chứa khoảng 10 7 CFU/mL sẽ được cấy trải trên các đĩa MHA (Mueller Hinton Agar) Trên bề mặt của các đĩa thạch đã cấy, các đĩa giấy lọc vô trùng (đường kính 6 mm) chứa 500 μg mỗi mẫu chiết xuất và đối chứng sẽ được đặt lên bề mặt thạch Các đĩa này sẽ được ủ trong 3 giờ ở 4 o C trước khi chuyển sang ủ 37 o C qua đêm Mỗi mẫu được thử nghiệm ba lần và vùng ức chế sẽ được đo bằng milimét Ethanol 70% được dùng làm đối chứng âm và streptomycin (2 μg/đĩa giấy) được dùng làm đối chứng dương
Thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC, các mẫu cao chiết được pha loãng bậc 2 bắt đầu từ 100 mg/mL với môi trường LB Các chủng vi khuẩn kiểm định được nuôi khoảng 5 giờ ở 37oC và pha loãng đến khoảng mật độ 10 6 CFU/ml Mỗi phản ứng được chuẩn bị với 250 μl dịch vi khuẩn và 250μl dịch cao chiết ở các nồng độ pha loãng khác nhau Các mẫu này được ủ ở 37oC và sau 24 giờ, lấy 100 μl mẫu trộn đều với 20 μl thuốc thử resazurin 0,015% trong các giếng đĩa 96 giếng Quan sát sự đổi màu trong các giếng, giá trị MIC là nồng độ thấp nhất trong dãy thử nghiệm không làm đổi màu resazurin (ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn) (Mohamed et al., 2016) Để xác định giá trị MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu), 100 μl mẫu (ở các ồng đọ mà không có sự đổi màu resazurin) được cấy trải trên đĩa LB agar và ủ ở 37oC qua đeme, quan sát sự hình thành khuẩn lạc Giá trị MBC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ của các cao chiết tiêu diệt toàn bộ vi khuẩn (không có khuẩn lạc trên đĩa) (Ngô Thái Bích Vân và cs., 2021; Lương Thị
2.2.4.3 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro
Hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư: KB, A549, HepG2, và MCF7 cũng như dòng tế bào khỏe mạnh HEK293 sử dụng xét nghiệm MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Mosmann, 1983) sẽ được áp dụng cho chiết xuất từ đế nấm
Các dòng tế bào sẽ được nuôi cấy trên DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium), với 10% FBS (feal bovine serum) và một số thành phần khác ở 37 o C trong tủ ấm ẩm và 5% CO2 Các dòng tế bào ở pha log sẽ được sử dụng để thí nghiệm Nồng độ 1 × 10 4 - 3 × 10 4 tế bào/mL tùy thuộc vào dòng tế bào sẽ được chuẩn bị cho thớ nghiệm bằng cỏch thờm 10 àL mẫu và 190 àL dung dịch tế bào, sau đó ủ ở điều kiện tiêu chuẩn Sau 72 giờ nuôi cấy, mỗi giếng thí nghiệm được bổ sung 10 àL MTT (5 mg/mL) và tiếp tục ủ trong 4 giờ Cỏc tinh thể formaran sẽ được hũa tan với 100 àL DMSO và mật độ sẽ được đo ở bước súng 540 nm trờn máy quang phổ Biotek Sự ức chế sự phát triển của tế bào sẽ được thể hiện bằng giá trị IC50
2.2.5 Phân tích thành phần hoá học
2.2.5.1 Hàm lượng phenolic tổng số
Phenolic tổng số sẽ được xác định bằng phép phân tích quang phổ với thuốc thử Folin-Ciocalteu (Kim, 2003) Cụ thể, cứ 100 àL mẫu phõn tớch ở cỏc nồng độ khỏc nhau được trộn với 10 àL thuốc thử Folin-Ciocalteu Sau 5 phỳt, thờm 100 àL
Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả dữ liệu được hiển thị dưới dạng ± SD từ ba lần lặp lại thí nghiệm Các kết quả được phân tích phương sai đa chiều và so sánh trung bình được thực hiện bằng thử nghiệm Tukey (SPSS phiên bản 26.0) và Microsoft Office Excel 2010 Sự khác biệt giữa các phương tiện được coi là đáng kể ở giá trị p cao chiết E80>cao chiết E100>cao chiết nước (Suttirak, 2009)
Hàm lượng flavonoid được xác định trong dịch chiết quả thể của C militaris với lượng 1,56 mg/g Nồng độ flavonoid được tính toán C militaris với lượng 1,56 mg/g Hàm lượng flavonoid được tính toán tương đương với rutin (RE) Hàm lượng flavonoid trong quả thể và sợi nấm được xác định tương ứng là 5,54 mg RE/g và 2,26 mg RE/g Trong dịch chiết nước của C militaris, nồng độ flavonoid là 275,52 mg/g, trong khi polyphenol là 19,79 mg/g Nồng độ flavonoid trong dịch chiết cao hơn so với trong quả tươi của C militaris Tổng hàm lượng flavonoid lần lượt là 6,6
Gạo Gạo + Nấm Măng cụt Măng cụt + Nấm
Hà m lượn g fla vo no id ( à g QE / m g ca o ch iế t) mg RE/100 g và 4,5 mg RE/100 g trong dịch chiết và thể quả tươi của C militaris (Je ̨drejko et al., 2021)
Trong báo cáo của Guntarti 2017, hàm lượng flavonoids được kiểm tra cho các mẫu vỏ quả măng cụt Kalimanta, Java và Sumatra chiết xuất với 70% ethanol lần lượt là 0,301; 0.,398 và 0,747 mg QE/g cao chiết (Guntarti et al., 2017)
Vỏ quả măng cụt được báo cáo là có hàm lượng chất chống oxy hóa phenolic tự nhiên tốt như axit phenolic và flavonoid Tuy nhiên, vỏ măng cụt được coi là lãng phí và bị loại bỏ do phần ăn được của quả được tiêu thụ nhiều Trong nghiên cứu của Razila và cộng sự (2021) xác định điều kiện chiết tối ưu của vỏ măng cụt theo hàm lượng phenolic tổng số (TPC) và hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) bằng cách chiết bằng ethanol Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được sử dụng để xác định ảnh hưởng của hai biến số chiết: nhiệt độ chiết (20–60 o C) và thời gian chiết (30–80 phút) đến hiệu suất tổng hàm lượng phenolic và tổng hàm lượng flavonoid của vỏ măng cụt Điều kiện tốt nhất cho TPC và TFC của dịch chiết vỏ măng cụt được lựa chọn dựa trên độ mong muốn đạt được khi sử dụng nhiệt độ chiết 50 o C và thời gian chiết 59 phút, thu được hàm lượng phenolic tổng số là 11,27 mg GAE/g và tổng hàm lượng flavonoid là 7,78 mg QE/g chiết xuất từ vỏ măng cụt Ở điều kiện tối ưu, vỏ măng cụt được báo cáo có giá trị năng lượng chống oxy hóa khử sắt là 137,07 mM TE/g mẫu khô và 92,68% hoạt tính nhặt gốc tự do Cấu hình và nhận dạng flavonoid của catechin và rutin ở điều kiện tối ưu được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Tóm lại, thời gian chiết là yếu tố quan trọng nhất đối với cả hoạt tính phenolic và flavonoid tổng số, sau đó là nhiệt độ (Razila & Ramli, 2021)
3.3.2 Đánh giá sự chuyển hoá của một số hợp chất chính trong cao chiết từ đế nấm bổ sung bột vỏ quả măng cụt
Kết quả kiểm tra sắc kí bản mỏng hình 3.8 cho thấy mẫu cao chiết đế vỏ măng cụt nuôi nấm có một số vạch chất mới so với các mẫu đối chứng (đánh dấu mũi tên) Có thể trong quá trình sinh trưởng của nấm C militaris đã có sự chuyển hoá một số chất trong vỏ quả măng cụt Những phân tích như sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), khối phổ là cần thiết cho những nghiên cứu tiếp theo để làm sáng tỏ nhận định này
Hình 3 8 Kết quả TLC các mẫu nghiên cứu A Hình ảnh kiểm tra ở bước sóng 254 nm; B Hình ảnh kiểm tra ở bước sóng 365 nm
0 a-mangostin; 1 Cao chiết đế gạo; 2 Cao chiết đế gạo nuôi nấm; 3 Cao chiết đế vỏ măng cụt 25%; và 4 Cao chiết đế vỏ măng cụt nuôi nấm
Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về tác động của nấm C militaris đối với các hợp chất thứ cấp từ vỏ quả măng cụt Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Putra và cộng sự (2023) sử dụng vỏ quả măng cụt trong quá trình lên men axit lactic Phương pháp so màu được sử dụng để xác định tổng phenol (thuốc thử Folin-Ciocalteu) và tổng flavonoid (thuốc thử AlCl3) Ngoài ra, phương pháp xác định tổng anthocyanin bằng cách sử dụng KCl và thuốc thử CH3COONa Kết quả cho thấy rằng việc bổ sung sucrose và chiết xuất nấm men trong quá trình lên men vỏ quả măng cụt có thể làm tăng đáng kể nồng độ hàm lượng phenol tổng số, flavonoid và anthocyanin nếu so sánh với đối chứng (giá trị p là 0,0001) Lên men là một trong những quá trình chiết xuất tự nhiên liên quan đến vi sinh vật và các quá trình enzyme dẫn đến sự phân huỷ của thành tế bào thực vật để các thành phần hóa học thực vật có thể được giải phóng Quá trình lên men axit lactic đã được các nghiên cứu trước đây báo cáo đã nâng cao đáng kể thành phần dinh dưỡng và các hợp chất hoá học khác Các nghiên cứu khác cũng cho rằng quá trình lên men axit lactic trên với quả dâu tằm có ảnh hưởng đáng kể mức độ của các hợp chất phenol, flavonoid và anthocyanin tổng số Ngoài ra, quá trình lên men axit lactic cũng làm cho môi
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 trường lên men trở nên có tính axit tương ứng với việc giải phóng các hợp chất có hoạt tính sinh học và các sản phẩm phụ của quá trình lên men.Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men axit lactic là nguồn cacbon và nitơ, đặc biệt là loại và nồng độ của chúng (Putra et al., 2023)
Biến đổi sinh học (bioconversion) được coi là một trong những trụ cột nền tảng của nền hóa học xanh Biến đổi hóa học thông qua biến đổi sinh học được thực hiện trong điều kiện ôn hòa, nhiệt độ phòng, có thể cung cấp giải pháp thay thế hiệu quả cho tổng hợp hóa học vì biến đổi vi sinh vật có thể làm giảm việc sử dụng và tạo ra các chất thải độc hại Biến đổi sinh học là một công cụ quan trọng để biến đổi hợp chất của hợp chất hữu cơ, đặc biệt là sản phẩm tự nhiên có cấu trúc phức tạp như steroid Quá trình biến đổi sinh học dựa trên toàn bộ tế bào vi sinh vật đã được thực hiện bằng cách sử dụng các hợp chất steroid làm điểm khởi đầu và một loạt các loại nấm đã được sàng lọc trong hoạt động chuyển đổi sinh học này Nghiên cứu này tập trung vào việc điều chỉnh cấu trúc của steroid qua nấm, nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nuôi cấy lên chất nền Nghiên cứu này khảo sát tác dụng của
Trichothecium roseum và SSW endphyte và được thực hiện lần đầu tiên Sự biến đổi sinh học của tibolone bằng nấm Trichothecium roseum mang lại 5 chất chuyển hóa Quá trình hydroxyl hóa chủ yếu diễn ra ở các vòng A, B và C, đặc biệt là ở các vị trí C-3, C-6 và C-12 Lần đầu tiên, việc biến đổi cấu trúc của một loại thuốc chống viêm, prednisolone bằng nấm nội sinh biển được mã hóa là SSW phân lập từ tảo biển, cỏ dại đã được báo cáo Sự biến đổi sinh học dẫn đến sự hình thành một hợp chất đã biết có tên là 20 beta-hydroxy prednisolone Việc chuyển hóa 21 - acetyl prednisolone được thực hiện song song với prednisolone nhằm thấy được tác dụng của chuỗi bên của prednisolone trong chuyển hóa sinh học Nấm nội sinh
Penicillium lapidosum (SSW) cũng cho kết quả dương tính trong quá trình khử acetyl hóa 21 - acetyl prednisolone thành prednisolone trong quá trình lên men trong hai ngày và cuối cùng chuyển hóa thành 20 beta-hydroxy prednisolone sau 6 ngày lên men Cấu hình tuyệt đối của 20 beta-hydroxy prednisolone cũng lần đầu tiên được xác nhận bằng hằng số liên kết hóa học thực nghiệm và tính toán cũng như phổ ECD Nấm nội sinh SSW được xác định là Penicillium lapidosum bằng cách giải trình tự theo phương pháp Blasting 2.2.10 của NCBI (Mohd Noor, 2014)
Một nghiên cứu khác về tác động của vỏ quả măng cụt đến quá trình lên men ở dạ cỏ, khả năng tiêu hoá chất dinh dưỡng và quần thể vi sinh vật ở trâu đầm lầy (Bubalus bubalis) được cho ăn chế độ ăn rơm rạ Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức về lượng chất khô ăn vào và khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng khi bổ sung bột vỏ quả mang cụt (P>0,05) Hơn nữa, việc bổ sung bột vỏ quả măng cụt không ảnh hưởng đến pH dạ cỏ, nhiệt độ, nitơ amoniac và nitơ urê máu Điều thú vị là, việc sản xuất axit propionic (C3) đã tăng lên đáng kể khi bổ sung bột vỏ quả măng cụt (P
