Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo mô hình nuôi tế bào 2D, 3D dùng để sàng lọc các cao chiết thực vật có độc tính trên tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú VN9 CD44+

DANH MỤC TỪ VIET TATTHUẬT NGỮ TEN DAY DU TIENG VIET ABC ATP-binding cassette Cassette gin ATP ABL Tyrosine-protein kinase ABL ADSCs Adipose Derived Stem Cells | Tế bao gốc trung mô từ mô

ĐẠI HOC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH TRUONG DAI HQC KHOA HOC TY NHIEN

PHAN LU CHÍNH NHÂN

NGHIÊN CỨU TAO MO HÌNH NUOI TE BAO 2D, 3D

DUNG DE SANG LOC CAC CAO CHIET THUC VAT

CO DOC TINH TREN TE BAO UNG THU VU, TE BAO

GOC UNG THU VU VN9 CD44'/CD24

LUAN AN TIEN Si SINH HOC

Tp Hồ Chí Minh - Năm 2021

ĐẠI HỌC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH

TRUONG DAI HOC KHOA HOC TU NHIEN

PHAN LU CHÍNH NHÂN

NGHIEN CUU TAO MO HINH NUOI TE BAO 2D, 3D DUNG

DE SANG LOC CAC CAO CHIET THUC VAT CO DOC

TINH TREN TE BAO UNG THU VU, TE BAO GOC UNG

THU VU VN9

CD44*/CD24-Nganh: SINH LY HOC NGUOI VA DONG VAT

Mã số: 62420104

Phản biện 1: PGS.TS Trần Mạnh Hùng Phản biện 2: TS Trần Thị Hải Yến

Phản biện 3: TS Bùi Thị Kim Lý

Phản biện độc lập 1: TS Trần Thị Hải Yến

Phản biện độc lập 2: TS Bùi Thị Kim Lý

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS TRƯƠNG DINH KIỆT

Tp Hồ Chí Minh - Năm 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các kết quả nghiên cứu được trình

bay trong luận án là trung thực, khách quan và chưa được công bồ bởi bat ky tác giảnào hay ở bat kỳ công trình nào khác

Tôi cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, cácthông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Phan Lữ Chính Nhân

LỜI CÁM ƠN

Luận án này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào

gốc, Viện Tế bào gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP.HCM và Phòng thí

nghiệm David Eisenberg, Phòng thí nghiệm Sorgani, Dai học UCLA dưới sự hướng

dẫn của Giáo sư Trương Đình Kiệt Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy về sựquan tâm và định hướng khoa học trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Thầy Phan Kim Ngọc, Thầy Phạm Văn Phúc,

Thầy David Eisenberg, Cô Alice Soragni đã tạo mọi điều kiện thuận lợi dé tôi có thé

hoàn thành luận án nghiên cứu của mình.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các đồng nghiệp, bạn bè làm việc tại Phòng thí nghiệmNghiên cứu và Ứng dụng TẾ bào gốc, Viện Tế bào gốc, Bộ môn Sinh lý học và CNSH

Động vật, Khoa Sinh học, Phòng Đảo tạo sau đại học thuộc Trường ĐH Khoa học

Tự nhiên đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Xin gửi món quà này đên Ba Mẹ, các Anh và Em như một lời tri ân vì đã là nguôn động lực lớn cho tôi trên suôt con đường học vân này.

il

MỤC LỤC

2/001 /0229.n00 088888 e ,H i

LOT CAM ON cossssssssssssssssssssssssssusssssssssnsssssssssssecsssssssussessssssusessssssuusessssssnescesssssssesssesssseesssesees ii

MUC LUC cessesssssssssssssssssssssuesssssnscsessnsecessssecesssnecsessnsssssnuecesssuecssssnecsessnsccesssuecesssseceesansceessaee iti

DANH MỤC TU VIET TAT sssssssssssssssssssessssssessssssssssssssecssssvecssssvecsssssseeesssvecsssanecessaneeesses viii

n0 /c8g(0e02.01c1n.-~- xỉ

DANH MUC HINH cscssssssessssssssssssssssssssecssssssssecsessssssecsssssssveceessssssecesssssssecsessssssecsessssaseeseess xii

MO DAU vessssssssssssssssvsesssssvecsssssecsssssscssssvecsssssscssssssecssssvecsssssscessavecsssasecsessssesssssvecsssasscess xviii

CHUONG 1 TONG QUAN assecssssssssssesssssessssecssssecssssessssecsssnecssssesssssessssscssasecssssesssseeessseeses 1

Ll Tổng quan về ung thur Vieieccccccccccscescsscssessessessesscsessessessessaessessessesseseseees 1

1.1.1 Sinh học tế bào ung thư VÚ 2-2 2S£+E‡SE‡EEEEE2EE2EEEEEEEEESEkrrrrrerree 2

1.1.2 Cơ sở phân tử của ung thư VÚ - 5 S23 33+ 3S EEEEEerrrrrerrrersrervre 4

1.2 _ Tế bào gốc ung thư VÚ - ©- E+SESEE£EE2EE2EEEEEEEEE121121121 7111111 xe 16

1.2.1 Phân lập va marker phân tử - - ¿+ 22+ 11+ ESEEserrserssrrssrres 16

1.2.2 Những đặc tinh quan trong của tế bao gốc ung thư vú [110, 114] 18

1.3 Nuôi cấy tế bao ung thu dùng trong sang lọc thuốc - :-¿ 19

1.3.1 Nuôi tế bào lớp đơn (nuôi 2D) 2-©52 2+SE£EE££Et£Et2EzEzExerxeree 19

1.3.2 Nhu cầu nuôi khối tế bào 3 chiều (nuôi 3D) - 2 2 s+cxzs+ 201.3.3 Ưu điểm của mô hình nuôi tế bào 3D dùng trong sàng lọc thuốc 221.3.4 Các phương pháp nuôi cấy tế bào 3D -¿- 2 22Sz+Eezxererszrred 23

1.3.5 Sự biểu hiện các protein kết nối tế bào — tế bào, tế bào và chất nên ngoại

bào khi nuôi cấy 3D - 2-52 2 2E EE2E21121127127127171121121111112121 21c 30

1.4 Sàng lọc thuốc trong nghiên cứu điều trị ung thư -:-z 31

1.4.1 Tinh hình trong ƯỚC eececeeseesessesseceecescesessesseseecseseeeeaeeaeeaes 31

1H

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2 5¿2++2z++zx+zxz+zxzzzed 321.4.3 Các liệu pháp điều tri ung thư chính dựa vào hợp chat thiên nhiên 36

1.5 Ly do cho sự cần thiết nuôi cấy tế bào gốc ung thư vú ở dạng 3D cho sàng

lọc các cao chiết thực vật có độc tính trên tẾ bảO S c n n n T2 2E E1 tre 37

CHUONG 2 VAT LIEU - PHƯƠNG P.HÁTP ccs<©2+eeseetvvvveeseerrrrvee 41

2.1 Sơ đồ các nội dung trong nghiên cứu trong luận án - 2 22 5+: 41

2.2 Vat WOU eee 42

2.1.1 Đối tượng thí nghiệm -¿- 2-5 essessessessesessessessssesessessessesseeees 42

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa CHẤT Sc-Sc St E111 E121011211112111111111111 1111 1x 43

2.3 Các phương pháp nuôi, phân lập tế bào gốc ung thư vú người Việt Nam

(09 “o0 a Ỏ 45

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy tẾ bào - ¿5+ s22 2212212712121 Ecrvee 45

2.3.2 Phương pháp phân tách tế bào băng kháng thé có hạt từ tinh (MACS) 492.3.3 Phương pháp phân tích quần thể tế bào bằng phương pháp

[9À A41905191)A 200070777 -.gdẠG,:|-ỒÔỒốỐ ÔỒ 49

2.3.4 Phương pháp phân tích chu kì tế bào bang dong chảy 50

2.4 Các phương pháp dùng trong thiết lập mô hình nuôi 2D, 3D 51

2.4.1 Phương pháp đo tín hiệu tế bào bằng MTTT - 2c sz+cz+czrserxees 512.4.2 Phương pháp đo tin hiệu tế bào bằng Resazurin . - 51

2.4.3 Phương pháp dựng đường cong tăng trưởng và thời gian nhân đôi của

dòng tẾ bàO - - Set E121121121112112112112111111011011211 1111012121111 1 1n re 522.4.4 Phương pháp nuôi cấy trên đĩa được tráng agarose - 532.4.5 Phương pháp nuôi cấy trên đĩa giọt tre0 cecccecessessesssesessessesseestesseesen 53

2.4.6 Phuong pháp đánh giá lõi hoại tỬ - -. - St S*2 Svvssvresrrrree 54

2.4.7 Phương pháp nuôi cấy trong chất nền matrigel 2-2-5 5z: 54

2.4.8 Phương pháp RT-PCR - -. c2 1221112111111 1 11111251711 E1 re 55

2.4.9 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch . -2- 25552 2x+sz>+zs2 58

iv

2.5 Cac phurong phap khac 1n 60

2.5.1 Phương pháp thê hiện số liệu bang bang màu 5 52-55¿ 602.5.2 Phương pháp phân tích quần thé aopotosis - 5z 5522 5+: 61

2.5.3 Phương pháp xử lý số liệu - 2 + + 2E+2EE2EEEEEEEEEEEEEEEErrrkervees 62

CHƯƠNG 3 KET QUA - BAN LUẬNN ccee©ccesecEE+eeeeEErxestetrxessrrrreesrrrree 63

3.1 Phân lập tế bao gốc ung thư vú CD44'/CD24, khảo sát sự tăng trưởng, khanăng tạo mamosphere và biểu hiện ABCG2 ¿5 2252+E++E2Ee£EeEzEzxeei 63

3.1.1 Phân lập tế bào gốc ung thư vú VN9 CD44+/CD24- s : 63

3.1.2 Khảo sát sự tăng fTƯỞng - - -ctnnnn HgHnHnHnH gh n nh nnưh 64

3.1.3 Đánh giá khả năng tạo mamosphere và biểu hiện ABCG2 65

3.3.1 Khảo sát, đánh giá kết quả nuôi tế bào theo mô hình 3D bằng 3 phương

Phap khac hau 0 -31 85

3.3.2 Đánh giá mô hình nuôi 3D sử dung đĩa giọt treo và chat nền matrigel vớithuốc kháng phân bào Doxorubicin - - 2-2 2 ++s+E+EE+E+EzEerxerxerssree 1023.3.3 Đánh giá mô hình nuôi 3D sử dụng chất nền matrigel với thuốc kháng

phân bào 'TirapazaimIne - - - - + + 3311332111151 1181 1151118111811 E81 E81 cgvrg 107

3.3.4 Thử nghiệm tính ồn định tạo khối tế bao của mô hình nuôi 3D trên một

số dòng tế bào khác -¿- ¿+ + E22 12 19E15711211211211211111111211211 11 1xx 110

3.3.5 Bản luận + HT HT HT HT HT HT HT HH Hi 114

3.3.6 Quy trình thử chất kháng phân bào trên tế bào ung thư vú và tế bao gốc

ung thư vú nuôi 3Ì - -. - - +1 3311332113391 1 59111111111 11181111811 E8 1g ng 115

3.4 So sánh biéu hiện một số gen, ty lệ quần thể tế bào CD44+/CD24- trong mô

hình nuôi 2D và mô hình nuôi 3D dùng matrigel eee 5 s«c++£+<<+++ 116

3.4.1 Sự khác nhau về biểu hiện ở mức phiên mã các gen liên quan đến methyl

3.4.2 Sự khác nhau về biểu hiện ở mức phiên mã gen trong con đường

[J7.4.1.9@ PM 122

3.4.3 Sự khác nhau về biéu hiện protein liên quan đến liên kết tế bào giữa mô

hinh 2D 6P 123

3.4.4 Sự khác nhau về ti lệ quan thé CD44+/CD24- giữa mô hình 2D va 3D

3.4.5 Đề xuất việc chọn mô hình nuôi 2D hoặc nuôi 3D dùng trong sàng lọchop chất có độc tính trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú 128

3.5 Đánh giá khả năng sử dụng tế bao gốc trung mô từ mô mỡ làm tế bào đối

chứng thay thế nguyên bào sợi trong quy trình sàng lọc chất có độc tính lên tế bảo

3.6 Ứng dụng mô hình nuôi 2D, 3D tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú

trong sảng lọc độc tính tế bào của 34 cao chiết thực vật - - 134

3.6.1 Thiết lập các thông số của quy trình sảng lọc -z2 1343.6.2 Phân tích tong thé IC50 của 34 cao chiẾt 2-2 2+se+xereesses 135

3.6.3 Xác định chi số tác dụng phụ SEI 2-52 s2Ec2E2EzExerxerrerex 1373.6.4 Kết quả sang lọc độc tính tế bào của 34 cao Chiét cece 138

3.7 Đánh giá tiềm năng sử dung của cao chiết cây Sao đen Hopea odorata 150

CHUONG 4 KET LUẬN — KIÊN NHỊ, << se te +ee£EseEkseEkeerkeeresereseree 158

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỖ -e<©ce<©cee+vee+EseEtserkeecrsere 161

vi

TÀI LIEU THAM KHẢ O ẻ-©©ẻ Sẻ ©t*£EE£EEt£EEE£EEteEEtEEtEEeEEeEEseEkeeEkserkserkscree 162

PHỤ LỤC Ó00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000060000 0060

vi

DANH MỤC TỪ VIET TAT

THUẬT NGỮ TEN DAY DU TIENG VIET

ABC ATP-binding cassette Cassette gin ATP

ABL Tyrosine-protein kinase ABL

ADSCs Adipose Derived Stem Cells | Tế bao gốc trung mô từ mô mỡ

AKT Protein kinase B Protein kinase loại B

ALDH Aldehyde dehydrogenase

BRCAT-associated RING BARDI

domain protein 1 BRCA Breast Cancer Gene Gen lién quan ung thu vu

CDK Cyclin-dependent kinases Kinase phụ thuộc Cyclin

CSC Cancer Stem Cell Tê bao gốc ung thư

DNMT DNA methyltransferases Enzym methyl hóa DNA

Dòng tế bào ung thư tuyến tiền

DU145 Prostate cancer cell line

liệt

ECM Extra Cellular Matrix Chất nên ngoại bào

EGF Epidermal growth factor Nhân tổ tăng trưởng biéu mô

Epithelial Cell Adhesion ol Ep-CAM Phân tử kêt nôi biêu mô

Molecule

gen điều chỉnh phản ứng của tế

The Growth Arrest and DNA „ GADD45 bào với stress, sự hình thành khôi

HER2 Human Epidermal growth Thụ thé yếu tô tăng trưởng biéu bì

factor receptor 2 người

HTS Highthrouput Screening Sang lọc thông lượng cao

Vili

Michigan Cancer

Foundation-MCF-7 : dòng tế bào ung thư vú

Mouse double minute 2

Neuronal cell adhesion cố `

N-CAM Phân tử kết nôi thuộc thân kinh

Molecule

NCI National Cancer Institute Viện ung thư quốc gia

Nonobese diabetic/severe tiéu đường kết hop suy giảm miễn

NOD/SCID ‹

combined immunodeficiency | dịch tram trọng

NPC Neuro Progenitor Cell Té bao tién than than kinh

PANC03.27 Pancreatic Cancer Cell line Dong té bao ung thu tuy

Dong té bao ung thu tuyén tién

PC3 human Prostate Cancer 3

liệt PEG Polyethylene glycol

PI3K Phosphoinositide 3-kinase

Poly hydroxyethyl Poly-HEMA Hydrogel

Transforming growth factor Nhân tố tăng trưởng chuyền dang

VN9 Vietnamese breast cancer cell | Dòng tế bào ung thư vú người

line 9 Việt Nam 9

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thé giới

DANH MỤC BANG

Bảng 1 1 Ưu và nhược điểm của các phương pháp nuôi cấy 3D [ 14] . -:-52 24 Bảng 1 2 Thành phan màng cơ sở tế bào chuột EHS [62] -2-©5+©cz+cxecs+zssrxczss 28 Bảng 1 3 Danh sách các thuốc trị ung thự [70] cccsccccccsscesvessesssessesssessessesssessessesssessesssesseess 35

Bảng 2 1 Thư viện 34 cao chiết sử dụng trong dé ti co.cccccecccsscesesseessessesssessesseessessesssesseess 43 Bảng 2 2 Các môi sử dụng trong dé tdi ccecceccccccecsessssssesssessesseessessesssessessesssessessisssessessseeseees 43 Bảng 2 3 Các kháng thé, thuốc nhuộm sử dụng trong dé tài -©5c©7sc5cccccccsrccces 44 Bảng 2 4 Các hóa chất trong nhuộm hóa mô miễn dịch -s:©5z©cs+cx+cs+cxecsez 44 Bảng 2 5 Các hóa chất trong phân tích độc tính tế bàO -©-+©s+©5z+cs+cxc+csrxersez 45 Bảng 2 6 Các hóa chất trong nuôi cấy 3D 5© +teS‡EéEEEEEEEEEEEE11E11211.11.xe 45 Bảng 2 7 Các dòng tế bào và môi trường nuôi THON UNG ©5255 55+2cscccccccscxersez 45 Bảng 2 8 Thanh phan phản ứng phiên Hỗ NguOc cecceccesscesvesseesessesseessessesssessesssssessesssesseess 56

Bảng 2 9 Chu trình nhiệt cho phản ứng phiên MA HQƯỢC ằScccSccsScssskseexeeereeree 57 Bảng 2 10 Thành phân phản ứng PCR vecccccsscsssessesssessesssessessessessesssessessesssessessusssessesssesseess 57 Bảng 2 11 Chu trình nhiệt phản ứng PCT cv kh rry 57

Bang 3 1 So sánh giữa phương pháp do bằng MTT và Ñesazurin -5 5c- 5e 5552 77

Bảng 3 2 So sánh hai phương pháp tạo khối tế bào 3D qua 7 ngày nuôi cấy 100

Bảng 3 3 Số liệu tổng hợp nông độ ức chế một nửa của 34 cao chiết lên tế bào ADSCs138

Bang 3 4 Số liệu tong hợp nông độ ức chế một nửa các cao chiết lên tế bào VN9 ở mô

Ninth 2D VG 3D E066 nh nố ốốố ẻ 139

Bảng 3 5 Số liệu tổng hợp nông độ ức chế một nửa các cao chiết lên tế bào gốc ung thư

vú N9 CD44+/CD24- ở mô hình 2D vài 3ÌD 5 kg Hiệp 141

Bang 3 6 Số liệu tổng hợp nông độ ức chế một nửa các cao chiết lên tế bào ung thư

MCF-7 ở mô hình 2D vài 3Ì D «SH TH TH TH HT TH TH TH TH HT Triệt 143

Bảng 3 7 Số liệu tổng hợp nông độ ức chế một nửa các cao chiết lên tế bào gốc ung thư

MCF-7 CD44+/CD24- ở mô hình 2D và 3'] «+ Street 145

XI

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Số liệu các ca mắc ung thư toàn cầu năm 2018 5c©5e+cccc+Eererxsrxee 2 Hinh 1 2 Cau an NA ố na .e 3 Hình 1 3 Sự methyl hóa quá mức ở các đảo CpG trên vùng promoter của các gen ức chế MS 11

Hình 1 4 Con đường tin hiệu nội bào PIZK/AKT wo.eecccccccccccesseesscesseesseesneesceensessneeeneenseenaees 14

Hình 1 5 Tế bào gốc tung tÏ VÍ - 55c SE SE EEEEEEEEEEEEE211211711211211111211 111110 17 Hình 1 6 Sự giống nhau của khối cầu tế bào 3D khi nuôi cấy và khối u in vivo 22 Hình 1 7 Cau /2N8⁄/728341018/4220 0n 26 Hình 1 8 Các spheroid được tạo ra bằng phương pháp hanging drop trên nhiều dòng tế

bào trong nghiên cứu của Kel Và CONG SIf - St SH HH ghe, 27

Hình 1 9 Nuôi cấy tế bào ung thư vú lớp đơn 2D và khói tế bào 2D trong matrigel 29

Hình 2 1 Hình ảnh mô tả buông đếm hồng câM ©22:©22+22++22++2E+22222E222EEz22zcct 47 Hình 2 2 Hình minh hoa sự khử muối resazurin thành resorufin ở tế bào sống "— 52

Hình 2 3 Sơ đồ nuôi cấy và thử thuốc trên matrigel c.ccccccccccesscsssvessesssesssesssesssessesssesseee 35

Hình 2 4 Hình minh hoạ màng tế bào ở tế bào bình thường và tế bào bị apoptosis 61

Hình 3 1 Kết quả phân tách quân thé CD44+/CD24- cccccssccsssssssssssesssesssesssessessessessvee 63 Hình 3 2 Đường cong tăng trưởng của 2 dòng tế bào ung thư vú thường và ứng viên té

bào góc ung thư vú VN9 (A) tương quan chỉ số tế bào với thời gian (B) thời gian nhân đôi

Hình 3 3 (A)Khả năng tạo mamosphere và (B) biểu hiện protein ABCG2 của dòng tế bào VN9 sau khi phân tách và làm giàu CD44+/CD24- (C) biểu hiện protein ABCG2 của dòng

VG Ban AGU NA cố ố 65 Hình 3 4 Thời gian nhân đôi thé hệ của dòng tế bào ung thư và ứng viên tế bào gốc ung

70705780 /0000n0n08088 66 Hình 3 5 Độ biến thiên tín hiệu tế bào theo thời gian của từng mật độ cấy trong đĩa 96

giếng theo thời gian từ ngày I ngày đến ngày 7 do bằng thuốc nhuộm MTT - 71 Hình 3 6 Đường cong tăng trưởng theo mật độ tế bào trong 7 ngày nuôi cấy lớp don

được do bằng thuốc nhuộm MTT 5 c SE S1 1121111111111111 11111211 Hee 72

Xil

Hình 3 7 Độ biến thiên tín hiệu tế bào theo thời gian của từng mật độ cấy trong đĩa 96

giếng theo thời gian từ ngày I ngày đến ngày 7 do bằng thuốc nhuộm Resazurin 74 Hình 3 8 Đường cong tăng trưởng theo mật độ tế bào trong 7 ngày nuôi cấy lớp đơn

được do bằng thuốc nhuộm ÑeS4ZHrÌH 5à Sc St SE 1111111111111 11112 1122Ereree 75

Hình 3 9 Đường cong đáp ứng thuốc Doxorubicin của tế bào gốc ung thu vú

CD44+/CD24- theo log nông độ (A) Sử dụng thuốc nhuộm MTT (B) Sử dụng thuốc

//771/8:{21:z27771/NREERREERERh.= 76 Hình 3 10 Nông độ ức chế một nửa của thuốc Doxorubicin lên tế bào gốc ung thư vú

CD44+/CD24- được do bằng phương pháp sử dung MTT va Resazurin (ns: không có khác

biệt thống KE) +- c tEEEE11E11211221 1 E21 1 1H21 tt tra 77

Hình 3 11 Tế bào ung thư vú được nuôi cấy dạng lớp don (A) Tế bào gốc ung thư vú

người Việt Nam VN9 CD44+/CD24- (B) Té bào ung thư vú người Việt Nam VN9 (C) Tế

bào gốc ung thư vú MCF-7 CD44+/CD24- (có xu hướng moc chong lên nhau giống mái

vom — dome structure — mũi tên đen) (D) Tế bào ung thư MCF-7 s.-5ccccccsscccres 79 Hình 3 12 Hình 3.12 Nông độ tức chế một nửa IC50 của Doxorubicin trên dòng 4 dòng tế

bao ung thư vú (*) p<0.001; (**) p<0.(005 2 S111 1111 1111111 111111111111 tr 80

Hình 3 13 Tế bào CD44+/CD24- trong dia 96 giếng đáy hình chữ U có trang agarose 1% sau 5 ngày nuôi cấy Độ phóng đại LÚ 5c 5E E2 2112112211212 ere 86 Hình 3 14 Biéu đồ đường cong tăng trưởng dựa trên kích thước của khối tế bào tạo bằng

_2/7.3/1-8/),.72541187 2.008 nh.-. 87

Hình 3 15 Các tế bào rời rạc không tạo thành cụm tế bào sau 48 giỏ ở các mat độ (A)

250 tế bào/giếng, (B) 500 tế bào/giếng, (C)1000 tế bào/giếng .- + sz+s++cscse2 88 Hình 3 16 Hình thái khối tế bào qua các ngày nuôi cấy ở mật độ 2000 tế bào/giếng (A)

Vào ngày 2, (B) vào ngày 5, (C) vào ngày Ô c2 33511351 EE3E3EEEEEEESEEEsrrkrrerrreese &8

Hình 3 17 Hình anh khói tế bào CD44+/CD44- quan sát dưới ánh sáng trắng và quan sát

dưới đèn huỳnh quang sau khi nhuộm PL (A), (B), (C), (D) là hình anh quan sát dưới anh

sáng trắng lan lượt vào các ngày nuôi cấy thứ 2, 5, 7, 9; (E), (F), (G), (H) là hình ảnh sau khi nhuộm PI và quan sát dưới đèn huỳnh quang vào các ngày nuôi cấy thứ 2, 5, 7, 9; (D),

(J), (K), (L) là hình anh kết hợp vào các ngày nuôi cấy thứ 2, 5, 7, 9 : 90

Hình 3 18 Đường cong tăng trưởng của khối tế bào được tạo bằng phương pháp giọt treo

trong 7 Hgày HHÔÌ CẤV 55c CS EEEE 1211211221121 221212211 re 91

xiii

Hình 3 19 Mô hình tế bào gốc ung thư vú VN9 nuôi cấy trong matrigel được tạo khối

hình trăng kHhujyẾT, 5 5c 5 2 E1 212211 221221221.21 re 93 Hình 3 20 Đường cong tăng trưởng dựa vào kích thước khối tế bào theo thời gian 94 Hình 3 21 Số lượng khối tế bào hình thành ở ngày 5 với kích thước trung bình 54um ở

các mật độ tế bào nuôi trong mafrig€Ï - 5c scE EkEEE211211271211211211211.11E1erre, 95

Hình 3 22 Khối tế bào hình thành trong matrigel từ tế bào don sau 5 ngày nuôi cấy (A)

ngày 0 (B) ngày 5 Mật độ 2000 tế bào/giỂngg - 2:52:52 25 222EEE2EE22212EE2E1221212Ecrk, 96 Hình 3 23 Tỉ lệ tạo khối tế bào sau 5 ngày nuôi cấy tế bào don trong matrigel 97 Hình 3 24 Duong cong tăng trưởng theo mật độ tế bào trong matrigel qua 7 ngày 97

Hình 3 25 Hình ảnh cắt lat và nhuộm H&E của khối tế bào sau 5 ngày nuôi cấy (A) Nuôi

bằng phương pháp giọt treo (B) Nuôi bằng phương pháp Matrigel z+5z+cs+s+ 98 Hình 3 26 Khối tế bào ở phương pháp giọt treo được xử lý với Doxorubicin ở nông độ (A)

IU/1⁄4/1081278/57/A00000/1344/77 PP na 103

Hình 3 27 Khoi tế bào ở phương pháp matrigel được xử lý với Doxorubicin ở nông độ (A)

IU/1⁄4//708128/57/A00000/1-44//77 PP P8 103 Hình 3 28 Đường cong đáp ứng theo nông độ Doxorubicin của VN9 CD44+/CD24- ở hai

7.27 827/15.7.218-.08nnnnẽne/«á 104 Hình 3 29 Biểu đồ so sánh nông độ ức chế một nwa cua Doxorubicin lên VN9

CD44+/CD24- ở hai phương pháp nuôi cấy giọt treo và nuôi cấy trong chất nên (ns: khác biệt không có ý nghĩa thống Ke) eccccccccccsscescssssessessessessessesssessessvessessesssessesssessessvsssessesaveeees 105 Hình 3 30 So sánh nông độ ức chế một nửa của Doxorubicin trên 4 dòng tế bào (*)

P<O.00L; (F*) P<O.OOS cc E— Ả 107

Hình 3 31 Nông độ ức chế một nửa cua Tirapazamine (TPZ) lên mô hình 2D và 3D tế bào gốc ung thư vú người Việt Nam VN9 CD44+/CD24- (*) p<0.0001 - 108 Hình 3 32 Nông độ ức chế một nửa cua Tirapazamine (TPZ) lên mô hình 2D và 3D của 4 dòng tế bào ung thư vú (*) p<0.0001; (**) p<0.0005 - 252552222 109 Hình 3 33 Tổng hợp nhuộm H&E các khối tế bào sau 5 ngày nuôi cấy và nhuộm

Ki67/Caspse khi hiện diện các thuốc Doxorubicin, Staurosphorine và ReACp33 112 Hình 3 34 Biéu đô đáp ứng với nông độ thuốc cua các dòng tế bào (A) MDA-MB-468.

(B) PANC03.27 (C) PC3 (D) MCF-7 (E) HUPT4 (F) DU145 (G) SK-NEP-1 (H) tổng

hợp nông độ tec ChE HỘI Nt ccecceccceccescssvessssssessessesssessesssessessesssessesssessessesssessessessessesaseeees 113

XIV

Hình 3 35 Kết quả điện di các gen PI3KCA và AKT] trên gel agarose 1,5% và được chụp bằng hệ thong máy UVP (A) Mô hình nuôi cấy VN9 CD44+/CD24- 2D và 3D, (B) Mô

hình nuôi cấy VN9 3D -s- 5 2222212211212 re 117 Hình 3 36 Biểu đồ so sánh biểu hiện các gen DNMT1, DNMT3B, BRCAI va p53 ở mức

phiên mã ở các mô hình nuôi cấy (*) p<0.005; (**) p<0.001; (ns): khác biệt không có ý

nghĩa thống ẰÊ - +5 +x‡SÉEEÉEEEEEE2191121121121121121.121212121212221122 re 118 Hình 3 37 Kết quả điện di các gen PI3KCA và AKT] trên gel agarose 1,5% và được chụp bằng hệ thong máy UVP (A) Mô hình nuôi cấy VN9 CD44+/CD24- 2D, (B) Mô hình nuôi cấy VN9 CD44+/CD24- 3D, (C) Mô hình nuôi cấy VN9 3D - 52 52+c+Es+czxcrxe2 122

Hình 3 38 Biểu đồ so sánh biểu hiện các gen PI3KCA và AKTI ở mức phiên mã ở các mô

hình nuôi cấy (*) p<0.01; (**) p<(.05 55 5522212212211221221221121.2121212 re 123 Hình 3 39 Biểu hiện các protein bám dính, liên kết tế bào (A, B, C, D) ở mô hình nuôi cấy

lớp đơn 2D, (E, F, G, H) ở mô hình nuôi cấy khối tế bào 3D phân tích bằng phương pháp

PLOWCYVLOMCLIY 000PnẼẺ 124

Hình 3 40 Biểu đồ so sánh biểu hiện các protein liên quan đến liên kết tế bào giữa mô

hình nuôi cấy lớp don 2D và mô hình nuôi cấy khối tế bào 3D (*) p<0.0001; (**) p<0.005

Hình 3 41 Tỉ lệ quân thể tế bào gốc ung thư vú người Việt Nam VN9 CD44+/CD24- khi

nuôi cấy 2D và 3D được phân tích bằng phương pháp flowcytometry (A) quan thể tế bào

VN9 nuôi cấy dạng 2D; (B) quan thể tế bào VN9 nuôi cấy dang 3D; (C) quan thể tế bào

gốc VN9 nuôi cấy dang 2D và (D) quân thể tế bào gốc VN9 nuôi cấy dạng 3'D 5s E212 211221121 1 1t 1112111 tre 127 Hình 3 42 Biéu đồ so sánh tỉ lệ quan thể tế bào gốc ung thư vú CD44+/CD24- khi nuôi

CD44+/CD24-cay 2D và 3D trên 2 dòng VN9 và VN9 CD44+/CD24- (*) p<0.0001 -. 128 Hình 3 43 Các marker dương tính của dòng tế bào gốc trung mô thu từ mô mỡ (A)CD44; (B)CD73; (C)CD90; (D) CD105 Các marker âm tính của dòng tế bào gốc trung mô thu từ

mô mỡ (E)CD14,CD34,CD45 va HLA-DR Khả năng biệt hoa của ADSCs (F)Mỡ;

(G)Xuong; (H)Sụn Cac marker của dòng nguyên bào sợi HF (I)CD90 và (J)Vimentin 132

Hình 3 44 Nông độ ức chế một nửa của Doxorubicin trên dòng tế bào nguyên bào sợi

người (HF) và dòng tế bào gốc trung mô thu từ mô mỡ người qua các thé hệ cấy chuyên tế

bào (*) p<0.001; (**) p<0.005; (ns) khác biệt không có ý nghĩa thong kê 133

XV

Hình 3 45 Biểu đồ phân bồ giá trị IC50 của 34 cao chiết khi thử trên mô hình nuôi cấy

lớp đơn 2D của 4 dòng tẾ DAO 55 SE EEEEEEEEE1211211211211211211212121111111 xe 136 Hình 3 46 Biểu đô phân bồ giá trị IC50 của 34 cao chiết khi thử trên mô hình nuôi cấy

khối tế bào 3D của 4 dòng tẾ bàaO - 55:52 St EE2E1E21221121122121121122121121121.11 1 e0 137

Hình 3 47 So sánh IC50 của 34 cao chiết, Dox và TPZ trên dòng tế bào ung thư vú VN9

Hình 3 48 Hình 3.45 So sánh IC50 của 34 cao chiết, Dox và TPZ trên dòng tế bào gốc

ung thư vú VN9 CD44+/CD24- Thang 1: Màu do tương ứng với độ nhạy, màu xanh lá

tương ứng với độ kháng lại cao chiết Thang 2: Màu đen tương ứng với tỉ lệ IC50 2D/3D

lớn hơn 1 Màu trắng xám tương tứng với tỉ lệ IC50 2D/3D nhỏ hơn l - 142

Hình 3 49 So sánh IC50 của 34 cao chiết, Dox va TPZ trên dòng tế bào ung thu vú

MCF-7 Thang 1: Mau đỏ tương ứng với độ nhạy, màu xanh lá tương ứng với độ kháng lại cao

chiết Thang 2: Màu đen tương tứng với tỉ lệ IC50 2D/3D lớn hơn 1 Màu trắng xám tương

ứng với tỉ lệ IC50 2D/3D nhỏ NON Ì St HT Hiệu 144

Hình 3 50 So sánh IC50 của 34 cao chiết, Dox va TPZ trên dòng tế bào gốc ung thư vú

MCF-7 CD44+/CD24- Thang 1: Mau đỏ tương ứng với độ nhạy, màu xanh lá tương ứng

với độ kháng lại cao chiết Thang 2: Màu đen tương ứng với tỉ lệ IC50 2D/3D lớn hơn 1.

Mau trắng xám tương ứng với tỉ lệ IC50 2D/3D nhỏ hơn l - 252cc 146 Hình 3 51 Tổng hợp các cao chiết được chọn lọc theo dòng tế bào và mô hình nuôi cấy

H1 278/1/7,87/17200n0n0n0n0nn a 4 147

Hình 3 52 Tổng hợp các cao chiết được chọn lọc theo dòng tế bào và mô hình nuôi cấy

//120/11/1,57/172PPPPP707Ẽ78Ẽ8A6 d 148

Hình 3 53 Kết quả thử độc tinh cua Doxorubicin lên dòng VN9 CD44+/CD24- trên mô

hình 2D và 3D (A) Tỉ lệ tế bào sống theo nông độ (B) Giá trị trung bình tỉ lệ tế bào sống của mô hình 3D cao hơn 2D (C) Đường cong nông độ tức chế một nửa - 151 Hình 3 54 Kết quả thử độc tinh của Tirapazamine lên dòng VN9 CD44+/CD24- trên mô hình 2D và 3D (A) Tỉ lệ tế bào sống theo nông độ (B) Giá trị trung bình tỉ lệ tế bào sống của mô hình 2D cao hơn 3D (C) Đường cong nông độ tức chế một nửa - 151 Hình 3 55 Kết quả thử độc tính của cao chiết Sao đen E18 lên dòng VN9 CD44+/CD24-

trên mô hình 2D và 3D (A) Tỉ lệ tế bào sống theo nông độ (B) Giá trị trung bình tỉ lệ tế

bào sống của mô hình 2D cao hơn 3D (C) Đường cong nồng độ ức chế một nửa 152

Xvi

Hình 3 56 Biểu đồ so sánh tổng hợp nông độ ức chế một nửa của (A) cao chiết Sao den

E18, (B) Doxorubicin và (C) Tirapazamin trên 2 dòng tế bào VN9 và VN9CD44+/CD44- ở

2 MO ith 2D Va BD 0n 153 Hình 3 57 Tac động cua cao chiết Sao den lên hình thái và chu kỳ tế bào gốc ung thư vú

VN9 CD44+/CD24- khi nuôi cấy khối tế bào 3D (A) Hình thái khối tế bào khi xử lý với

E18 và Tirapazamine (B) Phân tích chu kì tế bào bằng flowcytometry (C) So sánh các

phase trong chu kì tế bào khi xử lý với E18 và Tirapazamine (*) p<0.001 154 Hình 3 58 Biéu đô phân tích cảm ứng apoptosis bằng thuốc nhuộm AnnexinV và PI trên

khối tế bào gốc ung thư vú VN9 CD44+/CD24- khi xử lý với Tirapazamine và với cao chiết

Sao den E18 (A) Đối chứng không xử lý thuốc (B) Xử lý với IC50 Tirapazamin (C) Xử lý

với IC50 E18 (D) So sánh tỉ lệ dương tính với AnnexinV/PI (*)p<0.001 155

XVI

MỞ ĐẦU

Ung thư là bệnh gây tử vong hàng đầu ở nước ta Trong các năm gần đây, tỉ lệbệnh nhân được phát hiện ung thư ngày càng tăng Theo thống kê của tổ chứcGLOBOCAN năm 2018 ở nữ giới, trong đó tỉ lệ các ca mac mới đặc biệt ở ung thư

vú đứng thứ 2 chiếm 11.6% [13] Đặc biệt ở Việt Nam ung thư vú gây nên tỉ lệ tửvong cao thứ thứ hai sau ung thư cô tử cung và có hơn 40% bệnh nhân tái phát sau

điều trị bằng phẫu thuật, hóa trị, xạ trị hay kết hợp các liệu pháp Trong các bệnhnhân tái phát tỉ lệ các bệnh nhân có di căn là 60-70% Có nhiều nguyên nhân chonhững trường hợp tái phát bệnh và di căn này, ví dụ như sự định vi khối u vú bị bỏsót trong quá trình phẫu thuật loại bỏ khối u hay những vùng đi căn nhỏ đang pháttriển mà bác sĩ không tầm soát được Đặc biệt thêm một nguyên nhân cho sự tái phát

và di căn này chính là sự ton tai của quan thể tế bào gốc ung thư vú, mang những đặc

tinh tự làm mới, tăng sinh vô han và biệt hóa thành một quan thé không đồng nhất cókhả năng hình thành một khối u mới Đây chính là nguyên nhân chủ yếu gây nên sựthất bại của các liệu pháp điều trị Al-Hajj và cộng sự đã khám phá ra quan thể tế bàogốc ung thư vú lần đầu tiên trong khối u vú người với dau ấn bề mặt CD44*/CD24-[2] Như vậy, trong chiến lược điều trị ung thư vú, việc thiết lập một mô hình tế bàogốc ung thư vú sử dụng cho việc sảng lọc các được chất thiên nhiên hướng tới tìm ra

thuốc mới nhắm trúng đích tế bào gốc ung thư vú là cần thiết Việt Nam có nguồndược liệu déi dào với nhiều cây thuốc quý, vì thế tiến hành nghiên cứu sàng lọc các

hợp chất này trên mô hình tế bào gốc ung thư vú là hết sức thuận lợi Mặc dù đã cónhiều thuốc được phát triển dé điều trị các loại ung thư trên thé giới, song hiệu quađiều trị còn rất giới hạn Vì thế rất nhiều nghiên cứu đề phát triển thuốc và liệu phápđiều trị ung thư mới vẫn đang tiến hành trên khắp các quốc gia

Nước ta có nguồn dược liệu đồi dào với nhiều cây thuốc quý hiếm Hiệu quả

điều trị ung thư của các được liệu này có khác nhau ở các vùng miền, địa phương va

cá thê khác nhau Song, nhiều công bố cho thấy các cây thuốc chứa nhiều hoạt chất

mới và có hiệu quả điêu trị cao Mặc dù đã có nhiêu nghiên cứu sàng lọc, bào chê các

XVII

dược chất ở nước ta đã được tiến hành, Song, nhiều điểm tôn tại trong những quy

trình sàng lọc và công nghệ bảo chế ngày càng cho thay cần có một quy trình sànglọc và bào chế các dược chất hiện đại và chính xác hơn Hơn nữa, trong quá trình

sàng lọc và phát triển thuốc có độc tính trên ung thư cho thấy các thử nghiệm tiền

lâm sàng là giai đoạn quan trọng trong quá trình phát triển một loại thuốc có tiềmnăng chữa trị bệnh ung thư Tuy nhiên, nhiều loại thuốc ung thư đã thất bại trong điềutrị lâm sàng và không được chấp thuận dé điều trị trên người Một phan trong nhữngthất bại này được cho răng có nguyên nhân từ đữ liệu thu được trong các thử nghiệm

in vitro Trong nuôi cây in vitro, các té bào được nuôi cấy dạng lớp đơn không mô

phỏng đúng với điều kiện tự nhiên trong cơ thể người và không dự đoán đúng cácphản ứng của thuốc khi được điều trị trên cơ thé người Do vậy ma mô hình nuôi cấy

tế bào ung thư ở dạng 3D được phát triển, là mô hình có thé mô phỏng gần như các

đặc tính của khối u như sự phân bố các quan thé tế bao khác nhau trong khối u, sựbiệt hóa của tế bào, sự không đồng nhất của khối u, sự liên kết tế bao-té bào, tế bào-chất nền ngoại bào và mô hình này còn phản ánh đúng thực tế sự đáp ứng thuốc hơn

mô hình nuôi cấy lớp đơn 2D: Các tế bảo nuôi cấy dạng 3D có khả năng kháng lại

hóa trị liệu khi so sánh với các tế bào nuôi cấy đạng lớp đơn Lý do đơn giản đó chính

là các tế bào bên trong khối cầu 3D được bảo vệ bởi các tế bào xung quanh bên ngoài.Một lý do khác là do tốc độ tăng trưởng các vùng tế bào trên khối cầu khác nhau cũnggây nên sự kháng thuốc này Những đặc điểm này góp phần cũng cé cho quan điểmnuôi cấy khối tế bào 3D có thé tim thấy một số cơ chế kháng thuốc trong các khối utrong cơ thé, mang đến cơ hội dé mé sẻ các cơ chế và thử nghiệm phác đồ điều trị

nhiều loại thuốc in vitro trước khi tiến hành trên mô hình động vật và cudi cùng là

thử nghiệm lâm sàng.

Do vậy với mô hình tế bào gốc ung thư vú CD44'/CD24, sự sàng lọc các hopchất thiên nhiên hay dược chat trên mô hình nuôi cấy lập thé 3 chiều sẽ phản ánh gầnđúng với sự đáp ứng hay nhạy cảm với các tác nhân kháng phân bào của khối u trênthực tế, bỏ qua những sai sót mà mô hình nuôi cấy dạng lớp đơn mắc phải Hơn nữa

XIX

sử dụng tế bảo gốc ung thư vú sẽ hỗ trợ cho việc chọn lọc và phát triển các hợp chất

trong các liệu pháp nham trúng đích loại tế bào này

Từ những phân tích và nhận định nêu trên, tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứutạo mô hình nuôi tế bào 2D, 3D dùng để sàng lọc các cao chiết thực vật có độc

tính trên tế bào ung thu thư vú, tế bào gốc ung thư vú VN9 CD44*/CD24”” nhằm

đánh gia vai trò của quần thể tế bào gốc ung thư vú trong việc sàng lọc các cao chiết

nay.

Mục tiêu của đề tài:

Tạo ra một mô hình tế bào gốc ung thư vú dé có thé chọn lọc được các caochiết thực vật có độc tính trên đối tượng này từ các thư viện cao chiết thô tự nhiên,

các hợp chất tinh sạch hoặc thư viện thuốc đang phát triển hoặc đã thương mại hóa.Mục tiêu cu thể:

- Phan lập và làm giàu quan thé tế bào gốc ung thư vú

- _ Xây dựng được mô hình sàng lọc các cao chiết thực vật có độc tính trên tế bào

ung thư vú, gốc ung thư vú dạng lớp don 2D và dang khối tế bào 3D

- Ung dụng mô hình dé sàng lọc trên nguồn tài nguyên có san: thư viện các cao

chiết tự nhiên thô từ đó phân tích và đánh giá được hiệu quả sàng lọc của môhình tế bào gốc ung thư vú

Đối tượng nghiên cứu:

- Té bào ung thư vú người Việt Nam (VN9) và tế bào gốc ung thư vú

CD44+/CD24- được làm giàu từ quần thé VN9

Nội dung nghiên cứu:

- Ndi dung 1: Phân lập và làm giàu và đánh giá một số đặc tính của quan thê tế

bào gốc ung thư vú người Việt Nam: Ti lệ quần thé CD44+/CD24-, đườngcong tăng trưởng, khả năng kháng thuốc, khả năng tạo khối cầu

mammosphere.

- Ndi dung 2: Xây dựng mô hình nuôi cấy tế bào gốc ung thư vú lớp đơn 2D

cho sàng lọc thuốc: khảo sát thời gian, mật độ, sự đáp ứng với các thuốc gây

XX

độc và kháng phân bào chuẩn, từ đây thiết lập được quy trình sàng lọc trên mô

hình 2D.

Nội dung 3: Xây dựng mô hình nuôi cấy tế bào gốc ung thư vú dạng khối tế

bào 3D cho sảng lọc các cao chiết thực vật có độc tính: khảo sát thời gian, mật

độ, sự đáp ứng với thuốc gây độc tính và kháng phân bào, các đặc điểm khác

biệt so với mô hình nuôi cấy lớp đơn, các đặc điểm khác biệt giữa tế bảo ungthư vú và tế bào gốc ung thư vú Từ đây thiết lập được quy trình sàng lọc trên

mô hình 3D.

Nội dung 4: Ung dung 2 mô hình dé sàng lọc các cao chiết tự nhiên thô: phân

tích được sự khác nhau và hiệu quả sảng lọc giữa mô hình 2D với 3D và giữa

tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú

XXI

CHƯƠNG 1 TONG QUAN

1.1 Tong quan về ung thư vú

Theo thống kê ung thư toàn cầu năm 2018, GLOBOCAN ước tính ung thư vú

chiếm 11,6% tỷ lệ các ca mắc bệnh ung thư gây tử vong, xếp thứ hai sau ung thưphối Trên toàn thế giới, có khoảng 2.1 triệu trường hợp ung thư vú ở nữ mới đượcchan đoán vào năm 2018 [13] Tại Mỹ, khoảng 266.120 phụ nữ mắc ung thư vú vào

năm 2018 và 63.960 mắc ung thư vú di căn Theo Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ, tỷ lệung thư vú ở phụ nữ từ các nhóm chủng tộc và sắc tộc khác nhau như sau: tỷ lệ tử

vong đo ung thư vú đã giảm trong 25 năm qua ở Bắc Mỹ và một số khu vực ở châu

Âu Tuy nhiên, tại nhiều quốc gia châu Phi và châu Á, tỷ lệ tử vong do ung thư vú

đang tăng lên Tỷ lệ mắc ung thư vú tăng theo tuổi, từ 1,5/100.000 ở phụ nữ từ 20đến 24 tuổi lên đến đỉnh điểm là 421,3/100.000 ở phụ nữ từ 75 đến 79 tuổi; 95%trường hợp mới xảy ra ở phụ nữ từ 40 tuôi trở lên Độ tuổi trung bình của phụ nữ tạithời điểm chân đoán ung thư vú là 61 tuổi [108]

Riêng tại Việt Nam, ung thư vú là bệnh phổ biến nhất ở phụ nữ và ngày càngtăng cao Cụ thé, năm 2013, tỉ lệ mắc ở mức 24,4/100.000 phụ nữ, đến năm 2018 đãtăng lên tới 26,2 tương đương 15.000 ca mắc mới, trong đó có hơn 6.000 ca tử vong

Vào năm 2018, cứ 100.000 người phụ nữ Việt Nam người mắc ung thư vú có 10.5người tử vong tương đương [12] So với năm 2013, tuy số người mắc mới mỗi năm

tăng hơn, nhưng số lượng người tử vong do ung thư vú đã giảm (cứ 100.000 người

có 23 người tử vong vào 2013 thì đến nay chỉ 10,5 người tử vong vào 2018) Tỉ lệ

mắc mới ung thư vú của Việt Nam đang xếp 146/185 quốc gia, vùng lãnh thô khảo

sát, tỉ lệ tử vong ở mức 10,5/100.000 dân, xếp 150/185 [13]

a Định nghĩa ung thư vú

Ung thư vú là ung thư phát triển từ mô vú, trong đó các tế bào ác tính hìnhthành trong các mô của vú TẾ bao ung thư xâm lấn sang các mô vú khoẻ mạnh lân

cận rồi từ đó lan đến các hạch bạch huyết dưới nách Ung thư vú thường phát triểnnhiều nhất trong các tế bào từ lớp lót của ống dẫn sữa, được gọi là ung thư biểu môống và các tiểu thùy được gọi là ung thư biểu mô thuỳ [125]

Trong các nguyên nhân chính gây ung thư vú, yếu tố di truyền, bao gồm tiền

sử cá nhân hoặc gia đình mắc ung thư vú thường mắc các đột biến di truyền(BRCAI , BRCA2 và các gen liên quan đến với ung thư vú khác), chiếm từ 5% đến10% các trường hợp mắc ung thư vú [27] Các yếu tổ nguy cơ sinh sản như bắt đầucủa kinh nguyệt trước 12 tuổi, sinh con đầu tiên sau 30 tudi, vô sinh và mãn kinh sau

55 tuổi Ngoài ra còn các yếu tố khác do độ tuổi, giới tính, lỗi sống hay lạm dụng sửdụng các hormone như estrogen và progesterone, với hai trường hợp phổ biến nhất làtránh thai ở phụ nữ tiền mãn kinh và liệu pháp thay thế hormone ở phụ nữ sau mãn

kinh [108]

Tế bảo tiểu thùy Tế bảo

tiêu quản

Các tiêu quan

Các tiểu thùy Quang vú

Núm vú

b Phân loại ung thư vú

Phương pháp phân loại ung thư vú truyền thống dựa trên khả năng xâm lấnđược tham khảo theo tài liệu của Tổ chức Y tế Thế giới đã được chỉnh sửa lần 4 [125]

b1 Xâm lan: Các tê bao ung thư vượt ra khỏi vi trí ban đầu và lan đến các mô

xung quanh và có thể đi căn đến hạch bạch huyết và các bộ phận cơ thể khác, gồm:

- Ung thư biéu mô ống dẫn sữa xâm lan (Invasive Ductal Carcinoma — IDC)

Đây là loại phố biến nhất trong tổng số các ca mắc ung thư vú, chiếm 50-75%các ca ung thư vú xâm lan Chúng bắt đầu từ ống dẫn sữa và lan đến các mô xungquanh Khối u thường có dang hình sao bat thường

- Ung thư biểu mô tiểu thuỳ xâm lắn (Invasive Lobular Carcinoma - ILC)

Chiém 5-15% các ca ung thư vú xâm lấn Khối u bắt đầu bên trong các tiêuthuỳ hoặc thuỳ và di căn đến các bộ phận khác của cơ thé Khối u có kết cau bình

thường, phần bên ngoài của bầu vú khá cứng hoặc cứng Khối u thường biểu hiện

dương tính với thụ thé estrogen và progesteron

- Ung thư biểu mô dang ống (Tubular Carcinoma)

Là một nhánh nhỏ của IDC, chiếm 1-5% các ca ung thư vú xâm lan Khối uthường rất nhỏ và các tế bào ung thư tạo thành các cấu trúc dạng ống Khối u thườngbiểu hiện dương tính với thụ thé estrogen và biểu hiện âm tính với thụ thé yếu tố tăng

trưởng biểu mô tuyến vú HER2

- Ung thư biểu mô dịch nhay (Mucinous Carcinoma)

Là một nhánh nhỏ của IDC, chiếm 1-5% các ca ung thư vú xâm lan Phổ biến

hơn ở phụ nữ lớn tuổi Khối u mềm và hiếm khi di căn đến các hạch bạch huyết Các

tế bao được bao bọc bởi một lượng lớn chất nhay Chất nhày và tế bao ung thư kết

hợp với nhau tạo thành khối u giống như thạch

- Ung thư biểu mô dang tuy (Medullary Carcinoma)

La một nhánh nhỏ của IDC, chiếm <1% các ca ung thư vú xâm lắn, phổ biến

ở các phụ nữ trung niên Dạng này có khối u mềm và các mô tế bào giống như tuỷ

của não bộ.

- Ung thư biểu mô dạng nha (Papillary Carcinoma)

Phổ biến ở các phụ nữ sau mãn kinh Có hình thái nhú, nhưng mặt khác không

có các đặc điểm lâm sảng, di truyền hoặc tiên lượng.

b2 Không xâm lan: các tế bao ung thư không lan đến các mô xung quanh màchỉ tập trung tại vị trí ban đầu, gồm có:

- Ung thư biểu mô ống dẫn sữa tại chỗ (Ductal Carcinoma In-Situ - DCIS)

Là một dạng ung thư biểu mô không xâm lấn thường gặp, có thé trở thànhdạng ung thư xâm lan Nguy cơ tái mắc bệnh là dưới 30%

- Ung thư biểu mô tiêu thuỳ tại chỗ (Lobular Carcinoma In-Situ - LCIS)

Là dạng u lành tính không triệu chứng và không phát hiện được trong ảnh chụp

X-quang Thường được phát hiện ở phụ nữ trước mãn kinh, 40-50 tuổi

1.1.2 Cơ sở phân tử của ung thư vú

a Vai tro cua gen p53

al Khai quat

P53 là một trong những gen thường có sự mat chức năng trong nhiều loại ungthư, hơn một nửa trường hợp các bệnh ung thư thì có sự mất biểu hiện của P53 P53không hoạt động trong tế bào khi không có sự hư hại DNA Khi có sự ton hại DNA

p53 sẽ dừng chu ki tế bào đến khi được sửa chữa, nếu p53 không thực hiện được chứcnăng thì chu trình tế bào vẫn tiếp tục với những sai hỏng và tạo ra nhiều sai hỏng

DNA hơn nữa, dẫn đến không kiểm soát được chu trình tế bào và có thể hình thànhung thư, nhiều nghiên cứu công bồ liên quan giữa ung thư vú và sự bất hoạt hoặc độtbiến p53 đã được báo cáo [28]

a2 Chức năng

Như một tác nhân ức chế khối u, p53 cần thiết trong việc ngăn chặn sự tăngsinh không phù hợp của tế bao và duy trì tính toàn vẹn của bộ gen sau stress genotoxic.Theo sau các kích thích nội bao và ngoại bào khác nhau: chang hạn như tổn thương

DNA, biểu hiện vượt mức các oncogene, ø5 3 được hoạt hoá và trở thành protein điều

hòa gây ra những thay đổi sinh học khác nhau, ở cả 2 cấp độ tế bào đơn cũng nhưtrong toàn bộ cơ thê [156] P53 đáp ứng với những hư hại DNA bằng cách dừng chu

trình tế bào dé cho tế báo có khả năng sửa chữa những hư hỏng hoặc cảm ứng gây

apoptosis khi những hư hỏng không sữa chữa được, trên tế bào ung thư vú, nhiềuthuốc được phát triển dựa trên nguyên tắc này [128]

a3 Điều hoà chu kỳ tế bào

Khả năng của p53 có thé ngăn sự phát triển tế bào là mau chốt quan trọng cho

chức năng ức chế khối u p53 có thé bắt giữ tế bào trong pha G1, S và G2 của chu kỳ

tế bào P53 cảm ứng ngừng chu kỳ tế bào tại G1 và G2 và nó cung cấp thêm thời gian

dé cho các tế bao sửa chữa những hư hại di truyền trước khi vào giai đoạn tông hợp

DNA và phân bào Một trong những mục tiêu hạ nguồn - down stream chính của p53

là tác nhân ức chế cyclin phụ thuộc kinase (CDK) p21 p21 là một tác nhân điều hoachính việc ngừng chu kỳ tế bào phụ thuộc p53 ở pha G1 diễn ra sau khi tổn thương

DNA Dé đáp ứng với stress tế bào, p53 điều hòa tăng nồng độ p21 nội sinh Sự biểu

hiện vượt mức của p21 bắt giữ tế bào ở G1 bằng cách ngăn phức hợp cyclin mediated phosphoryl hóa Rb và phóng thích E2F (E2F có chức năng giúp biéu hiện

E/CDK2-những gen cần thiết cho tế bào đi vào pha S) [156] Ngược lại, khi p21 bị ức chế,

phức hợp cyclinE/CDK2 phosphoryl hóa protein Rb thành dạng hyperphosphoryl Rb,

dạng này rời khỏi phức hợp với E2F, E2F được giải phóng sẽ cho phép tế bào tiếp

tục chu trình đi vào pha S [22].

a4 Cảm ứng quá trình apoptosis

Với chức năng là một protein gác công (gatekeeper), p53 có vai trò theo đõistress tế bào và gây chết tế bào nếu cần thiết Trong các mô nếu tác nhân stress gây

hư hỏng nghiêm trọng và không thé phục hồi các hư hai, p53 có thé cảm ứng dé bắt

dau quá trình apoptosis, để loại bỏ các tế bào bị hư hỏng Kha năng của p53 dé tạo ra

quá trình apoptosis dường như tương quan với khả năng ngăn chặn những biến đôi

ác tính Những kết qua này cho thấy việc quy định quá trình apoptosis là một chứcnăng trong việc ức chế khối u cũng như sự tiến hóa của p53

Những sản phẩm gen gây ra apoptotic bởi p53 bao gồm Bax (Bel-2 liên kếtvới protein X), DR5/KILLER (death receptor 5), DRAL, Fas/CD95 (thụ thể tín hiệuchết tế bào), PIG3 (cảm ứng gen p53), Puma (tác nhân điều chỉnh điều hòa tăng P53

của quá trình apoptosis), Noxa, pidd, PERP, Apaf-1 (yếu tố hoạt hoá apoptosis 1), Scotin, pS3AIP1, và một số yếu tố khác Các sản phẩm của các gen này

protease-có thé gây apoptosis qua một con đường bên ngoài hoặc bên trong, gọi là con đườngthụ thể gây chết và con đường ty thể Con đường apoptosis bên trong diễn ra khi các

tế bào chịu stress và được chi phối bởi các protein họ Bcl-2 Ho protein Bcl-2 bao

gồm ba lớp: protein kháng apoptosis Bcl-2 và Bel-XL, protein tiền apoptosis Bax,Bak và Bcl-XL, và protein tiền apoptosis Bid "BH3 only", Bad, Noxa, va Puma

Trong sự điều hoa của quá trình bên trong, sản phẩm gen tiền apoptosis: như Bax,Bid, Puma, Noxa, và p53AIP1 nam tai ty thé va thúc day sự mất điện thé màng ty

thể và phóng thích cytochrome c, dẫn đến sự hình thành của các phức hợp

apoptosome với Apaf-1 và caspase 9 [22].

p53 được hoạt hoá có thé điều chỉnh trực tiếp hoặc gián tiếp sự biểu hiện các

protein mục tiêu và các protein kiểm soát tính thắm của mang ty thé, và do đó có thêđiều chỉnh việc phóng thích các protein ty thé và thực hiện quá trình apoptosis Trong

con đường chết tế bao, p53 có thé thúc day quá trình apoptosis thông qua sự hoạt hoá

các thụ thể chết ở màng tế bào, bao gồm Fas/CD95, DR4 và DR5 và dẫn đến sự ứcchế của IAP (các protein ức chế apoptosis) Cả DR4 và DR5 gây ra apoptosis bởiTRAIL, phối tử Fas và tác nhân hóa trị liệu và Fas thì cần thiết cho quá trình apoptosis

phụ thuộc p53 trong hau hết các mô [22]

p53 có thé gây ra apoptosis qua cơ chế phụ thuộc vào lưới nội chất bằng việcchuyên hoạt hóa Scotin, một protein nằm trong lưới nội chất và màng nhân p53 cũng

có thé thúc đây quá trình apoptosis qua cơ chế sao chép độc lập p53 có thé trực tiếp

hoạt động apoptosis nếu thiếu sao chép hoặc tong hợp protein dưới một số điều kiện

và loại tế bào nhất định Trong ty thé, p53 gắn trực tiếp đến Bcl-XL/Bcl-2 dé thay théBax hoặc protein BH3, do đó tạo điều kiện thay đổi apoptosis ty thể phụ thuộc Bax

p53 cũng có thé gắn với Bak ty thé và gây ra oligomerization Bak, phóng thích

cytochrome c sau quá trình thắm của màng ty thể Trong một số trường hợp, nếu chỉ

có sự cảm ứng apoptosis của 1 gen đôi khi không đủ dé gây ra quá trình apoptosis, vìmức độ cao của chất ức chế chu kỳ tế bao có thé chiếm ưu thé và dẫn đến ngừng chu

kỳ tế bao Phan ứng apoptosis có thé được tăng cường thông qua sự dừng chu kỳ tếbao (ví dụ bằng cách chặn p21WAF1/Cip1 hoặc 14-3-38) Nếu p21WAF1/Cipl hay

14-3-3ö được loại ra khỏi tế bao sai hỏng, tế bào sẽ chết thay vì ngừng chu kỳ của nó[128] Ở các loại ung thư biểu mô đặc biệt là ung thư vú, phát hiện sự tủa của proteinp53 trong tế bào làm cho protein này không hoạt động dẫn đến sự không kiểm soát

quá trình apoptosis của các tế bào ung thư này [156]

b Vai trò cua gen BRCAI, BRCA2

b] Khải quát

BRCA (BReast CAncer Gen) có vai trò quan trong trong sửa chữa DNA va

điều khién phiên mã dé đáp ứng với những tổn thương DNA, hon nữa protein BRCAcòn duy tri su ồn định của nhiễm sắc thé, do đó bảo vệ những hư hại đến bộ gen Bêncạnh đó sự phiên mã của BRCAs còn điều hoà một số gen khác liên quan đến sửa

chữa DNA, chu kỳ tế bào và quá trình apoptosis Họ protein BRCA có vai trò quan

trong trong ung thư vú có tính di truyền, khoảng 10% các bệnh nhân ung thư vú là di

truyền và khoảng 30-70% các trường hợp này có liên quan đến những sai hỏng trong

tế bào dòng mầm của gen ức chế khối u BRCA/ hoặc BRCA2 [39] Phụ nữ có bat

thường trong gen BRCA/ hoặc BRCA2 có đến 80% nguy cơ phát triển ung thư vú.Nhiều nghiên cứu khác cho thay sự methyl hóa quá mức promoter của BRCA/,

BRCA2 và được coi như một cơ chế bat hoạt biéu hiện gen BRCAI, 2 [39]

b2 Chức năng

Mặc dù cấu trúc của gen BRCA/ va gen 8RC42 rất khác nhau, nhưng có một

số chức năng liên quan đến nhau đó là khả năng sửa chữa những sai hỏng DNA thông

qua tái tổ hợp tương đồng Chức năng của BRCA2 chưa được hiểu hết, các báo cáochỉ tập trung đến khả năng sửa sai DNA, trong khi chức năng của 8RC41 được hiểu

rõ trong sửa chữa DNA, kiểm soát chu trình tế bào, ubiquitin protein và tô chức lại

nhiễm sắc thé [98]

b3 Sửa chữa sai hong DNA mach đôi

Trong cơ chế sửa chữa thông qua tái tổ hợp tương đồng (HR), các protein sửa

chữa sử dụng các trình tự tương đồng còn nguyên vẹn từ một nhiễm sắc thé chị em,

từ một nhiễm sắc thể tương đồng, hoặc từ nhiễm sắc thé giống nhau (tùy thuộc vàogiai đoạn chu kỳ tế bào) như một khuôn mẫu, quá trình sửa chữa DNA này diễn ratrong nhân tế bào

Trong nhân, protein BRCA/ tương tác với RADS1 trong quá trình sửa chữa hư

hỏng DNA mạch đôi Nguyên nhân gây sai hong DNA gồm có sự bức xa tự nhiênhay cũng có thê xảy ra khi nhiễm sắc thé trao đổi vật liệu di truyền Khi tiếp xúc vớicác tác nhân gây tôn hại DNA, gen BRCA/ nhanh chóng trở thành dạng

hyperphosphoryl và được di chuyển cùng với Rad§ đến vị trí tổng hợp DNA mà được

đánh dấu bằng kháng nguyên nhân tế bào (PCNA) Tuy nhiên cơ chế tương tác giữaBRCAI và RAD5I chưa biết rõ trong khi protein BRCA2 tương tác trực tiếp vớiprotein RADS51 thông qua vùng BRC lặp lại và một phan trong C-terminus Bằng

cách sửa chữa sai hỏng trên DNA, ba protein này đóng vai trò trong việc duy trì sự

ồn định của hệ gen của con người [98]

BRCAI trực tiếp gắn với DNA, ái lực cao hơn với DNA cấu trúc nhánh Khảnăng này giúp gắn với DNA, góp phần vào khả năng ức chế hoạt động của phức hợpnuclease mRNA cũng như các hoạt động nuclease độc lập của Mrel1 Điều này cóthé giải thích vai trò của gen 8RC41 dé thúc đây việc sửa chữa DNA bởi sự tái tổhợp không tương đồng.

b4 Diéu hòa phiên mã

BRCAI có thê điều hòa phiên mã và sửa chữa những hư hại nhiễm sắc thé Nó

là một thành viên của lõi RNA polymerase II, 8RCA7 có thể hoạt động như một yếu

tố đồng hoạt hóa phiên mã Ngoài ra, gen BRCA/ tương tác với p300/CBP, nhân tốđồng hoạt hóa phiên mã CREB Sự sữa chữa NST thông qua hoạt động histonedeacetylase: chăng hạn như các thành phần của tổ hợp sửa chữa nhiễm sắc thể liên

quan với SWI /SNE.

b5 Điều hòa chu kỳ tế bào

Khi có kích thích tạo ra hư hại DNA, BRCA/ dựa trên trạng thai phosphoryl

hóa của nó gây ra bắt giữ chu kỳ tế bào BRCA/ chuyên hoạt hóa p2lcip1/WAF1,

góp phan bắt giữ tại điểm kiểm soát G1 / S Phosphoryl ATM của BRCA/ đóng vai

trò trong việc hoạt hoá trạm kiểm soát trong pha S BRCA/ cũng ý nghĩa trong điềuhòa phiên mã của một số gen: như cyclinB, 14-3-3sigma, GADD45, wee-1 kinase vàPLKI liên quan đến điểm kiêm soát G2 / M [98]

b6.Diéu hòa quá trình apoptosis

Protein 8RC41 có thể tương tác với p53 và có thé kích thích phiên mã p53phụ thuộc vào p21WAF1/CIPI và MDM2 Ngoài ra, phức hợp BRCAI-BARDI cần

thiết cho phản ứng phosphoryl hóa p53 tại Serl5 do hư hại DNA Phản ứngphosphoryl hóa p53 tại Ser-15 là điều cần thiết cho sự bắt giữ chu kỳ tế bao trong pha

G (1)/ S qua sự cảm ứng phiên mã phụ thuộc vào cyclin và chat ức chế kinase p21

b7 Sự Ubiquitin hóa

BRCAI và BARDI tương tác với nhau để tạo thành một ubiquitin ligase E3.

RNA polimerase bị ngừng tại vi trí của ton thương DNA, là một mục tiêu cho

ubiquitin ligase, do đó cho phép sửa chữa DNA.

Nhiều nghiên cứu cho thấy răng cả hai protein 8RC41 va BRCA2 điều hòa

hoạt động của các gen khác và đóng một vai trò quan trọng trong phát triển phôi thai

Protein BRCA/ có thé tương tác với nhiều protein khác, bao gồm các protein ức chếkhối u và nhân tố điều hoà chu trình phân chia tế bao

c Vai trò cua methyl hóa DNA và các DNA methyltransferase DMNT [83]

Su methyl hoa DNA được xúc tác bởi ho enzyme DNA methyltransferases

(DNMTs) Enzyme này xúc tác việc chuyển một nhóm methyl từ methionine (SAM) đến cystosine trong CpG site Họ enzyme methyltransferase ởđộng vật có vú bao gồm DNMTI, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B Họ này được chialàm 2 loại theo chức năng gồm có methyltransferase duy trì và methyltransferase khởiphát (de novo) Enzyme Methyltransferase duy trì gồm có DNMTI, chức năng của

S-adenosyl-nó là gắn nhóm methyl đến những DNA ở tình trạng methyl hóa một nửa sau quá

trình sao chép DNA Trong khi DNMT3A và DNMT3B giúp gắn nhóm methyl lên

DNA chưa từng methyl hoá trước đó DNMT1, DNMT3A, DNMT3B cần cho sựthiết lập tình trạng methyl hoá trong vùng promotor và exon thứ nhất trong bộ genngười Trong tế bào soma, trạng thái methyl hoá được bảo tồn cao và thông quá quá

trình phân chia tế bào nó được duy trì nhờ hoạt động của DNMTI Enzyme này là

một thành phan của phức hợp sao chép DNA và duy trì sự methyl hoá DNA bằng

cách thêm nhóm methyl vào vi tri carbon thứ 5 trong cytosine của dinucleotide CpG

trên mach DNA mới được tổng hop

Cấu trúc của các enzyme DNMT1, DNMT3A, DNMT3B bao gồm vùng điều

hòa (N-terminal regulatory) và vùng xúc tác (C- terminal catalytic) Có sự khác biệt

trong chức năng cua N-terminal trong những enzyme nay DNMT1 đòi hỏi sự tương

tác lẫn nhau giữa vùng N-terminal và C-terminal cho hoạt động xúc tác của nó Vùng

C-terminal được tách ra của DNMT1 thì không hoạt động xúc tác mặc dù có sự hiện

diện của các motif có trình tự bảo tồn cao điển hình của DNMTs hoạt động Trong

khi đó C-terminal của DNMT3A và DNMT3B thì hoạt động mà không có sự tương

10

tac với vung N-terminal Sự khác biệt giữa DNMT1 và de novo DNMTs cho thấy sựkhác nhau đáng kể trong cơ chế điều hoà hoạt động methyl hoá của các enzyme nay.

Đảo CpG không bị methylhoá Gen biểu hiện

biểu hiện gen trong các tế bào động vật có vú Khi sự methyl hóa diễn ra bất thường

sẽ gây ra những biến đổi có thé dẫn tới ung thư [43] Những bat thường methyl hóaDNA xảy ra rất sớm trong sự hình thành khối u đã giúp các tế bào khối u có thé thíchnghi một cách nhanh nhất với những thay đổi trong môi trường sống và phát triển

băng cách điều hòa “bật” hoặc “tắt” gen của chúng Chúng thường “tắt” các gen gây

tự chết của tế bao, trong khi “bật” các gen liên quan đến sự phát triển của tế bào, điềunày cho phép tế bao ung thư trở nên bat tử và có lợi thế khi xâm nhập vào các mô

khỏe mạnh [58].

11

Methyl hóa DNA chỉ sự gắn nhóm -CHạ ở vị trí carbon số 5 của Cytosine (C5),hình thành dạng 5-methylcytosine Cytosine (C) bắt cặp với Guanine (G) theo chiều

5’ — 3’ trên một mach của gen hình thành nên vùng cytosine-phosphate-guanine

(CpG) Khoảng 60% đến 90% các CpG bị methyl hóa ở động vật có vú và những

vung it CpG bi methyl hoá mạnh hơn so với vùng giàu CpG Những vùng giàu CpG

(ít nhất 200 bp) với hàm lượng GC lớn hơn 50% được gọi là đảo CpG (CGI) Các

đảo CpG thường thuộc vùng gen khởi động (promoter) hoặc vùng mã hoá (exon) đầu

tiên và các đảo CpG rất hiếm khi bị methyl hoá ở các tế bào bình thường Tuy nhiên,

ở các khối u ung thư, các đảo CpG thuộc vùng promoter bị methyl hoá rất mạnh [58].Khi so sánh với mô bình thường, các kiểu methyl hóa DNA khác thường — gồm

methyl hóa DNA quá mức (hypermethylation) và methyl hóa DNA dưới mức

(hypomethylation) có liên quan tới một số lượng lớn các khối u ác tính ở người

Methyl hóa DNA quá mức thường xảy ra ở các dao CpG trong vùng promoter và liên

quan tới sự bat hoạt gen Su methyl hóa dưới mức liên quan đến sự phát triển và tiễntriển của bệnh ung thư thông qua những cơ chế khác nhau Điển hình là sự methylhóa quá mức của gen ức chế khối u và sự methyl hóa đưới mức của gen sinh ung

[139].

Quá trình methyl hoá DNA được xúc tác bởi enzyme DNA methyltransferase

(DNMTs) Họ DNMT ở động vật có vú có năm loại: DNMT1, DNMT2, DNMT3A,

DNMT3B và DNMT3L, trong đó chỉ có ba loại được chứng minh có hoạt tính

methyltransferase: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B DNMTI đóng vai trò chủ yếu

trong việc điều hoà sự methyl hoá DNA của một mô chuyên biệt DNMTI là

methyltransferase duy trì chính ở động vật có vú, có chức năng gắn nhóm methyl vàocác cytosine trên một sợi của DNA với điều kiện sợi còn lại trước đó đã bị methylhóa DNMTI được phiên mã cao trong giai đoạn S của chu kỳ tế bao, đảm bảo tinh

trung thực và sự di truyền vô tính của các kiêu methyl hoá đặc trưng trong các chuỗiDNA con sau sao chép [93] Đã có nhiều báo cáo khang định mức độ biéu hiện quá

mức của DNMTI có liên quan đến sự phát triển của khối u như ung thư ruột kết [122],

ung thư biểu mô gan [34] và ung thư biểu mô tế bào vảy của thực quản [155] Đặc

12

biệt quan tâm là DNMT2 với vai trò methyl hoá RNA thay vì DNA tuy nhiên cơ chếchưa rõ [127] DNMT3 hoạt động như một de novo methyltransferase và bao gồm

hai protein liên quan được mã hóa bởi các gen khác nhau, DNMT3A và DNMT3B.

Chức năng của DNMT3B là nhận ra các DNA chưa được methyl hoá và chịu trách

nhiệm gắn thêm nhóm methyl vào cytosine trên các DNA nay Dé đánh giá trực tiếpvai trò và cơ chế của quá trình methyl hóa đe novo trong sự phát triển khối u, Lin vàcộng sự đã tăng sự biểu hiện của gen DNMT3AI1, một biến thể của DNMT3A và

DNMT3BI, một biến thé của DNMT3B ở chuột Ape Min/* , Và thay rằng DNMT3BI

Min/+ sân đôi và tăng kích thước

đã tăng cường số lượng khối u dai tràng ở chuột Apc

trung bình của khối u dai tràng, trong khi DNMT3AI không có tác dụng Sự biểuhiện quá mức của DNMT3BI đã làm tăng quá trình methyl hóa và bất hoạt sự biểu

hiện của các gen ức chế khối u Sfrp2, Sfrp4 và Sfrp5 [77] Ngoài ra, DNMT3B còn

có vai trò quan trọng trong quá trình tạo phôi nên được biểu hiện cao trong phôi độngvật có vú sớm, nhưng DNMT3B lại giảm biểu hiện trong quá trình biệt hóa tế bao

[153] Hơn nữa, chức năng của DNMT đã được nghiên cứu rộng rãi trên chuột bằng

cách nhăm mục tiêu gen Chuột bị thiếu DNMTI mắt khoảng 90% quá trình methylhóa DNA và chết sớm trong quá trình tạo phôi Các tế bào gốc phôi chuột thiếuDNMTI hoặc cả DNMT3A và DNMT3B đều có các telomere kéo dài đáng kể,khang định vai trò của methyl hóa DNA trong việc duy trì tính toàn ven củatelomere [26] Ngoài ra, những bat thường của gen BRCA/ có liên quan đến sựmethyl hoá vượt mức ở vùng promoter, làm tăng nguy cơ phát triển ung thư vú

[101] Đã có nghiên cứu chứng minh sự tăng mức biểu hiện của DNMTI có liên

quan đến bat hoạt biêu hiện gen của ho BRCA [102] Trong những nghiên cứu gầnđây, người ta phát hiện rằng trên 50% số người mắc các bệnh về ung thư đều cónhững điểm khác biệt trên gen mã hoá p53 so với người bình thường [143] Nhữngsai hỏng trên gen mã hoá protein p53 dẫn đến sự điều hoa mat kiểm soát tạo ra nhiềusai hong DNA trên bộ gen và có thé hình thành ung thư Trong ung thư vú, nghiên

cứu về cơ chê điêu hoà của p53 ngoài những đột biên trên gen còn liên quan dén tình

13

trang methyl hoá của gen này Nhiều vị trí methyl hoá đơn lẻ của gen p53 có liênquan đến quá trình hình thành khối u ung thư vú [116].

d Vai tro của PI3K/AKT như PI3KCA, AKT1

Con đường PI3K/AKT là con đường truyền tín hiệu nội bao nhằm thúc đây quátrình trao đổi chất, tăng sinh, sống sót, hình thành mạch đề đáp ứng với tín hiệu ngoại

bào Quá trình phosphoryl serine/threonine là trung gian truyền tín hiệu này đến mộtloạt các chất ở “hạ nguồn” của con đường tín hiệu Các protein quan trọng liên quan

là phosphatidyinositol 3-kinase (P/3K) và protein kinase B (PKB hay AK7).

Phosphatidyinositol 3-kinase (P/3K) là một họ enzyme lớn được phân lập vào 1990

bởi nhóm nghiên cứu cua Cantley P/3K là một kinase có khả nang phosphoryl] hóa

nhóm 3-hydroxyl của vòng inositol trong phân tử phosphatidylinositol (PtdIns) namtrên màng tế bào PI3K có ba lớp là P/3K lớp I, PI3K lớp II, P/3K lớp IIL Trong đó,

PI3K lớp I được nghiên cứu nhiều nhất P/3K lớp I là enzyme di thé được tạo thành

từ một tiểu đơn vị xúc tác (p110) và một tiêu đơn vị điều tiết [90]

vi Ìm kturỂnttrmnnummiininn Shee

—— # :

@ wR

Nhân tô Nhân to (p27) (82T)

khang apoptosis gây apoptosis

Hình 1.4 Con đường tin hiệu nội bao PI3K/AKT

14

Hệ gen của động vật có vú mã hóa tạo bốn loại đồng phần của p110 laa, B, 5, y va

một số đồng phan của tiêu don vị điều tiết Các tiểu đơn vị p1 10œ, p110f, p1 10 kết

hợp với tiêu đơn vị điều tiết là p85 [90] Trong khi đó p1 10y kết hợp với tiểu đơn vịđiều tiết p101 và p84/p87 PI3KCA là tiểu đơn vị p110œ của phosphatidyinositol 3-kinase PI3K được kích hoạt khi có tín hiệu hoạt hóa của các thụ thé tyrosine kinase

(RTKs); thụ thé protein G (GPCRs) hoặc RAS được hoạt hóa [90, 92] Sau khi được

kích hoạt, tiểu đơn vị điều tiết sẽ tương tác với vùng nội bào của thụ thê Tương tác

nay sẽ hoạt hóa tiểu don vị xúc tác liên kết với màng tế bào va phosphoryl hóa

PtdIns-4,5-P› (PIP2) thành PtdIns-3,4,5-P3 (PIP3) PIP3 có chức năng như một tín hiệu thứ

hai quan trọng trong tế bảo

AKT là một trong những nhân tố “hạ nguồn” chủ yếu của PI3K Họ kinase AKTgồm có 3 đồng phân chính là AKT1 (PKBa) biểu hiện trong hầu hết các tế bào của

cơ thé, 4K72 (PKBB) biểu hiện chủ yếu ở các mô xảy ra các phản ứng chuyền hóainsulin, AKT3 (PKBy) chủ yếu ở não [84, 90] PIP3 là tín hiệu giúp hoạt hóaphophoinositide phụ thuộc kinase (PDK), PDK tiếp tục phosphoryl hóa AKT tại vị trí

threonine 308 (T308) Ngoài ra, phức hop mTOR2 sẽ phosphoryl hóa AKT ở vi trí

serine 473 (S473) [90, 105] Sau khi được hoạt hóa đầy đủ, 4K7 sẽ chuyên từ màng

tế bào vào nhân tế bào [90] 4K7 sẽ phosphoryl hóa các phân tử mục tiêu nhằm ứcchế hoặc tăng cường các protein mục tiêu và điều hòa các quá trình như apoptosis,autophagy và chu kỳ tế bào 4K7 phosphoryl hóa glycogen synthase kinase 3

(GSK3B) và FoxO1 làm ức chế hoạt động của chúng GSK3B bị bat hoạt làm tăng

quá trình sinh tổng hop cyclin DI và làm tăng chu kỳ tế bào FoxO1 bị bat hoạt làmhạn chế sự phiên mã của p27 va p21, hai thành phan có vai trò ức chế hoạt động củakinase phụ thuộc cyclin (CDK), do đó làm tăng hoạt động của chu kỳ tế bào [105].AKT được kích hoạt cũng tạo điều kiện cho sự sống sót của tế bào thông qua việc làmgiảm biéu hiện các nhân tổ gây apoptosis như Bad, Bax, p53 và làm tăng cường biểu

hiện Bcl-2, Bcl-xl can trở quá trình apoptosis [31, 105].

PI3K/AKT là con đường truyền tín hiệu nội bào quan trọng điều hòa quá tăng sinh

và sông sót của tế bao và đặc biệt trong sự phát triển của ung thư Sự biểu hiện quá

15

mức của vùng nhiễm sắc thể chứa gen mã hóa P/3KCA có khả năng gây nên một số

bênh ung thư ở người như ung thư buồng trứng, ung thư cô tử cung, ung thư dạ dày[90] Đột biến gen P/3KCA cũng là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh ung thư như

ung thư vú, ung thư phối, ung thư da dày, ung thư buồng trứng [74] Bên cạnh đó,con đường PI3K/AKT còn là mục tiêu trong các liêu pháp điều tri ung thư Sự kết hợp

giữa FoxO và cảm ứng hoạt động của protein PTEN cùng với ức chế mTOR có tiềmnăng trong điều trị ung thư tuyến giáp [103] Hiện nay các nhà nghiên cứu đã pháttriển các thuốc điều trị nhắm vào con đường P/3K/AKT, chăng hạn như ung thư vú

và đã cho kết quả tốt khí ức chế chế được sự phát triển và xâm 14n của dòng tế bao

MCE-7 [30].

1.2 Tế bào gốc ung thư vú

1.2.1 Phân lập và marker phân tử

Tế bào gốc ung thư vú (Breast cancer stem cells-Tế bào gốc ung thư vú) trongkhối u vú người được phát hiện và báo cáo đầu tiên năm 2003 bởi Al-Hajj và cộng

sự Quan thé tế bào này biéu hiện marker CD44*/CD24““", Chi cần khoảng 100 tế

bào thuộc quan thé này đã có thê hình thành khối u trong chuột NOD/SCID trong khi

10,000 tế bào ung thư bình thường không thể hình thành được khối u [2] Sau đó,

kiêu hình CD44*/CD24 đã được dùng dé xác định và phân lập tế bào gốc ung thư

[117] Các tế bào gốc ung thư vú có thể được phân lập từ mẫu bệnh nhân sau khi nuôi

cay sơ cấp in vitro hay từ những dòng tế bào ung thư vú đã có trước đó

16

(Phuc PV va cs, 2006) (Al-Hajj va cs; Whicha va cs, 2003)

Hình 1.5 Tế bào gốc ung thư vú

Tuy nhiên nhiều nghiên cứu khác cho thấy các dòng tế bào ung thư với 90%

tế bào gốc ung thư vú có khả năng gây u cũng như các dòng tế bào chỉ có 5% tế bàogốc ung thư vú với kiêu hình tương tự, từ đó cho thấy rằng chỉ cần có một nhóm nhỏ

trong quan thê tế bao ung thư vú là có thé tự làm mới và gây u mạnh mẽ Dựa trênkiểu hình CD44 !/CD247“" của tế bào gốc ung thư vú, một số marker khác đã được

phát hiện Ho Aldehyde dehydrogenase (ALDH) của enzyme cytosolic chịu trách

nhiệm oxy hóa các aldehyde trong tế bao, dẫn đến quá trình oxy hóa cua retinol thànhaxit ALDHI chiếm ưu thế trong các đồng vị và hiện diện trên tế bào động vật có vú

Trước hết hoạt động ALDH ở mức cao trong tế bào gốc ở người Nó cũng hoạt động

mạnh trong nhiều loại tế bào gốc ung thư Tế bào ung thư vú dương tính với ALDHcao có thê gây ra các khối u trong chuột NOD/SCID Qua đó cho thấy nơi tập trungALDH+ cũng chứa quan thê tế bào gốc ung thư vú Sự kết hợp của kiêu hình CD44*/CD24 và ALDH + dé chọn lọc tế bào gốc ung thư vú cho thấy các tế bào với kiểuhình này có khả năng gây u cao hơn so với các tế bào đơn thuần là CD44'/CD24 hay

ALDH-+.

17