TỔNG QUAN
Dịch tễ học bệnh gout
Bệnh gout là một loại bệnh viêm khớp phổ biến nhất thế giới và liên quan đến việc gia tăng nồng độ acid uric trong máu, đặc trưng bởi hiện tượng lắng đọng tinh thể urate trong khớp và mô liên kết [1] Theo những nghiên cứu dịch tễ học từ các quốc gia khác nhau, việc gia tăng tỉ lệ mắc bệnh gout trong cộng đồng sẽ dẫn đến tổn thất đáng kể về kinh tế đối với một quốc gia [2]
Theo dữ liệu trong nghiên cứu về Gánh nặng Bệnh tật Toàn cầu năm 2017 (Global Burden of Disease Study) có gần 41.2 triệu người trưởng thành mắc bệnh gout, con số này đã tăng gần gấp đôi so với số liệu năm 1990 là 20,2 triệu người [3]
Tỉ lệ mắc bệnh gout trung bình trên toàn cầu từ 1% đến 4%, tỉ lệ mắc mới hằng năm trong khoảng từ 0,3 đến 6 ca mắc mới tính trong 1000 người [4-6] Ở một số quốc gia, tỉ lệ mắc bệnh gout có thể lên tới 10% tổng dân số [8] Hầu hết các quốc gia phát triển có tỉ lệ gia tăng số lượng bệnh nhân mắc bệnh gout cao hơn nhiều so với các nước đang phát triển [7, 8] Khu vực châu Á-Thái Bình Dương có tỉ lệ mắc bệnh gout cao nhất toàn thế giới, với một số nước có tỉ lệ mắc hơn 10% [6] Ngoài ra, khu vực châu Âu, Bắc Mỹ và các quốc gia phát triển ở châu Á đều được ghi nhận với tỉ lệ mắc bệnh gout cao và tăng lên theo từng năm [5, 6] Tỉ lệ mắc bệnh gout cũng thay đổi dựa trên độ tuổi và giới tính Tỉ lệ mắc bệnh gout đối với nam giới cao hơn ở nữ giới, đặc biệt tỉ lệ mắc bệnh gout tăng cao ở những đối tượng trung niên và người cao tuổi [5, 6, 9]
Tại Việt Nam, theo thống kê của Khoa Xương khớp bệnh viện Bạch Mai, trong vòng 20 năm (1978-2000) tốc độ gia tăng của bệnh nhân gout rất đáng báo động, cụ thể là tỉ lệ bệnh nhân mắc bệnh gout tăng từ 10% đến 15% Theo thống kê của chương trình định hướng cộng đồng về kiểm soát bệnh thấp khớp (COPCORD) năm 2013 tại
Hà Nội, tỉ lệ mắc bệnh gút khoảng 0,14% [10]
Sự gia tăng của tỉ lệ mắc bệnh gout và số ca mắc mới hàng năm liên quan mật thiết đến lối sống không lành mạnh hiện nay bao gồm chế độ ăn nhiều purine đặc biệt là thịt và hải sản, đồ uống có cồn nhất là bia và rượu mạnh cùng với các thức uống
4 nhiều đường fructose dẫn đến hội chứng chuyển hóa với bệnh béo phì, mỡ trong máu, lão hóa nhanh [11, 12] Những nghiên cứu trên đã chỉ ra mối nguy hại và sự bùng nổ nhanh chóng của bệnh gout, điều này đặt ra nhu cầu cấp bách cho những nghiên cứu về phương pháp điều trị bệnh gout để làm chậm xu hướng phát triển của căn bệnh này
Hình 1.1 Tỉ lệ mắc bệnh gout chuẩn hóa theo độ tuổi tính trên 100,000 dân số năm
Tổng quan về bệnh gout
1.2.1 Lịch sử sơ lược và định nghĩa
Bệnh gout được xem như một trong những căn bệnh lâu đời nhất trên thế giới với lần đầu tiên được ghi nhận bởi người Ai Cập cổ đại vào năm 2640 trước Công nguyên Sau đó, ca bệnh gout cấp tính đầu tiên được Hippocrates phát hiện vào thế kỷ XV trước Công nguyên và đặt tên là “unwalkable disease”, có nghĩa là căn bệnh không thể đi lại được Thuật ngữ bệnh gout bắt nguồn từ tiếng Latinh “gutta” có nghĩa là “rơi”, xuất phát từ một quan niệm y học thời trung cổ cho rằng trong cơ thể có 4 loại “chất dịch” quan trọng giúp duy trì cơ thể khỏe mạnh, khi một trong bốn loại
“chất dịch” này dư thừa sẽ “rơi” vào khớp gây đau và viêm Trong những tài liệu lịch sử, bệnh gout đều gắn liền với việc sử dụng nhiều những thức ăn bổ dưỡng và uống nhiều bia rượu, gắn liền với lối sống của những nhà giàu, quý tộc thời xưa Chính vì điều này, bệnh gout còn được ví như “căn bệnh của vua chúa” [13]
Về lịch sử phát triển của các thuốc điều trị bệnh gout, colchicine là một loại alkaloid có nguồn gốc từ cây nghệ tây (Colchicum autumnale) đã được dùng như một loại thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh gout bởi một thầy thuốc cơ đốc giáo tên là Alexander vào thế kỷ VI sau Công nguyên [14] Vào cuối thế kỷ XIX, lần đầu tiên thuốc tăng đào thải acid uric ở niệu đạo được sử dụng trong điều trị bệnh gout [13] Hiện nay, thuốc kháng viêm không steroid thường dùng để điều trị bệnh gout cấp tính [15] Có lẽ tiến bộ quan trọng nhất trong việc điều trị bệnh gout là sự phát hiện và ứng dụng của các hợp chất ức chế enzyme xanthine oxidase nhằm hạn chế tăng acid uric máu, điển hình là hiệu quả trong việc làm giảm nồng độ urate trong huyết tương và nước tiểu Các hợp chất ức chế enzyme xanthine oxidase đã được chứng minh là có thể ngăn cản sự phát triển của các tinh thể urate lắng đọng tạo thành hạt tophi [16]
Hình 1.2 Tinh thể urate lắng đọng trong các khớp
Gút là bệnh do tinh thể mononatri urat (MSU) lắng đọng trong dịch khớp và tổ chức liên kết Sự hình thành các tinh thể urate là do nồng độ axit uric huyết thanh (SUA) vượt ngưỡng nhất định Chẩn đoán bệnh gút dựa trên việc phát hiện các vi tinh thể này trong dịch khớp và các mô.
1.2.2 Giai đoạn lâm sàng của bệnh gout
Bệnh gút là một bệnh lý mạn tính, tiến triển theo ba giai đoạn chính nếu không được điều trị phù hợp: bệnh gút cấp tính (có cơn gút), bệnh gút không triệu chứng (giai đoạn tiềm ẩn) và bệnh gút mãn tính (viêm khớp mạn tính do lắng đọng tinh thể urat).
Viêm khớp gout cấp là tình trạng viêm cấp tính do tinh thể urat lắng đọng trong khớp Cơn gout cấp biểu hiện bằng những cơn đau dữ dội, sưng và nóng đỏ khớp do tinh thể urat monosodium lắng đọng Cơn gout cấp thường khởi phát ở khớp ngoại vi, chủ yếu ở chi dưới Tần suất các cơn gout cấp tăng dần theo tiến trình bệnh, từ vài cơn/năm ở giai đoạn đầu đến hơn 12 cơn/năm khi bệnh tiến triển Sau nhiều năm lặp lại các cơn gout cấp, bệnh chuyển sang giai đoạn viêm khớp mạn tính.
Giai đoạn giữa các cơn gout cấp tính được gọi gout không triệu chứng Trong giai đoạn này, mặc dù không có các biểu hiện lâm sàng nhưng bệnh vẫn phát triển với sự rút ngắn thời gian giữa các cơn gout cấp do tích tụ tinh thể urate trong cơ thể ngày càng nhiều
Viêm khớp gout mạn tính là giai đoạn cuối của bệnh gout Theo thời gian, khoảng thời gian giữa các cơn gout cấp ngắn dần và biến mất, các tinh thể acid uric lắng đọng tạo thành các dạng hạt tophi làm cho các cơn đau tăng nhanh theo từng đợt, dẫn đến viêm khớp liên tục, biến dạng khớp, kéo dài phá hủy các khớp, đồng thời các mô xung quanh cũng bị tổn thương và dẫn đến dị tật Hạt tophi thường xuất hiện sau
Bệnh gout mạn tính không được điều trị đủ trong khoảng 10 đến 20 năm có thể dẫn đến hình thành hạt tophi, dấu hiệu nhìn thấy được ở 12% bệnh nhân sau 5 năm và 55% bệnh nhân sau 20 năm mắc bệnh Ở giai đoạn này, bệnh gout đã tiến triển nghiêm trọng và gây ra các tổn thương đáng kể cho các khớp.
7 triển rất nhanh và trở nên phức tạp và khó kiểm soát, vì các biến chứng tác động vào cơ thể, việc điều trị gặp rất nhiều khó khăn
1.2.3 Biến chứng của bệnh gout
Sự hình thành hạt tophi là một trong những biến chứng quan trọng của bệnh gout (Hình 1.3) Hạt tophi là tập hợp những tinh thể monohydrate urate, kết tủa trong mô liên kết và có thể gây biến dạng, tổn thương mô mềm xung quanh và dẫn đến phá hủy khớp cũng như các hội chứng đau mãn tính, dai dẳng và chèn ép dây thần kinh [22]
Hình 1.3 Hạt tophi hình thành trong khớp ngón tay
Ngoài ra, một trong những biến chứng nghiêm trọng của bệnh gout và tình trạng tăng acid uric là các bệnh về thận, được phân thành: bệnh thận do gout, lắng đọng tinh thể trong ống thận và sỏi thận [23] Bệnh thận mạn tính là biến chứng thường gặp và nguy hiểm trên những người bị gout mãn tính xác định bởi sự hiện diện của tinh thể natri urate tại tủy thận Nồng độ acid uric trong máu tăng cao tích tụ lại làm bệnh lý thận nặng thêm Mức độ suy thận càng nặng, như trong giai đoạn cuối có thể đòi hỏi phải chạy thận nhân tạo lọc máu Do đó, làm tăng nguy cơ các biến chứng nguy hiểm khác cho cơ thể, trong đó có tử vong Bệnh thận do gout được [24] Lắng đọng tinh thể trong ống thận sẽ dẫn đến suy thận cấp tính Sử dụng liệu pháp hóa trị với các bệnh nhân mắc bệnh: cường huyết cầu do rối loạn tủy xương và rối loạn tăng
8 tế bào bạch huyết sẽ làm tăng nguy cơ mắc bệnh Tinh thể urate lắng đọng rải rác ở tổ chức kẽ thận, bể thận, niệu quản lâu ngày hình thành sỏi uric Sỏi uric gây tắc nghẽn đài bể thận, ứ nước ở thận Ngoài ra, còn có thể dẫn đến tình trạng nhiễm trùng đường tiết niệu, tiểu máu do sự cọ sát của sỏi.
1.2.4 Mối liên hệ giữa bệnh gout và các dạng oxy hoạt động
Các dạng oxy hoạt động (ROS) là các gốc tự do và các phân tử khác chứa oxy có khả năng phản ứng mạnh do có electron tự do ROS được tạo ra như sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất tế bào và bao gồm các gốc tự do như hydroxyl (ãOH), alkoxyl (ROã), peroxyl (ROOã), superoxide (O2ã), nitroxyl radical (NOã).
Hầu hết các ROS nội sinh chuyển hóa từ gốc tự do anion superoxide vì vậy anion superoxide được gọi là ROS sơ cấp, các ROS chuyển hóa từ nó gọi là ROS thứ cấp Gốc tự do anion superoxide được hình thành chủ yếu thông qua hệ enzyme NADPH oxidases (NOXs), xanthine oxidase (XO) và chuỗi truyền điện tử ty thể (mETC) [28] Xanthine oxidase nội mô có thể góp phần tạo ra ROS (Hình 1.4), đây là một enzyme tham gia vào cả hai quá trình khử hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành uric acid và là mục tiêu của các loại thuốc điều trị tăng acid uric và bệnh gout Allopurinol là một chất có cấu trúc tương tự như hypoxanthine và được biết đến như là chất ức chế enzyme xanthine oxidase rất mạnh, vì thế allopurinol được sử dụng rộng rãi để kiểm soát lượng uric acid của bệnh nhân gout [29] Tuy nhiên theo kết quả nghiên cứu của Chiara Galbusera và cộng sự, allopurinol là một cơ chất tạo ra các gốc tự do trong quá trình chuyển hóa hypoxanthine xanthine và xanthine thành uric acid [30]
Do đó, một số bệnh nhân sử dụng thuốc allopurinol để điều trị gout mãn tính đều có nguy cơ mắc những bệnh do gốc tự do gây ra vì allopurinol có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase nhưng không thể ngăn được sự hình thành gốc tự do
Hình 1.4 Gốc tự do được tạo ra do hoạt động của enzyme xanthine oxidase
Các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase
Nhiều hợp chất tự nhiên đã được phân lập và chứng minh có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase, hỗ trợ quá trình làm giảm hàm lượng acid uric trong máu Trong đó nổi bật là các hợp chất thuộc polyphenol, một dạng cấu trúc phân tử chính trong tự nhiên, tồn tại với số lượng lớn và đa dạng trong các loài thực vật Polyphenol có thể được chia thành nhiều phân nhóm, trong đó nhiều hợp chất đã được chứng minh là có tác dụng trong việc ức chế enzyme XO
Hình 1.8 Cấu trúc của các hợp chất thuốc nhóm flavonoid
Flavonoid là một dạng polyphenol được đặc trưng bởi cấu trúc C6-C3-C6, hai vòng phenyl (vòng A, vòng B) và dị vòng C được chia thành 6 loại chính bao gồm flavanones, isoflavones, flavonols, proanthocyanidins and anthocyanins (Hình 1.8) [53] Những phân tích về cấu trúc đã chứng minh nhóm -OH ở vị trí C-5 và C-7 của vòng A sẽ cho khả năng ức chế XO mạnh, cũng như các nhóm -OH trên vòng B cũng góp phần ức chế XO [54, 55] Theo Akihigo Nagao và các cộng sự đã khảo sát nhiều falvonoids và cho thấy các flavones và flavonols với cấu trúc nhóm -OH ở vị trí C-7 như chrysin (1),luteolin (2), kaempferol (3), quercetin (4), myricetin (5),
Isorhamnetin có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) với hiệu quả cao, với giá trị IC50 trong khoảng 0,4 àM đến 5,02 àM Ngược lại, các hợp chất flavonoid ít phân cực như isoflavone và anthocyanidin lại có hiệu quả ức chế XO kém hơn.
Hình 1.9 Cấu trúc của các hợp chất flavonoid có khả năng ức chế XO
Hình 1.10 Các hợp chất acid hydrocinnamic có khả năng ức chế XO
Hydroxycinnamic acid là những hợp chất phenolic hiện diện với nồng độ cao trong nhiều loại thực vật kèm với nhiều tác dụng đến sức khỏe Cinnamic acid, ferulic acid, courmaric acid, caffeic là những acid được biết đến rộng rãi Theo nghiên cứu của Tran Minh Ngoc, Nguyen Minh Khoi và cộng sự đã chiết xuất các hợp chất từ
17 cành của Cinnamomum cassia được chứng minh có hoạt tính ức chế XOD, trong đó đã xác định được sự có mặt của acid cinnamic (5) và acid courmaric (6) với giá trị
IC50 26.4 àg/mL, 32.2 àg/mL [56]
Tannins là một polyphenol tan nhiều trong nước và có nhiều trong thực vật Theo Hatano, có nhiều tannins mang hoạt tính ức chế XOD, điển hình như cornusiin
A (IC50: 27 àM), oenothein B (IC50: 20 àM), camptothecin (7) (IC50: 12 àM), cornusiin D (IC50: 12 àM), gallic acid (8) (IC50: 24 àM), methyl gallate (9) (IC50: 29 àM), cornusiin C (IC50: 17 àM), coriariin A (IC50: 9.8 àM), ellagic acid (10) (IC50: 3.1 àM) và valoneic acid (11) (IC50: 0.79 àM) [57]
Hình 1.11 Các tannins có khả năng ức chế xanthine oxidase
Ngoài các hợp chất thuộc nhóm polyphenol kể trên đã được chứng minh có hoạt tính ức chế XO, thì nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra một số chất trong nhóm alkaloids cũng cho tác dụng tương tự Thí nghiệm tiến hành bởi Ahmad và cộng sự đã cho thấy oxindole alkaloids từ cây Isatis costata có tiềm năng điều trị bệnh tăng acid uric máu
Từ Isatis costata, sáu hợp chất oxindole alkaloid đã được phân lập: costinones A, costinones B, isatinones A (12), isatinones B (13), indirubin và trisindoline Costinones A có hoạt tính cao nhất (IC50: 90,3 ± 0,06 µM) so với các hợp chất còn lại.
B (IC50: 101.7 ± 0.02 àM), isatinones A (IC50: 117.5 ± 0.03 àM), isatinones B (IC50: 130.6 ± 0.05 àM), indirubin (IC50: 170.5 ± 0.01 àM), trisindoline (IC50: 179.6 ± 0.04 àM) [58]
Hình 1.12 Các alkaloids có khả năng ức chế xanthine oxidase
1.3.Các đối tượng thực vật nghiên cứu
Các loài thực vật được chọn trong nghiên cứu này gồm: ổi, actiso, diệp hạ châu, sen, lá dứa, cải bẹ xanh, lá lốt, mãng cầu ta, ngải cứu, ngũ trảo và đại bi Những thực vật này được lựa chọn vì được trồng phổ biến tại Việt Nam, có nhiều công dụng, giá thành hợp lý và có các thông tin về hoạt tính sinh học được ghi nhận trong Đông y, kinh nghiệm dân gian và các nghiên cứu khoa học trước đây.
Các đối tượng thực vật nghiên cứu
1.4.1 Lá ổi ( Psidium guajava L.) Ổi, tên khoa học là Psidium guajava L., là loài cây ăn quả thường xanh lâu năm, thuộc họ Myrtaceae, có nguồn gốc từ Brazil Cây cao nhiều nhất 10m, đường kính thân tối đa 30cm, thân chắc, vỏ nhẵn Cành non 4 cạnh, khi già mới tròn dần, lá đối xứng Hoa lưỡng tính, bầu hạ, mọc từng chùm 2-3 chiếc, ít khi ở đầu cành mà thường ở nách lá, năm cánh, màu trắng, nhiều nhị vàng [59, 60]
Lá ổi có chứa hàm lượng polyphenol cao, hàm lượng tannin trong lá ổi chiếm khoảng 10% bao gồm các loại tanin thủy phân được, không thủy phân được và loại hỗn hợp Ngoài ra trong lá ổi còn có các dẫn chất flavane monomer của các tannin như catechin, gallocatechin, leucocyanidin Thêm vào đó trong lá ổi còn có chứa các flavonoid như quercetin, avicularin, guajaverin cùng các triterpenoid tự do như crataegolic acid [61, 62]
Theo y học cổ truyền, lá ổi có tác dụng trị đau bụng tiêu chảy, lỵ hoặc nấu nước sát trùng vết thương, mụn nhọt lở loét với lượng thích hợp Theo những nghiên cứu khoa học, lá ổi đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học như kháng stress oxy hóa, loại bỏ các gốc tự do, ngăn ngừa và hạn chế một số bệnh tật liên quan đến tim mạch, đột quỵ, tăng huyết áp, đái tháo đường và ung thư Hơn thế nữa các flavonoid trong lá ổi còn có khả năng kháng khuẩn mạnh trên nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh [63-65]
Trong một nghiên cứu của Elsevier Theoduloz và cộng sự ở 15 loại dược liệu về khả năng ức chế XO cho kết quả giỏ trị IC50 của lỏ ổi cho giỏ trị khoảng 16 àg/ml [66] Ngoài ra, lá ổi cũng đã được chứng minh có tác dụng làm giảm lượng acid uric và mức độ creatin trong chứng tăng acid uric máu trong thí nghiệm in vivo [67] Lá ổi được xác định giàu các hợp chất flavonoid, đặc biệt là quercetin [65] Dịch chiết lá ổi đã chứng minh tác dụng kháng khuẩn và chống tiêu chảy, đồng thời có thể làm giãn cơ trơn ruột và ức chế các cơn co thắt ruột [63, 68] Đồng thời, lá ổi còn thể hiện các đặc tính chống oxy hóa được liên kết với polyphenol được tìm thấy trong lá của nó [65, 69, 70]
Sen, tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn., thuộc họ Nelumbonaceac là loài cây thân thảo, mọc dưới nước, chiều cao hơn 1 mét Ngó sen màu trắng, tiết diện gần tròn, có khía dọc màu nâu, ngọn có mang chồi hình chóp nhọn Thân rễ phình to thành củ, màu vàng nâu, hình dùi trống, gồm nhiều đoạn, thắt lại ở giữa, trong có nhiều khuyết rộng Lá hình lọng có 2 thùy sâu đối xứng nhau, dài 30-55 cm, rộng 20-30 cm, mép lá hơi uốn lượn, mặt trên xanh đậm, nhẵn bóng; mặt dưới xanh nhạt, nhám Cuống lá và cuống hoa có nhiều gai và khoang rỗng bên trong Đế hoa rất lồi dạng hình nón ngược, mép lồi lõm, xốp, non màu vàng, già màu xanh, dài 5-7 cm, đường kính 6-8 cm, chứa nhiều quả sen [60, 71].Theo y học cổ truyền, lá sen có vị đắng, tính bình, có tác dụng chữa băng trung huyết lỵ Gương sen có vị đắng, chát, tính ôn, có tác dụng cầm máu, chữa tiểu tiện khó khăn Tim sen có vị đắng, tính hàn, dùng để hạ sốt, mất ngủ Lá sen có tác dụng thanh nhiệt, an thần, tán ứ, lợi thấp, cầm máu lợi can, thận [72, 73].
Lá sen được chứng minh các định có các hợp chất có hoạt tính sinh học như phenolic acid, flavonoid, alkaloid, polysaccharide, và terpenoid [71] Một nghiên cứu của Yuchen Tian và cộng sự đã cho thấy trong lá sen đặc trưng bởi 12 alkaloid, 14 flavonoid cùng với khả năng kháng oxy hóa và ức chế xanthine oxidase [74] Cả hai nhóm alkaloid và flavonoid đều đóng góp vào hoạt tính sinh học của lá sen, trong đó chủ yếu là các hợp chất norcoclaurine, o-nornuciferine, N-nornuciferine, nuciferine, luteolin,diosmetin, quercetin, and quercetin-3-o-glucuronide
1.4.3 Đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC.)
Cây đại bi còn được gọi là băng phiến, mai hoa băng phiến, mai phiến, long não hương, mai hoa não, ngải nạp hương, ngải phiến, từ bi và có tên khoa học là Blumea balsamifera (L.) DC thuộc họ Cúc-Asteraceae Cây đại bi là một cây nhỏ, cao từ 1,5 m đến 2,5 m Thân có nhiều rãnh chạy dọc, có nhiều lông, trên ngọn có nhiều cành
Lá hình trứng hai đầu nhọn nhưng hơi tù, trung bình dài 15 cm và rộng 5 cm, mặt trên có lông, mép lá gần như nguyên hay xẻ thành răng cưa và ở gốc lá thường có 2, 4 hoặc 6 thùy nhỏ do phiến lá phía dưới bị xẻ quá sâu Vò lá sẽ có mùi thơm dễ chịu của băng phiến Hoa màu vàng, mọc thành chùy ở kẽ lá hay đầu cành Trên hoa có
Cây đại bi có nhiều lông tơ, sử dụng lá to dày, nhiều lông, mùi hắc Lá đại bi có thể thu hái quanh năm nhưng tốt nhất vào mùa hè, rửa sạch, phơi âm can để điều chế mai hoa băng phiến Trong dân gian, lá đại bi được dùng làm thuốc chữa cảm sốt, cúm, ra mồ hôi; nước sắc lá uống chữa đầy bụng, ăn uống khó tiêu, ho đờm; nấu nước ngâm rửa hoặc giã nát đắp ngoài da trị lở loét, vết thương sưng đau Ở Philippines, lá đại bi còn được dùng làm thuốc lợi tiểu, chữa sỏi thận, phù nề.
Hiên nay, đã phân lập được hơn 100 hợp chất từ cây đại bi bao gồm nhiều nhóm chất khác nhau như: terpenoids, flavonoids, ester, alcohols, sterols [75] Cao chiết từ lá cây đại bi cho thấy khả năng kháng khối u, kháng nấm và kháng oxy hóa với hợp chất mang lại hoạt tính sinh học trên là borneol [77, 78] Trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase, từ cao chiết lá của cây đại bi phân lập được
8 flavonoids có hoạt tính gồm: blumeatin, tamarixetin, rhamnetin, luteolin-7-methyl ether, luteolin, quercetin, 5,7,3’,5’-tetrahydroxyflavanone, dihydroquercetin-4’- methyl ether với IC50 dao động từ 2.38 đến 58.86 àM [79]
Actiso có tên khoa học là Cynara cardunculus L., thuộc họ Cúc-Asteraceae, là cây thân thảo lớn, cao từ 1 - 1.2 m, có thể đến 2 m, có thân ngắn, thẳng và cứng Lá to, dài, mọc so le, phiến lá có răng không đều, mặt trên lá màu xanh lục, mặt dưới có lông trắng Cụm hoa to mọc ở ngọn thân, màu đỏ tím hoặc tím nhạt, quả nhẵn bóng, màu nâu sẫm, có mào lông trắng Lá được thu hái vào năm thứ nhất của thời kỳ sinh trưởng hoặc cuối mùa hoa, đem phơi hoặc sấy khô ở 50 °C đến 60 °C Từ lâu actiso đã được biết đến với công dụng lợi mật do hợp chất cynarine mang lại, cynarine có tác dụng loại trừ các acid mật, do đó làm giảm cholesterol trong máu Theo y học cổ truyền, lá actiso có tác dụng lợi mật, chỉ thống, chủ trị tiêu hóa kém, viêm gan, viêm túi mật, sỏi mật [59, 60]
Cây Actiso chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học nổi bật như cynarine, apigenin và luteolin, có tác dụng chính như chống oxy hóa, bảo vệ gan, thúc đẩy bài tiết mật, giảm lipid máu và ngăn ngừa xơ vữa động mạch.
22 về hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase của actiso vẫn còn khá ít Tuy nhiên, theo kết quả thu được từ nghiên cứu của Khoa Dược, Đại học Florida phân lập được
2 flavonoids là luteolin và luteolin 7-Oglucoside có hoạt tính ức chế XOD với IC50 lần lượt 1.49 và 19.90 àM [82]
Cây dứa thơm, tên khoa học là Pandanus amaryllifolius Roxb., là thực vật thân thảo, mọc hoang dại thành bụi, có thể cao đến 1 m, phân nhánh Lá dứa hình mũi mác, nhẵn, xếp thành hình máng, dài 40-50 cm, rộng 3-4 cm, có mùi thơm và được người dân Việt Nam sử dụng để tạo mùi thơm cho bánh kẹo Lá nếp được tìm thấy ở nhiều nơi tại các quốc gia Đông Nam Á như Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Malaysia, Philippines Riêng với điều kiện thời tiết và khí hậu thích hợp như ở Việt Nam thì cây có thể phân bổ ở cả 3 miền đất nước Ở Việt Nam lá dứa được sử dụng như một bài thuốc dân gian để chữa bệnh tiểu đường, chữa tăng huyết áp và đau nhức xương khớp [60, 83] Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây lá dứa Cụ thể là, báo cáo của Nur Afira Ahmad Shukor và cộng sự đã chứng minh khả năng kháng oxy hóa của cao chiết lá dứa với hoạt tính kháng oxy húa bằng phương phỏp DPPH (>100 àg/mL) cựng với thử nghiệm hoạt tớnh khỏng gout in vitro và in vivo cho thấy khả năng ức chế xanthine oxidase và giảm hàm lượng acid uric trong máu đáng kể [84] Ngoài ra, Anchalee Chiabchalard và cộng sự cũng đã chứng minh khả năng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường với cao chiết lá dứa với mức đường huyết trung bình là 6.16 ± 0.79 mmol/L so sánh với nhóm chứng dương là 5.55 ± 0.98 mmol/L [85]
1.4.6 Cải bẹ xanh (Brassica juncea L.)
Cải bẹ xanh, tên khoa học là Brassica juncea L., là một loài cây thân thảo, sống một đến hai năm và có thể cao tới 1,5 m Lá phía dưới có rãnh sâu, phiến lá lượn sóng, mép có răng cưa thô Cải bẹ xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu được dung cho mục đích ăn uống, cung cấp chất xơ, khoáng, …hoặc để điều trị một số bệnh như ho, viêm phế quản Ngoài ra, ở một số nước, cải bẹ xanh được trồng để lấy hạt ép dầu và làm thuốc Trong y học cổ truyền, cải bẹ xanh có vị cay đắng, tính ấm có tác dụng an thần, giảm đau, trị đờm thấp [60, 86, 87] Trong cải bẹ xanh có nhiều hợp chất hữu
NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM HOẶC LÝ THUYẾT
Mục tiêu nghiên cứu
Qua việc đánh giá tình hình bệnh gout trong nước và thế giới và những ảnh hưởng xấu đến chất lượng sống mà bệnh phân phải đối mặt, mục tiêu của luận văn này sẽ tiến hành sàng lọc và đánh giá các loài thực vật có khả năng hỗ trợ điều trị gout nhờ hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase thông qua thí nghiệm in vitro và sau đó tối ưu điều kiện chiết với mục tiêu là hàm lượng flavonoid tổng và hoạt tính ức chế xanthine oxidase của thực vật có hoạt tính tốt nhất
Bảng 2.1 Các đối tượng thực vật khảo sát
Tên thực vật Tên khoa học Bộ phận sử dụng
Mãng cầu ta Annona squamosa L Lá
Ngải cứu Artemisia vulgaris L Thân, lá
Ngũ trảo Vitex negundo L Lá Đại bi Blumea balsamifera (L.) DC Thân, lá
Sen Nelumbo nucifera Gaertn Lá
Diệp hạ châu Phyllanthus urinaria L Thân, lá Ổi Psidium guajava L Lá
Lá lốt Piper lolot C.DC Thân, lá
Dứa Pandanus amaryllifolius Roxb Lá
Cải bẹ xanh Brassica juncea L Lá
Nội dung nghiên cứu
Từ mục tiêu đề ra, nội dung của luận văn bao gồm hai nội dung chính:
Nội dung 1: Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase của 11 loài thực vật gồm sen, đại bi, actiso, diệp hạ châu, ổi, ngải cứu, ngũ trảo, mãng cầu ta, lá dứa, cải bẹ xanh và lá lốt với các nội dung thực hiện cụ thể như sau:
- Xử lý và đánh giá các loại nguyên liệu
- Chiết và so sánh hiệu quả thu cao tổng của các loại nguyên liệu
- Định lượng polyphenol và flavonoid tổng của các cao để dự đoán hoạt tính sinh học của chúng
- Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của các cao để tìm ra loài thực vật có hoạt tính mạnh nhất
Nội dung 2: Tối ưu hóa quy trình chiết của thực vật được chọn cho hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase và hàm lượng flavonoid tổng
- Thực hiện luân phiên từng biến với các điều kiện khác nhau (nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ rắn/lỏng) để tìm ra điểm tối ưu (điều kiện trích ly thích hợp mà tại đó hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase là tối ưu)
- Thực hiện quy hoạch thực nghiệm với các điều kiện khác nhau (nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ rắn/lỏng) để tìm ra điểm tối ưu (điều kiện trích ly thích hợp mà tại đó hàm lượng flavonoid là tối ưu)
- So sánh kiểm tra giá trị TFC và khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của cả 2 điểm tối ưu
- Xác định lại khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm và phân tích phổ FT-IR của
Hóa chất và thiết bị
Various chemicals, including xanthine oxidase enzyme, xanthine, allopurinol, gallic acid, ethanol, DPPH, hyaluronidase enzyme, BSA, ascorbic acid, ursolic acid, Na2CO3, HCl, NaOH, folin–ciocalteau, and FeCl3, were utilized in the study.
Thiết bị: máy đo độ ẩm (SATORIUS MB45), máy cô quay (RE 301A-W), bể đánh siêu âm (Elmasonic S100H), máy đo quang phổ UV-Vis (Genesys 10S UV – Vis), máy ủ lắc (Awareness Stat Fax – 2200).
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Xác định độ tro toàn phần
Lấy 2g mẫu thử vào chén sứ hoặc chén platin đã nung nóng và cân khối lượng Đốt mẫu thử ở nhiệt độ 450 độ C cho đến khi không còn carbon, sau đó làm nguội và cân trở lại Nếu tro thu được vẫn còn carbon, dùng nước nóng cho vào khối chất đã than hóa, khuấy và lọc qua giấy lọc không tro.
29 dịch lọc vào một cốc riêng, cho giấy lọc và cắn vào chén và nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng Cho phần dịch lọc vào cắn trong chén nung và cho bốc hơi đến khi khối lượng không đổi, tỉ lệ phần trăm của tro toàn phần được tính theo công thức sau [60]: Độ tro (%) = m 2 − m 1
2 × (1 − 0.01W) m1, m2: khối lượng chén trước và sau nung (g)
Dùng máy đo độ ẩm (SATORIUS MB45), cân 0.100g dược liệu, rãi đều trên đĩa nhôm và sấy ở 105 o C đến khi khối lượng không đổi Độ ẩm dược liệu sẽ được hiển thị trên màn hình máy khi quá trình đo kết thúc Độ ẩm được tính theo công thức sau [60]:
W (%) =m 1 − m 2 m 1 × 100 m1, m2: khối lượng trước và sau (g)
Thực hiện phép đo 3 lần và lấy kết quá trung bình Có thể xác định khối lượng nguyên liệu khô từ độ ẩm W theo công thức sau: m khô = m × (1 − 0.01W) mkhô: khối lượng nguyên liệu khô (g); m: khối lượng nguyên liệu cân (g)
Trước khi chiết, nguyên liệu được đo độ ẩm, dùng 20.0g bột nguyên liệu khô chiết với dung môi là cồn tuyệt đối, tỉ lệ 1:10 (g/mL), đun trên bếp cách thủy, nhiệt độ dao động từ 40 – 50 o C trong 45 phút, dùng cánh khuấy chân vịt với tốc độ khuấy
270 – 280 rpm Sau khi kết thúc quá trình chiết, lọc bã và thu hồi bã cho quá trình chiết tiếp theo Dịch chiết được cô quay bằng máy cô quay (RE 301A-W), sau cô quay thu được cao chiết, xác định độ ẩm cao chiết và chuyển sang khối lượng cao khô để tính hiệu suất chiết theo công thức sau:
H (%) = m cao khô mnguyên liệu khô × 100 mcao khô: khối lượng cao khô thu được sau cô quay (g); mnguyên liệu khô: khối lượng nguyên liệu khô đem chiết (g)
Hình 2.1 Quy trình chiết 2.4.4 Phương pháp khảo sát sơ bộ thành phần hóa học thực vật Định tính polyphenol
Cho 2mL dịch chiết vào ống nghiệm, sau đó thêm vài giọt dung dịch FeCl3 Tùy vào số lượng, vị trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu đỏ Định tính flavonoids
Tác dụng với Mg/HCl: thêm vài hạt Mg kim loại vào dịch chiết rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc vào Sau vài phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẫm hoặc đỏ tươi ứng với các hợp chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanone
Tác dụng với chì acetate: cho 1mL dịch chiết vào ống nghiệm, sau đó thêm 1mL dung dịch chì acetate 10% Phản tạo tủa từ vàng đến sậm
Dùng khoảng 5 g bột dược liệu và dung dịch H2SO4 1% cho vào erlen và đun nhẹ trong 1 giờ Tiến hành lọc và lấy dịch lọc thử nghiệm với các loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff Định tính tannin
Thêm vào dịch chiết 1mL dung dịch gelatin 1% có chứa 10% NaCl Hiện tượng dương tính khi có phản ứng tạo tủa Định tính carotenoid
Cho vào dịch chiết 2 giọt H2SO4 đậm đặc, dung dịch xuất hiện ánh xanh dương nếu có mặt carotenoids
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng giữa thuốc thử oxy hóa khử Folin-Ciocalteu (gồm acid phosphotungstic (H3PW12O40) và acid phosphomolybdic (H3PMo12O40)) với hợp chất phenolic tạo thành hỗn hợp oxide có màu xanh (W8O23 và Mo8O23) Tiến hành đo độ hấp thu tại bước sóng 760 nm và xác định hàm lượng polyphenol tổng dựa trên đường chuẩn của acid gallic [102]
Chuẩn bị các dung dịch sau:
Khối lượng cần cân cho mẫu cao được tính theo công thức:
1 − ℎ× 10 −6 Trong đó: M (g): khối lượng cao cần cân
C (ppm): nồng độ mẫu cần pha
V (ml): thể tích mẫu cần pha h (%): độ ẩm của mẫu cao
32 Dung dịch Na2CO3 20%: hòa tan 20 g Na2CO3 bằng nước cất, định mức thành 100 mL và đun sôi Thêm một vài tinh thể Na2CO3 sau khi dung dịch nguội và chờ sau 24h để lọc lấy dung dịch trong
Dung dịch acid gallic 1mg/mL: hòa tan 10 mg acid gallic trong 1 mL DMSO, định mức lên 10 mL bằng nước cất và pha loãng thành các nồng độ sau: 1000, 900, 800,
700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 0 (àg/mL) Đường chuẩn acid gallic:
Cho 200 àL thuốc thử Folin-Ciocalteu vào 40 àL dung dịch acid gallic tại cỏc nồng độ khác nhau, đồng nhất bằng bể siêu âm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Thêm
600 àL dung dịch Na2CO3 20% và 3160 àL nước cất và hỗn hợp trờn, đồng nhất bằng bể lắc siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Tiến hành đo quang tại bước sóng 760 nm Lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ, lấy giá trị trung bình Các bước tiến hành lập đường chuẩn acid gallic được mô tả trong Hình 2.2
Hình 2.2 Quy trình định lượng polyphenol tổng
Hình 2.3 Đường chuẩn acid gallic
Tính toán kết quả: từ độ hấp thu của acid gallic tại các nồng độ, dựng được đồ thị ở
Hòa tan 10 mg cao chiết trong 1 mL DMSO 100% và pha thành các nồng độ phù hợp có độ hấp thu nằm trong khoản tuyến tính của đường chuẩn acid gallic Tiến hành đo mẫu tương tự bước lập đường chuẩn acid gallic, lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình
Hàm lượng polyphenol tổng được tính theo công thức sau:
TPC = GAE × v m TPC: hàm lượng polyphenol tổng trên 1 g cao chiết (mg/g)
GAE: hàm lượng tương đương của acid gallic suy ra từ đường chuẩn (mg/mL) v: thể tích mẫu (mL) m: khối lượng khô của mẫu (g)
2.4.6 Định lượng flavonoids bằng phản ứng tạo phức với AlCl 3
Nguyên tắc: dựa trên phản ứng tạo phức giữa AlCl3 với flanovoids Tiến hành đo độ hấp thu tại bước sóng 425 nm và dựa vào đồ thị đường chuẩn quercetin để xác định hàm lượng flavonoids tương ứng [103]
34 Chuẩn bị các dung dịch sau:
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Chuẩn bị và đánh giá nguyên liệu
Tất cả các loại thực vật được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm sen (Nelumbo nucifera Gaertn.), đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC.), actiso (Cynara cardunculus
L.), diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.), ổi (Psidium guajava L.), mãng cầu ta (Annona squamosa L.), ngải cứu (Artemisia vulgaris L.), ngũ trảo (Vitex negundo L.), lá lốt (Piper lolot C.DC.), dứa (Pandanus amaryllifolius Roxb.) và cải bẹ xanh (Brassica juncea L) được thu hái từ vườn dược liệu tỉnh Long An
Các thực vật nghiên cứu được thu hái vào tháng 12/2019, sau đó được xử lý và sấy trong buồng có nhiệt độ từ 50-60 o C cho đến khi độ ẩm đạt dưới 12% theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V [60] Sau đó dược liệu được nghiền nhỏ thành bột với kích thước từ 0.25-1 mm và được đóng gói trong túi nhựa để bảo quản và sử dụng cho các công đoạn tiếp theo Kết quả đo độ ẩm và độ tro toàn phần bột của các thực vật nghiên cứu được thể hiện trong Bảng 3.1
Bảng 3.1 Độ ẩm và độ tro của các đối tượng nghiên cứu
Tên đối tượng Độ ẩm (%) Độ tro toàn phần (%)
46 Dược liệu sau khi thu hái được trải qua các bước sơ chế nhằm làm sạch và ổn định dược liệu Dược liệu được sấy với mục đích làm cho độ ẩm của dược liệu đạt tới độ an toàn nhằm trong quá trình bảo quản dược liệu không bị nhiễm mốc, vi khuẩn, không bị tác động bởi enzyme và hạn chế các biến đổi hoá học có thể xảy ra trong dược liệu như bị thủy phân, oxy hoá, đồng phân hoá từ đó giúp tăng thời gian bảo quản và chất lượng nguyên liệu trong quá trình nghiên cứu Theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V, hầu hết độ ẩm của các dược liệu sử dụng được quy định không được vượt quá 12% [60] Trong quá trình sấy, dược liệu thường nâng nhiệt độ sấy đến khoảng nhiệt độ 50-60 o C, ở những nhiệt độ này khiến cho các enzyme xúc tác sinh hóa trong thực vật bất hoạt giúp cho các hợp chất không bị biến tính [114] Ngoài ra, còn có một chỉ số khác có thể dung để đánh giá chất lượng nguyên liệu là độ tro toàn phần Độ tro toàn phần được định nghĩa là lượng chất vô cơ còn lại sau quá trình nung cháy nguyên liệu, các chất vô cơ này bao gồm muối khoáng, kim loại…có trong dược liệu [60] Đây là một chỉ số nhằm đánh giá độ sạch của nguyên liệu, mỗi một nguyên liệu đều có giá trị độ tro quy định trong Dược điển Việt Nam [60] Như vậy dựa trên kết quả Bảng 3.1 thì tất cả các đối tượng nghiên cứu đều đạt tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam V và được sử dụng để chiết theo phương pháp đã nêu ở Mục
2.3.3 Sau đó mẫu cao chiết sẽ được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ -20 o C nhằm tránh các trường hợp biến tính các hợp chất trong cao chiết và sự phát triển của các vi sinh vật ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Hiệu suất thu cao tổng
Hiệu suất thu cao tổng được xác định để so sánh lượng cao thu được giữa các lần chiết, từ đó lựa chọn số lần chiết tối ưu nhất Quá trình chiết theo quy trình quy định tại Mục 2.3.3 sử dụng ethanol tuyệt đối làm dung môi, nhiệt độ chiết 45-50 oC, thời gian chiết 45 phút, thực hiện 4 lần chiết liên tiếp Hiệu suất thu cao tổng của các đối tượng được thể hiện trong Hình 3.2.
Hình 3.1 Hiệu suất chiết của các đối tượng nghiên cứu
Kết quả theo Hình 3.2, hiệu suất chiết cao tổng của các đối tượng có giá trị trong khoảng từ 9% đến 34%, trong đó lá sen và mãng cầu ta là hai đối tượng đạt hiệu suất chiết vượt trội nhất (lần lượt là 33.32% và 31.83%) với giá trị cao gấp hai đến ba lần hiệu suất chiết của các thực vật còn lại Trong khi đó, đại bi có hiệu suất chiết thấp nhất là 8.80% Các đối tượng lá lốt, ngải cứu, đại bi, diệp hạ châu thì bộ phận sử dụng bao gồm cả lá và thân, tỉ lệ cellulose trong thân cao ảnh hưởng tới khả năng khuấy trộn và hiệu quả khuếch tán của các hợp chất sẽ khiến cho hiệu suất chiết giảm [115] Trên lý thuyết thì nếu số lần chiết càng tăng hiệu suất chiết và lượng hợp chất được chiết xuất cũng gia tăng Tuy nhiên, theo số liệu hiệu suất chiết đến lần chiết thứ tư của các đối tượng khảo sát đều rất thấp (dưới 1%) Hiệu suất thu cao chiết của các thực vật trong lần chiết đầu tiên chiếm tỉ lệ lớn nhất trong hiệu suất chiết cao tổng Lần chiết thứ hai cho hiệu suất chiết còn khoảng 1/3 đến 1/2 lần chiết đầu tiên và lần chiết thứ ba còn khoảng 1/10 đến 1/5 Nguyên nhân của điều này là do lần đầu tiên hầu hết hợp chất trong được liệu được khuếch tán vào dung môi Đến những lần sau, hàm lượng hợp chất trong cao chiết giảm đi dẫn đến hiệu suất thu cao chiết giảm Con số dưới 1% của lần chiết thứ tư cho thấy nếu chiết thêm thì hiệu suất tổng vẫn tăng nhưng không đáng kể mà còn khiến cho quy trình chiết tốn thời gian và kém
48 hiệu quả Vì vậy, để đảm bảo hiệu suất chiết, tiết kiệm dung môi và thời gian chiết thì các dược liệu nghiên cứu thực hiện quá trình chiết trong ba lần.
Sơ bộ hóa thực vật
Mục đích của việc sơ bộ hóa thực vật nhằm xác định sự hiện diện của một số nhóm chất tự nhiên trong cao chiết của các dược liệu, từ đó có thể dự đoán sơ bộ về hoạt tính của các đối tượng nghiên cứu Sơ bộ hóa bao gồm các quy trình định tính một số hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học như polyphenol, flavonoid, alkaloid, tannin Các nhóm chất như polyphenol, flavonoid, alkaloid, tannin đã được chứng minh có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase hỗ trợ điều trị bệnh gout [116] Bên cạnh đó, polyphenol là nhóm chất chuyển hóa thứ cấp tồn tại rộng rãi và phổ biến trong tự nhiên có nhiều hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng gout, kháng ung thư [117] Flavonoid đã được chứng minh có khả năng khả năng ức chế nhiều loại enzyme khác nhau như xanthine oxidase, perosidase, nitric oxidase, những enzyme này liên quan đến sản xuất các gốc tự do trong cơ thể từ đó hạn chế những tổn thương oxy hóa đến các đại phân tử trong cơ thế đồng thời các flavonoid còn có thể ngăn ngừa thoái hóa mạch máu, giảm nguy cơ bệnh tim mạch [118] Bên cạnh đó, các alkaloid đặc trưng với khả năng tác động đến hệ thần kinh và thể hiện ảnh hưởng mạnh mẽ đến các cơ quan thông qua đặc tính kháng viêm, kháng ung thư, kháng gout [119] Nhóm tannin, những polyphenol có khả năng tan trong nước, đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học trong số đó được đặc trưng là khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn mạnh [120] Hợp chất carotenoid đóng một vai trò quan trọng trong chế độ dinh dưỡng của cơ thể và đặc trưng với khả năng chống oxy hóa [121] Việc định tính những hoạt chất nhằm xác định sự hiện diện của chúng trong cao chiết giúp dự đoán sơ bộ về tiềm năng đối với việc điều trị bệnh gout và các biến chứng liên quan
Theo kết quả định tính Bảng 3.2, các mẫu cao chiết những thực vật khảo sát đều cho phản ứng xác định sự có mặt của polyphenol và flavonoid, đa số cho phản ứng với thuốc thử nhận biết tannin và một số đối tượng cho phản ứng xác định sự có mặt alkaloid và carotenoid Trong đó, các đối tượng mãng cầu ta, ngải cứu, sen và ổi cho phản ứng mạnh với FeCl3 khẳng định sự xuất hiện dồi dào của các hợp chất thuộc
Xác định thành phần flavonoid trong các cao chiết thực vật sử dụng hai thuốc thử Mg/HCl và chì acetate, xác định được các nhóm flavonone, flavanone, flavone, flavonol và hydroxyphenol như quercetin, luteolin Phản ứng định tính tannin cho thấy phản ứng tạo tủa với gelatin, đặc biệt mạnh ở mãng cầu ta, ngải cứu và lá ổi Sử dụng thuốc thử Dragendorff và Bouchardat giúp định tính alkaloids toàn diện, thuốc thử Bouchardat đặc hiệu cho morphine Ngải cứu và đại bi có phản ứng định tính với cả hai thuốc thử alkaloids Mãng cầu ta, ngũ trảo, sen và dứa phản ứng với Bouchardat Phản ứng định tính carotenoid chỉ có ở ngải cứu, ngũ trảo và lá dứa.
Từ kết quả những phản ứng định tính với các hợp chất tự nhiên có thể đưa ra dự đoán sơ bộ về khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của các thực vật khảo sát, trong đó các đối tượng mãng cầu, ngải cứu và ổi thể hiện các phản ứng mạnh thể hiện sự có mặt dồi dào của các hợp chất tự nhiên từ đó cho thấy tiềm năng trong việc điều trị bệnh gout và các biến chứng liên quan
Bảng 3.2 Kết quả định tính của các đối tượng khảo sát Đối tượng
Các nhóm hợp chất được định tính
Mg/HCl Chì acetate Bouchardat Dragendorff
‒ không có phản ứng với thuốc thử
+ có phản ứng với thuốc thử
++ có phản ứng mạnh với thuốc thử
Trong các hợp chất tự nhiên, polyphenol và flavonoid là những hợp chất có mặt trong hầu hết các thực vật, đa dạng về phân loại cũng như là hoạt tính sinh học [117] Chính vì vậy, bước tiếp theo cần tiến hành định lượng các hợp chất polyphenol, flavonoid để có thể nhận định rõ ràng hơn về khả năng ức chế xanthine oxidase của các đối tượng nghiên cứu.
Định lượng polyphenol và flavonoid
Polyphenol là một nhóm chức lớn trong tự nhiên đặc trưng bởi nhiều nhóm hydroxyl, xuất hiện rộng rãi trong thực vật và đa dạng về cấu trúc Polyphenol được chia làm các nhóm flavonoid, acid tannic và ellagitannin [125] Trong đó, flavonoid được xem là một hợp chất quan trọng, có mặt đa dạng trong thực vật và đồng thời nhiều hợp chất thuộc nhóm flavonoid đã được các định thể hiện hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase như quercetin, luteolin [53, 118] Ngoài ra polyphenol và flavonoid còn đặc trưng cho khả năng kháng oxy hóa [125] Vì vậy, tiến hành định
51 lượng tổng polyphenol (TPC) và flavonoid (TFC) để có thể dự đoán hoạt tính sinh học của các đối tượng nghiên cứu, kết quả định lượng được thể hiện trong Bảng 3.3 và Hình 3.2
Hình 3.2 Hàm lượng polyphenol và flavonoid của các đối tượng nghiên cứu
Dựa trên số liệu từ Hình 3.2 các đối tượng nghiên cứu có giá trị hàm lượng TPC và TFC khác nhau Trong đó, hàm lượng TPC tổng của cao chiết lá ổi là cao nhất, đạt 150.32 mg GAE/g cao khô cao hơn gấp 4 lần thực vật có hàm lượng TPC thấp nhất (30.33 mg GAE/g cao khô) là cải bẹ xanh Một số đối tượng có giá trị hàm lượng TPC đáng kể lớn hơn 100 mg GAE/g cao khô bao gồm diệp hạ châu, ngải cứu và mãng cầu ta Những thực vật có hàm lượng TPC thấp bao gồm actiso, lá dứa với giá trị lần lượt là 36.26 mg GAE/g, 41.15 mg GAE/g cao khô Ngũ trảo, lá lốt, đại bi và lá sen có giá trị hàm lượng trung bình từ 50 đến 100 mg GAE/g cao khô Đối với hàm lượng flavonoid tổng, đối tượng lá ổi cũng đạt giá trị cao nhất 190.61 mg GAE/g, trong khi đó actiso có hàm lượng TFC thấp nhất, 35.88 mg QUE/g cao khô Các giá trị TFC đáng kể tiếp theo lần lượt là của đối tượng mãng cầu ta, diệp hạ châu, ngải cứu, sen lần lượt là 180.23, 170.49, 137.75 và 146.04 mgQUE/g cao khô Dựa trên kết quả định lượng TPC và TFC, có thể dự đoán đối tượng lá ổi sẽ thể hiện khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase vượt trội so với các đối tượng khác Điều này phù
52 hợp với kết quả định tính, khi đối tượng cao chiết lá ổi đều cho những phản ứng mạnh với các thuốc thử định tính các hợp chất polyphenol, flavonoid, tannin Để khẳng định những dự đoán từ các thí nghiệm định tính và định lượng, bước tiếp theo tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế xanthine oxidase in vitro của các đối tượng nghiên cứu.
Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme XO của các đối tượng
Như trình bày ở Mục 1.2.5, enzyme xanthine oxidase là chất xúc tác cho quá trình chuyển hóa hypoxanthine và xanthine thành acid uric, một trong những nguyên nhân trực tiếp gây nên bệnh gout Vì vậy, việc hạn chế sự hình thành acid uric bằng cách ức chế enzyme xanthine oxidase trở thành một phương pháp phổ biến để đáng giá hoạt tính kháng gout của các đối tượng nghiên cứu Giá trị hoạt tính của các đối tượng nghiên cứu được thể hiện qua Bảng 3.3 và Hình 3.3
Bảng 3.3 TPC, TFC và khả năng ức chế enzyme XO của các đối tượng Đối tượng TPC
Lỏ lốt 73.56 ± 0.56 69.76 ± 0.77