Luận án tiến sĩ Hóa học: Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Aegiceras floridum, họ Sú (Aegicerataceae) mọc ở rừng ngập mặn Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh

Các hợp chất được phân lập được từ vỏ thân cây su trắng.... Sự kết hợp những chứng cứ khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên và hoạt tính sinh học đã góp phan c

LUU HUYNH VAN LONG

KHAO SAT THANH PHAN HOA HOC VA HOAT TINH SINH HQC CUA CAY AEGICERAS FLORIDUM, HQ SU

(AEGICERATACEAE) MQC O RUNG NGAP MAN

CAN GIO, TP HO CHi MINH

LUAN AN TIEN SI HOA HOC

TP Hồ Chí Minh — Năm 2023

LƯU HUỲNH VẠN LONG

KHẢO SÁT THÀNH PHAN HÓA HỌC VA HOAT TÍNH

SINH HỌC CUA CUA CÂY AEGICERAS FLORIDUM, HQ SU

(AEGICERATACEAE) MỌC O RUNG NGAP MAN

CAN GIO, TP HO CHÍ MINH

Ngành: HOA HỮU CƠ

Mã số ngành: 62 44 01 14

Phản biện 1: PGS.TS Hà Diệu Ly

Phản biện 2: PGS.TS Lê Tiến Dũng

Phản biện 3: PGS.TS Phan Thị Anh Đào

Phản biện độc lập 1: PGS.TS Lê Tiến Dũng

Phản biện độc lập 2: TS Bùi Xuân Hào

Phản biện độc lập 3: PGS.TS Đỗ Thị Mỹ Liên

NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC

1 GS.TS Nguyễn Kim Phi Phụng

2 GS.TS V6 Thanh Giang

TP Hồ Chí Minh — Nam 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận án tiến sĩ nganh Hóa hữu co, với đề tài “ Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh hoc cua cay Aegiceras floridum, Ho Su

(Aegicerataceae) moc ở rừng ngập mặn Can Giờ, TP Hồ Chi Minh” là công trình

khoa học do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Nguyễn Kim Phi Phụng

va GS.TS Võ Thanh Giang.

Những kết qua nghiên cứu của luận án hoàn toàn trung thực, chính xác va

không trùng lap với các công trình đã công bô trong và ngoài nước.

Nghiên cứu sinh

(Ký tên, ghi họ tên)

Lưu Huỳnh Vạn Long

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành luận án nghiên cứu, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

GS TS Nguyễn Kim Phi Phụng, người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý báu Cô luôn động viên, tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ về vật chất cũng như tỉnh thần cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu Cô là người truyền cho tôi ngọn lửa đam mê trong nghiên cứu khoa học Cô luôn luôn kể cận chia sẻ, khích lệ, đôn déc tôi nỗ lực vượt qua những khó khăn để hoàn thành luận án.

GS TS Võ Thanh Giang, người Thầy đồng hướng dẫn, hỗ trợ và chia sẽ những kinh

nghiệm nghiên cứu khoa học quý báu.

GS TS Warinthorn Chavasiri và chương trình thực tập sinh, đã giúp tôi có điều

kiện học tập và thực nghiệm trong môi trường hiện đại, tại Khoa Hóa học, Trường Đại

hoc Chulalongkorn, Thailand.

PGS TS Nguyễn Trung Nhân va Thay Cô trong Bộ môn hóa hữu co, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giúp đỡ và góp ý trong quá trình hoàn thành các

chuyên đề tiến sĩ.

GS.TS Nguyễn Cửu Khoa, PGS.TS Hà Diệu Ly, PGS.TS Phan Thị Anh Đào, PGS.TS Lê Tiến Dũng, PGS.TS Đỗ Thị Mỹ Liên đã phản biện, góp ý nhiều vấn đề sâu sắc giúp tôi chỉnh sửa và hoàn thiện luận án.

Phòng Đào tạo Sau đại học trường ĐH KHTN TP HCM đã hướng dẫn, tạo điều kiện

thuận lợi giúp tôi hoàn thành các thủ tục hành chính theo quy định.

TS Nguyễn Văn Ngọt đã giúp xác định tên khoa học loài cây nghiên cứu.

PGS.TS Dương Thúc Huy đã góp ý trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận

án.

Ban Giám hiệu và Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ứng dụng, Trường Đại học Thủ Dầu Một tạo nhiều điều kiện thuận lợi hỗ trợ tôi trong thời gian hoàn thành luận án.

Bo Me, Vợ va hai Con đã luôn đồng hành, động viên và hỗ trợ về mặt tinh thần rất lớn

giúp tôi hoàn thành luận án.

Nghiên cứu sinh

Lưu Huỳnh Vạn Long

li

Danh mục từ Vidt tat cccccecccscsccssssesessesssseceesecsesecsucsesecsesussesarsusersuseesassesessesevsecaneavavees vi

Danh mục hình ảnh - 2E 2221612231111 2531 111951 111931 111821111 g1 E1 kg key VIH

Danh mục bảng DiGU eee essessessessessessssvssssessessesucsussscsucsessessssscsuessessssssteaeseees 1X

MO DAU ooo 3 | Chương 1 TONG QUAN 55-552 S2 E22EE2EE221121127171211211211 112121 CEre 3

1.1 Đặc tính thực vật c E11 1211111 SS ng vn ng 1 ng xec 3

1.2 Nghiên cứu về thành phan hóa học - 2-2 s2+z2z+£x+zzzzsed 4

1.3 Nghiên cứu về được tính - 2-2 s+s+x+£E++E++EEerxerxzrxerxerxee 9

Chương 2 THỰC NGHIỆỆM -. . 2222 252222 sse2 11

2.1 Hóa chất và thiết Dic ececcseesssseecssneeessnesessseesseneesssneecssneeeseneees 11

2.2 Nguyên lIỆU - G1 TT TH ng HH Hàn Hàn nrht 13

2.3 Điều chế các lOại ŒaO -¿- 5: tct+ESEESE+EEEEEE2EEEEE2EEEEEEEEEEEESErErrres 13 2.4 Ly trích và phân lập các hợp chất hữu cơ - ¿5:52 18

2.5 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tính tế bào ung thư 27

2.6 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa DPPPH - - -++s«- 30

2.7 Nơi thực hiện thử nghiệm 5c 222 3222 EEEExsrrerrrsreske 31

Chương 3 KET QUA VA BAN LUẬN - 2-55 222 2E EEEEEeErerrerree 32

3.1 Khảo sát cấu trúc hóa hỌC -:-cc tt SxEEEEEEEEEEEEeEkrkrrxrrerrea 32

3.1.1 Khảo sát cau trúc hóa hoc của hợp chất AF ló cse¿ 32 3.1.2 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất AF 22 : 35

1H

3.1.3 Khảo sát cau trúc hóa học của hợp chat AF 18 37

3.1.4 Khảo sát cau trúc hóa học của hợp chất AF 19 40

3.1.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất AF 20 s-: 42 3.1.6 Khao sát cau trúc hóa học của hợp chất AF 21 45

3.1.7 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất AF 17 -s-: 48 3.1.8 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất AF 7 -ccccccees 50 3.1.9 Khảo sát cau trúc hóa học của hop chất AF 8 -¿ 52

3.1.10 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất AF 10 56

3.1.11 Khảo sát cau trúc hóa học của hợp chat AF 6 57

3.1.12 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất AF 23 s9 3.1.13 Khảo sát cau trúc hóa học của hợp chất AF 24 -.- 61

3.1.14 Khao sát cấu trúc hóa học của hop chat AF 2 63

3.1.15 Khao sát cấu trúc hóa học của hợp chất AF l - 67

3.1.16 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất AF 3 -cec: 68 3.1.17 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chat AF 4 69

3.1.18 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất AF 12 - 71

3.1.19 Khảo sát cau trúc hóa học của hợp chất AF 14 72

3.1.20 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất AF 15 73

3.1.21 Khảo sát cau trúc hóa học của hợp chất AF 13 75

3.1.22 Khảo sát cau trúc hóa học của hợp chất AF I1 76

3.1.23 Khao sát cấu trúc hóa học của hợp chất AF 25 - 78

3.1.24 Khảo sát cau trúc hóa học của hợp chất AF 26 79

3.1.25 Khảo sát cau trúc hóa học của hợp chất AF 27 - 83

3.2 Kết qua thử nghiệm hoạt tính sinh học -¿ ¿252552 88

3.2.1 Hoạt tinh gây độc tế bào ung thư 2- ¿522 55z+2xczzscr+2 88

3.2.2 Hoạt tinh khang oxy hóa DPPH - ¿+ 2 +2 *++xsesssesss2 90

IV

Chương 4 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 2-52 SE E2 2E 93 DANH MỤC CÔNG TRÌNH TÁC GIẢ 98

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHU LỤC L c1 2112111112111 151 tk HH Ha

DANH MỤC TỪ VIET TAT

Cụm từ

kag Tiéng Anh Tiếng Việt

viet tat

AF Aegiceras floridum Tén khoa hoc loai cay

brs Broad singlet Mui don rộng

CD30D Methanol-d¿ Methanol deuterium hóa

CDC]: Chloroform—d Chloroform deuterium hóa

Phô tương tác hai chiều

COSY Correlation Spectroscopy Hn

d Doublet Mãi đôi

dd Doublet of doublets Mui đôi-đôi

DMSO Dimethyl sulfoxide

DMSO-de Dimethyl sulfoxide—ds Dimethy! sulfox ide

deuterium hóa

DPPH 1,1-Diphenyl-2—picrylhydrazyl

EtOAc Ethyl acetate

Gai Galactose Đường galactose

Glc Glucose Duong glucose

Hz/ MHz Hertz/ Mega Hertz đơn vi tan số

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phố tương tac di hạt nhân

Correlation spectroscopy !H-!C qua 2-3 liên két

HR_ESI-MS High resolution electrospray Khối pho phan giải Cao với kỹ

ionization mass spectrometry thuật ion hóa phun điện tử

HSQC Heteronuclear Single Quantum Phô tương tac di hạt nhân

Correlation spectroscopy 'H—'C qua 2-3 liên kết

ICso Inhibitory Concentration 50% Nông độ ức chế 50%

SCso Scavening Concentration 50% Nông độ bắt gốc tự do 50%

J Coupling constant Hang s6 ghép

m Multiplet Mũi đa

MeOH Methanol

m/z mass to charge ratio Ti lệ khối lượng trên điện tích

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Rr Retardation factors Hệ số làm chậm

Rha Rhamnose Đường rhamnose

Rut Rutinose Duong rutinose

Ss Singlet Mũi đơn

f Triplet Mũi ba

TLC Thin Layer Chromatography Sac ký lớp mỏng

Xyl Xylose Duong xylose

5 Chemical shift Độ dich chuyền hóa học

MCF-7 Michigan cancer foundation-7 Tế bao ung thư vú

DANH MỤC HÌNH ANH

Hình 1.1 Hình ảnh loài Aegiceras ƒlOridÏUIM 5c Sc SS+ + sseseexsessres 3

Hình 1.2 Cau trúc các hợp chất quinone ¿- 2 2s +£x+EE£EE2EE2EzEerxerxered 5 Hình 1.3 Cấu trúc các hợp chat triterpene 2- 2 ++22++2x++zxzrxrzrxrrxeerxeee 6

Hình 1.4 Cau trúc các hợp chất flavonol - 2 ++x++E£+E++E++ExerEezExzrxerxerxee 7

Hình 1.5 Cau trúc các hợp chất phenol - - 2-2 2 +2 £E++E£+E+zEeExerxzrxzrszrs 7 Hình 1.6 Cau trúc các hợp chat sterol - 2-2 2+S+E£EE£EEEEEEEEEEEEEEEerkerkered 8 Hình 1.7 Cau trúc các hợp chất khác -. - ¿- ¿+ ++EE9EE£EE2EE2E2EEEEeEEEEEerkerxrrxres 8

Hình 3.1 Tương quan HMBC va COSY của AF 16.00 cccceccccesseesseeeseeeeteesseeensees 33

Hình 3.2 Tương quan HMBC va COSY của AF 22 SG LH Hư, 36 Hình 3.3 Tương quan HMBC và COSY của AF T8 che 39

Hình 3.4 Tương quan HMBC va COSY của AF ]9 41

Hình 3.5 Tương quan HMBC va COSY cua AF l7 cà 49 Hình 3.6 Tương quan HMBC va COSY của AF 26 cà se 83 Hình 4.1 Các hợp chất được phân lập được từ lá cây sti trang 94

Hình 4.2 Các hợp chất được phân lập được từ vỏ thân cây su trắng 96

DANH MỤC SƠ DO Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế các loại cao của lá cây sứ frắng . - 16

Sơ đồ 2.2 Quy trình điều chế các loại cao của vỏ thân cây sứ frắng 17

Sơ đồ 2.3 Quy trình phân lập hợp chat từ cao ethyl acetate lá sú trăng 23

Sơ đồ 2.4 Quy trình phân lập hợp chất từ cao n-hexane vỏ thân sú trắng 24

Sơ đồ 2.5 Quy trình phân lập hợp chat từ cao ethyl acetate vỏ thân st trắng 27

Sơ đồ 2.6 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bao bang phương pháp SRB 29

vill

DANH MỤC BANG BIEU

Bang 1.1 Kết qua thử nghiệm độc tinh của 5-O-ethylembelin và

5-O-methyleimbelI - - E33 3188311 1835111321138 xre 9

Bang 1.2 Kết quả thử nghiệm in vitro ức chế ký sinh trùng sốt rét của các

phân đoạn cao của A.cormiculatum Ặc2Ă Sàn 10

Bảng 2.1 Khối lượng và thu suất các loại cao từ lá và vỏ thân của cao thô

methanoÌL -cc c1 21211 211211 *1 921v kh nh nh nh nh nh hư 14

Bang 2.2 Kết quả sắc ký cột n-hexane lá sú trang - -‹ -.- 19

Bang 2.3 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate lá sú trang 22

Bang 2.4 Kết quả sắc ký cột cao n—hexane vỏ thân sú trắng 22

Bảng 2.5 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate vỏ thân sii trang 2Ó Bang 3.1 So sánh phô NMR của AF 16 với 3-methoxy-5-undecylphenol 34

Bang 3.2 So sánh phô NMR của AF 22 với 3-methoxy-5-octylphenol 36

Bảng 3.3 So sánh phô NMR của AF 18 với 2-hydroxy-5-methoxy ~3-nonylbenZzo- Ï ,4-QUInON€ - - 1x 2119 123 9E EEEEkkkggrrrrrrrrư 39 Bảng 3.4 So sánh phố NMR của hợp chất AF 19 với 5-(3-hydroxypropyl) -7-methoxy-3-methylbenzofuran-2-y])-3-methoxyphenol 42

Bảng 3.5 So sánh phố NMR của hợp chat AF 20 với 2,8-dihydroxy ~7-methoxy-3,9-diundecyldibenzofuran- l,4-dione - ‹ 44

Bảng 3.6 So sánh phô NMR của hợp chất AF 21 với 10-hydroxy-4 -Ó-methyl-2, I 1-diundecygomphilacfone -¿- 5c 25s + + + 47 Bảng 3.7 So sánh phô NMR của hợp chất AF 17 với 2,8,10-trihydroxy-6H-benzo[e]chromen-6-one -5+ 5-52 49 Bang 3.8 So sánh phô NMR của AF 7 với quercetin - 5+ +s<xccszxsee 52 Bang 3.9 So sánh phô NMR của hợp chat AF 8 với myricetin - 54

Bang 3.10 Phổ 'H, 'C-NMR của 3 hop chất flavonol -+- 55

Bảng 3.11 So sánh phé NMR của hợp chat AF 10 với isorhamnetin 57

Bảng 3.12 So sánh phô NMR của hợp chất AF 6 với spinasterol - 59

Bang 3.13 So sánh phé NMR của AF 23 với 2-methyl-5-nonylbenzene-1,3-diol 61

ix

Bang 3.14 So sánh phô NMR của AF 24 với methyl 3,4-dihydroxybenzoate 62

Bảng 3.15 So sánh phổ NMR của hợp chat AF 2 với acetovanilone 64

Bảng 3.16a Phé 'H-NMR một số hợp chất phenol được phân lập 65

Bảng 3.16b Phố !3C-NMR một số hợp chat phenol được phan lập 66

Bảng 3.17 So sánh phô NMR của hợp chất AF 1 với vanillic acid 68

Bang 3.18 So sánh phổ NMR của hợp chất AF 3 với protocatechuric acid 69

Bảng 3.19 So sánh phô NMR của hợp chất AF 4 với p-hydroxybenzoic acid 70

Bang 3.20 So sánh phô NMR của hợp chất AF 12 với methyl 4-hydroxy-3-methoxybenZOaf€ - cccs ssstsisiererrsrrres 71 Bang 3.21 So sánh phổ NMR của hợp chat AF 14 với methyl 3,5-dihydroxy-3-methoxybenzoaf€ - c1 vn vn 111 re 73 Bảng 3.22 So sánh phố NMR của hợp chất AF 15 với gallic acid 74

Bảng 3.23 So sánh phố NMR của hợp chất AF 13 với methyl 4-hydroxybenzoate -.-. -c -c << s+2 76 Bảng 3.24 So sánh phố NMR của hợp chất AF 11 với (25)-4-(n-hydroxyphenyl)bufanol - ác hs HH nh như 77 Bang 3.25 So sánh phô NMR của hợp chat AF 25 với với methyl /—orseÌÏinaf€ - - c1 21 112111211191 12 1111118111111 11811 kg 79 Bảng 3.26 So sánh phô NMR của hợp chất AF 26 với (+)-lIyoniresinol3œ-@—ZØ—D-—glucopyranoside ¿ - + + + s++ 82 Bang 3.27 So sánh phố NMR của hợp chất AF 27 với ursolic acid - 85 Bảng 3.28 Tỷ lệ phần trăm (%) gây độc tế bào MCF-7 và HeLa của các hợp chất

được phân lập từ cây sú trắng ccc 22222112222 sen 88

Bảng 3.29 Giá trị ICso (uM) gây độc một số tế bào ung thư của các hợp chất được

phân lập từ cây sú trang c c2 122 2 xe 89

Bang 3.30 Tỷ lệ phan trăm (%) bắt gốc tự do DPPH -5- 552: 91

Bang 3.31 Giá trị SCso qug/mL) bắt gốc tự do DPPH của các hợp chat được phan

lập từ cây sú trang c c2 T122 TT TT nàn 91

MỞ ĐẦU

Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đã và đang đóng góp những thành tựu quý báu cho ngành hóa học cũng như ngành sinh học và y được học Sự kết hợp những chứng cứ khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên

và hoạt tính sinh học đã góp phan củng cé và phát triển các bài thuốc y học cổ truyền một cách thuyết phục nhất.

Việt Nam có vị trí địa lý thuộc vùng nhiệt đới nóng âm, là điều kiện phát

triển hệ thực vật phong phú và đa dang Day cũng chính là lý do nền y học cổ truyền của nước ta phát triển mạnh Với vai trò nghiên cứu về hóa học các hợp chất thiên nhiên, chúng tôi mong muốn được đóng góp vào sự phát triển chung này.

Với hệ sinh thái phong phú và đa dạng, rừng ngập mặn Cần Giờ, TP HCM được công nhận là khu dự trữ sinh quyền rừng ngập mặn của thế giới Hệ thực vật rừng ngập mặn phát triển trong điều kiện của thời tiết, độ âm cao, thường xuyên chịu tác động lên xuống của thủy triều và có hệ côn trùng, vi sinh vật phong phú đa dạng đã thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học Đặc biệt, gần đây một sé hợp chat hữu cơ được phân lập từ các cây đặc trưng của rừng ngập mặn như: hợp chat phorbol ester được phân lập từ lá và thân cây giá (Excoecaria agallocha L.) có

tác dụng kháng HIV; polysaccaride có hoạt tính kháng HIV đã được phân lập từ lá của các cây vet trụ (Bruguiera cylindrica (L.) Blume), cây gia (Excoecaria agallocha

L.), cây đước đôi (Rhizophora apiculata BÌ.), cay đước xanh (Rhizophora mucronata

Poir in Lamk), cây sam biển (Sesuvium portulacastrum L.) hoặc Sueda maritima va Sueda monica; hợp chất benzoxazoline mà dẫn xuất đường ribose của nó cho thay có hoạt tính kháng ung thư va kháng virus được phân lập từ cây Ô rô (Acanthus

illicifolius L.)

Chi Aegiceras thuộc họ Sú (Aegicerataceae) bao gồm hai loài Aegiceras

corniculatum và Aegiceras floridum Đến nay, chỉ một loài Aegiceras corniculatum

đã được nghiên cứu về phân lập thành phần hoá học và thử nghiệm hoạt tính sinh học cho những kết quả khả quan Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học cho thấy cao methanol của lá cây Aegiceras corniculatum có hoạt tinh kháng sốt rét (ICso 29.3

ug/mL) Hai hợp chất 5-O-methylembelin và 5-O-ethylembelin, được phân lập từ thân, cành của loài Aegiceras corniculatum, có hoạt tính ức chế vai dong tế bao ung thư như HL-60, Bel7402, Hela, và Us37 với nồng độ ICso 0.1 đến 9.0 ug/mL.ÊÌ

Mục tiêu của luận án nhằm khảo sát thành phần hóa học của loài Aegiceras

floridum (họ Sú—Aegicerataceae) và thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào như HeLa

(ung thư cổ tử cung), MCF-7 (ung thư vú), NCI-H460 (ung thư phổi), HepG2 (ung

thư gan) và Jurkat (ung thư mau) cũng như hoạt tính kháng oxy hóa DPPH các hợp

chất được phân lập Kết quả nghiên cứu đóng góp thêm về đặc điểm “Hóa-Thực

vật” với loài cây cùng chi Aegiceras corniculatum.

CHƯƠNG 1 TONG QUAN

1.1 DAC TINH THUC VAT

Cây su trắng có tên khoa hoc 4egiceras floridum Roem & Schult., là một

Hình 1.1: Hình ảnh loài Aegiceras floridum

Ở Việt Nam, chi Aegiceras có hai loài là Aegiceras corniculatum (còn gọi là

sú đỏ) và Aegiceras floridum (còn gọi là st trăng) 2! 1

1.1.1 Mô tả thực vật

Cây su trắng (Aegiceras floridum) dạng tiểu mộc không lông Lá có phiến hình muỗng thường vào 5.5 x 2.7 cm, dày, cứng, không lông, bìa uốn xuống, gânphụ không rõ, 3—5 cặp, đáy từ từ hẹp thành cuống Chùm tụ tán ở ngọn nhánh, đàivặn, vành vặn, tiểu nhụy 5, bao phan có ngăn ngang thành nhiều buồng phụ Trái

khô, hột không phôi nhũ, mam mọc thành móc ngay (Hình 1.1) 7!

1.1.2 Phân bố

Cây su trắng mọc ở các vùng có độ mặn cao ở Philippines, Indonesia, Đông Malaysia và miền Nam Việt Nam.!*!

1.2 NGHIÊN CUU VE THÀNH PHAN HÓA HỌC

Cho đến nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam chưa có một công bố nào nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Aegiceras floridum (Su trắng).

Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của loài cây cùng chi, sú đỏ Aegiceras corniculatum đã được công bô.

Các nhóm chat quinone, flavonol, phenol, triterpene, sterol và một số dang

hợp chat khác đã được phan lập từ các bộ phan lá, thân cành và vỏ của loài cây A corniculatum Quinone, triterpene và flavonol là những nhóm hợp chất chính của

chi 4egiceras.Ll

* Hợp chất quinone

Năm 1989, ba dẫn xuất của 1,4-benzoquinone, rapanone

(2,5-dihydroxy-3-tridecyl-1,4-benzoquinone) (1), embelin

(2,5-dihydroxy-3-undecyl-1,4-benzoquinone) (2) và 5-O-methylembelin

(2-hydroxy-5-methoxy-3-undecyl-1,4-benzoquinone) (3) được phân lập từ thân và cành của A corniculatum.”! Sau đó,

vào nam 2004, sáu hydroquinone 5-O-ethylembelin (4), methylembelin (5), 2-dehydroxy-5-O-methylembelin (6), 3,7-dihydroxy-2,5-

2-O-acetyl-5-O-diundecylnaphthoquinone (7), diundecyldibenzofuran-1,4-dione (8), 2,8-dihydroxy-7-methoxy-3,9-

2,7-dihydroxy-8-methoxy-3,6-diundecyldibenzofuran-1,4-dione (9) cũng được phân lập từ thân va cành của A.

Tu vỏ cay A corniculatum, genin-A (18), aegiceradienol

(28-norolean-12,17-dien-3f-ol) (19) va aegiceradiol (3f,28-dihydroxy-olean-12,15-diene) (20) đã được

phan lập.!”°Ì Nam 2005, bốn dẫn xuất triterpene,

160-hydroxy-13,28-epoxyoleanan-3-one (21), protoprimulagenin (22), aegicerin (23), embelinone (24) cũng được

phân lập từ vỏ thân cây A corniculatum bởi nhóm tác giả Daojing Zhang.Í!9Ì Trước

đó, quá trình phân lập aegicerin (23) cũng được thực hiện từ vỏ cây A majus (đồng

danh của A corniculatum).""")

Năm 2012, arjunolic acid (25) và maslinic acid (26) được tach ra từ vỏ cây A.

corniculatfum.H?l

Năm 2017, nhóm tác giả L.B.Vinh Í?l đã phân lập được 4 hợp chất triterpene saponin từ lá A corniculatum, bao gồm aegicoroside A (27),

sakurasosaponin (28), sakurasosaponin methyl ester (29),

(36,16a,20a)-3,16,28-trihydroxyolean-12-en-29-oic acid

3-{Ó-Ø-p-glucopyranosyl-(1—>2)-Ó-[Ø-D-glucopyranosyl-(1—4)]-a-L-arabinopyranoside}(30) và oleanolc acid

/-D-Hình 1.3 Cau trúc hóa học các hợp chat triterpene

* Hợp chất flavonol

Isorhamnetin (quercetin-3'-methyl ether) (32) va dẫn xuất isorhamnetin

3-O-a-L-rhamnopyranosy]l-(1—>6)-Ø-D-glucopyranoside (33) được phan lập từ vỏ cay A.

corniculafumi.LT] L0

Từ cao ethyl acetate của lá 4 corniculatum, chin flavonol cũng được phân lập,

bao gồm rutin (34), nicotiflorin (35), isoquecitrin (36), quercitrin (37), isomyricitrin

(38), hyperoside (39), myricitroside (40), astragalin (41) va quercetin-3-D-xyloside (42) "71

Năm 2004, 2-methoxy-3-nonylresorcinol (43) và 3-undecylresorcinol (44) được

phân lập từ vỏ cây A corniculatum.! Sau đó, năm 2005, hai hợp chất syringic acid

(45) và gallic acid (46) cũng được phân lập từ vỏ của loài trên.!9l

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học các hợp chất sterol

* Các loại hợp chất khác

Năm 2004, hợp chat 10-hydroxy-4-O-methyl-2,11-diundecylgomphilactone

(49) đã được tách ra từ vỏ cây A corniculaum.lPÌ Năm 2012, nhóm tác giả M.

Gowri Ponnapalli !'3! đã phân lập các hợp chat mới isocorniculatolide A (50),

11-O-methylisocorniculatolide A (51), 11-O-methylcorniculatolide A (52) và hydroxy-11-O-methylcorniculatolide A (53) va corniculatolide A (54) từ vỏ cay A.

1.3 NGHIÊN CỨU VE DƯỢC TÍNH

Một số nghiên cứu dược tính loài 4egiceras corniculatum cho biết:

Ở Châu Á và Australia, cây A corniculafum đã được sử dụng như một loại thuốc truyền thống để trị các bệnh hen suyễn, huyết áp, tiểu đường và thấp khớp.

Một số nghiên cứu trước đây cho biết loài cây này có tác dụng chống tác nhân oxy

hóa, chữa trị bệnh ngứa, viêm nhiễm.!!°

Theo Võ Văn Chi, vỏ cây A corniculatum có tác dụng thuốc cá, có nơi dùng

vỏ hoặc lá nau nước súc miệng trị bướu cô [1Ì

Theo Edgardo Gomez và cộng su,!!5! hợp chất 5-O-methylembelin (3) có kha năng gây độc cho cá ở nồng độ 1 ppm trong khoảng thời gian 75 phút.

Theo Minjuan Xu và cộng sự,°Ì vỏ và hạt cây sử dụng dé trị bệnh vảy cá Các thử nghiệm in vitro cho thay 5-O-methylembelin (3) và 5-O-ethylembelin (4) có tác

dụng chống lại sự phát triển của các dòng tế bào HL-60, Belz4œ, Uo37 va Hela.

Colchicine (positive control) 1.6 0.4 0.1 01

Các triterpene như arjunolic acid (25) và maslinic acid (26) trong cây được sử

dụng dé chữa bệnh viêm nhiễm L1°Ì

Theo Sundaram Ravikumar,!'®! thử nghiệm in vitro ức chế ky sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum của cao trích cây A corniculatum cho kết quả cao nhất ở

nồng độ 150 pg/mL là 94.98 % gây độc tính Kết quả các thử nghiệm tương tự trên

4 phân đoạn cao acetone, chloroform, methanol, ethanol của cây A corniculatum

được thê hiện ở Bảng 1.2.

Bang 1.2: Kết quả thử nghiệm in vitro ức chế ký sinh trùng sốt rét của

các phân đoạn cao của A corniculatum ! 16]

À wo ko ros ` mm pO A :

Cao phân Phân trăm ức chê (%) ký sinh trùng sôt rét tại các nông độ (g/mL) Nồng độ

đoạn Cao

3.125 6.25 12.5 25 50 100 (ug/mL) (ug/mL) (ug/mL) (ug/mL) (ug/mL) (ug/mL) (ug/mL)

Acetone 0.00 0.00 0.00 2.90+0.09 12.98 +0.97 | 27.98+1.09 >100

Chloroform 0.00 3.05+0.84 | 7.87+2.98 23.9842.93 | 36.98+7.87 56.84+2.98 83.04+12.09

Ethanol 0.00 11.77+1.76 | 14.9845.29 | 17.9342.98 | 36.98+4.84 54.87+4.87 85.46+12.76

Chú ý: Kết quả thể hiện là kết quả trung bình của 3 lần thử.

Triterpene saponin sakurasosaponin (28) thê hiện khả năng gây độc rất mạnh

trên bốn dòng tế bào ung thư, bao gồm MCF-7 (ung thư vú), HCT116 (ung thu

ruột), BI6F10 (u ác tính) và A549 (ung thư biểu mô) Trong khi đó, sakurasosaponin methyl ester (29) chỉ gây độc hoạt tính mạnh đối với dòng tế bào MCF-7, A549 và HCT116 Giá trị nồng độ ICso của hai hợp chất trên thé hiện ở trong khoảng 2.89 + 0.02 đến 9.86 3 0.21 (uM).?I

Các hop chất quinone O-methylembelin (3), O-butylembelin (11) và O-methylrapanone (17) thé hiện khả năng gây độc đối với dòng tế bào HL-60 (ung

5-thư bach cầu), BGC-823 (ung 5-thư da dày) rất mạnh Giá trị nồng độ ICso khoảng 7.6 đến 10.6 (uM) Ngoài ra, 5-O-ethylembelin (4) cũng thể hiện khả năng gây độc mạnh đối với dòng tế bào A2780 (ung thư buồng trứng ở người) với ICso 10.58

(uM) |!

10

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIEM

2.1 HÓA CHÁT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất

* Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm:

ø-hexane (CaH¡4), chloroform (CHC]:), dichloromethane (CH›C]›), ethyl acetate

(CH:COOC;H:), acetone (CH3COCH3), methanol (CHạOH) là hóa chất Việt

Nam (Chemsol).

Nước cất (HaO) hai lần.

* NaaSOa (Trung Quốc).

* Thuốc thử: dé phát hiện các vết chất hữu cơ bằng sắc ky lớp mỏng, phun xịt

bang dung dich sulfuric acid 10 % va dung dịch vanilline/H2SO4 (hòa tan 2 g vanilline trong 100 mL ethanol 96°, thêm từ từ can thận 2 mL H2SOs)

+ Silica gel 60 (0.04-0.06 mm) (Himedia, Merck) dùng cho sắc ký cột.

* Sac ký bang mỏng TLC loại Kiesel gel 60F2s4 (Merck).

* Sephadex LH-20 (Ge Healthcare).

* Dong tế bao ung thu cổ tử cung Hela, ung thư vú MCF-7 được lưu giữ trong

nitrogen lỏng (-196 °C và được bảo quan tai Phong Thí nghiệm Sinh học phân

tu—B6 môn Di truyén (Khoa Sinh hoc—Truong Đại hoc Khoa học Tự nhiên, Đại hoc

Quốc gia TP HCM).

* Các dòng tế bào ung thư do công ty American Type Culture Collection (ATCC) (Hoa Kỳ) cung cấp, được nuôi cấy trong môi trường E’MEM có bé sung

L-glutamine (2 mM), HEPES (20 mM), amphotericin B (0,025 g/mL), penicillin

G (100 UI/mL), streptomycin (100 pg/mL), 10% (v/v) huyết thanh bao thai bò FBS

* Máy lắc ngang Ika.

* Các loại cân điện tử, cân kỹ thuật, cân phân tích (4 chữ số)

* Thiết bị ghi phổ:

* Pho 'H-NMR, !3C—NMR và 2D-NMR được ghi trên máy cộng hưởng từ

hạt nhân Bruker Avance III 500 MHz (Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM) và Varian Mercury Plus

400 MHz (Khoa Khoa học, Trường Dai học Chulalongkorn, Thailand).

* Pho khối MS: khối phổ phân giải cao (HR—ESI-MS) được ghi bởi thiết bị

MicrOTOF-Q ghép LC—Agilent 1100 LC—MSD Trap (Phòng thí nghiệm Phân

tích Trung tâm, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM) và khối phổ phân giải thấp (ESI-MS) được ghi bởi thiết bị MSQ plus

Mass.

* Độ hấp thu quang được ghi trên quang phổ kế tử ngoại Spectrophotometer DR

2000 (phòng thí nghiệm Sinh hoc phân tử, bộ môn Sinh học phân tử, khoa Sinh,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM).

* Máy đo độ hap thu quang (Elisa Multiskan Ascent).

* Dia 96 giếng.

12

* Các dụng cụ thông thường khác như: pippetman, ependorf, đầu tip, falcol.

* Thiết bị đo năng lực trién quang: trién quang kế Kriiss-Germany (Phòng thí nghiệm Hợp chất Tự nhiên và Hóa dược, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM).

Một mẫu cây ép khô ký hiệu số US—B016, được lưu trong bộ lưu giữ tiêu

bản thực vật tại bộ môn Hóa hữu cơ, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM.

2.2.2 Thu hái mẫu

Lá tươi và vỏ thân cây sú trắng được thu hái ở rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp.

Hồ Chí Minh, vào tháng 6 năm 2014 Lá cây tươi sau khi thu hái loại bỏ những lá

sâu bệnh, vàng úa, rửa sạch, để ráo,

La tươi và vỏ thân được sây ở nhiệt độ 45—50 °C cho đến khô, sau đó xay

nhuyễn thành bột dé làm nguyên liệu cho nghiên cứu.

2.3 DIEU CHE CÁC LOẠI CAO

2.3.1 Điều chế cao thô methanol từ lá

Bột khô của lá cây sú trắng Aegiceras floridum (15.5 kg) được trích kiệt bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi methanol ở nhiệt độ phòng (21 Lit x 3 lần) Lọc phần dịch trích, cô quay và thu hồi dung môi Thực hiện nhiều lần, thu được cao thô

methanol (1,500.0 ø) Sử dụng phương pháp trích lỏng-lỏng trên cao thô methanol

lần lượt bằng các đơn dung môi với độ phân cực tăng dần n-hexane va ethyl acetate Phần còn lại tan trong nước được làm khan đến khối lượng không đổi, sau

đó thêm methanol vào phần cô đặc nay, dé lang, loc lấy phần dung dịch, thu hồi dung môi thu được cao methanol và phần cặn còn lại không tan trong methanol bị

13

loại bỏ Các dịch trích thu được cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, kết quả

thu được là 3 loại cao tương ứng.

Toàn bộ quy trình điều chế các loại cao từ lá sú trăng được tóm tắt ở Sơ đồ

2.1 Khối lượng và thu suất các loại cao thu được tính trên khối lượng nguyên liệu

khô ban đầu được trình bày trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Khôi lượng và thu suât các loại cao của lá và vỏ thân của

cao thô methanol

Cao methanol 650.0 43.33 500.0 52.63 Tổng 1250.0 83.33 900.0 94.74

14

2.3.2 Điều chế cao thô methanol từ vỏ thân

Bột khô của vỏ thân cây sú trắng Aegiceras floridum (20.5 kg) được trích kiệt bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi methanol ở nhiệt độ phòng (30 Lit x 3

lần) Lọc phần dịch trích, cô quay và thu hồi dung môi Thực hiện nhiều lần, thu được

cao thô methanol (950.0 g) Sử dụng phương pháp trích lỏng-lỏng trên cao thô

methanol lần lượt bằng các đơn dung môi với độ phân cực tăng dan: z-hexane va ethyl acetate Phần còn lai tan trong nước được làm khan đến khối lượng không đi, sau đó thêm methanol vào phan cô đặc này, dé lắng, lọc lay phan dịch, thu hồi dung môi thu được cao methanol và phần cặn còn lại không tan trong methanol bị loại bỏ.

Các dịch trích thu được được cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, kết qua

thu được là 3 loại cao tương ứng.

Toản bộ quy trình điều chế các loại cao được tóm tắt ở Sơ đồ 2.2 Khối lượng và thu suất các loại cao thu được tính trên khối lượng cao thô methanol ban đầu được trình bày trong Bảng 2.1.

15

LÁ CÂY TƯƠI

— Rửa sạch, sấy khô, xay nhuyễn

BỘT LÁ KHÔ

(15.5 kg)

— Ngâm dam trích kiệt với methanol

— Lọc, cô quay thu hôi dung môi

CAO THÔ METHANOL

— Trích lỏng-lỏng với ethyl acetate

— Cô quay thu hôi dung môi

(650 g)

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế các loại cao của lá su trắng

16

VỎ THÂN TƯƠI

— Say khô, xay nhuyễn

BỘT VỎ THÂN KHÔ

(20.5 kg)

— Ngâm dam trích kiệt với methanol

— Lọc, cô quay thu hôi dung môi

CAO THÔ METHANOL

— Trích lỏng-lỏng với ethyl acetate

— Cô quay thu hôi dung môi

2.4 LY TRÍCH VÀ PHAN LẬP CÁC HỢP CHAT HỮU CƠ

Bằng phương pháp sắc ký cột pha thường trên các cao trích thu được để phân tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau Tiếp tục sắc ký trên các phân

đoạn thu được, với hệ dung môi giải ly phù hợp Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng

phương pháp sắc ký lớp mỏng, kết hop soi đèn UV2s4 và hiện vết bang dung dich HaSO¿ 10 % hoặc vanilline/HaSOx có gia nhiệt bản mỏng đến 105 °C Sử dụng

phương pháp sắc ký gel (hạt gel Sephadex LH-20) kết hợp với sắc ký cột silica gel

pha thường dé nâng cao hiệu quả phân lập các hợp chat trong các phân đoạn.

Theo sơ đồ 2.1 và sơ đồ 2.2, từ cao thô methanol lá và vỏ thân sú trắng thu được lần lượt ba cao ø-hexane, cao ethyl acetate và cao methanol tương ứng với mỗi nguyên liệu ban đầu.

2.4.1 Phân lập hợp chat từ cao ø—-hexane của lá cây su trắng

Trong quá trình thực nghiệm, lá cây sú trắng được nghiên cứu trước vỏ thân Cao n—hexane của lá được chọn nghiên cứu đầu tiên.

Tiến hành sắc ký cột silica gel trên cao n—hexane (150.0 g) với hệ dung môi

n—hexane-ethy] acetate (từ 99 : 1 đến 0 : 1) thu được 7 phân đoạn Fh.I-Fh.7.

Khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng ba phân đoạn Fh.1-Fh.3 cho biết các phân đoạn này chứa nhiều chất béo và nhiều chất màu không phân cực Tương tự phân đoạn Fh.7 có vết kéo dài chồng chập Do đó, các phân đoạn này không được tiến

hành sắc ký cột silica gel.

Thực hiện sắc ký cột silica gel trên phân đoạn Fh.4-Fh.6 giải ly với hệ dung

môi n—hexane-ethyl acetate (từ 95:5 đến 3 : 7), thu được các phân đoạn nhỏ tương

ứng Tuy nhiên qua quá trình sắc ký nhiều lần trên các phân đoạn thu được từ cao n-hexane của lá không thu được kết quả Nguyên nhân có thé do các phân đoạn chứa nhiều chất màu chlorophyll Sau khi loại bỏ chlorophyll, khối lượng các phân

đoạn thu được ít, sau đó kiểm tra trên sắc ký bản mỏng xuất hiện các vết tương tự

các vết trên bảng sắc ký lớp mỏng khảo sát của cao ethyl acetate Có thé trong giai

đoạn phân các loại cao từ cao thô methanol bằng phương pháp trích lỏng-lỏng

không hiệu quả dẫn đến hiện tượng các chất tương tự đều hiện điện trong hai cao n—

18

hexane và cao ethyl acetate Ngoài ra, phân đoạn của n-hexane thê hiện khá ít vết hợp chất thiên nhiên trên bản sắc ký bản mỏng Vì những lý do trên, tác giả không khảo sát tiếp các phân đoạn còn lại từ cao n—hexane mà chuyền sang phân lập các

chat của cao ethyl acetate Kết quả, từ cao n—hexane của lá st trắng không phân lập

được hợp chất nào Một số phân đoạn sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2 Kết quả sắc ký cột cao n-hexane lá st trắng (150.0 g)

Phân Dung môi Khối lượng Kết quả eos

doan giải ly (g) SKLM Ghi chú

Fhl | H-EA (99:1) 8.0 Nhiều vết keys ca ek TẾ

Fh2 | H-EA (95:5) 117 màu kém | hiểu chất háo và nhiều chât

Fh.3 H-EA (9:1) 15.3 phân cực

Fh4 | H-EA(73) 25.0 Nhiều vết Nhiều chlorophyll và các vết

Fh.5 H-EA (1:1) 23.5 mau xanh chat tương tự các vet cao ethyl Fh.6 H-EA (3:7) 17.5 acetate

Fh7 | H-BA (0:1) 25.0 Vet kéo dài Chưa khảo sát

chông chập (H — n-hexane; EA—ethyl acetate)

2.4.2 Phan lập hợp chat từ cao ethyl acetate của lá cây sú trắng

Tiến hành sắc ký cột silica gel trên cao ethyl acetate (450.0 g) với hệ dung môi n-hexane-ethyl acetate (từ 10 : 0 đến 0 : 1) thu được 8 phân đoạn Fea.I-Fea.8,

sau đó giải ly với hệ dung môi ethyl acetate-methanol (9:1) thu được phân đoạn

Fea.9 Tiếp tục thực hiện sắc ký cột nhiều lần trên những phân đoạn khác nhau theo

hệ dung môi phù hợp đã phân lập được 13 hợp chất hữu cơ tinh sạch.

Thực hiện sắc ký cột silica gel trên phân đoạn Fea.2 (65.7 g) giải ly với hệ dung môi ø-hexane-ethyl acetate (từ 9:1 đến 3 : 7), thu được 7 phân đoạn nhỏ, Fea2.1— Fea2.7 Tiếp tục thực hiện sắc kí cột silica gel nhiều lần với các hệ dung môi chloroform-methanol (100:0 đến 99:1) giải ly trên phân đoạn Fea.2.3 (4.5 g) đã

cô lập được hai hợp chat, kí hiệu là AF 2 (8.0 mg) va AF 6 (6.5 mg).

Tương tự, thực hiện sắc kí cột silica gel trên phân đoạn Fea.5 (53.5 g) giải ly với hệ dung môi ø-hexane-ethyl acetate (từ 8:2 đến 0 : 1) thu được 9 phân đoạn

nhỏ, Fea.5.1 — Fea.5.9 Tiếp tục thực hiện sắc kí cột silica gel nhiều lần với các hệ

19

dung môi chloroform-methanol (100:0 đến 80:20) giải ly trên phân đoạn Fea.5.3 (5.5 g) đã cô lập được hai hợp chất, kí hiệu là AF 1 (8.0 mg) va AF 4 (9.0 mg).

Tương tự sử dụng hệ dung môi chloroform-methanol (9:1 đến 7:3) thực hiện sắc kí cột silica gel nhiều lần trên phân đoạn Fea.5.5 (7.0 g) đã phân lập được hai hợp

chất AF 3 (6.0 mg) và AE 7 (11.0 mg).

Thực hiện sắc kí cột silica gel trên phân đoạn Fea.3 (35.3 g) giải ly với hệ dung môi n-hexane-ethyl acetate (từ 9:1 đến 0 : 1) và hệ dung môi ethyl acetate— methanol (từ 95:5 đến 7:3) thu được 8 phân đoạn nhỏ, Fea.3.1—Fea.3.8 Tiếp tục thực hiện sắc kí cột silica gel nhiều lần với các hệ dung môi chloroform—methanol

(100:0 đến 85:15) giải ly trên phân đoạn Fea.3.1 (3.5 g) đã cô lập được ba hợp chat,

kí hiệu là AF 11 (9.5 mg), AF 12 (8.5 mg) và AF 13 (5.5 mg) Tương tự từ phân

đoạn Fea.3.3 (2.5 g) đã phân lập được một hợp chat AF 10 (11.2 mg).

Thực hiện sắc kí cột silica gel trên phân đoạn Fea.6 (27.5 g) giải ly với hệ

dung môi n-hexane-ethyl acetate (từ 8:2 đến 0 : 1) và hệ dung môi ethyl acetate— methanol (từ 95:5 đến 5:5) thu được 10 phân đoạn nhỏ, Fea.6.1—Fea.6.10 Tiếp tục thực hiện sắc kí cột silica gel nhiều lần với các hệ dung môi chloroform-methanol

(100:0 đến 75:25) giải ly trên phân đoạn Fea.6.2 (2.2 g) đã phân lập được hai hợp

chất AF 8 (11.3 mg) và AF 14 (14.5 mg) Tương tự từ phân đoạn Fea.6.5 (1.5 g) đã phân lập được hợp chat AF 15 (16.5 mg) với các hệ dung môi chloroform—methanol (95:5 đến 6:4) Các kết quả được trình bày trong Sơ đồ 2.3 và Bảng 2.3.

2.4.3 Phân lập hợp chat từ cao n—hexane của vỏ thân cây sú trắng

Tiến hành sắc ký cột silica gel trên cao ø-hexane với hệ dung môi n—hexane—chloroform (từ 9 : 1 đến 0 : 10) thu được 6 phân đoạn (H.1-H.6), sau đó giải ly với hệ dung môi chloroform —methanol (9:1) thu được phân đoạn H.7 Tiếp tục thực hiện sắc ký cột nhiều lần trên những phân đoạn khác nhau theo hệ dung môi phù hop đã phân được 7 hợp chất hữu co, ký hiệu AF 16 đến AF 22.

Phân đoạn H.3 (20.5 g) tiếp tục được sắc ký cột với hệ dung môi n-hexane-chloroform theo tỉ lệ tăng dần từ 9:1 đến 3:7 thu được 7 phân đoạn

H.3.1-H.3.7 Tiến hành sắc ký cột phân đoạn H.3.3 (2.5 g) với Sephadex LH-20,

20

giải ly bằng hệ dung môi chloroform-methanol (1:1) thu được 3 phân đoạn, H.3.3.1-H.3.3.3 Tiếp tục, sắc ký cột phân đoạn H.3.3.2 (350 mg) với hệ dung môi chloroform-methanol từ 99:1 đến 97:3 thu được bốn hợp chat AF 16 (1.5 mg), AF

18 (6.5 mg), AF 19 (6.5 mg) và AF 20 (9.0 mg) Thực hiện sắc ký cột tương tự đối

với phân đoạn H.3.3.1 (125 mg) thu được hợp chat AF 22 (2.0 mg).

Phân đoạn H.5 (18.5 g) được tiến hành sắc ký cột với Sephadex LH-20, giải

ly bang hệ dung môi chloroform-methanol (1:1) thu được 8 phân đoạn H.5.8) Thực hiện sắc ký cột tương tự cho phân đoạn H.5.1 thu được 3 phân đoạn H.5.1.1-H.5.1.3 Tiếp tục với phân đoạn H.5.1.3 (2.0 g) được 3 phân đoạn nhỏ FI-F3 Từ F2 (125 mg) sắc ký cột với hệ dung môi chloroform—methanol từ 98:2 đến 93:7 thu được hai hợp chất AF 17 (2.0 mg) va AF 21 (9.5 mg) Các kết quả được trình bày trong Sơ đồ 2.4 và các Bảng 2.4.

(H.5.1-21

Bang 2.3 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate lá st trắng (450.0 g)

Phân | Dungmôi | Khối lượng Kết quả take

đoạn giải ly (g) SKLM Ghi chú

Feal | H-EA(9:1) 14.0 Nhiều vết Chưa khảo sát

; kus Khao sát thu được 2 hợp chat:

Fea2 | H-EA (8:2) 65.7 Vet rõ AF 2 (8.0 mg) và AF 6 (6.5 mg)

Khao sát thu được 4 hop chat:

` ge AF 10 (11.2 mg), AF 11 (9.5

Fea3 | H-EA(7:3) 35.3 Vết rõ mg), AF 12 (8.5 mg), AF 13 (5.5

- mg)

Fea4 | H-EA(73) 35.0 Nhiéu vêt Chưa khảo sát

Khảo sát thu được 4 hợp chất:

Fea9 | EA-M(:1) 71.8 Nhiều vết Chưa khảo sát

(H — n-hexane; EA—ethyl acetate; M—methanol)

Bảng 2.4 Kết quả sắc ký cột cao n-hexane vỏ than su trắng (150.0 g)

Phân Dung môi Khôi lượn Ket qua oe

doan giải ly (g)_ “| SKIM Ghi chú

H.1 H-C (9:1) 9.5 Nhiều vết Chưa khảo sát

H2 | HC(8:2) 16.7 Vếtrp | Khảosát nung không phân lập

lược chât Khảo sát thu được 5 hợp chất:

koe AF 16 (1.5 mg), AF 18 (6.5

H3 | HC(73) 20.5 Vếtõ | m2 AE \ (6 SN AF 3ù (0.0

mg), AF 22 (2.0 mg)

H.4 H-C (1:1) 16.8 Nhiều vết Đang khảo sát

Khảo sát thu được 2 hợp chất: H.5 H-C (3:7) 18.5 Vết rõ AF 17 (2.0 mg), AF 21 (9.5

mg).

H.6 | HC(01) 17.4 Nhiều vết | Khảo sát hưng không phân lập

ược chât

H7 | CM(]) 31.1 Nhiều vết Chưa khảo sát

(H—ø6-hexane; C — chloroform; M—methanol)

22

Sơ đồ 2.3 Quy trình phân lập hợp chat từ cao ethyl acetate lá su trắng

O-M (75:25)

AEB AF14 (

(11.3 mg) Ệ (14.5 mg) (16.5 mg)

23

Sơ đồ 2.4 Quy trình phân lập hợp chất từ cao n-hexane vỏ than sú trắng

24

2.4.4 Phân lập chất từ cao ethyl acetate của vỏ thân cây st trắng

Tiến hành sắc ký cột silica gel trên cao ethyl acetate (250 g), giải ly với hệ dung môi n—hexane-ethyl acetate theo tỉ lệ thể tích tăng dan từ 9:1 đến 0:10 thu

được 7 phân đoạn (EA.I-EA.7), sau đó giải ly với hệ dung môi ethyl acetate—

methanol (9:1) thu được phân đoạn EA.8.

Phân đoạn EA.2 (21.5 g) tiếp tục được sắc ký cột với hệ dung môi

n-hexane-ethyl acetate theo tỉ lệ tăng dần từ 9:1 đến 3:7 thu được 7 phân đoạn

(EA.2.I-EA.2.7) Tiến hành sắc ký cột phân đoạn EA.2.2 (2.1 g) với Sephadex LH-20, giải ly bằng hệ dung môi chloroform—methanol (1:1) thu được 4 phân đoạn nhỏ (EA.2.2.1-EA.2.2.4) Tiếp tục, sắc ký cột phân đoạn EA.2.2.2 (350 mg) với hệ dung môi chloroform-methanol từ 99:1 đến 92:8, thu được hai hop chất AF 23 (4.5 mg) và AF 24 (15.5 mg) Các kết quả được trình bày trong Sơ đồ 2.5 và Bảng

2.5.

Phân đoạn EA.3 (25.5 g) được sắc ký cột với hệ dung môi n—hexane-ethyl acetate theo tỉ lệ tăng dần từ 75 : 25 đến 6 : 4 thu được 6 phân đoạn (EA.3.I-EA.3.6) Tiến hành sắc ký cột phân đoạn EA.3.1 (1.9 g) với Sephadex LH-20, giải ly bằng hệ dung môi chloroform—methanol (1:1) thu được 4 phân đoạn

nhỏ EA.3.1.1-EA.3.1.4 Tiếp tục, sắc ký cột phân đoạn EA.3.1.2 (150 mg) với hệ

dung môi chloroform-methanol 98 : 2 thu được hai hợp chất AF 25 (7.5 mg) và

AF 27 (11.5 mg) Các kết quả được trình bày trong Sơ đồ 2.5 va Bảng 2.5.

Phân đoạn EA.6 (25.1 g) được sắc ký cột với hệ dung môi n—hexane-—ethyl

acetate theo tỉ lệ tăng dan từ 6 : 4 đến 0: 1 thu được 7 phân đoạn (EA.6.1—EA.6.7).

Tiến hành sắc ký cột phân đoạn EA.6.3 (1.7 g) voi Sephadex LH-20, giải ly bằng

hệ dung môi chloroform-methanol (1:1) thu được 6 phân đoạn nhỏ

EA.6.3.1-EA.6.3.6 Tiếp tục, sắc ký cột phân đoạn EA.6.3.2 (125 mg) với hệ dung môi chloroform-methanol 80 : 20 đến 70 : 30 thu được hợp chất AF 26 (8.0 mg) Các kết quả được trình bày trong Sơ đồ 2.5 và Bảng 2.5.

25

Bảng 2.5 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate vỏ thân sú trăng (250.0 g)

Phân Dung môi Khôi lượn Kêt quả oe

doan giải ly (g)_ “| SKIM Ghỉ chú

EA.1 | H-EA (9:1) 18.3 Nhiều vết Chưa khảo sát

Khảo sát thu được 2 hợp chất:

kon Khao sát thu được hợp chat:

EA.6 | H-EA (3:7) 25.1 Vắt rõ AF 26 (8.0 img),

EA.7 | H-EA(0:1) 32.9 Nhiéu vét Chưa khảo sát

EA.8 | EA-M(:]) 45.2 Nhiều vết Chưa khảo sát

(H — n-hexane; EA-ethyl acetate; M—methanol)

26

Sơ đồ 2.5 Quy trình phân lập hợp chat từ cao ethyl acetate vỏ thân sú trang

Sephadex’ LH-20,

O-—M (1:1¥

EA.6.3.2

(125.0 mg)

2.5 THỨ NGHIEM HOAT TÍNH GAY ĐỘC TE BAO UNG THU

Hoạt tính gây độc tế bao trên các dòng tế bao HeLa (ung thu cổ tử cung), MCF? (ung thư vú), NCI-H460 (ung thư phổi), HepG2 (ung thu gan) va Jurkat (ung thư máu) được thử nghiệm trên các hợp chất tinh sạch phân lập được đánh giá kết quả bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB).H7Iö738]

2.5.1 Nguyên tắc

Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản

và nhạy dé xác định độc tính tế bao trong thử nghiệm SRB là một thuốc nhuộm tích

điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết tao màu sẽ phan ánh lượng protein tổng của tế bao [71

Trong thử nghiệm, tế bảo được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó, SRB

27

liên kết với protein tế bào được hịa tan tạo dung dịch trong suốt cĩ màu hồng Mật

độ quang đo được của dung dich tương quan với lượng protein tơng hay thé hiện số

lượng tế bào sơng sĩt Sự thay đổi lượng tế bao so với mau chứng phan ánh độc tính

tế bào của chất nghiên cứu.

2.5.2 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB

Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB được

trình bày trong Sơ đồ 2.6

2.5.3 Thiết kế khảo sát

* Một mẫu chứng dương: tế bào với camptothecin ở nồng độ 0,01 ug/mL.

+ Một mẫu chứng âm: tế bào với dung mơi hịa tan chat thử (DMSO 0,25 %).

* Các mau cần thử nghiệm hoạt tính gây độc.

* Thiết kế thử nghiệm của một mẫu bao gồm hai giếng tế bào cĩ mơi trường nuơi

cấy chất thử ở nồng độ khảo sát và hai giếng khơng cĩ tế bào cĩ mơi trường nuơi cấy chất thử ở nồng độ khảo sát (hai giếng blank).

+ Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình.

2.5.4 Xử lý kết quả

* Xác định phan trăm gây độc tế bào

Sau khi cĩ giá trị mật độ quang ở bước sĩng 492 nm và 620 nm (ký hiệu là ODà¿ và ODe20):

* Tính giá tri OD = ODa92 — ODaso (1)

* Tính ODao¿ (hoặc OD620) = OD» — ODplank (2)

* Tinh tỉ lệ (%) gây độc tế bao theo cơng thức:

OD

%1= (I

Cc

)x 100 %

Với: ODw: giá tri OD của giếng cĩ chứa tế bao

ODulam: giá trị OD của giếng blank (khơng cĩ tế bào)

OD: giá tri OD của mẫu thử tình từ cơng thức (1) và (2) OD.: giá tri OD của mẫu chứng (control) tình từ cơng thức (1) và (2)

28