Tóm tắt luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò hoạt tính sinh học một số dẫn xuất của axit ursolic tách chiết từ cây sơn trà poilan (eriobotrya poilanei)

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Cơng trình hồn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN VĂN HÀ Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THANH TÂM NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THĂM DỊ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA AXIT URSOLIC TÁCH CHIẾT TỪ CÂY SƠN TRÀ POILAN (ERIOBOTRYA POILANEI) Phản biện 1: GS.TS.NGND ĐÀO HÙNG CƯỜNG Phản biện 2: GS.TSKH NGUYỄN BIN Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số: 60.44.27 Luận văn ñược bảo vệ trước Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 26 tháng năm 2011 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin- Học liệu, Đại học Đà Nẵng Đà Nẵng - Năm 2011 - Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng MỞ ĐẦU Đối tượng phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu Lý chọn ñề tài Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ xã hội loài người, bệnh nguy hiểm ung thư, viêm gan B gia tăng cách đáng báo động Việc tìm kiếm hợp chất có hoạt tính cao, phương pháp chữa bệnh ngày trở nên cần -Mẫu Sơn Trà Poilan -Các dẫn xuất amin, amit * Phạm vi nghiên cứu thiết Nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính ứng dụng vào -Thu hái mẫu thực vật Chiết tách, tinh chế axit ursolic thực tế ñể sản xuất thuốc phòng chữa bệnh Điều chế dẫn xuất -Tổng hợp dẫn xuất từ axit ursolic tách từ chất có hoạt tính phân lập từ nguồn thực vật với hàm lượng lớn đường hiệu để tìm kiếm chất có hoạt -Thử hoạt tính sinh học chất tổng hợp ñược Phương pháp nghiên cứu tính sinh học cao lý thú Axit ursolic tritecpen tồn phổ biến nhiều Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài loài thực vật khác Axit ursolic dẫn xuất có tác dụng hỗ Trong khn khổ đề tài này, chúng tơi sử dụng axit ursolic trợ chữa bệnh ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng HIV tách ñược từ Sơn Trà Poilan ñể tiến hành nghiên cứu tổng hợp thành phần mỹ phẩm để phịng ngừa chống lại bệnh số dẫn xuất nhằm tìm kiếm chất có hoạt tính lý thú, từ ung thư da Nhật Bản tìm thuốc phịng chữa bệnh ñể nâng cao sức Khi nghiên cứu thành phần hóa học Sơn Trà Poilan khỏe, sống người Vì vậy, kết đề tài có ý Việt Nam, chúng tơi ñã phân lập ñược axit ursolic với hàm lượng nghĩa khoa học thực tiễn cao (0.32% so với mẫu khơ) Vì vậy, để tận dụng nguồn ngun liệu Cấu trúc luận văn góp phần tìm kiếm dẫn xuất có hoạt tính lý thú axit ursolic, ñề tài ñịnh hướng tổng hợp số dẫn xuất amin, amit vào nhóm hydroxy vị trí C-3 carboxyl C-28 Phần mở ñầu gồm 03 trang, kết luận gồm 01 trang tài liệu tham khảo 09 trang Nội dung luận văn chia làm chương: Chương 1: Tổng quan- 35 trang Mục đích đề tài -Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất amin, amit -Nghiên cứu hoạt tính sinh học chất tổng hợp ñược Chương 2: Thực nghiệm- 09 trang Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận- 27 trang CHƯƠNG phẩm, thảo dược loài thực vật khác táo, húng quế, bạc hà, TỔNG QUAN oải hương, mận [43], [68] 1.1 CÁC HỢP CHẤT TRITECPEN 1.1.1 Khái niệm chung 1.1.2 Một số khung tritecpen 1.1.2.1 Tritecpen mạch thẳng 1.1.2.2 Tritecpen khung dammaran 1.1.2.3 Tritecpen khung hopan 1.1.2.4 Tritecpen khung lupan 1.1.2.5 Tritecpen khung oleanan Axit Ursolic 74 1.1.2.6 Tritecpen khung friedelan 1.1.2.7 Tritecpen khung taraxeran (friedooleanan) 1.1.3 Sinh tổng hợp tritecpen 1.1.4 Hoạt tính sinh học 1.1.4.1 Hoạt tính chống ung thư khối u 1.1.4.2 Hoạt tính chống vi rút kháng khuẩn Các nghiên cứu dược lý ñã axit ursolic thể phổ hoạt tính đa dạng như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm nhiễm, bảo vệ gan, chống lại tế bào ung thư khối u Axit ursolic có khả ngăn chặn ức chế tạo u ung thư giai ñoạn khác nhiều loại ung thư vú, gan, ruột Do tồn nhiều tự nhiên từ nhiều nguồn khác 1.1.4.3 Hoạt tính chống viêm 1.1.5 Một số nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất có nhiều hoạt tính lý thú nên axit ursolic ñược sử dụng làm nguyên liệu ñầu ñể tổng hợp nhiều dẫn xuất có hoạt tính mạnh tritecpen 1.2 TỔNG QUAN VỀ AXIT URSOLIC VÀ CÁC DẪN XUẤT CỦA NÓ 1.2.2 Một số nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất axit ursolic 1.2.1 Axit ursolic Tồn rộng rãi tự nhiên với hàm lượng cao, có Axit ursolic ( axit 3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic, AU) (74) nhiều hoạt tính thú vị, nhiều dẫn xuất axit ursolic có hoạt cịn gọi urson, prunol, micro-merol , tritecpen khơng tính lý thú tổng hợp Sự chuyển hóa nhóm chức độc, chất rắn dạng bột, màu trắng, có cơng thức phân tử C30H48O3 hydroxyl C-3 nhóm cacboxyl C-17 axit ursolic tạo thành kết tinh cồn tuyệt đối Nó tồn nhiều thực dãy dẫn xuất có hoạt tính sinh học lý thú Các sản phẩm từ phản ứng axetyl hóa nhóm hydroxyl amit hóa nhóm cacboxylic axit ursolic có hoạt tính sinh học cao so với axit ursolic Hai hợp chất este hóa với nhóm isopropyl C17-COOH nhóm succinyl C3-OH axit ursolic thể hoạt tính độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt NTUB1 người với giá trị IC50 7.97 µM 8.65 µM [62] Những biến đổi hóa học vịng A axit ursolic tạo hệ liên hợp 1-en-2-cyano-3-one hay 1-en-2-trifluoro-3-one dẫn xuất ñều cho thấy khả ức chế mạnh sinh trưởng dòng tế bào ung thư: KU7, 253JB-V (ung thư bàng quang) Panc-1 Panc-28 (ung thư tuyến tụy) [18] Hay dẫn xuất 5β-(1-methyl2-ethyl)-10α-(3-aminopropy-l)des-A-urs-12-en-28-oic acid thể hoạt tính độc tế bào dịng tế bào ung thư tuyến tiền liệt – Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam xác ñịnh tên khoa học *Chiết mẫu thực vật phân lập axit ursolic Mẫu (1800g) ñược sấy khô, nghiền nhỏ ngâm chiết lần hỗn hợp metanol:nước (85:15) nhiệt độ phịng Sau cất loại dung mơi áp suất giảm, dịch nước cịn lại chiết với dung mơi n-hexan, etyl axetat, n-butanol Cất loại dung môi áp suất giảm thu ñược cặn dịch chiết tương ứng với khối lượng 12, 110 130g 50 g dịch chiết EtOAc ñược ñưa lên cột silicagel, giải hấp hỗn hợp n-hexan: EtOAc với tỉ lệ EtOAc tăng từ 50 đến 100%, sau hỗn hợp EtOAc:MeOH với tỉ lệ MeOH tăng từ ñến 50% thu ñược 20 phân ñoạn NRP.152 với nồng ñộ ức chế IC50=3.3µM [22] Sự biến đổi hóa Các phân đoạn 1- 10 xuất kết tủa bột màu trắng, chúng học kết hợp vòng A vòng C axit ursolic tạo hợp chất tơi lọc hút, lấy phần chất rắn rửa nhiều lần với n-hexan, thu bis-enone có khả ức chế hình thành nitric oxit (NO) với nồng ñược 11,7g bột, ký hiệu EPE1, cho vệt mỏng phân ñộ ức chế tương ứng IC50=5.1 µM [55] tích, hỗn hợp chứa chất phổ 1H-NMR Vì CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 CHIẾT TÁCH AXIT URSOLIC ñể tăng khả phân tách hỗn hợp chúng tơi tiến hành phản ứng axetyl hóa EPE1 Tinh chế sản phẩm axetyl hóa cột silicagel với hệ dung mơi n-hexan: EtOAc = 92:8 thu hai chất axit 3β-axetyl ursolic axit 3β-axetyl pomolic Thủy phân sản phẩm axit 3β-axetyl ursolic với NaOH 4N thu ñựợc 5,8 g axit * Mẫu thực vật ursolic (hàm lượng 0.32% so với mẫu khơ) (Hình 2.1) Mẫu Sơn Trà Poilan rừng quốc gia Bì Dúp, Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng vào tháng năm 2009 TS Đỗ Tiến Hiệp 2.2 TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT Ở VỊ TRÍ C3-OH CỦA Lá E poilanei (1,8 kg) AXIT URSOLIC Phơi khô, nghiền nhỏ Ngâm chiết MeOH : H2O (85:15) to phòng Cất quay chân không, loại metanol Dịch H2O Thêm 250ml H2O Chiết phân lớp với n-hexan, EtOAc n-butanol Dịch EtOAc Dịch n-hexan Dịch BuOH Dịch H2O lại Cất loại dung môi Cặn EtOAc (50g) SKC silicagel n-Hexan: EtOAc,lượng EtOAc 50-100% EtOAc:MeOH, lượng MeOH - 50% thu ñược 20 phân ñoạn(PD EPE1- EPE20) Phân ñoạn 1-10 Phân ñoạn 11 Phân ñoạn 20 Lọc, hút chất rắn Thực phản ứng acetyl hóa hỗn hợp chất rắn thu Thủy phân axit 3β-acetyl ursolic Axit ursolic 5.8 g (0.32% so với mẫu khơ) Hình 2.1: Sơ đồ chiết, tách axit ursolic từ Sơn Trà Poilan Hình 2.2: Sơ ñồ tổng hợp dẫn xuất 89, 90 nhóm C3-OH axit ursolic 2.2.1 Tổng hợp chất axit 3-oxo-urs-12-en-28-oic 87 100 mg CrO3 ( mmol ) hòa 10 ml H2SO4 30% ñược nhỏ dần vào hỗn hợp 46 mg axit ursolic ( 0,1 mmol) hòa tan 10 ml axeton Hỗn hợp phản ứng ñược khuấy nhiệt độ phịng 10 Cất loại dung môi hữu áp suất giảm chiết EtOAc hữu áp suất giảm tới khô thu ñược cặn rắn màu trắng, cặn (50 ml), pha hữu rửa lần với nước cất (20 ml + 20 ml) cất ñược làm cột silicagel hệ dung môi n-hexan: EtOAc= 4:1 loại áp suất giảm thu ñược chất rắn, ñem tách cột silicagel thu ñược 27 mg sản phẩm 89 Hiệu suất: 83 % với hệ dung môi n-hexan: EtOAc= 7:1 thu ñược 30 mg chất 87 Hiệu suất: 65 % H-NMR (CDCl3): δ 0.80 (3H, s, CH3), 0.86 (3H, d, J=6.3 Hz, CH3), 0.94 (3H, J=6.3 Hz, CH3), 1.02 (3H, s, CH3), 1.07 (3H, s, H-NMR (CDCl3): δ 0.83 (3H, s, CH3), 0.86 (3H, d, J=6.5 CH3), 1.12 (3H, s, CH3), 2.18 (3H, s, -COCH3), 2.19 (1H, d, J=11.5 Hz, CH3) 0.96 (3H, d, J=6.0 Hz, CH3), 1.03 (3H, s, CH3), 1.06 (3H, Hz, H-18), 2.30 (1H, m, H-2a), 2.93 (1H, m, H-2b), 5.25 (1H, m, H- s, CH3), 1.09 (3H, s, CH3), 2.19 (1H, d, J=11.5 Hz, H-18), 2.36 (1H, 12) m, H-2a), 2.51 (1H, m, H-2b), 5.25 (1H, m, H-12) 2.2.4 Tổng hợp chất axit 3-hydrazono-urs-12-en-28-oic 90 2.2.2 Tổng hợp chất axit 3-hydroxyimino-urs-12-en-28-oic 88 30 mg oxo 87 (0,066 mmol) 0.1 ml hydrazin hòa 10 Hỗn hợp 46 mg (0,1 mmol) chất oxo 87 ml ml EtOH, hỗn hợp phản ứng khuấy nhiệt ñộ 600C Dịch NH2OH.HCl 40% nước hịa tan vào ml pyridine/methanol để nguội xuống nhiệt độ phịng, sau cất loại dung mơi với tỉ lệ 1/1 đun 60 C Sau cất loại dung mơi hữu hydrazin áp suất giảm, cặn cịn lại ñược chiết ba lần áp suất giảm, cặn cịn lại chiết ba lần EtOAc, dịch chiết EtOAc, dịch chiết ñược gộp lại rửa với nước, làm khan ñược gộp lại rửa với nước, làm khan Na2SO4, lọc dịch chiết Cất Na2SO4, lọc dịch chiết Cất loại dung mơi, cặn tinh chế cột loại dung mơi, đem tách cặn thu ñược cột silicagel CH2Cl2: MeOH= silicagel hệ dung môi nhexan: EtOAc= 3: thu ñược 20 mg chất 89 98: thu ñược 34 mg oxim 88 Hiệu suất: 73 % Hiệu suất: 65% H-NMR (CDCl3): δ 0.82 (3H, s, CH3), 0.88 (3H, d, J=7.0 Hz, H-NMR (CDCl3): δ 0.83 (3H, s, CH3), 0.86 (3H, d, J=6.0 1 CH3), 0.96 (3H, d, J=6.0 Hz, CH3), 1.02 (3H, s, CH3), 1.06 (3H, s, CH3), Hz, CH3), 0.93 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3), 0.98 (3H, s, CH3), 1.02 (3H, 1.07 (3H, s, CH3), 1.15 (3H, s, CH3), 2.22 (1H, d, J=11.5 Hz, H-18), s, CH3), 1.08 (3H, s, CH3), 1.14 (3H, s, CH3), 2.10 (1H, m, H-2a), 2.26 (1H, m, H-2a), 3.04 (1H, m, H-2b), 5.26 (1H, t-like, H-12) 2.20 (1H, d, J=9.2 Hz, H-18), 2.48 (1H, m, H-2b), 5.26 (1H, t-like, 2.2.3 Tổng hợp axit 3-acetocyimino-urs-12-en-28-oic 89 0,1 ml anhidrit axetic ñược nhỏ vào dung dịch 30 mg H-12); C-NMR (CDCl3): δC 182.6 (-COOH), 161.25 (C=N-NH2), 13 138.1 (C-13), 125.64 (C-12) oxim 88 (0,064 mmol) ml pyridine nhiệt độ phịng Hỗn hợp phản ứng ñược khuấy nhiệt ñộ cất loại dung môi 10 11 2.3.TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT Ở VỊ TRÍ C17-COOH CỦA AXIT URSOLIC 12 dần vào hỗn nợp này, phản ứng khuấy 12 nhiệt độ phịng Sau phản ứng kết thúc 30 ml CH2Cl2 ñược thêm vào, pha hữu ñược rửa với nước (20 ml), làm khan Na2SO4, cất loại dung môi, cặn 2.3.1 Tổng hợp chất axit 3β-acetyl ursolic 91 Hòa tan 46mg (0,1 mmol) axit ursolic 74 hỗn hợp ml thu ñược ñem tách cột silicagel, hệ dung mơi n-hexan:EtOAc = 6:1 thu 53 mg chất 92 Hiệu suất: 76% pyridin ml anhidrit axetic Hỗn hợp khuấy nhiệt độ phịng 14 Sau cất loại pyridin anhidrit axetic dư áp suất giảm tới thu ñược cặn rắn màu trắng, cặn hịa tan 50 ml EtOAc, rửa dịch chiết hữu 10 ml dung dịch HCl 5%, sau pha hữu rửa lần với nước Làm khan Na2SO4, cất loại dung mơi cặn làm cột silicagel với hệ dung môi n-hexan: EtOAc = 10:1 thu ñuợc 46 mg sản phẩm 91 Hiệu suất: 92% H-NMR (CDCl3): δ 0.77 (3H, s, CH3), 0.85 (3H, d, J=6.0 Hz, CH3), 0.86 (3H, s, CH3), 0.95 (3H, s, CH3), 0.96 (3H, s, CH3), 1.07 (3H, s, CH3), 1.25 (3H, s, CH3), 2.04 (3H, s, H3CCOO), 2.18 (1H, d, J=3.5 Hz, H-18), 4.50 (1H, m, H-3), 5.23 (1H, t, J=3.5 Hz, H12) 2.3.2 Tổng hợp Methyl N-(3β β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl]-11amino undecanoate 92 Hòa tan 49 mg axit 3β-acetyl ursolic 91 (0,1mmol) ml CH2Cl2, oxalyl clorua (0.1) ml ñược thêm vào Hỗn hợp khuấy nhiệt độ phịng 48 Sau cất loại CH2Cl2 oxalyl clorua dư áp suất giảm tới thu ñược cặn rắn khơ, cặn hịa tan ml CH2Cl2 50 µl triethylamin Dung dịch 22 Hình 2.3: Sơ ñồ tổng hợp dẫn xuất amid 93, 94 nhóm C17- mg NH2(CH2)10COOCH3 (0,1 mmol) ml CH2Cl2 ñược nhỏ COOH axit ursolic 11 12 13 14 2.3.3 Tổng hợp dẫn xuất amit axit 93 hữu cơ, làm khan Na2SO4, cất loại dung môi, tách cột Hòa tan 35 mg chất 92 (0,05 mmol) vào hỗn hợp ml THF/MeOH (1:1) dung dịch NaOH 4N (0,5 ml) nhỏ vào nhiệt độ phịng, phản ứng khuấy tiếp nhiệt ñộ 15 Cất loại silicagel, hệ dung mơi n-hexan:EtOAc = 3:1 thu 27 mg chất 94 Hiệu suất: 45% H-NMR (CDCl3): δ 0.76 (3H, s, CH3), 0.85 (3H, d, J=6.0 dung mơi hữu áp suất giảm, cặn cịn lại ñược hòa tan Hz, CH3), 0.86 (3H, d, J= 6.8 Hz, CH3), 0.89 (3H, s, CH3), 0.93 (6H, nước cất trung hịa HCl 2N đến pH=7, chiết CH2Cl2 (50 s, CH3), 1.07 (3H, s, CH3), 2.03 (3H, s, -OCOCH3), 2.58 (4H, br s, ml), dịch chiết ñược rửa với nước, làm khan Na2SO4, lọc dịch NH2 -CH2NH2), 2.95 (1H, m), 3.26 (1H, m) nhóm - chiết, cất loại dung mơi, tinh chế sản phẩm cột silicagel, hệ CONHCH2), 4.46 (1H, dd, J=5.5, 10 Hz, H-3), 5.28 (1H, br s, H-12), dung môi n-hexan: EtOAc = 2:1 thu ñược 30 mg chất 93 Hiệu suất: 5.86 (1H, br.s, -CONH) 95% CHƯƠNG H-NMR (CDCl3): δ 0.78 (s, 3H, CH3), 0.87 (3H, d, J=6.5 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hz, CH3), 0.93 (3H, d, J=7.0 Hz, CH3), 0.99 (3H, s, CH3), 1.07 (3H, s, CH3), 1.26 (3H, s, CH3), 2.32 (2H, t, J= 7.5 Hz, -CH2-COOH), 3.02 (1H, br s), 3.22 (m, 1H) -CONH-CH2, 3.28 (m, 1H, H-3), 5.31 3.1 CHIẾT TÁCH AXIT URSOLIC Từ dịch chiết tổng với hỗn hợp dung môi MeOH : H2O (85 : (1H, br s, H-12), 5.93 (1H, br s, -CONH-) 15) Sơn Trà Poilan sau cất loại dung môi áp suất 2.3.4 Tổng hợp N-(3β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl)-1,7-diaminohep- giảm ñược phân bố dung môi n-hexan, EtOAc -tane 94 chiết EtOAc sắc ký cột silicagel, kết tinh với hệ dung Hòa tan 49 mg axit 3β-acetyl ursolic 91 (0,1mmol) ml CH2Cl2, oxalyl clorua 0,1 ml ñược thêm vào Hỗn hợp ñược khuấy nhiệt độ phịng 48 Sau cất loại CH2Cl2 oxalyl clorua dư áp suất giảm tới thu cặn rắn khơ, cặn hịa tan ml CH2Cl2 Dung dịch ñược nhỏ vào hỗn hợp dung dịch 65 mg BuOH Cất loại dung mơi thu cặn chiết tương ứng Từ cặn NH2(CH2 )7NH2 (0,5 mmol) 15 mg mơi thích hợp phản ứng axetyl hóa, phản ứng xà phịng hóa phân lập 5,8 g axit ursolic (hàm lượng 0,32% so với mẫu khơ) (Hình 2.1) Các số liệu phổ 1H-NMR 13 C-NMR axit ursolic tách ñược phù hợp với tài liệu ñã công bố 3.2 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA AXIT triethylamin ml CH2Cl2, nhiệt độ phịng Sau ñược URSOLIC khuấy tiếp nhiệt ñộ 12 giờ, phản ứng kết thúc 30 ml CH2Cl2 3.2.1 Phản ứng nhóm C3-OH axit ursolic thêm vào, pha hữu ñược rửa với nước (20 ml), tách lấy pha 13 3.2.1.1 Tổng hợp axit 3-acetocyimino-urs-12-en-28-oic 89 14 15 16 Phản ứng ñược thực theo sơ ñồ ( hình 2.2) • Chất 87, 88 Phổ 1H 13C-NMR cho thấy phân tử chất 87 có chứa nhóm ketone (δC = 217.7), nhóm axit (δC = 184.1), nối đơi dạng >C=CH- [δH = 5.25 (1H, t, J = 3.5), δC = 138.0 s; 125.6 d) Trên phổ 1H 13C-NMR cho thấy phân tử chất 88 có nhóm axit (δC = 182.8), nối đơi dạng >C=CH- [δH = 5.25 (1H, t, J = 3.5), δC = 138.1 s; 125.6 d], tín hiệu nhóm ketone khơng cịn mà xuất tín hiệu nhóm >C=N δC =167.6 Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13C-NMR hai chất 87, 88 phù hợp với tài liệu cơng bố [7], [53] • Chất 89 Khi so sánh số liệu phổ 1H-NMR chất 89 với chất 88 hệ dung môi CDCl3, nhận thấy tín hiệu pic khơng có thay ñổi nhiều, xuất thêm pic δH 2.18 nhóm -COCH3 phổ 1H-NMR 89 Phổ IR cho thấy ñỉnh hấp thụ 1765 cm-1 (axit carbonyl), 1692 cm-1 (>C=N) (hình 3.7) Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử m/z = 512 [M + H]+ Kết hợp liệu phổ hồng ngoại, phổ khối ESI-MS phổ H, 13C-NMR, kết luận cấu trúc dẫn xuất thu cơng thức 89 Hình 3.7: Phổ IR chất 89 15 16 17 18 3.2.1.2 Tổng hợp axit 3-hydrazono-urs-12-en-28-oic 90 Khi cho oxo 87 tác dụng với hydrazin EtOH nhiệt ñộ 60 C 3h thu ñược chất hydrazono 90 với hiệu suất 65% • Chất 90 Phổ IR cho đỉnh hấp thụ đặc trưng nhóm NH2 3458 cm-1 nhóm carboxyl 1689 cm-1 Phổ khối va chạm electron ESI-MS cho pic ion phân tử m/z = 469 [M + H]+ Trên phổ C-NMR chất 90, xuất thêm pic δ 13 161.25 ppm nhóm C=N-NH2 So sánh phổ 1H-NMR chất 90 với oxo 87, chúng tơi nhận thấy tín hiệu H-2a H-2b 90 dịch chuyển phía trường cao khoảng 0.1 0.5 ppm ảnh hưởng nhóm C=O 87 thay nhóm C=N-NH2 90 Kết hợp phổ IR, phổ khối phổ 1H 13C-NMR cho thấy chất thu ñược phù hợp với cấu trúc chất 90 (hình 3.12) 3.2.2 Phản ứng nhóm C17-COOH axit ursolic 3.2.2.1 Tổng hợp axit N-(3β -Hydroxy-urs-12-en-28-oy)]-11-amino undecanoic 93 Phản ứng ñược thực theo sơ đồ (hình 2.3) • Chất 91 Chất 91 cho pic ion phân tử m/z = 497 [M - H]- phổ khối ESI-MS Phổ 1H 13C-NMR cho thấy 91 sản phẩm 17 Hình 3.12: Phổ 1H-NMR chất 90 18 19 20 axetyl hóa axit ursolic, thể qua tín hiệu nhóm axit (δC = 183.97), nhóm metyl có gắn với oxy (δH = 4.50 m, δC = 80.97 d), nối đơi dạng >C=CH- [δH = 5.23 (1H, t, J = 3.5), δC = 137.99 s; 125.75 d], nhóm axetyl [δH = 2.04 (3H, s), δC = 171.02, 21.18] bảy nhóm metyl • Chất 93 Phổ IR cho thấy ñỉnh hấp thụ 3434 cm-1 (OH), 1710 cm-1 (carbonyl acid), 1630 cm-1 (amid carbonyl) Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử m/z = 663 [M + Na]+ Trên phổ 1H-NMR 93, xuất tín hiệu δ 5.93 nhóm -NH amit, tín hiệu nhóm H-3 δ 3.28 pic dạng triplet -CH2- gần nhóm axit 2.32 ppm, khơng thấy tín hiệu singulet δ ≈ ppm nhóm methyl ester nhóm acetyl δ ≈ ppm Phổ 13 C-NMR cho thấy khơng có tín hiệu nhóm axetyl nhóm metyleste Kết hợp phổ hồng ngoại, phổ khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân H 13 C-NMR chúng tơi nhận thấy nhóm axetyl nhóm metyl este ñều bị thủy phân ñể tạo thành chất 93 (hình 3.16) 3.2.2.2 Tổng hợp dẫn xuất N-(3β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl)1,7-diaminoheptane 94 Hình 3.16: Phổ IR chất 93 Tương tự 92, chất 94 ñược tổng hợp phản ứng axit 3-axetyl ursolic 91 sau hoạt hóa nhóm cacboxyl nhờ oxalyl clorua với 1,7-diaminoheptane CH2Cl2 nhiệt độ phịng • Chất 94 Trên phổ 1H-NMR chất 94, xuất pic δ 5.86 nhóm -NH amit, δ 2.95 3.26 proton Ha, Hb cạnh nhóm (hình 2.3) 19 20 21 22 amit vị trí C-28, 4.26 ppm H-3 pic dạng br s NH2 δ 1 2.58 ppm So sánh phổ H-NMR 94 với H-NMR axit 3β- 3.3 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CÁC DẪN XUẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC axetyl ursolic[3] N-(3β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl)-1,9-diaminnon-ane [53], chúng tơi kết luận cấu trúc đề nghị phù hợp với 94 Kết nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào dẫn xuất tổng hợp dịng ung thư người nêu bảng ñây: KB : ung thư biểu mô Hep-G2 : ung thư gan Lu : ung thư phổi MCF7 : ung thư vú Như bảng 3.2 ta thấy, chất tổng hợp ñược 89, 90, 93 có hoạt tính dịng tế bào KB, Hep-G2, Lu MCF7 Trong đó, dẫn xuất 89 có khả ức chế mạnh nhiều so với axit ursolic dòng tế bào với giá trị IC50 tương ứng 4.32, 4.31, 5.44 3.43 µg/ml Bảng 3.2: Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ursolic acid dẫn xuất tổng hợp STT Hình 3.20: Phổ 1H-NMR chất 94 21 Tên mẫu B1-chất 89 B2-chất 90 Kết quả: Giá trị IC50 (µ µg/ml) mẫu thử dòng tế bào KB HepG2 Lu MCF7 4,32 4,31 5,44 3,43 23,23 46,05 123,07 55,36 22 23 Chất tham khảo A5-chất 93 Axit Ursolic Ellipticin 24 11,60 17,90 17,56 14,44 10,23 11,75 12,23 8,0 0,621,25 0,621,25 0,621,25 0,621,25 KẾT LUẬN Đã nghiên cứu qui trình chiết tách hiệu axít ursolic từ Sơn Trà thu hái rừng quốc gia Bì Dúp, Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng với hàm lượng tương đối cao (0,32% so với trọng lượng khơ) Từ axit ursolic tách ñược, ñã tổng hợp ñược dẫn xuất chất 89, 90, 93 94, chất 89, 90, 93 hợp chất mới, đến chưa có tài liệu cơng bố Cấu trúc hóa học chất sạch: axit ursolic chất tổng hợp ñược ñược xác ñịnh phương pháp phổ ñại phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân Kết thử hoạt tính gây độc tế bào chất 89, 90 93 dòng tế bào ung thư Lu, KB, Hep-G2 MCF7 cho thấy dẫn xuất có hoạt tính dịng tế bào đem thử, chất 89 thể hoạt tính cao cao nhiều so với axit ursolic 23 24