tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillus sinhenzyme cellulase

 Nửa cuối thế kỷ XX: Đã phát hiện được CoEnzyme Harde và Young, 1906; nghiên cứu động học phản ứng enzyme; kết tinh được enzyme và xác định được bản chất hóa học của enzyme là protein,

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Đồ án tốt nghiệp

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Phòng Đào tạo Đại học và sau Đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Minh Trí đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua

Chân thành cảm ơn!

Sinh viên Nguyễn Thị Bảo Hiếu

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vi

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE 3

1.1.1 Giới thiệu về cellulose 3

1.1.2 Tìm hiểu về cây sắn và bã sắn 4

1.1.3 Tình hình tận dụng bã sắn nguyên liệu 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 5

1.2.1 Lịch sử phát triển enzyme học 5

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 9

1.2.3 Giới thiệu về cellulase 9

1.2.3.1 Cấu trúc của enzyme cellulase 10

1.2.3.2 Tính chất của enzyme cellulase 11

1.2.3.3 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase 11

1.2.4 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulose 12

1.2.5 Ứng dụng của enzyme cellulase 12

1.2.6 Tình hình nghiên cứu về enzyme cellulase 14

1.2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.2.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

1.3 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS 15

1.3.1 Đại cương về Bacillus 15

1.3.2 Một số vi khuẩn Bacillus thường gặp trong tự nhiên: 16

1.4 TỔNG QUAN VỀ VẬT LIỆU NGHIỂN CỨU 20

PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU 23

2.1.1 Đối tượng 23

2.1.2 Vật liệu 23

2.1.2.1 Thiết bị 23

2.1.2.2 Hoá chất 23

2.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật (g/ml) 24

2.1.3.1 Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống) 24

2.1.3.2 Môi trường thử hoạt tính enzyme cellulose 24

2.1.3.3 Môi trường nuôi thu enzyme cellulase 24

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Phương pháp phân lập 25

2.2.2 Phương pháp giữ giống 26

2.2.3 Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn 26

2.2.3.1 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc 26

2.2.3.2 Phương pháp làm tiêu bản cố định 27

2.2.3.3 Phương pháp nhuộm Gram 27

2.2.4 Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme cellulase 28

2.2.5 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô 28

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase 28

2.2.6.1 Phương pháp đục lỗ thạch 28

2.2.6.2.Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 28

2.2.6.3 Phương pháp tính hoạt độ hệ enzyme cellulase 29

2.2.7 Bố trí thí nghiệm 31

2.2.7.1 Thí nghiệm xác định các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase 31

2.2.7.2 Thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh enzyme cellulase tốt nhất 33

2.2.7.3 Ứng dụng enzyme cellulase của chủng Bacillus tuyển chọn vào việc thủy phân cellulose có trong bã sắn 35

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN THEO PHƯƠNG PHÁP MILLER 37

3.2 TUYỂN LỰA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH ENZYME CELLULASE TỐT NHẤT 38

3.2.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ thực phẩm lên men Natto 38

3.2.2 Dựa vào vòng thủy phân CMC 1% tuyển lựa chủng Bacillus sinh enzyme cellulase 38

3.2.3 Đặc điểm hình thái của 3 chủng B1, B3, B7 39

3.2.3.1 Hình thái khuẩn lạc 39

3.2.3.2 Hình thái vi khuẩn 39

3.2.4 Dựa vào hoạt tính enzyme cellulase của 3 chủng B1, B3, B7 để chọn chủng sinh enzyme mạnh nhất 41

3.2.4.1 Xác định định tính hoạt tính cellulase 41

3.2.4.2 Dựa vào định lượng Glucose bằng phương pháp đo quang Miller để xác định hoạt độ enzyme cellulase 43

3.3 ĐIỀU KIỆN ĐỂ ENZYME CELLULASE CÓ HOẠT TÍNH CAO NHẤT 47

3.3.1 Nghiên cứu nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase 44

3.3.2 Nghiên cứu pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase 44

3.4 NUÔI CẤY THU ENZYME CELLULASE 44

3.4.1 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 47

3.4.2 Nghiên cứu thời gian ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 48

3.5 BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CELLULOSE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÃ SẮN 50

KẾT LUẬN 53

ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử cellulose 3

Hình 1.2: Cấu trúc không gian của enzyme cellulase 10

Hình 1.3: Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase lên cellulose 11

Hình 2.1: Sơ đồ phân lập Bacillus từ thực phẩm lên men Natto 25

Hình 2.2: Ống nghiệm giữ giống Bacillus 26

Hình 2.3: Sơ đồ xác định các điền kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase 32

Hình 2.4: Sơ đồ các điều kiện nuôi cấy Bacillus thích hợp để sinh tổng hợp enzyme cellulase 34

Hình 2.5: Ứng dụng enzyme cellulase vào việc thủy phân cellulose trong bã sắn 36

Hình 3.1: Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp Miller 38

Hình 3.2: Cấy ria chủng Bacillus trên đĩa petri 38

Hình 3.3: Vòng thủy phân CMC 1% của các chủng Bacillus 38

Hình 3.4: Tiêu bản nhuộm Gram của chủng B1 40

Hình 3.5: Tiêu bản nhuộm Gram của chủng B3 40

Hình 3.6: Tiêu bản nhuộm Gram của chủng B7 41

Hình 3.7: Vòng thủy phân cellulose của 3 chủng B1, B3, B7 42

Hình 3.8: Biểu diễn hoạt độ enzyme cellulase của 3 chủng B1, B3, B7 43

Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase 44

Hình 3.10: pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase 46

Hình 3.11: pH ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 47

Hình 3.12: Thời gian ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 49

Hình 3.13: Ủ bã sắn với enzyme cellulase 50

Hình 3.14: Lượng Glucose sinh ra trong quá trình thủy phân cellulose của enzyme cellulase trên 1g môi trường bã sắn khô 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần trong bã sắn 4

Bảng 1.2: Một số vi sinh vật sản xuất cellulase 12

Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn glucose 29

Bảng 2.2: Xác định hoạt độ cellulase 30

Bảng 3.1: Đường kính vòng thủy phân của các chủng Bacillus 39

Bảng 3.2: Đường kính vòng thủy phân của 3 chủng B1, B3, B7 42

Bảng 3.3: Lượng Glucose (%) sinh ra khi thủy phân cellulose trong 100g bã sắn 52

MỞ ĐẦU

Vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng Chúng ở xung quanh ta: trong đất, nước, không khí, thậm chí trong cơ thể con người Chúng có thể gây ra các bệnh khôn lường như bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ở người và gia cầm, lở mồm, long móng ở bò lợn nhưng chúng cũng đem lại cho ta nguồn lợi vô cùng to lớn nếu ta biết hiểu chúng và biết sử dụng chúng có mục đích sẽ giúp cuộc sống của con người tốt đẹp hơn

Từ xa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từ vi sinh vật

Ngày nay chúng ta đang sống trong thế kỷ 21, thế kỷ của khoa học công nghệ

và đặc biệt là công nghệ vi sinh càng chứng tỏ ưu thế của mình

Hiện nay đã có nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng hợp từ

vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công – nông nghiệp, y học và đời sống của con người

Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, LactoBacillus đã và đang được sử dụng

trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các nghành sản xuất như: rượu, bia, công nghệ dệt, y học, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phế thải hữu cơ làm sạch môi trường nuôi trồng thủy sản là nhờ khả năng sinh ezyme thủy phân amylase, protease, cellulase của chúng

Các nhà máy chế biến thực phẩm được hình thành và phát triển ngày càng nhiều Bên cạnh đó, các chất thải được thải ra môi trường ngoài với một lượng lớn Điển hình như nhà máy chế biến tinh bột từ củ sắn, vào vụ thu hoạch có khoảng 100 – 150 tấn bã sắn được thải ra hằng ngày Lượng bã sắn tồn đọng là nguyên nhân gây

ô nhiễm môi trường Với mong muốn tận dụng lại nguồn bã sắn để làm thức ăn chăn nuôi cho gia súc: bằng cách sử dụng enzyme cellulase phân lập từ vi sinh vật

để phân giải cellulose thành các sản phẩm dễ tiêu hóa như đường kết hợp bổ sung các chất phụ gia khác như cám gạo, rỉ đường tăng thành phần dinh dưỡng Nhờ

đó, ta chuyển phế liệu thành một sản phẩm có ích trong chăn nuôi sẽ giảm thiểu nạn

ô nhiễm môi trường

Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

‘‘Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh enzyme Cellulase”

Nội dung

- Tuyển lựa chủng Bacillus sinh enzyme cellulase

- Xác định một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme thu được

- Sơ bộ đánh giá khả năng sinh enzyme của chủng vi khuẩn Bacillus phân

lập được

Đề tài được thực hiện trong thời gian ngắn là 3 tháng không tránh khỏi hạn chế và thiếu sót Tôi rất mong nhận được các ý kiến bổ ích của những ai quan tâm đến đề tài để hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE

1.1.1 Giới thiệu về cellulose

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật Ngoài ra người ta thường thấy chúng có nhiều ở tế bào của một số loài vi sinh vật Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi

Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-Dglucose-pyranose Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside Các gốc glucose trong glucose thường lệch nhau một góc 1800C và có dạng như một chiếc ghế bành Cellulase thường chứa 10.000 – 14.000 gốc đường và được cấu tạo như Hình 1.1

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử cellulose Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn có khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase [5]

Cấu tạo củ sắn gồm 4 phần chính: vỏ gỗ, vỏ thịt, thịt sắn và lõi sắn

Bã sẵn

Hiện nay ở nước ta có trên 60 nhà máy tinh bột sắn với tổng công suất khoảng

38 triệu tấn củ sắn tươi/năm Theo ước tính một nhà máy chế biến tinh bột sắn có công suất 30 – 100 tấn/ngày sẽ sản xuất được 7,5 – 25 tấn tinh bột, kèm theo đó là

1.1.3 Tình hình tận dụng bã sắn nguyên liệu

Bã sắn nguyên liệu chứa độ ẩm cao và một số chất như tinh bột, chất béo rất

dễ bị vi khuẩn phân hủy gây ra mùi hôi thối gây ô nhiễm môi trường Từ Bảng 1.1 trong thành phần bã sắn tươi còn chứa một số chất dinh dưỡng do đó ta có thể tận dụng để biến phế liệu thành một sản phẩm khác có ích hơn phục vụ cho những mục đích nhất định

 Ở Việt Nam

- Làm thức ăn cho động vật nhai lại

- Sản xuất thức ăn chăn nuôi có giá trị cao

- Sản xuất etanol sinh học

- Vấn đề nghiên cứu nhiên liệu sinh học thay thế cho xăng cũng được nhiều nước trên thế giới quan tâm Thái Lan là nước sản xuất thành công etanol sinh học

từ bã sắn, thành công này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng vì nước này phải nhập 2/3 nguồn năng lượng từ nước ngoài

Bã sắn đã được tận dụng trong rất nhiều lĩnh vực để giảm thiểu ô nhiễm môi trường Tuy nhiên ở Việt Nam thì điều này còn hạn chế Với đề tài phân lập

Bacillus có hoạt tính cellulase Và bước đầu ứng dụng chủng Bacillus phân hủy

cellulose trong bã sắn để làm thức ăn trong chăn nuôi Tôi muốn góp một phần nhỏ

bé trong công cuộc bảo vệ môi trường ở nước ta

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME

1.2.1 Lịch sử phát triển enzyme học [9]

Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp Enzyme có trong tất cả các tế bào sống, là chất xúc tác sinh học Enzyme có đầy đủ các tính chất của chất xúc tác, nhưng enzyme có hiệu xuất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác Ezyme không những có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, mà sau khi tách khỏi hệ thống sống, ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác

 Trước thế kỷ XVII

Việc sử dụng enzyme có tính chất kinh nghiệm thuần túy

Người cổ xưa đã biết dùng vi sinh vật như là nguồn enzyme trong các quá trình lên men: Làm rượu vang, sản xuất giấm, làm bánh mỳ…

 Thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XVIII

Đã đề ra được khái niệm enzyme

Vanhemon (Vanhemont) người Hà Lan, lần đầu tiên đã quan sát được hiện tượng tạo thành chất khí khác không khí trong quá trình lên men

1659, Silvius lần đầu tiên nêu lên rằng, về cơ bản tất cả các quá trình sống đều

là những quá trình hóa học

 Nửa cuối thế kỷ XVIII

Đã có những thí nghiệm đầu tiên về enzyme:

Công trình nghiên cứu khả năng tiêu hóa thịt trong dạ dày Công trình này do Reaumur (người Pháp) bắt đầu và sau đó được Spallanzani (người Ý) mở rộng Năm 1986, Schwann đã gọi chất làm tiêu hóa thịt này là pepsin

Từ năm 1800, người ta cũng đã cho rằng, trong ruột có một enzyme phân giải protein khác Sau đó Kuhne đặt tên là trypsin

Protease thực vật được sử dụng khá sớm, từ năm 1700 người dân ở các đảo Thái Bình Dương đã biết sử dụng đu đủ để làm mềm thịt

 Nửa đầu thế kỷ XIX

Người ta đã tách được một số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyên liệu khác có tác dụng thủy phân các chất tương ứng, và bước đầu tách được các chất tạo nên quá trình lên men

Mở đầu là công trình nghiên cứu của Kiecgiop (người Nga, 1814), nước chiết

từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường từ 400C –

 Nửa cuối thế kỷ XIX

Đã tinh sạch được một số enzyme và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của enzyme

Trong thời kỳ này đã có những thông báo về cơ chế tác dụng của enzyme: Wurtz (1880) đã chỉ ra rằng, papain tạo thành hợp chất không tan với fibrin trước khi thủy phân nó

 Nửa cuối thế kỷ XX:

Đã phát hiện được CoEnzyme (Harde và Young, 1906); nghiên cứu động học phản ứng enzyme; kết tinh được enzyme và xác định được bản chất hóa học của enzyme là protein, xác định được một số hệ thống enzyme xúc tác cho quá trình đường phân…

Việc xác định cấu trúc enzyme là vấn đề có tính chất cốt lõi để làm sáng tỏ nhiều vấn đề trong nghiên cứu enzyme, enzyme đầu tiên được kết tinh là urease, tinh thể urease bao gồm protein, khi hòa tan trong dung môi sẽ có hoạt tính enzyme Công trình này mở ra một giai đoạn mới, một bước ngoặc quan trọng trong lịch sử nghiên cứu enzyme

 Những thành tựu chính về nghiên cứu enzyme và công nghệ enzyme trong nửa cuối thế kỷ XX

Đã áp dụng thành công các phương pháp hiện đại trong nghiên cứu enzyme: hoàn thiện phương pháp xác định cấu trúc bậc I phân tử enzyme ; nghiên cứu liên quan giữa cấu trúc và chức năng của phân tử

Lần đầu tiên đã phân loại và cách gọi tên enzyme một cách có hệ thống

Phát hiện các restrictase (enzyme giới hạn)

Tổng hợp hóa học enzyme Đến nay người ta đã tổng hợp được enzyme từ nguyên liệu ban đầu là các chất phân tử thấp như các cyclodextrin, sau đó gắn thêm các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme Với phương pháp tổng hợp này đã tổng hợp nhân tạo enzyme có hoạt tính phân giải ester giống chymotripsin nhưng có độ bền lớn hơn

Thành tựu khác là thiết kế enzyme có hoạt tính hay đặc tính mới bằng cách ghép một enzyme vào một bộ khung cấu trúc khác

Phát hiện reverse transcriptase

Phát hiện một số phân tử sinh học thuộc các nhóm chất có hoạt tính sinh học khác cũng có hoạt tính xúc tác như enzyme: kháng thể, rybozyme

Đã hình thành ngành Công nghệ sản xuất enzyme, sản xuất các chế phẩm enzyme không tan và sử dụng chúng trong thực tế

Tạo được các enzyme tái tổ hợp và thiết kế các enzyme có tính năng mới Thành tựu lớn khác là tạo được mô hình của một số enzyme gắn được với màng

 Phương hướng nghiên cứu công nghệ enzyme hiện nay và trong tương lai

Nghiên cứu, áp dụng các kỹ thuật, công nghệ mới hiên đại để:

Sàng lọc, tuyển chọn hoặc tạo nguồn nguyên liệu giàu ezyme mong muốn Thu nhận chế phẩm enzyme có hiệu suất, hoạt độ và độ bền cao, giá thành ngày càng thấp

Nghiên cứu liên quan giữa cấu trúc và chức năng của phân tử, cơ chế điều hòa của phân tử và hệ thống enzyme

Phát triển nghiên cứu tổng thể bộ protein/enzyme, sinh học enzyme trong tổng thể của hệ thống sống: sự phân bố, quan hệ tương tác, quá trình trao đổi, tác dụng, chức năng sinh lý, các dạng tồn tại của chúng trong hệ thống sống

Mô hình hóa phân tử, hệ thống enzyme trong tế bào và cơ thể sống

Cải biến định hướng phân tử enzyme, thiết kế các phân tử enzyme mới với những đặc tính mong muốn và có hiệu quả sử dụng cao trong thực tế

Phát triển nghiên cứu proteome góp phần giải thích cơ chế các quá trình bệnh

lý ở mức độ phân tử

Mở rộng phạm vi ứng dụng enzyme trong thực tế

Nghiên cứu tạo các chip enzyme

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme [9]

- Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

- Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm

- Ảnh hưởng của các ion kim loại

- Ảnh hưởng của các anion

- Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa khác

- Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

1.2.3 Giới thiệu về cellulase

Cellulase là phức hệ thuỷ phân cellulose tạo thành các phân tử đường glucose Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ enzyme bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-glucananse hay enzyme C1, Endo-β-glucananse hay Endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay Cx và β-glucosidase hay cellobioase:

β- Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydroase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một phần Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì

có tác dụng hiệp đồng rõ rệt

 Endo-1,4-glucanese (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một các tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác động mạnh lên cellodextrin Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose

β-1,4- β-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiase và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase,

còn cellodextrin thì có hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên Chức năng của β-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng cellulase

1.2.3.1 Cấu trúc của enzme cellulase

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là acid amin, các acid amin được nối với nhau bởi liên kết peptid-CO-NH Ngoài ra, trong cấu trúc còn có những thành phần phụ khác Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm Endo-glucanase và Exo-glucanase giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xúc phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosin hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quang mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose Hơn nữa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD (cellulose binding domain) với cellulose Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều lần liên kết trong cellulose tinh thể Vùng gắn kết với cellullose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme

Hình 1.2: Cấu trúc không gian của ezyme cellulase

1.2.3.2 Tính chất của enzyme cellulase

Cellulase thủy phân cellulose trong tự nhiên ở các dẫn xuất như carboxymethyl cellulase (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC) Cellulase cắt liên kết β-1,4-glucidase trong cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc

Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau Cellulase hoạt động ở các pH từ 3 – 7, nhưng pH tối thích trong khoảng pH = 4 – 5 Nhiệt độ tối ưu từ 40 – 500C Hoạt tính của cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 800C trong 10 – 15 phút Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose

và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg Ngoài ra, cellulase còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ

1.2.3.3 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Cellulase là một hệ phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose

- Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme 1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose

Hình 1.3: Cơ chế tác dụng của ezyme cellulase lên cellulose

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên

có loài phát triển mạnh, có loài phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm

1.2.4 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulose

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Số lượng các loài tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc loại nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia vào quá trình phân giải này Bảng 1.2 là một số loài vi sinh vật được các nhà nghiên cứu kỹ nhất

Bảng 1.2: Một số vi sinh vật sản xuất cellulase

Preudomonas Fluorescens B.megaterium B.mensenteroides Clostridium sp Acerobacte xylinum

Vi khuẩn dạ cỏ bò

Ruminoccus albus Ruminobacter parum Bacterioides

Amylophillus sp

C butiricum

C locheheadil Cellulosemonas

1.2.5 Ứng dụng của enzyme cellulase

Trong công nghiệp thực phẩm

Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi rau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của các nghành trồng trọt và lâm nghiệp Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose Nó chỉ có

giá trị làm tăng tiêu hóa, nhưng với số lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa

Chế phẩm cellulase thường dùng để:

 Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc

 Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật

Ứng dụng của cellulase trong chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm các loại thực phẩm đặc biệt trong thức

ăn cho trẻ em

Dùng cellulase để xử lý các loại rau quả, bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo , các loại chè, tảo biển và lương thực như gạo

Trong sản xuất bia

Dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và quá trình đường hóa

Trong sản xuất agar

Cellulose làm tăng chất lượng của agar hơn là với phương pháp dùng acid phá

vỡ thành tế bào

Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Bổ sung endoglucanase trong công đoạn nghiền bột giấy sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình sợi cellulase, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin

Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ

Bổ sung cellulase trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol giúp phá hủy thành tế bào cellulose, giúp tăng lượng đường và đẩy nhanh tốc độ phản ứng của tinh bột và amylase dẫn đến hiệu suất thu hồi rượu tăng

Trong công nghệ sử lý rác thải và phân bón vi sinh

Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn đến mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất hiệu quả Enzyme này có khả năng phân giải rác thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác

Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có các vi sinh vật được nghiên cứu và sản xuất Phức hợp cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy thải ra Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao) Sinh khối này chứa nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysacchatide quan trọng quyết định tới số lượng, chất lượng giấy là cellulose Vì vậy, nước thải của các nhà máy, cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao

Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy cellulase thành các nguồn nhiên liệu sinh học đang được quan tâm đặc biệt trong ngành công nghiệp năng lượng sạch trên toàn thế giới Đặc biệt ứng dụng trong việc xử lý rác thải hữu cơ và phân bón vi sinh

1.2.6 Tình hình nghiên cứu về cellulase

1.2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950 Cuối thế

kỷ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ vi sinh vật Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm như: Trichoderma reseii [13], Schizophillum commune [19], Fusarium lini, Penicillium funiculosum Năm 2000,

đã nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm phức hệ 3 enzyme: endoglucanase, cellobihydrolase và –glucosidase thủy phân hoàn toàn glucose

Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì

Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn, được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B sublitis, B polymxa, B cereus, Bacillus sp KMS-330 [14]

Do cellulase có nhiều ứng dụng nên có rất nhiều nghiên cứu về nó: nghiên cứu

về các tính chất hóa lý như xác định khối lượng phân tử, xác định nhiệt độ tối ưu, xác định pH tối ưu…

1.2.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cellulose [4] Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase như: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý

của cellulase từ chủng Penicillium sp DTQ – HK1[5] Nghiên cứu phân loại và xác

định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưu nhiệt…

1.3 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS

1.3.1 Đại cương về Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương Thuộc chi Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu Bacillus được phân biệt

với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh

trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc Tế bào Bacillus có thể

đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi

khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và

rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kì C và N [18]

Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng

các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ Một vài loài có thể lên men carbonhydrat tạo thành glycerol và butandiol; một vài loài khác thì cần

vitamin, acid amin Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 – 450C, nhưng cũng có loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 650C [15]

Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophillus, hay phù hợp với pH = 2 – 6 như Bacillus acidocadrius Bacillus có khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase ),

do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường,

1.3.2 Một số vi khuẩn Bacillus thường gặp trong tự nhiên:

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được các nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là

Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [20]

Bacillus sublitis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất

và đặc biệt là cỏ khô

Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên nốt

ở củ khoai tây bị u Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc từ động thực vật Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính acid ở điều kiện tối ưu Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mỳ Phần lớn các thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram (+) đều nhận được từ việc nghiên

cứu Bacillus sublitis [20]

Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3 – 5) × 0,6 µm

Chúng phát triển riêng rẻ như những sợi đơn bào Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lòi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch

nhiệt cao Bào tử của Bacillus sublitis cũng chịu được nhiệt khá cao

Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,5 – 0,9 µm Phân bố theo nguyên tắc chặt chẽ, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm Chúng phát tán rộng rãi Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kì sinh trưởng phát triển của vi khuẩn Chúng

không có khả năng trao đổi chất nên có khả năng sống vài chục năm, thậm chí đến

200 – 300 năm [2]

Vi khuẩn Bacillus được xem là vi khuẩn điển hình vì có những đặc tính tiêu

biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid

amin, [23] ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà Bacillus sublitis

có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium(IV) và Plutonium(IV) [16]

Đặc biệt Bacillus sublitis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật – một thực

phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe [21]

Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 × (0,7 – 1) µm, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 – 1,5 µm [20] Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào

Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hơi lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh vòng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục

Sinh trưởng trên môi trường đơn giản không cần thêm bất kỳ một yếu tố sinh trưởng nào

Bacillus mengaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự B.sublitis, do đó

nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp

Bào tử hình bầu dục và kéo dài 0,5 – 0,9 µm, nằm ở vị trí bất kì trong tế bào,

tế bào Bacillus mensentericus không bị phình to khi mang bào tử

Khuẩn lạc bám chặt vào môi trường thạch, có khi dính vào môi trường, mỏng,

nhăn, xám nhạt – trắng, có thể màu Gram, vàng nâu, hồng hoặc đen như Bacillus mensentericus niger (đen), Bacillus mensentericus ruber (hồng)

tối đa 50 – 550C, pH = 4,5 – 5 thì ngừng phát triển

Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase, protease lớn hơn hẳn Bacillus sublitis nhưng lên men đường thì kém hơn

Bacillus cereus

Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí

Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh độc tố cho

thực phẩm hư hỏng Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh, giống Bacillus

này có độc tính, gây ngộ độc thực phẩm [20]

Tế bào Bacillus cereus dày Kích thước(1 – 1,5) × (3 – 5) µm, có khi dài hơn,

chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,9 × (1,2 – 1,5) µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chưa các hạt và không bào Khuẩn lạc của

Bacillus sereus phẳng, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm [1]

Bacillus pumilus

Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường B pumilus có mặt trong đất nhiều hơn B Subtilis

Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mở lan không ranh giới Tế bào của nó gần

giống như tế bào B Sublitis

Bacillus polymyxa

Bacillus polymixa có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhầy, lan dần ra

xung quanh, mép đôi khi có thùy

Tế bào có kích thước (0,6 - 1) × (2 – 7) µm, đứng riêng rẽ hay xếp đôi, chuỗi ngắn Khi hình thành bào tử tế bào sẽ phồng lên giống quả chanh [1]

Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6) µm, nằm giữa tế bào [20] Loại vi khuẩn này có khả năng làm giảm pectin và polysaccarit trong cây Chúng còn có khả năng

cố định đạm

Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực phẩm bị hỏng Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm Môi trường kem và những môi trường có tính acid yếu phù hợp với loại vi khuẩn này Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin Đây là loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược

Bacillus brevis

Người ta tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm

Khuẩn lạc có màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc

Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7 – 1) × (3 – 5) µm Chúng thường

đứng riêng rẽ Bào tử có hình bầu dục, kích cỡ (0,8 – 1) µm, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên [1]

Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp acid amin cho

sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin [20]

Bacillus simplex

Khuẩn lạc giống khuẩn lạc B cereus, phẳng, khá khuyếch tán, bề mặt hơi xù

xì (dạng bột hoặc dạng nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm Đặc biệt khuẩn lạc

Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường [1]

Tế bào nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) × 80,6 µm, thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi

Bào tử có hình bầu dục, kích thước 0,6 × 0,9 µm, nằm lệch tâm

Bacillus lincheniformis

Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D – glutamate và phẩm đỏ cùng với nhiều chủng khác

Bào tử của chúng phát tán trong đất Chúng sinh trưởng phát triển trên các loại thực phẩm Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra bacitracin, một kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp dược [20]

1.4 TỔNG QUAN VỀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Giới thiệu về Natto

Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản làm từ các hạt đậu nành lên men, có màu nâu, mùi khó ngửi, vị bùi và ngăm, có nhiều chất dịch rất nhớt và dính Natto được các nhà khoa học kết luận là có rất nhiều chất dinh dưỡng, là một trong những nguồn chất đạm đóng vai trò quan trọng cho cơ thể con người

Cách làm natto truyền thống

Chọn các hạt đậu nành nhỏ, ngâm nước trong vòng một ngày cho mềm ra, đem luộc thật chín Sau đó gói đậu nành đã xử lý cho vào các túm rơm (đã thanh trùng qua nước sôi không quá 10 phút), ủ ở 420C từ 1-2 ngày để lên men

Hình 1.4: Lên men Natto

Cách làm natto hiện đại

Sử dụng men kosokin để lên men đậu nành đã luộc chín khoảng 24 giờ trong môi trường nhiệt độ chừng 400C

Giải mã những bí ẩn chung quanh Natto [22]

Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của Natto là tiến sĩ K.Yabe, một chuyên gia về vi sinh học công bố những kết quả tìm tòi của ông về sự lên men của Natto vào năm 1894, ghi lại rằng “Natto, một loại pho-mai thực vật” để giới thiệu

với các nước phương tây vốn rất quen thuộc với các loại phô-mai từ sữa bò hay sữa

dê Trước Abe, chưa có một ai tìm hiểu nguyên nhân tại sao Natto có thể lên men từ rơm rạ bọc quanh, quả là môt điều kỳ bí Với kiến thức về vi sinh vật, TS Abe cho rằng đậu nành nấu chín chắc chắn được lên men bằng một loại vi sinh vật “nào đó”

và với phương pháp trích ly, Abe đã tìm thấy 4 loại vi khuẩn (ba loại thuộc họ

Micrococci và một loại Bacillus) đã giúp cho đậu nành lên men dễ dàng (ông ta đã phát hiện Bacillus subtilis là loại men giúp cho đậu nành nấu chín lên men (nhưng

không xác định đó là một loại enzyme có trong rơm rạ bọc quanh Natto) Những khám phá này về mặt khoa học của Abe đã gây được tiếng vang vì nhờ đó giới chuyên môn xác định được tính chất đặc biệt về dinh dưỡng của Natto về phương diện vi sinh

Vào năm 1905 TS Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã thành công trong việc tách 2 loại vi khuẩn Natto từ đậu nành nấu chín, trong đó vi khuẩn gây ra mùi

hương đặc biệt làm hạt đậu lên men (Bacillus Natto) cũng như vi khuẩn tạo chất nhờn rất dẻo dai (Bacillus mesentericus vulgarus) tạo vị ngọt

Bacillus Natto đồng nghĩa với Bacillus Subtilis trong thuật ngữ ngày nay

Nhiều nghiên cứu cho thấy người ta dùng nhiều loại men tương tự để sản xuất Natto nhưng tất cả đều thất bại, sản phẩm Natto này không có mùi và dẻo như Natto sản xuất bằng loại men ủ từ rơm rạ, điều đó giúp các nhà khoa học Nhật Bản xác nhận được rằng con men tạo ra Natto phải là một loại men các đặc tính khác với loại men

Bacillus Subtilis tuy rằng cùng họ

Hiệu quả dinh dưỡng – Thực phẩm chức năng

 Protein (35 – 45%) bao gồm các loại acid amin cơ bản (Isoleucine, Leucine, Lysin, methhionin, Phenylamin, Tryptophan, Valin…)

 Isoflavones (chất Genistein) là một estrogen thực vật ngăn đông máu trong động mạch, chống xốp xương, giúp cho hoạt động của não bộ cho nam lẫn nữ dưới

4 dạng: Aglycone, Daizein, Genistein và Glycitein Mỗi ngày cơ thể cần 50 mg Isoflavones (tương đương với ½ miếng đậu phụ hay 30 gr đậu nành rang) là chất không bị tiêu hủy trong quá trình chế biến, nấu nướng thức ăn Isoflavones được lý

giải như môt hoạt chất chống Oxy hóa, ngăn cản các gốc tự do (free radical) tấn công LDL, giúp cơ thể giảm Cholesterol xấu (LDL), tăng đào thải chúng ra ngoài

và làm giảm nguy cơ suy tim mạch

 Chất béo (15-20%) trong đó acid béo bão hòa thấp (13%), không có cholesterol (acid béo không bão hòa 30%) Lượng acid béo không no cần thiết như acid Linoleic 50% và 7% Alpha Linoleic acid là nguồn cung cấp acid béo chuỗi mạch dài Omega 3 (phát triển não trẻ em) quan trọng cho cơ thể như DHA ( Docosa Hexanoic Acid) và EPA (Eicossa Pentaenoic Acid) có hiệu quả trong việc trị các chứng bệnh về tim mạch, ung thư và nhiều bệnh khác

 Giảm các chứng tiền mãn kinh

 Giảm nguy cơ suy tim

 Ngăn ngừa một số bệnh ung thư: ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến

PHẦN II

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU

Kính hiển vi quang học Máy lắc

2.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật (g/ml)

2.1.3.1 Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống)

 Tất cả các môi trường đều được hấp ở 1atm trong 30 phút

Pha chế thuốc thử Lugol

Cách pha: 1g I2 + 2g KI cho vào 100ml nước cất, khuấy cho tan hết (chỗ tối), sau đó đổ vào lọ tối màu, tránh ánh sáng và thoáng mát

Cách chuẩn bị môi trường

Các thành phần môi trường được hòa tan trong nước cất Đối với môi trường

có agar cần được đun sôi quấy đều sau đó đem thanh trùng Môi trường được thanh trùng trong điều kiện: áp suất 1 atm ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân lập

Trên mẫu thực phẩm lên men Natto, lấy một vòng que cấy dịch nhớt trên bề mặt hạt đậu Cấy ria trên đĩa petri chứa môi trường thạch dinh dưỡng để phân lập vi khuẩn Đem ủ trong tủ ấm hoặc để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ

Sau khi ủ nhiều khuẩn lạc xuất hiện Làm tiêu bản một phần khuẩn lạc và soi kính để xác định hình dạng của vi khuẩn Giữ lại tất cả vi khuẩn Gram (+) có hình

que, sinh bào tử Đây là Bacillus spp

Hình 2.1: Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus từ thực phẩm lên men Natto

2.2.2 Phương pháp giữ giống

Các chủng vi sinh vật đã được phân lập nhiều lần sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng là môi trường giữ giống trong ống nghiệm Bảo quản giống trong ngăn mát của tủ lạnh

Tiến hành

Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm chờ thạch đông Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn phân lập và cấy zic zăc trên bề mặt thạch nghiêng Đậy nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 340C Sau 24 giờ thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40C giữ giống

Giống được cấy chuyển 2 tuần/lần và được hoạt hóa trước khi nhân giống

Hình 2.2: Ống nghiệm giữ giống Bacillus

2.2.3 Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn

Các chủng được quan sát trên môi trường NA bằng mắt thường, và kính hiển

vi quang học Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái được đánh giá dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình dáng, màu sắc, bề mặt và mép khuẩn lạc

2.2.3.1 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc

Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường NA:

- Khả năng phát triển của khuẩn lạc

- Bề mặt khuẩn lạc

- Màu sắc khuẩn lạc

2.2.3.2 Phương pháp làm tiêu bản cố định [3]

Thực hành vô trùng tạo vết bôi:

Trước tiên, khử trùng tay, bàn bằng cồn 700 Thực hiện các thao tác dưới ngọn lửa đèn cồn hoặc trong tủ cấy vô trùng

Hơ nóng đỏ đầu que cấy và phần kim loại Hơ nóng phần tay cầm Làm nguội đầu que cấy ít nhất 5 giây, lấy một ít vi khuẩn trên khuẩn lạc rời ở đĩa petri Đặt vòng cấy chứa vi khuẩn lên chính giữa lam kính và dàn đều vi khuẩn Hơ que cấy nóng đỏ trước khi làm tiêu bản mới

2.2.3.3 Phương pháp nhuộm Gram [3]

Là kỹ thuật nhuộm để tách vi khuẩn ra là 2 nhóm: một nhóm là Gram (+) và một nhóm là Gram (-) Thủ tục dựa trên khả năng vi sinh vật giữ màu tím của crystal violet trong quá trình làm mất màu bằng alcohol Vi khuẩn Gram (-) bị mất màu tím của crystal violet bởi alcohol Vi khuẩn Gram (+) không bị mất màu tím và giữ lại màu tím của crystal violet Sau khi mất màu tím, đỏ safranin được sử dụng tạo màu hồng cho vi khuẩn Gram (-) đã bị mất màu

 Tiến hành nhuộm

Lam kính với vết bôi đã cố định bằng nhiệt

Phủ crystal violet lên vết bôi và giữ trong 20 giây

Sử dụng nước cất rửa sạch vết thuốc nhuộm trong một thời gian ngắn, làm ráo nước thừa

Phủ vết bôi với dung dịch iodine của Gram và giữ 1 phút

Đổ hết dung dịch của Gram và giội tràn vết bôi với ethy alcohol 95% trong 10 – 20 giây Đây là bước quyết định Vết bôi dày sẽ cần khoảng thời gian lâu hơn vết bôi mỏng Sự mất màu xuất hiện khi dòng chảy hòa tan thuốc nhuộm không còn màu

Dừng hoạt động của alcohol bằng cách rửa tiêu bản với nước

Phủ safranin trên vết bôi và giữ trong 20 giây Rửa nhẹ nhàng trong vài giây,

để khô tự nhiên

Soi tiêu bảng dưới vật kính dầu (100×)

2.2.4 Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme cellulase

Sử dụng phương pháp cấy điểm trên môi trường thạch dinh dưỡng có bổ sung CMC 1%, ủ ở nhiệt độ 300C trong 24h Sau đó nhuộm bằng thuốc thử Lugol và đo đường kính vòng thủy phân

2.2.5 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô

Nuôi cấy chủng Bacillus sinh enzyme mạnh nhất trong môi trường lỏng với

CMC 1%, Peptone 5 %, Cao nấm 2,5 % Ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/15 phút, thu dịch enzyme nổi và bỏ đi phần lắng sinh khối tế bào

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase

2.2.6.1 Phương pháp đục lỗ thạch

Môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase là CMC 1%, Agar 2% Lấy dịch enzyme nhỏ vào lỗ thạch, đem ủ trong tủ ấm ở 24 giờ Sau đó nhuộm Lugol và đem đo đường kính thủy phân

2.2.6.2 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử: phương pháp

MILLER [12]

- Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

- Hóa chất

Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate Đun nhẹ cho tan rồi định mức tới 100ml

Dung dịch glucose mẫu (500µg/ml): cân 0,5g D – glucose pha trong nước cất thành 1 lít

- Cách tiến hành

Dựng đồ thị chuẩn glucose:

Từ dung dịch glucose 500 (µg/ml), pha các dung dịch glucose có nồng độ từ

Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng

Dung dịch cơ chất 0,3%: cân chính xác 3g CMC, hòa tan trong dung dịch đệm acetat 0,1N, pH = 5, khuấy trong 2 giờ ở 450C để hòa tan cơ chất, thêm dung dịch đệm cho đủ 1000ml

Dung dịch enzyme thô sau khi thu từ ly tâm (100ml), lấy khoảng 20ml đem đi đun sôi ở 1000C, sau đó làm lạnh nhanh

Hút 0,5ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 0,5ml DNS Đun sôi cách thủy trong 3 phút

Thêm vào 5ml nước cất Đo OD tại bước sóng 540nm

 Cách tính

Đơn vị hoạt độ của enzyme cellulase được xác định như sau: một đơn vị hoạt độ enzyme tương ứng với 1µg glucose trong thời gian thủy phân cơ chất CMC 1 giờ

HđCellulase (đvhđ/ml)

G = G (mẫu không bất hoạt) – G (mẫu bất hoạt)

G: là nồng độ glucose sinh ra trong quá trình thủy phân cơ chất của enzyme cellulase

V: Thể tích dịch enzme cellulase trong phản ứng thủy phân cơ chất