Khố luận tốt nghiệp
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA : SINH HỌC
NGUYEN THI QUANG - K29A
“TUYEN CHON CHUNG VI KHUAN ACETOBACTER XYLINUM CHO MANG DAY, NGHIEN CUU ANH HUONG CUA ETANOL, AXIT AXETIC,
(NH,);SO,, pH,ỨNG DỤNG LÀM THẠCH DỪA ”
KHỐ LUẬN TĨT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Vi sinh vật
Người hướng dẫn :
Thạc sĩ: Nguyễn Khắc Thanh
Hà Nội: 2007
Trang 2
LỜI CẢM ƠN
Để cĩ được sự thành cơng của đề tài khố luận, em đã nhận được sự giúp đỡ tâm huyết và tận tình của các thầy cơ trong bộ mơn VI Sinh tổ thực vật, đặc biệt là sự
giúp đỡ của thầy Nguyễn Khắc Thanh và cơ Đinh thị Kim Nhung cùng các bạn sinh viên, những ý kiến đĩng gĩp của các bạn trong nhĩm vi sinh Em xin được bày tỏ lịng cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất về sự giúp đỡ quý báu đĩ của các thầy cơ, các bạn trong nhĩm vi sinh và người trực tiếp hướng dẫn em là thầy Nguyễn Khắc Thanh
Trang 3Khố luận tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Khố luận tốt nghiệp này được hồn thành đưới sự hướng dẫn tận tình của
thạc sĩ Nguyễn Khắc Thanh Em xin cam đoan rằng: Đây là kết quá nghiên cứu của riêng em
Kết quả này khơng trùng với kết quả của bất kì tác giả nào đã cơng bố
Nêu sai em xin chịu hồn tồn trách nhiệm
Trang 4TOM TAT CONG TRINH
Thạch dừa là sản phẩm được tạo thành trong quá trình nuơi cấy vi sinh Acetobacter xylinum trong mơi trường nước dừa chuyên hố thành
Hemixenluoza, qua chế biến và xử lý cùng với một số nguyên liệu thành thạch dừa Đây là mĩn ăn cổ truyền của một số nước Đơng Nam Á: Philipin,
Malaixia Việt Nam cũng là một trong những xử sở của dừa Bên cạnh các mĩn
ăn được chế biến từ dừa như cơm dừa, kẹo dừa, bánh đa Thì thạch dừa cũng
được khá nhiều người ưa thích Thạch dừa với thành phần chính là
Hemixenluloza, cĩ tác dụng giúp cho quá trình tiêu hố tốt hơn, dưỡng da, chống lão hố, giảm cholesterol trong máu và phịng ngừa một số bệnh ung thư Ở nước ta, việc nghiên cứu ứng dụng vi khuânAcetobacter xylinum và sản xuất
thạch đừa rất ít, xuất hiên một vai cơ sở sản xuất thạch dừa (Thành phố Hồ Chí
Minh) nhưng sản lượng ít trong khi nhu cầu sử dụng thạch dừa ngày càng tăng, hơn nữa nguồn nguyên liệu lại khá dồi dào Đứng trước nhu cầu và tiềm năng đĩ cũng như việc nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum dén viéc ứng dụng tạo nguồn thức ăn từ nguyên liệu sẵn cĩ là một việc làm cĩ ý nghĩa thực tiễn và lý
luận sâu sắc, vì vậy tơi đã chọn và nghiên cứu đề tai:”Tuyén chon chúng vi
khuẩn 4cefobacfer xylinum cho màng dày, nghiên cứu ảnh hướng etanol, axit axefic, (NH¿);SO¿, pH, ứng dụng làm thạch dừa”
Trong đề tài này, từ các nguồn nguyên liệu sẵn cĩ ở trong nước tơi đã phân lập được 60 mẫu, tuyén chon duge 02 ching vi khuan Acetobacter xylinum cho màng dày hơn cả làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo Nghiên cứu khả năng tao mang chon ra hai ching vi khuan Acetobacter xylinum 1a A; va Ag cho mang day nhat
Nghiên cứu tiếp theo là quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang
học
Nghiên cứu động thái phát triển của hai chủng trên
Nghiên cứư ảnh hưởng của etanol, axit axetic, (NH¿)zSO¿x pH tới quá trình tạo màng của hai chủng này
Trang 5Khố luận tốt nghiệp
PHAN 1 DAT VAN ĐỀ 1.1 Ly do chon dé tai
Cũng như các linh vực khoa học khác, cơng nghệ vi sinh mà tiền thân của nĩ là cơng nghệ lên men cơ đã trải qua những chặng đường phát triển đầy khĩ khăn, phức tạp Đã từ rất lâu con người đã biết ứng dụng quá trình lên men trong sản
xuất vào đời sống như: Làm tương, muối dưa, làm bánh mì, sản xuất bia
rượu mà chưa hiểu hết bản chất của quá trình lên men Cho đến gần đây khi
trên thị trường đã xuất hiện một loại thực phẩm mới đĩ là thạch dừa Đây là một
loại thực phẩm được khá nhiều người ưu thích và bổ đưỡng: Giúp cho quá trình tiêu hố tốt hơn, dưỡng da, giảm cholesterol trong máu, chống lão hố, ngăn ngừa một số bệnh ung thư Tuy nhiên trong nước mới chỉ một vài cơ sở sản xuất, trong khi nhu cầu sử dụng thạch đừa ngày càng cao, hơn nữa nguồn nguyên liệu thơ để sản xuất lại khá đồi đào và cũng rất khĩ dé bảo quản nước dừa Đứng trước tiềm năng và nhu cầu ấy chúng tơi đã chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài:
:°Tuyễn chon ching vi khuẩn Acetobacter xylinum cho mang day, nghién
cứu ảnh hưởng etanol, axit axetic, (NH,);SO„, pH, ứng dụng làm thạch dừa” 1.2.Mục tiêu của đề tài
Từ các nguồn nguyên liệu: Bia, rượu vang, hoa quả, giấm tiến hành phân lập tuyển chọn các chủng cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men
1.3.Nhiệm vụ
Phân lập tuyển chon cac ching vi khuan Acetobacter xylinum cho mang day, tir đĩ chọn ra hai chủng cho màng dày nhất làm đối tượng nghiên cứu
Tìm hàm lượng của etanol, axit axetic, (NH¿);SO¿, pH thích hợp cho sự phát
triển của hai ching Acetobacter xylinum tuyển chọn được
1.4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hố của các
chung Acetobacter xylinum co khả năng cho màng dày
Trang 6Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.1 Lược sử nghiên cứu và phân loai vi khuan Acetobacter xylinum
(A.xylinum)
2.1.1.Lược sử nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum
Người ta thường gọi quá trình chuyên hố rượu thành axit axetic là quá trình lên men axetic, nhưng thực chất đấy là một quá trình oxi hố, vi khuẩn gây ra quá trình này là vi khuẩn axetic thuộc giống 4cefobacter Trước đây con người mới chỉ ứng dụng quá trình này để làm giấm từ rượu vang hỏng một cách thụ động mà chưa hề biết đến cơ chế và bản chat cud no Tuy vay tới những năm đầu của
thế kỉ 19 con người đã điều chế được axit axetic đậm đặc, biết giấm là sản phẩm
lên men của nhĩm vi sinh vật mà ngày nay chúng ta goi la Acetobacter hay vi
khuẩn axetic Từ đĩ đến nay đã cĩ rất nhiều khoa học nghiên cứu về loại vi
khuẩn này
Người đầu tiên nhìn thấy vi sinh vật là Antoni Lơvenhuc (1632-1723) và Person (1822) là người đầu tiên nghiên cứu về axit axetic từ lớp màng mỏng phát triển
trên giám Ơng đã chứng minh được đĩ là một loại vi sinh vật cĩ tên là
Mycoderma axetic
Nam 1973 Kittzing nhan xét quá trình lên men giấm nhất thiết phải cĩ vi sinh vật, như vậy ơng đã khẳng định rõ vai trị của vi sinh vật trong quá trinh lên men giám Cùng năm đĩ, Hansen cung tách được hai loại vi khuẩn thuần khiết từ mangf giấm ong goi dé la Mycoderma aceti va Mycoderma pasteurianum Nam (1862-1868) L.pasteur là người đầu tiên khám phá ra cơ chế của quá trình
lên men axetie, đĩ là một quá trình oxI hố rượu etylic Ơng đã chứng minh sự
đúng đắn trong nhận xét của Kittzing & Hansen, khẳng định bản chất của quá
trình lên men axetic Với việc sử dụng kính hiển vi bởi Lơvenhuc thì nhận thức về sự tồn tại của thế giới vi sinh vật mới thực sự bắt đầu, nhờ đĩ Pasteur đã xem
xét sự xuất hiện màng trên bia và rượu vang một cách kỹ lưỡng Cuối cùng ơng
kết luận màng đĩ được tạo thành do một loại trực khuẩn (màng là tập hợp những
tế bào trực khuẩn) và ơng cũng gọi là Mycoderma aceti
Trang 7Khố luận tốt nghiệp
2.1.2.Phân loại vỉ khuẩn Acetobacter
Từ trước tới nay đã cĩ rất nhiều tac gia dé cập đến vấn đề này trong đĩ đáng chú ý nhất là khố phân loại của Beijerinck Ơng phân loại vi khuẩn dựa vào hai dấu
hiệu
Một là: Kha nang str dung dam amoni để thực hiện sự sinh trưởng và phát triển
Hai là: Cĩ hay khơng cĩ giai đoạn di động trong quá trình phát triển
Năm 1962 Heneberg đã chia tất cả các vi khuẩn axetic thành 4 nhĩm theo nơi sống đặc trưng của chúng
Nhĩm I: Vi khuẩn khơng phát triển trên bia vì hoa Hublon độc với chúng
Nhĩm 2: Vi khuẩn phát triển trên bia
Nhĩm 3: Vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang Nhĩm 4: Vi khuẩn để sản xuất giắm theo phương pháp nhanh
Năm 1934, theo nghiên cứu của hội nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ, các vị khuẩn
axetic cĩ khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ
nên đã kết hợp vào họ Nitrobacteriaceae Tir do vi khuân giấm giữ tên là
Acefobacter Năm 1848 Vanght cơng bố kết quả của mình khi ơng quan sát thay
được sự di động của nhiều loai Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum,
Acetobacter oxydans, Acetobacter malanogenum
Vanght đã giải thích rang các lồi trên cùng một loại cĩ đơn mao ở cực và đã xác
nhận vị trí của vi khuẩn axetic trong ho Pseudomonadaceae
Ngày nay theo khố phân loại của Bergeys và nhiều tác giá khác đã xếp vi
khuan Acetobacter va Gluconobacter vao ho Acetobacter iaceae
Nam 1914 Bergeys phan loai cac loai trong giéng Acetobacter thanh hai loai
- Loai 1: Oxi hoa axit axetic thành CO; và H;O
+ Loại này sử dung muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất, đại diện là vi khuân
Acetobacter aceti
+ Khơng sử dụng muối amoni làm nguồn nito duy nhất
Trên bề mặt mơi trường dịch thể tạo màng nhày cĩ chứa xenluloza, điển hình là acetobacter xylinum
Trên bề mặt mơi trường dịch thé khơng tao mang nhay chita xenluloza, dàng
Trang 8_ Loại 2: Vi khuẩn khơng oxi hố axit axetic +Tạo thành sắc tố trên mơi trường glucoza
Sắc tố nâu tới đen nhạt : Acetobacter malanogenus Sắc tố hồng: Acefobacter zancens
+ Khơng tạo thành sắc tố
Nhiệt độ thích hợp nhất là 30-35°C: Acetobacter suboxydans
Nhiệt độ thích hợp giưa 18-21°C :Acetobacter oxydans
Năm 1960 Shiwel và Car nghiên cứu về đặc trưng nuơi cấy sinh hố của vi khuan Acetobacter va dua ra két luan khong thê cĩ sự đồng nhất các vi khuẩn Acetobacter Tư những nghiên cứu về 4cefobacter người ta đã khơng ngừng phát huy vai trị của nĩ trong đời sống con người Nhu cầu của con người vè sử dụng Acetobacter ngay càng đa dạng và chúng được sử dụng nhiều trong các cơng trình khoa học phục vụ nhu cầu hàng ngày như: lên men giám, chế biến thức ăn,
sản xuất vitaminC, Bị, Ba, By, sản xuất tơ nhân tạo
2.2 Đặc điểm chung về vi khuẩn 4cefobacfer|2]
Ngày nay người ta đã biết vi khuân 4cefobacter là tác nhân chính của quá trình lên men axetic Chúng thuộc vào 2 giống vi khuẩn Acetobacter chu mao hoặc khơng bà Giwconobacter đơn mao Đây là 2 giống vi khuan axeticquan trọng nhất trong họ Acetobaccter iaceae Ching phé bién trongty nhiên, cĩ trên
bề mặt lá, hoa quả chúng tạo ra axIx axetic từ rượu etylic
Trong té bao Gluconobacter khơng cĩ chu trình tricacboxylic hoạt động nên nĩ khơng thê oxi hố axetat nhưng cĩ một chu trình khác thay thế( chu trình glyoxylat)
Khong oxi hoa axit axetic
Khi so sánh vi khuẩn này với những vi khuẩn thuộc giồng pseudomonas
thấy cĩ đặc điểm tương tự Chúng chỉ khác pseudomonas ở chỗ chịu được độ
axit cao hơn, khă năng chuyên hố pepton yếu ít di động và khơng sinh sắc
tố.Nhiều loại vi khuẩn Acetobacter khi phát triển trên mơi trường thiếu thức ăn hoặc mơi trường đã nuơi cấy lâu dễ làm biến đổi hình thái thành dạng cĩ hình
thái đặc biệt
Vi khuan Acetobacter 6 dạng hình que, cĩ thé cĩ tiêm mao, di động,
Trang 9Khố luận tốt nghiệp
Trên cơ sở dựa vào tính chất đặc trưng của vi khuẩn 4ceobacer mà người ta xếp chúng vào nhĩm độc lập là khả năng oxi hố rượu etylic thành axit axetic, pH=4,5 Ngồi ra chúng cịn thực hiện quá trình oxi hố khơng hồn tồn các
hợp chất hữu cơ khác để tạo thành các hợp chất xeton,
Vi khuan Acetobacter chỉ phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ
thích hợp từ25-30°C, pH thích hợp 5,4-6,8 hố dị dưỡng hữu cơ [10,15]
Đặc điểm phan biét Acetobacter va Gluconobacter So sanh với
Pseudomonas
Dac diém so sanh Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas ¬ Đơn mao ở cực hoặc Chu mao hoặc Chu mao ở VỊ trí tiêm mao ˆ
khơng khơng cực
Phát triển ở + +
pH=4.5 =
Oxy hố etanol + +
pH=4.5 —
Oxy hoa axit : + +
axetic —
Oxy hố lactat — + +
Glucoza -> + + + Gluconate Su dung tinh bét + lactose ~ ~ ~ Su dung Gelatin — _ + Sắc tơ huỳnh + quang — ~ s
Về hình dạng tế bao, vi khuan Acetobacter la những trực khuẩn hình que,
kích thước trung bình từ 0,6-0,8um Các tế bào đứng tách riêng hoặc xếp thành chuỗi, loại đặc biệt cĩ tế bào hình cầu tuỳ thuộc vào điều kiện pH mơi trường
„nhiệt độ nuơi cấy [2J.Vi khuẩn Acefobacfer khơng cĩ khả năng sinh bào tử, tạo
Trang 10màng nhày, một số cĩ khả năng di động nhờ tiêm mao,một số khơng cĩ khả năng
này
Khi nghiên cứu về khuẩn lạc và mang vi khuan Acetobacter trén méi trường cấy cho thay vi khuẩn Acetobacter phát triển tốt trên mơi trường nước bia, các mơi trường cĩ chứa cao nắm men:glucoza, rượu etylic, hoặc manitol Trên mơi trường đặc chúng phát triển những khuẩn lạc trịn đều đặn đường kính trung bình là 3mm, bề mặt trơn bĩng, phần giữa khguẩn lạc nơi lén day va sam hơn các phần xung quanh Một số loại cĩ khuẩn lạc lớn(đ=4-5mm) bề mặt trơn bĩng khơng cĩ màu, mỏng như hạt sương nhỏ đễ dàng dùng que cấy gạt ra khỏi mơi truường
Trên mơi trường lỏng vi khuẩn axetic phát triển tạo thành lớp màng Dung dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt Khi nghiên cứu lớp màng này người ta thấy cĩ sợi xenluloza giống như ở trong sọi bơng
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuân axetic đối với nguồn cacbon, nitơ và các chất sinh trưởng rất đa đạng Chúng sử đụng đường, rượu etylic, axit hữu cơ làm nguồn cacbon, muối amoni làm nguồn nitơ Trong quá trình phát triển chúng cĩ nhu cầu đối với một số axit amin, chất kích thích sinh trưởng
Một số lồi vi khuẩn cĩ khả năng tơng hợp các chất cao phân tử:xenluloza, tỉnh bột .Con người đã ứng dụng điều này trong sản xuất cơng nghiệp
Vi khuẩn axetic cĩ khả năng oxi hố gluxit theo mấy hướng sau:
-Hướng 1: Khơng cĩ sự photphoril hố cơ chất với sự tham gia của enzym đặc hiệu
-Hướng 2: Oxxi hố các cơ chất đã được photphoril hố trong con đường pentozo photphat
-Hướng 3: Theo sơ đồ của Entenr-Doudoroff -Hướng 4: Theo chu trình Krebs hoặc Glyoxylat
2.3.Một số loại vi khuẩn Acetobacter[10,15]
2.3.1.Acetobacter xylinum
Là những trực khuẩn hình que (2um), đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi,
khơng di động các tế bào được bao bọc bởi chất dầy, tạo váng nhanh khá dày, bắt
màu xanh với thuốc nhuộm lốt và H;SO¿
Trang 11Khố luận tốt nghiệp
Trực khuẩn hình que khơng di động, bắt màu gram âm màu vàng với
thuốc nhuộm lốt Chúng tạo khuẩn lạc sám trên gelatin với dịch lên men chứa
10% đương xacaroza thường phát triên trên bia
2.3.3.Acetobacter Pasteurianum
Bắt màu xanh với thuốc nhuộm lốt, tao thành váng khơ và nhăn nheo Tế bào xếp rời nhau thành chuỗi, nhiệt độ thích hợp là 30°C
2.3.4.Acetobacter kiitzingianum
Là vi khuẩn cĩ màng nhầy, nhẫn ở mép và được nâng lên theo thành bình Trực khuẩn ngắn, to, thơ, khơng đi động, tạo thành màng xếp nếp trên các mơi trường lỏng
2.3.5.Acetobacter acetosum
Cac té bao xép riêng rẽ thành từng chuỗi, khơng di động, nhiệt độ thích
hợp 30-> 36°C
2.3.6.Acetobacter scutzenbacri
Cĩ dạng hình que, thường đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đơi, cĩ thể tạo thành những dang tế bào đặc biệt Trong mơi trường cĩ thể tích luỹ tới 11,5%
axit axetic
2.3.7.Acetobacter lindsni
Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo thành chuỗi, đơi khi bắt gặp các tế bao phinh to như hình cầu Trên các mơi trường lỏng, váng vi khuẩn cĩ màu vàng nâu, nhớt
2.3.8.Acetobacter subxydans
Dạng hình que, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi ngắn, khong cé kha năng đi động, tạo thành những màng mỏng dễ tan vỡ
2.3.9.Acetobacter hoshiakii
trực khuẩn, thường xếp riêng rẽ, khơng di động Khuẩn lạc trên thạch với
chất chiết rút đậu nành nhỏ, trịn, ở dạng hạt sáng, sau đĩ chuyên màu nâu Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên mem trịn, màu trắng sữa, về sau ở giữa hố
nâu, phần ngồi màu vàng nhạt
2.3.10.Acetobacter ascendens
Truc khuan khơng di động, các khuẩn lạc trên Glucoza, gelatin khơ, trắng,
Trang 122.3.11.Acetobacter oxydans
Trực khuẩn, các tế bào rời nhau, cĩ khả năng di động, khuẩn lạc trên
gelatin trịn, sau đĩ thành những dạng khơng phân nhánh đặc trưng 2.3.12.Acetobacter pÏlicatum
Trên vài mơi trường chúng được nhộm màu như nhau Ở 28->30°C tạo
thành những khuẩn lạc phơng to kéo dài, khuẩn lạc trên gelatin rượu vang trịn,
hơi nhơ lên, âm ướt
2.3.13 4cefobacter orleanense
Trực khuẩn dài trung bình, gặp nhiệt độ cao cĩ thê sinh ra dị hình kéo đài,
hoặc phình to ra, váng vi khuẩn tạo ra rất dày ở trên mơi trường lỏng Tích luỹ được 4,5% axit axetic, thường dùng để sản xuất rượu vang
Tĩm lại
Các loại Acefobacrer thường phát triển tốt ở nhiệt độ 25-> 30°C Một số
loại cĩ khả năng tổng hợp vitamin B,, Bo, một số loại cĩ khả năng chuyên hố
rượu socbit thành đường socboza Chúng được sử dụng trong cơng nghiệp dược phẩm sản xuất vitamin C, cĩ khả năng oxi hố rượu thành axit axetic
Dựa vào đặc điểm trên người ta ứng dụng sản xuất đối với từng chủng nhưng trong sản xuất để quá trình lên men đạt hiệu quả cao khơng dùng hỗn hợp nhiều loại vì trong hỗn hợp cĩ thê gặp loại oxi hố axit axetic trong khi mơi trường vẫn cịn rượu etylic
2.4.Cơ sở khoa học của sự lên men axetic
Người ta gọi quá trình chuyên hố rượu thành axit axetic là quá trình lên men axetic hay lên men giấm [5.6] Nhưng thực ra đây là quá trình oxi hố khử
nhờ một nhĩm vi khuẩn thuộc chỉ 4cefobacfer chúng thuộc hai giống
Acetobacter chu mao hoac khéng và gluconobacter don mao
Bản chất sinh học của quá trình chuyên hố rượu etylic thành axit axetic
được Kiittzing nêu lên đầu tiên vào năm 1838, đến năm 1868 Pasteur đã xác
Trang 13Khố luận tốt nghiệp
Giai đoạn 1: Rượu etanol được chuyên thành axetaldehit Giai đoạn 2: Axetaldehit được hydrat hố thành axit axetic
Tiếp theo đĩ cĩ nhiều tác giả nghiên cứu về cơ chế quá trình này
Trên cơ sở đĩ các tác giả đã xây dựng được một sơ đồ chung cho quá trình oxy hố này
Rượu etylic dưới tác dụng của enzym oxi hố khử bị oxi hố đến
axetaldehit, axetaldehit tiếp tục bị các alhidròenaza oxi hố đến axit axetic
Trong quá trình này các điện tử được giải phĩng đều được chuyền đến các
coenzym của các enzym này như: NADP-> NADPH; Phương trình tổng quát của quá trình lên men như sau
CH;CH;OH + O; -> CH;COOH + HO + 494.4 (KJ) hoặc 117 Kcal Acetobacter 1a vi khuan hiếu khí cĩ khả năng oxy hố các cơ chất trong
điều kiện hiếu khí nhưng lại tạo ra các sản phẩm chưa được oxy hố hồn tồn
như axit axetic, giống như sản phâm lên men kị khí nên người ta gọi là quá trình oxy hố khơng hồn tồn [15]
2.5.Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men axetic
2.5.1.Nhiệt độ
Vi khuẩn axetic thuộc nhĩm ưu 4m nhiệt độ thích hợp là 25 -> 30°C Néu
nhiệt độ quá thấp sẽ làm quá trình lên men diễn ra chậm, cong khi nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn và đến một mức nào đĩ thì quá trình sinh sản
của vi khuẩn sẽ bi đình chỉ làm giảm hiệu suất của quá trình lên men [10,15] 2.5.2 Ảnh hướng của các hợp chất vơ cơ và hữu cơ
2.5.2.1 Sự axit hố dịch lên men
Trong quá trình sản xuất giẫm người ta thường đưa vào cơ chất ban đầu một lượng giấm nhất định để axit hố mơi trường nhằm mục đích: Ngăn cản sự
phát triển của vi sinh vật cĩ hại và đưa vào dịch lên men một lượng vi khuẩn
nhất định
Độ axit ban đầu cĩ thể dao động từ 2->6% Theo nghiên cứu của Eapen và
Rao 1979 thì hiệu xuất cao nhất đạt được ở độ axit ban đầu của cơ chất là 2%
Trang 142.5.2.2 Hàm lượng etylic trong dung dịch lên men
Rượu etylic được sử dụng như một cơ chất, hàm lượng cĩ thể thay đổi từ 2
-> 10 %, nếu hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men
Dé tránh hiện tượng oxy hố tiếp tục axit axetic thành CO› và HạO cần một lượng rượu sĩt trong sản phẩm từ 0.2-> 0.5% Lượng rượu này cĩ tác duụng
ức chế tổng hợp enzym oxi hố axit axetic và muối axetat [10]
2.5.2.3 Ảnh hưởng của các hợp chất chứa C, N, P
Để quá trình lên men xảy ra nhanh trong dung địch lên men, ngồi glucoza, rượu etylic, đung dịch lên men cần được bổ sung một số muối khống
như: (NH¿);SO¿, (NH¿);HPO¿, KH;PO¿, MgSO¿7HO, CaHPO¿ tuỳ theo nhu
cầu cụ thể của từng loại Ngồi ra can bé sung thêm vitamin và chất kích thích
sinh trưởng như pepton, cao nắm mem, cao thịt [7, 8, 9, 10]
2.5.2.4 Ảnh hưởng của oxy
Theo cơ chế của quá trình lên men dé oxy hố một mol rượu cần một mol
Oz.Trong thực tế nhiều tác giả cho thấy lượng oxy cần thiết phái lớn hơn gấp đơi lượng oxy lý thuyết Thực tế cho thấy, càng thống khí, năng suất cảng cao Vi vậy quá trình lên men kéo dài 3 ->5 tuần, nồng độ giắm thu được 3 -> 7 % axit axetic Trong khi đĩ phương pháp tuần hồn nhờ tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn lên quá trình rút xuống 5 ->7h Ở phương pháp chìm thời gian chỉ cịn 3->4 ngày
[10]
2.6.Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter 2.6.1 Địa điểm nơi phân lập
2.6.2 Đặc điểm hình thái
Quan sát hình dạng và cách sắp xếp té bao, sự hình thành vỏ nhay, tiém
mao, khả năng di động, màu sắc tế bào khi nhuộm gram, khả năng sinh bào tử
2.6.3 Đặc điểm nuơi cấy
Trang 15Khố luận tốt nghiệp
2.6.4 Đặc điểm sinh lý
Bao gồm quan hệ của vi khuẩn với nhiệt độ, pH của mơi trường, khả năng
hình thành sắc tố, kị khí hay hiếu khí, khả năng lên men Cần đi sâu nghiên cứu một số đặc điểm sinh hố, phương pháp hiện nay đang được là tính và so sánh ty
A+T G+X
lệ hoặc trong tế bào hoặc nhân [3] G+X T
Trang 16PHẢN 3 ĐĨI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu
Đĩ là các chủng vi khuẩn zcefobacfer xyÏinum thuần khiết được phâ lập từ
màng giấm, nước đừa và dịch hoa quả 3.2.Hố chất và mơi trường
© Hoa chat
Cac loai duong; Glucoza, Xacaroza, Fructoza
Một số chất vơ cơ như: KạHPO¿, KH2PO4, MgSO,7H,0, (NH4)2SO4,
(NH¿);HPO¿, CaCO;, NaOH
Một số chất hữu cơ như: Rượu etylic, axit axetic, pepton, agar
Dụng cụ và thiết bị: Hộp lồng, ống nghiệm, pipec, bàn trang thuỷ tinh, que
cấy, đèn cồn, các loại bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, tủ sấy, buồng vơ
trùng, cân phân tích, kính hiển vi
e Mơi trường
MTI dùng cho phân lập MT2: Tuyển chọn
Trang 17Khố luận tốt nghiệp MT3: Moi ` :A MT4: Thử khả năng tạo trường nghiên „ mảng cứu
Nước máy 1000ml Nước dừa 1000m1]
C¿H¡zOs 20g SA(amonisunfat) 0,8% pepton 5g DAP(amoniphotphodipazic) 0,2% (NH¿);SO¿ 8g Sacaroza 2% K;HPO¿ 5g (NH¿);HPO¿ 2g MgSO/7HO 2g
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập các chúng vi khudn Acetobacter theo phương pháp của Vinogradski
Để cĩ các chủng vi khuẩn 4cefobacfer chúng tơi tiễn hành phân lập chúng từ
các dịch lên men như: giấm, nước hoa quá, bia, nước dừa Nguồn nguyên liệu
này được pha lỗng trên mơi trường 3 Xác định hàm lượng đường, rượu
etylic, axit axetic trên cơ sở đĩ chuẩn bị mơi trường cĩ thành phần thích hợp,
cĩ đủ dinh dưỡng, nguồn cacbon, nitơ, rượu etylic tạo điều kiện cho chúng
phát triển tốt Mơi trường lên men được pha chế, phân vào các bình tam giác hoặc bình cầu, khử trùng trong nồi hấp 6 0,5 at, dé nguội, bổ sung rượu etylic đưa vào tủ âm cĩ nhiệt độ 28-30°C trong 7-15 ngày Vi khuẩn axetic là loại hiểu khí vì vậy trên mơi trường lỏng bao giờ cũng tạo thành màng, màng đĩ
chính là tập hợp tế bào vi khuân axetic Tiếp đĩ chúng tơi thu nhậnvi khuẩn
axetic Sau khi đã cĩ dịch lên men, để cĩ được các chung vi khuẩn thuần
khiết, đầu tiên sử dụng phương pháp pha lỗng pasteur, Việc pha lỗng được thực hiện với dung dịch NaCL 0,5% vơ trùng hoặc nước cất, pipet vơ trùng,
ống nghiệm vơ trùng(I0 ống) Cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất, dùng
Trang 18dịch pha lỗng cĩ nồng độ 10” Cứ tiếp tục như vậy hết 10 ống nghiệm ta được các dung dịch pha lỗng từ 10 dén 107° Các mức pha lỗng này quyết
định số lượng vi sinh vật dự kiến ban đầu cĩ trong mẫu
Sau khi cĩ dung địch pha lỗng tiến hành phân lập trên mơi trường thạch đĩa(mơi trường I) Ta dùng pipet hút I lượng nhỏ dung dịch pha lỗng ở mức độ nhất định( thường 10”- 10”), mở nắp đĩa khơng quá to, nhỏ I giọt dung dich pha lỗng vào Dùng bàn trang vơ trùng, trang một lượt đều khắp mặt thạch, thực hiện trong tủ cây vơ trùng Tuy nhiên mơi trường thạchđĩa trước đĩ phải được khử trùng bằng nồi hấp ở 0,5 at trong thời gian 3 ngày liên tiếp,
sau đĩ đồ ra hộp lồng đề đơng lại mới tiến hành phân lập Các dụng cụ khác
cũng phải được khử trùng bằng nồi hấp sau đĩ sấy khơ
Sau khi phân lập được 4-7 ngày thì trên mơi trường xuất hiện những khuẩn lạc mọc riêng rẽ Chọn những khuẩn lạc cĩ vịng phân giải lớn đường kính từ
0,8mm trở lên [2,6,11,12,13]
3.3.2 Tuyén chon cac chung vi khuẩn Acetobacter thuan khiét
Dùng que cấy( đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cơn) gợt lấy từng khuẩn lạc riêng rẽ và cấy vào các ống thạch nghiêng( mơi trường 2) Mơi trường này cũng phải được khử trùng bằng nồi hấp ở 0,5 at thời gian 30 phút trong 3 ngày, sau dé da vào các ống nghiệm đặt nghiêng để nguội, mơi trường đơng
lại là được Mỗi ống là một mẫu, mẫu nuơi được mã hố dưới 1 kí tự riêng để vào tủ ấm Sau 5-6 ngày các chủng vi khuẩn này sẽ phát triển theo đường cấy
Tiếp theo làm mẫu tiêu bản nhuộm gram và quan sát hình dạng tế bào dưới
kính hiển vi, cách làm như sau:
Bước 1: Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đĩ rửa lại bằng HCL hoặc
H;SO¿ Cuối cùng rửa lại bằng cồn, nước cất và lau khơ
Bước 2: Nhỏ | giọt nước vơ trùng lên lam kính, dùng que cay da khử trùng lấy 1 ít vi khuẩn trong ống nghiệm hồ vào giọt nước vơ trùng trên lam kính Hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn để cĩ định vết bơi
Trang 19Khố luận tốt nghiệp
cồn(20s) rửa lại bằng nước Nhỏ dung địch Fuchsin lên giữ trong 1-2 phút, rửa nước, hong khơ tự nhiên
Mục đích của phương pháp này là để phân loại vi khuẩn: phân loại vi khuẩn
gram am (Gr )va vi khuan gram duong(Gr’) Nếu sau khi nhuộm kép mà tế
bào bắt màu hồng thì đĩ là vi khuẩn Gr, nếu bắt màu tím là vi khuẩn Gr’ Vi
khuẩn Gr’ la do chất nguyên sinh của tế bào được cấu tạo từ loại protein đặc biệt cĩ chứa muối nucleatmagie Muối này cĩ khả năng tạo với tím gentian và lugon thành một phức chất bền khĩ bị rửa trơi bởi cồn nên khi quan sát tế bào vi khuẩn Gr” bắt màu tím( màu của gentian) Trong khi đĩ những vi khuẩnGrˆ khơng cĩ khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm gentian và lugon nên đễ bị rửa trơi bởi cồn Do đĩ khi nhỏ fuchsin lên tế bào
vi khuẩn Gr’ sé bat mau hồng( màu của fuchsin)
Cĩ thể so tuyén cdc ching vi khuan Acetobacter bằng cách thử khả năng oxi hố etanol trên 2 mơi trường A và B
Mơi trường A: Dịch chiết nắm men 3%, CaCO; 2%, agar 2%, nrou etylic 15%- 2ml Khi nhân giống vi khuan axetic nếu 1a Gluconobacter sé tạo một vịng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là 4cefobacier vịng sáng rõ hơn nhiều và cĩ một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc hướng về phía vịng sáng
Mơi trường B: Dịch chiết nắm men 3%, agar 2%, xanh lục Bromclesol Iml
cua dung dịch 2,2%, rượu etylic 15%- Iml
Khi cấy giống vi khuẩn axetic néu 1a Gluconobacter no sé lam cho moi
trường biến thành màu vàng Nếu là 4cefobacrer cũng làm biến đổi mơi
trường thành màu vàng nhưng cĩ một váng màu xanh lơ do quá trình oxi hố cac axit[ 12]
Đề giữ giống cần tiến hành cấy chuyền 2 tháng 1 lần từ ống thạch nghiêng
này sang ơng thạch nghiêng khác [11, 12, 13]
3.3.3 Phương pháp tuyển chọn các chúng vỉ khuẩn A xylinuim cho màng dày
Trang 20Cay cac ching vi khuan Acetobacter thuan khiét duoc lựa chọn bằng 2 phương pháp trên ở các ống thạch nghiêng sang mơi trường nước dừa( mơi trương 4), sau đĩ:
- _ Quan sát quá trình hình thành mang và đo độ dày màng khi màng đạt độ
dày nhất định
- Quan sat đặc điểm màng tạo thành trên mơi trường lỏng, day hay mong, nhăn hay trơn, dễ vỡ hay dai, cĩ ăn thành bình hay khơng
- Quan sat hinh dang té bao trén kinh hién vi
- _ Xác định hàm lượng axit axetic tạo thành của mỗi mẫu vi khuẩn 4
xylinum
- Quan sat mơi trường nuơi cấy đục hay trong
-_ Nghiên cứu đặc tính sinh lí của các chủng đã chọn được
3.3.4 Phương pháp xác định số lượng tế bào của các chủng vi khuẩn Acetobacter
Để xác định số lượng tế bào vi khuẩn trên mơi trường cấy nhanh, đơn giản, chúnh xắct dùng phương pháp đếm số lượng tế bào trên buồng dếm hồng cầu Dụng cụ dùng để đếm là buồng đếm Goriaep Đĩ là một phiến kính đày cĩ các đường kẻ ở giữa để chia thành 400 hình vuơngcĩ diện tích tơng cộng là 1400m” Cách tiến hành: Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha lỗng canh trường ở các mức độ 10”- 107 tuỳ theo giai đoạn phát triển của vi khuẩn trong mơi trường mà pha lỗng ở độ pha lỗng khác nhau Dùng pipet vơ trùng nhỏ l giọt vào khe hở giữa 2 lưới đếm và lamen
-Cách đếm: Đếm trong 5 ơ lớn chéo nhau hình dấu (x) Đếm 4 ơ ở 4 gĩc và l ơ ở giữa Đề đám báo độ chính xác đếm lặp lại 3-4 lần
Cách tính số lượng tế bào : X=a.50xf
X: Số lượng tế bào trong 1ml canh trường A: Số tế bào trung bình cĩ trong 1 ơ F: Hệ số pha lỗng
Trang 21Khố luận tốt nghiệp M=*Š® Xi Túi M: Tb cộng các chỉ số tạo thành X; Chỉ số tạo thành n: Số lần thí nghiệm
3.3.5.2.T rung bình bình phương các sai biệt cho biết số lần thí nghiệm thu được
x Xi-M)2 sai khác nhau nhiêu hay ít 5 = >x@¡-M3 n- : ï )
õ: Trung bình bình phương các sai biệt của chỉ số tạo thành
3.3.5.3: Sai số đại điện trung bình cộng
ở
vn
tm =
3.3.5.4 Hệ số biến thiên trung bình cộng các chỉ số tạo thành
ổ
Trang 22PHAN 4 KET QUA NGHIEN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập vi khuẩn acetic từ màng của bia, chuối, giắm, nước dừa, tuyến chọn các chủng vi khuẩn 4 xylinum
Để tiến hành phân lập, trước tiên chúng tơi tiến hành làm dịch lên men Cho vào bình cầu hoặc bình tam giác cĩ dung tích 500 ml khống 200 ml nước hoa qua hoặc giấm, thêm vào đĩ 1 ml rượu etylic và axit hố mơi trường
bằng 2 ml axetic, cĩ thể cĩ vai lát chuối tiêu chín đã bĩc vỏ với mục đích
cung cấp thêm nguồn gluxit, vitamin cho vi khuân axetic phát triển, đạy bằng nút bơng, cho vào tủ ấm 30°C Sau 5-7 ngày trên bề mặt thống của bình cầu sẽ xuất hiện lớp màng màu trắng, màng đĩ chính là tập hợp tế bảo vi khuẩn axetic cĩ trong dịch lên men từ các nguồn nguyên liệu kể trên[1 1,12,14] Hình I :Mẫu dịch lên men từ nguồn nguyên liệu là giắm
Trang 23
Khố luận tốt nghiệp
Khi đã cĩ dịch lên men tơi tiến hành phân lập tạo các mẫu vi khuẩn 4cefobacfer
Để phân lập được các vi khuẩn acetic ta dùng que cấy hoặc đũa thuý tỉnh đã vơ trùng lấy dịch chiết lên men hoặc lấy 1 lượng màng nhất định cho vào nước vơ trùng đánh tan đều Tiếp theo tiến hành pha lỗng theo phương pháp pasteur ở các độ pha lỗng khác nhau từ 10” -10”° Sau đĩ gieo cấy trên mơi trường thạch
dia (mt 1) đã được hấp để khử trùng dé tach khuẩn lạc riêng rẽ Sau khi phân lập
được 4-7 ngày trên bề mặt mơi trường thạch đĩa xuất hiện những khuẩn lạc cĩ kích thước to nhỏ khác nhau Hầu như các khuản lạc cĩ đường kính từ 0,6-2,4
mm, bề mặt trơn bĩng, phần giữa dày lên va sam màu hơn các phần xung quanh Cũng cĩ dạng bề mặt xù xì, nhăn nheo
Hình 2 : Khuan lac vi khuan acetic ở độ pha lỗng 10”
Trang 24
Sau khi đã cĩ khuẩn lạc trên mơi trường thạch đĩa dùng que cấy đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn got lay từng khuẩn lạc riêng rẽ Mỗi khuẩn lạc cấy trên 1 ống thạch nghiêng và là 1 mẫu , mỗi mẫu được mã hố bằng 1 kí tự riêng Sau | thoi gian phân lập và tuyên chọn liên tục tơi đã tuyển chọn được 60 mẫu vi khuẩn acetic từ các nguồn nguyên liệu nĩi trên Sau 3-5 ngày các tế bao này phát triển theo đường cấy
Hình 3 : Vi khuẩn acetic trên mơi trường thạch nghiêng
Tiếp theo tơi tiến hành nuơi cấy 60 mẫu vi khuẩn này vào mơi trường số 3 Khi nuơi cây được 15 ngày cần kiểm tra khả năng oxi hố etanol và xác định xem các mẫu đĩ là 4cefobacter hay Giuconobacter Trong 60 mẫu đĩ tơi xác
định được 6 mẫu là chủng vi khuan Acetobacter xylinum So sanh với đặc
diém cia vi khuan A.xylinum toi thay vi khuan A.xylinum 1a loai true khuan
hình que 2um đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, khơng di động, các tế bao
được bao bọc bởi chất nhay tạo váng nhăn và dày, bắt màu xanh với thuốc
nhuộm Iot và HaSOa
Trang 25
Khố luận tốt nghiệp
Căn cứ vào đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hố của vi khuẩn 4 y/inm tơi
khẳng định 6 chủng đã chon la vi khuan A.xylinum, ki hiệu từ AI-> A6
4.2 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái sinh lí, sinh hố của vi khuẩn
A, xylinum
Tơi dùng 6 chủng vi khuẩn 4 xyimum nuơi cấy sang mơi trường nước đừa( mt 4) Mơi trường này được khử trùng ở 0,5 at, trong 30 phút để nguội, cây giống vào Theo dõi khả năng tạo màng, quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học
4.2.1 Quan sát khả năng tạo màng của 6 chủng vi khuẩn A.xylinum Khi cấy sang mơi trường nước dừa tơi thấy I ít chủng màng xuất hiện ở ngày thứ 3, đa số xuất hiện ở ngày thứ 5 Ba ngày đầu kê từ khi xuất hiện màng dày nhanh , những ngày sau đĩ màng phát triển nhưng chậm lại, mơi trường cấy cĩ cá đục và trong Sau 20 ngày nuơi cấy kết quả thu được ở báng
Bang 1: Kha nang tao mang cua 6 ching vi khuan A.xylinum
Mơi trường
STT | Ký hiệu chủng Khả năng tạo màng nuơi cấy
Rat mong |Mỏng | Day Duc Trong
1 A.xylinum AI + - - - + 2 A.xylinum A2 - ++ - + - 3 A.xylinum 43 - - +++ l+ 7 4 A.xylinum 44 + - - - + 5 A.xylinum 45 - ++ - - + 6 A.xylinum A6 - - +++~ [4+ - Ghi chú: Dấu (+): cĩ Dấu (-): Khơng
Dấu (++): Màng dày tăng dần
Dau (+++): Mang rat đày và tăng lên nhanh{[ 12]
Trang 26Loại 1 : Màng mỏng(<0,5cm) dịch nuơi cấy trong Loại 2: Màng mỏng, dịch nuơi cấy trong
Loại 3: Màng đày (>2em) mơi trường nuơi cấy đục Loại 4: Màng dày, dịch nuơi cấy trong
Nhận xét: Hầu hết vi khuẩn 4 xy/imum là vi khuẩn hiếu khí, vì thế trên mơi
trường lỏng bao giờ chúng cũng phát triển lớp màng dày mỏng khác nhau trên bề mặt và mang đặc điểm tuỳ tính chất của từng loại Màng đĩ chính là tập hợp vi khuẩn A xylinum
Kết quả thí nghiệm cho thấy 2 chủng vi khuân A3 và A6 cho màng dày nhất
là 2,5 và 2,6 em Vì vậy tơi quyết định giữ lại 2 chủng này để tiếp tục nghiên
cứu
Hình 4: Ảnh tạo màng dày của I số chủng A.xylinum
Trang 27
Khố luận tốt nghiệp
4.2.2 Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn 41.xylinum trên kính hiển vi
quang học
Sau khi đã kiểm tra khả năng oxi hố etanol và xác định 6 mẫu vi khuẩn A.xylinum tơi tiễn hành quan sát hình dạng tế bào của các chủng vi khuẩn này
trên kính hiển vi quang học cĩ độ phĩng đại 1000 lần Dựa theo nguồn
nguyên liệu phân lập, đặc điểm khả năng tạo màng, độ dày màng, hình dạng
tế bào của các chủng tơi quyết định giữ lại 2 chủng 4.xylimum A3 và A6 cĩ đặc tính cho màng dày hơn cả
Kết quả quan sát được dẫn ra ở hình 5 và 6
Nhận xét: Số lượng mẫu 4.xyiizm khá nhiều nhưng chỉ chọn ra 2 chủng đại diện cho màng dày đề làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo
4.3 Nghiên cứu động thái phát triển của 2 chúng vi khuẩn 4 xyÏ„um A3
và A6
Tiến hành nuơi cấy 2 chủng này trên mơi truờng số 3 Ở mơi trường này các thành phần dinh dưỡng đã được tối ưu Nuơi cấy trên mơi trường này nhằm mục đích xác định xem khoảng thời gian nào thì số lượng tế bào của các chủng vi khuẩn đạt cực đại
Mơi trường này được hấp đề khử trùng trong 3 ngày liên tiếp, để nguội sau đĩ cấy giống vào, bồ sung thêm rượu etylic và axit axetic, để trong ti 4m
Trang 28
Tiến hành xác định số lượng tế bào tại các thời điểm :0,
24.48,72,96,120,144,168,192,216,240,264,288,312,336,360,384,408,432h bằng phương pháp đếm số lượng tế bào trên buồng đếm hồng cầu{3, 4, 7]
Các chủng Thời gian (h) Số lượng tế bảo x 10” A3 A6
Kết quả được dẫn ra ở bảng 2 và biêu đồ I
Trang 29Khố luận tốt nghiệp 0 0,19+ 0,05 0,15 24 0,28+ 0.25 0,37 48 2,3 + 0,015 2,5 72 6,1 + 0,04 4,5 96 6,15 + 0,35 6,2 120 11,5 + 0,06 15,73 144 14,8 + 0,15 16,86 168 17,5 + 0,02 14,25 192 24,9 + 0,03 22,5 216 30,2 + 0,016 29,16 240 40,5 + 0,045 42,7 264 47,8 + 0,04 46,9 288 60,15 + 0,015 61,2 312 90,2 + 0,02 92,5 336 129,1 + 0,035 127,3 360 124,5 + 0,04 90,0 384 122 + 0,026 90,5 408 119,53 + 0,03 85,53 432 117,28 + 0,015 80,9
Trang 30300 250 200 150 100 50
4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH tới qua
trình tạo màng của 2 chủng Acetobacter xylinum A3 và A6
4.4.1 Ảnh hưởng của (NH4)2SO4
Trước tiên chúng tơi tiễn hành nuơi cấy 2 chủng này trên mơi trường số 3, sau đĩ thay đổi dần yếu tổ (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau:
0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9, 1,0(%)
Biểu đồ 2 Biểu diễn độ dày cúa chúng vi khuẩn 4cefobacfer xylinum A3 và
A6 cĩ tỷ lệ (NH4)2SO4 ở các mức độ khác nhau
Trang 31
Khố luận tốt nghiệp 2.5 1.5 0.5 BA3 MAG
4.4.2 Ảnh hưởng của etanol
Sử dụng nồng độ etanol ở các nồng độ khác nhau:
4;6;8;10; 12(g/)
Kết qua thí nghiệm được thể hiện ở biêu đồ 3
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 mang (cm) ay D6 d BA3 mw AG 6 8 10 12 Nồng độ etanol (g/1)
Trang 32Nhận xét:
Ching vi khuan Acetobacter xylinum A3 phat triển ở tat cả các nơng độ ctanol đã pha nhưng phát triển tốt nhất ở nồng độ 8(g/I) Chủng A6 phát triển tốt nhất ở nơng độ etanol là 4g/I
4.4.3 Ảnh hưởng của axit axetic
Mơi trường nuơi cấy được pha chế ở các nồng độ:
1;1,5;2;2,5; 3,0 (g/)
Qua thí nghiệm ta thu được kết quá sau:Nhận xét:
Tối thích cho A3 là 2 g/1 và A6 là I (g/I) Ở các nồng độ khác lớn hơn và nhỏ
hon mang tạo ra mỏng hơn Giải thích: axit axetic được
xem như là nguồn nguyên liệu thơ ban đầu, 1 nguồn cacbon bé sung cho phan ứng polime hố để tạo thành xenluloza
4.4.4 Ảnh hướng của độ pH
pH: 3,0— 3,5 —4,0— 4,5 — 5,0 5,5 — 6,0 _
Kết quả thí nghiệm được thê hiện ở biêu đồ Š
BA3 @A6 Độ dày màng(cm) ° ¬ M ont ana w Do pH Nhận xét:
Qua bảng 6 và biểu đồ 5 ta thấy độ dày màng đạt giá trị cực đại ở pH = 4,5
Trang 33Khố luận tốt nghiệp
4.5 Ứng dụng 2 chúng vi khuẩn Acetobacter xylinum A3 và A6 vào làm
thạch dừa trong phạm vỉ phịng thí nghiệm
Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 5.1 Kết luận
- Da phan lap dugc 6 mau vi khuan Acetobacter xylinum tu nguén nguyên liệu là giấm
- _ Nghiên cứu khả năng tạo màng Quan sát hình dạng tế bào
- _ Nghiên cứu động thái phát triển
-_ Nghiên cứu ảnh hưởng của etanol, axit axetic, (NH4)25O4, pH tới quá trình tạo màng của 2 ching vi khuan Acetobacter xylinum A3
va AO
- Ung dụng 2 chúng này vào làm thạch dừa trong phịng thí nghiệm Kết quá đã thu được lớp màng thạch đừa với độ đày nhất
Voi chung Acetobacter xylinum A3 đạt: 2,5cm Voi chung Acetobacter xylinum A6 dat: 2,6cm
5.2 Dé nghi ;
Trang 34MỤC LỤC trang Lời cảm ơn 2 Lời cam đoan 3
Tĩm tắt cộng trình —_ 4
Phân 1 Đặt vân đề 5
Phân 2 Tơng quan tài liệu ,
2.1 Lược sử nghiên cứu và phân loại vi khuan Acetobacter 8
2.2 Dac diém chung vé vi khuan Acetobacter 10
2.3 MOt s6 loai vi khuan Acetobacter 12
2.4 Co so khoa học của sự lên men axetic l3
2.5 Các điêu kiên ảnh hưởng tới quá trình lên men axetic 14
2.6 Các tiêu chuân phân loại 4cefobacte 16
Phân 3.Đơi tượng và phương pháp nghiên cứu 16
3.1 Đối tượng nghiên cứu 16
3.2 Hố chất và mơi trường 17
3.3 Phuong phap nghiên cứu 22
Phân 4 Kêt quả nghiên cứu và thảo luận 22
4.1 Phân lập vi khuẩn axetic từ mang cua bia, chuối, giám, nước dừa,
tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum 24
4.2 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố của vi
khuan Acetobacter xylinum 27
4.3 Nghiên cứu động thái phat triển của hai chủng vi khuân
Acetobacter xylinum 28
4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng cua etanol, axit axetic, (NH4)2.SOx,pH tới
quá trình tạo màng của hai chủng vi khuẩn 4cefobacter xylinum 33 4.5 Ungs dụng 2 chủng vi khuẩn Acerobacter xylinum vào làm thạch 33
dừa trong phạm vi phịng thí nghiệm
Phân 5 Kết luận va đề nghị
Trang 35Khố luận tốt nghiệp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Ngơ Kế Sương (1970), Cơ sở lý luận vi sinh
học, Nxb khoa học kỹ thuật
2 Nguyễn Lân Dũng và một số cộng sự (1976), Một số phương pháp nghiên cứu
vi sinh vật, (1, 2) Nxb khoa học kỹ thuật
3 Nguyễn Lân Dung, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến (1979), Vi sinh vật (1) Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, tr 87-107
4 Nguyễn thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật học, Nxb giáo dục
5 Văn Thuý Hà, Đào Thị Bích Ngọc (1999), Nghiên cứu động thái phát triển của một số chủng vi khuẩn 4cefobacter xylinum, Thơng báo khoa học
trường ĐHSPHN 2, tr 9-12
6 Hữu Thị Hải, Đào Thị Bích Ngọc (1999), Nghiên cứu ảnh hưởng của một số nhân tơ vơ cơ tới sự tạo màng của một số chủng vi khuan Acetobacter xylinum, Thong bao khoa hoc Truong DHSPHN 2
7 Nguyễn Duy Hưng (2000), Phân lap va tuyén chon mét s6 chung vi khuan Acetobacter xylinum, tng dung lam thach dira, Cong trinh du thi giai thưởng sinh viên nghiên cứu khoa học
8 Dinh Thi Kim Nhung (1993), Khảo sát lên men axefic trong mơi trường cĩ thay đường glucoza bằng đường malt, Thơng báo khoa học Trường ĐHSPHN 2, tr 9— 12
9 Đinh Thị Kim Nhung (1995), Phân lập và tuyên chọn chủng vi khuẩn