2.2.6.1. Phương pháp đục lỗ thạch
Môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase là CMC 1%, Agar 2%. Lấy dịch enzyme nhỏ vào lỗ thạch, đem ủ trong tủ ấm ở 24 giờ. Sau đó nhuộm Lugol và đem đo đường kính thủy phân.
2.2.6.2. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử: phương pháp MILLER [12].
- Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử.
Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
- Hóa chất
Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate. Đun nhẹ cho tan rồi định mức tới 100ml.
Dung dịch glucose mẫu (500µg/ml): cân 0,5g D – glucose pha trong nước cất thành 1 lít.
- Cách tiến hành
Từ dung dịch glucose 500 (µg/ml), pha các dung dịch glucose có nồng độ từ 50 – 250 (µg/ml).
Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn glucose
Nồng độ Glucose (µg/ml) 0 50 100 150 200 250 Thể tích dung dịch glucose mẫu(ml) 0 10 20 30 40 50
Nước cất 100 90 80 70 60 50
Cho 0,5ml dung dịch glucose vào các ống nghiệm sạch và khô, thêm vào 0,5ml thuốc thử DNS. Đun nóng cách thủy trong 3 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Thêm vào mỗi ống 5ml nước cất và đo mật độ quang ở bước sóng 540nm với ống đối chứng là nước cất.
Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose.
Mẫu thí nghiệm
Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đường chuẩn Glucose.
Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng.
2.2.6.3. Phương pháp tính hoạt độ hệ enzyme cellulase [12].
Nguyên tắc
Để xác định hoạt tính enzyme cellulase, ta cần sử dụng CMC như cơ chất, ủ dịch chiết enzyme với CMC trong 60 phút pH = 5,0. Hệ enzyme cellulase sẽ tác dụng lên CMC, phóng thích các phân tử glucose, dựa vào hàm lượng glucose xác định hoạt độ cellulase.
Hóa chất
Dung dịch CH3COOHNa 0,1N: cân chính xác 8,2g CH3COONa, thêm nước cất và định mức tới 1000ml.
Dung dịch CH3COOH 0,1N: hút 5,77ml CH3COOH, thêm nước cất và định mức tới 1000ml.
Dung dịch đệm acetate 0,1N pH = 5: Cho từ từ dung dịch CH3COONa 0,1N vào dung dịch CH3COOH 0,1N, điều chỉnh pH = 5 bằng máy đo pH.
Dung dịch cơ chất 0,3%: cân chính xác 3g CMC, hòa tan trong dung dịch đệm acetat 0,1N, pH = 5, khuấy trong 2 giờ ở 450C để hòa tan cơ chất, thêm dung dịch đệm cho đủ 1000ml.
Dung dịch enzyme thô sau khi thu từ ly tâm (100ml), lấy khoảng 20ml đem đi đun sôi ở 1000C, sau đó làm lạnh nhanh.
Cách tiến hành
Bảng 2.2: Xác định hoạt độ cellulase Mẫu enzyme Mẫu chứng
CMC 0,3% 3ml 3ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch đệm 1ml 1ml
Dung dịch enzyme 1ml 1ml (đã bất hoat) Giữ ổn định trong 1h
Đun cách thủy trong 10 phút
Làm 3 ống nghiệm thử enzyme và 3 ống nghiệm chứng.
Hút 0,5ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 0,5ml DNS. Đun sôi cách thủy trong 3 phút
Thêm vào 5ml nước cất. Đo OD tại bước sóng 540nm. Cách tính
Đơn vị hoạt độ của enzyme cellulase được xác định như sau: một đơn vị hoạt độ enzyme tương ứng với 1µg glucose trong thời gian thủy phân cơ chất CMC 1 giờ.
HđCellulase (đvhđ/ml)
G = G (mẫu không bất hoạt) – G (mẫu bất hoạt)
G: là nồng độ glucose sinh ra trong quá trình thủy phân cơ chất của enzyme cellulase.
2.2.7. Bố trí thí nghiệm
2.2.7.1. Thí nghiệm xác định các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase enzyme cellulase
Nhiệt độ Tiến hành
Nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus tuyển chọn ở môi trường lỏng thu enzyme: cao nấm 2,5%, peptone 5%, CMC 1% trong 48h trên máy lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem ly tâm lạnh ở 8000 vòng/15 phút để thu dịch enzyme. Ủ enzyme với cơ chất CMC ở các nhiệt độ khác nhau 300C, 400C, 500C, 600C trong 1 giờ. Làm tương tự với mẫu đã bất hoạt enzyme ở các nhiệt độ khác nhau. Đem đo quang ΔOD 540nm các mẫu thí nghiệm.
Làm 3 ống không bất hoạt enzyme và 3 ống đã bất hoạt enzyme ở các nhiệt độ khác nhau để so sánh hoạt tính của enzyme cellulase.
pH
Tiến hành
Nuôi chủng vi khuẩn Bacillus tuyển chọn ở môi trường lỏng thu enzyme: cao nấm 2,5%, peptone 5%, CMC 1% trong 48h trên máy lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem ly tâm lạnh ở 8000 vòng/15 phút để thu dịch enzyme. Ủ enzyme với cơ chất CMC ở các pH khác nhau pH = 5, 6, 7, 8, 9 trong 1 giờ. Làm tương tự với mẫu đã bất hoạt enzyme ở pH khác nhau. Đem đo quang ΔOD 540nm các mẫu thí nghiệm.
Làm 3 ống không bất hoạt enzyme và 3 ống đã bất hoạt enzyme ở các pH khác nhau để so sánh hoạt tính của enzyme cellulase.
Hình 2.3: Sơ đồ xác định các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase. Nuôi cấy Bacillus
tuyển chọn
Sinh khối vi khuẩn + dịch Enzyme Cellulase
Dịch Enzyme Cellulase thô
Mẫu bất hoạt Cơ chất CMC Xác định hoạt độ Cellulase Lắc 180 vòng/48h Ly tâm 8000 vòng/15 phút Đo ∆OD 540nm Nhiệt độ (0C) 30, 40, 50, 60 pH 5, 6, 7, 8, 9 Mẫu không bất hoạt
2.2.7.2. Thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh enzyme cellulase tốt nhất cellulase tốt nhất
pH
Tiến hành
Nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus được tuyển chọn trên môi trường dinh dưỡng lỏng: cao nấm 2,5%, peptone 5%, CMC 1%, đã được điều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch đệm Photphat. Khảo sát ở các môi trường pH khác nhau pH = 5 ,6 ,7 , 8, 9 đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase. Nuôi cấy vi khuẩn trên máy lắc 180 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 34h. Đem đo quang ΔOD 540nm để xác định hoạt độ enzyme cellulase.
Thời gian Tiến hành
Nuôi chủng vi khuẩn Bacillus tuyển chọn trên môi trường dinh dưỡng lỏng cao nấm 2,5%, peptone 5%, CMC 1%, pH = 6: ở các thời điểm 0h, 6h, 12h, 18h, 24h, 34h, trên máy lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ phòng sau đó xác định giá trị mật độ quang ở bước sóng 540nm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.4: Sơ đồ các điều kiện nuôi cấy Bacillus thích hợp để sinh tổng hợp enzyme cellulase
Nuôi cấy Bacillus
tuyển chọn
Điều kiện nuôi cấy
Dịch Enzyme thô Sinh khối vi khuẩn + dịch
Enzyme Cellulase
Đo ∆OD 540nm
Hoạt độ Enzyme Cellulase Thời gian (giờ)
6, 12, 18, 24, 30, 32, 34
pH 5, 6, 7, 8, 9
Ly tâm 8000 vòng/ 15 phút Lắc 180 vòng/ 36h
2.2.7.3. Ứng dụng enzyme cellulase của chủng Bacillus tuyển chọn vào việc thủy phân cellulose có trong bã sắn việc thủy phân cellulose có trong bã sắn
Nuôi chủng vi khuẩn Bacillus tuyển chọn trên môi trường lỏng: CMC 1%, peptone 5%, cao nấm 2,5% trong 48 giờ trên máy lắc để thu canh cấy dịch enzyme.
Tỷ lệ ủ enzyme cellulase với cơ chất là bã sắn: 50g bã sắn + 20ml enzyme cellulase có bổ sung chất kháng khuẩn Tetracylin và kháng nấm Natri Benzoat.
Ủ dịch enzyme với bã sắn ở nhiệt độ phòng tại các thời điểm 0h, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h..
Ở các mốc thời gian từ và 6h, 12h,18h , 24h, 30h lần lượt lấy 3g mẫu sắn ở hai mẫu 1, 2 bất hoạt sự hoạt động của enzyme cellulase phân giải cellulose có trong bã sắn. Tiếp theo pha loãng theo tỷ lệ 1:3 rồi lọc lấy dịch đem đi đo quang OD540nm.
Lưu ý: Mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là
Hình 2.5 : Ứng dụng enzyme cellulase vào việc thủy phân cellulose trong bã sắn. Nuôi cấy Bacillus
tuyển chọn
Ủ bã sắn + dịch Enzyme Cellulase
Pha loãng mẫu Thí nghiệm
Đo ∆OD 540nm
Canh cấy dịch Enzyme Cellulase
Bất hoạt mẫu Thí nghiệm
Dịch lọc Tetracylin + Natri Benzoat Tỷ lệ 1:3 Xác định lượng Glucose (mg/g bã sắn khô) Lắc 180 vòng/phút/48h Tỷ lệ Enzyme 40%
Thời gian (giờ) 0, 6, 12, 18,
PHẦN 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÂY DỰNG ĐỒ THỊ CHUẨN GLUCOSE THEO PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG MILLER
Xây dựng đường chuẩn glucose để xác định được nồng độ glucose của các mẫu thí nghiệm thông qua đo mật độ quang ΔOD 540nm.
Số liệu thí nghiệm được trình bày ở Phụ lục 1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2. TUYỂN LỰA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH ENZYME
CELLULASE TỐT NHẤT
3.2.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ thực phẩm lên men Natto
Từ mẫu thực phẩm lên men Natto phân lập được vi khuẩn Bacillus. Phân lập được 11 chủng vi khuẩn Bacillus.
Hình 3.2: Cấy ria chủng Bacillus trên đĩa petri
3.2.2. Dựa vào vòng thủy phân CMC 1% tuyển lựa chủng Bacillus sinh enzyme cellulase
Dựa vào phương pháp cấy điểm trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung cơ chất CMC 1%, để 24h ở nhiệt độ phòng. Sau đó thử lugol, vùng phân giải CMC sẽ không bắt màu thuốc thử. Xác định được 11 chủng Bacillus sinh enzyme cellulase, và chọn ra 3 chủng sinh enzyme mạnh nhất để đi xác định hoạt độ enzyme. Ký hiệu 3 chủng là B1, B3, B7.
Bảng 3.1: Đường kính vòng thủy phân của các chủng Bacillus
D = D2 – D1
D2: Đường kính vòng thủy phân + đường kính khuẩn lạc. D1: Đường kính khuẩn lạc.
D: Đường kính vòng thủy phân.
3.2.3. Đặc điểm hình thái của 3 chủng B1, B3, B7 3.2.3.1. Hình thái khuẩn lạc 3.2.3.1. Hình thái khuẩn lạc
Chủng B1 khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, mép nhăn, tạo thành bề mặt mịn lan trên bề mặt.
Chủng B3 khuẩn lạc tròn, lồi ở giữa, màu trắng đục, mép trơn.
Chủng B7 khuẩn lạc có bề mặt khô, mọc lan trên bề mặt thạch, màu xám trắng, tâm đậm màu, viền răng cưa.
3.2.3.2. Hình thái vi khuẩn
Khi nhuộm Gram quan sát dưới kính hiển vi, cả 3 chủng đều bắt màu tím tức 3 chủng là trực khuẩn Gram (+) và có cả bào tử.
Chủng Bacillus Đường kính vòng thủy phân D (cm)
B1 2,5 B2 1,3 B3 2,7 B4 2,0 B5 2,1 B6 1,4 B7 3,0 B8 1,8 B9 0,9 B10 1,5 B11 1,6
Hình 3.4: Tiêu bảng nhuộm Gram chủng B1
Hình 3.6: Tiêu bản nhuộm Gram chủng B7
3.2.4. Dựa vào hoạt tính enzyme cellulase của 3 chủng B1, B3, B7 để chọn chủng sinh enzyme mạnh nhất chủng sinh enzyme mạnh nhất
3.2.4.1. Xác định định tính hoạt tính cellulase
Tiến hành thí nghiệm trên môi trường thạch – CMC 1%. Để thử hoạt tính enzyme chúng tôi thực hiện theo phương pháp đục lỗ thạch. Nhỏ dịch enzyme thô sau khi ly tâm vào giếng thạch, sau 35 giờ tiến hành nhỏ lugol theo dõi xem có vùng phân giải xung quanh giếng không và đo đường kính phân giải của các enzyme quanh giếng.
Hình 3.7: Vòng thủy phân cellulose của 3 chủng B1, B3, B7 Bảng 3.2: Đường kính vòng thủy phân của 3 chủng B1, B3, B7
Chủng Bacillus Đường kính vòng thủy phân D (cm)
B1 2,5
B7 3,0
B3 2,7
D = D2 – D1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
D2: Đường kính vòng thủy phân + đường kính giếng thạch. D1: Đường kính giếng thạch.
D: Đường kính vòng thủy phân.
Qua kết quả bảng cho thấy, cả 3 chủng đều có khả năng sinh enzyme cellulase. Từ 3 chủng Bacillus có hoạt tính mạnh nhất, bước đầu chọn chủng B7 là chủng sinh enzyme mạnh nhất.
Tuy nhiên, để biết được chủng Bacillus nào có hoạt tính cao nhất thì ta đi xác định hoạt độ enzyme sẽ thu được kết quả chính xác thông qua việc đo hàm lượng glucose sinh ra trong quá trình phân giải CMC 1%.
3.2.4.2. Dựa vào định lượng Glucose bằng phương pháp đo quang Miller để xác định hoạt độ enzyme cellulase xác định hoạt độ enzyme cellulase
Nuôi cấy 3 chủng B1, B3, B7 trên môi trường dinh dưỡng lỏng có cơ chất: cao nấm 2,5%, peptone 5%, CMC 1%. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc 180 vòng/phút trong 48 giờ. Sau đó đem ly tâm lạnh ở 40C thu dịch enzyme thô.
Chia dịch enzyme thành 2 phần: lấy 20ml đem đi đun nóng trong 10 phút (bất hoạt), phần enzyme bảo quản lạnh để tránh biến tính enzyme (không bất hoạt).
Ta làm 3 ống nghiệm mẫu enzyme không bất hoạt và 3 ống nghiệm mẫu enzyme bị bất hoạt cho mỗi chủng B1, B3, B7. Sau đó đem đo quang tại bước sóng 540nm.
Số liệu thí nghiệm trình bày ở Phụ lục 2.
0 10 20 30 40 50 60 70 Chủng B1 Chủng B3 Chủng B7 H o ạ t đ ộ c el lu la se ( đ v h đ /m l)
Dựa vào đồ thị Hình 3.8 ta thấy hoạt độ enzme cellulase của chủng B7 là cao nhất.
Kết luận: Chủng B7 có hoạt tính enzyme mạnh nhất, chọn chủng B7 để khảo
sát các yếu tố ảnh hưởng như nhiệt độ, pH, thời gian...
3.3 ĐIỀU KIỆN ĐỂ ENZYME CELLULASE CÓ HOẠT TÍNH CAO NHẤT 3.3.1. Nghiên cứu nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase 3.3.1. Nghiên cứu nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase
Nuôi chủng B7 ở môi trường lỏng thu enzyme: cao nấm 2,5%, peptone 5%, CMC 1% trong 48h trên máy lắc ở nhiệt độ phòng. Đem ly tâm lạnh ở 8000 vòng/15 phút để thu dịch enzyme. Ủ enzyme với cơ chất CMC ở các nhiệt độ khác nhau 300C, 400C, 500C, 600C trong 1 giờ với hai mẫu thí nghiệm bất hoạt và không bất hoạt enzyme. Đem đi đo quang ΔOD 540nm.
Số liệu thí nghiệm trình bày ở Phụ lục 3.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 30 40 50 60 Nhiệt độ H o ạ t đ ộ E n zy m e C el lu la se ( đ v h đ /m l)
Nhận xét
Khảo sát hoạt tính cellulase ở các nhiệt độ khác nhau để tìm ra thông số tối ưu rất cần thiết. Vì nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến enzyme, nếu việc sử dụng enzyme cellulase ở các nhiệt độ không hợp lý có thể gây bất hoạt hay làm giảm hoạt tính của nó, dẫn đến việc ứng dụng ezyme cellulase không đạt hiệu quả cao.
Qua kết quả Bảng 4 – Phụ lục 3: Mẫu bất hoạt enzyme có nồng độ glucose thấp hơn hẳn mẫu không bất hoạt enzyme. Xác định được có sự hoạt động của enzyme tác dụng lên cơ chất và khác nhau ở tại các nhiệt độ khác nhau.
Dựa trên đồ thị Hình 3.9, hoạt độ enzyme cellulase cao nhất ở 400C. Vậy enzyme hoạt động mạnh nhất tại nhiệt độ 400C và giảm dần khi nhiệt độ càng cao.
Do bản chất của enzyme là protein nên khi ở nhiệt độ cao (≥ 50) sẽ bị biến tính dẫn đến làm mất hoạt tính enzyme. Các kết quả trước đây cũng thể hiện rõ điều này: Chủng nấm sợi phân lập từ rác có hoạt tính mạnh nằm trong dải nhiệt độ từ 31 – 340C [4], chủng nấm sợi Penicillium sp. DTQ – KH1 ở nhiệt độ 300C [5]. Tuy nhiên cũng có các nhóm vi khuẩn ưa nhiệt thì nhiệt độ thích hợp để sinh tổng hợp enzyme cellulase có hoạt tính mạnh ở 500C [6]. Chủng B7 có nhiệt độ tối thích là 400C, cao hơn các chủng nấm sợi và thấp hơn nhóm vi khuẩn ưa nhiệt.
Kết luận: Ở 400C là nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động phân giải cellulose tốt nhất của enzyme cellulase.
3.3.2. Nghiên cứu pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase
Nuôi chủng B7 ở môi trường lỏng thu enzyme: cao nấm 2,5%, peptone 5%, CMC 1% trong 48h trên máy lắc ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem ly tâm lạnh ở 8000 vòng/15 phút để thu dịch enzyme. Làm hai mẫu thí nghiệm: enzyme bất hoạt và không bất hoạt ủ với các môi trường pH =5, 6, 7, 8, 9 trong 1 giờ. Đo quang ΔOD 540nm các mẫu thí nghiệm để xác định hoạt độ cellulase.
Số liệu thí nghiệm được trình bày ở Phụ lục 4. 0 10 20 30 40 50 60