Nguyên tắc
Để xác định hoạt tính enzyme cellulase, ta cần sử dụng CMC như cơ chất, ủ dịch chiết enzyme với CMC trong 60 phút pH = 5,0. Hệ enzyme cellulase sẽ tác dụng lên CMC, phóng thích các phân tử glucose, dựa vào hàm lượng glucose xác định hoạt độ cellulase.
Hóa chất
Dung dịch CH3COOHNa 0,1N: cân chính xác 8,2g CH3COONa, thêm nước cất và định mức tới 1000ml.
Dung dịch CH3COOH 0,1N: hút 5,77ml CH3COOH, thêm nước cất và định mức tới 1000ml.
Dung dịch đệm acetate 0,1N pH = 5: Cho từ từ dung dịch CH3COONa 0,1N vào dung dịch CH3COOH 0,1N, điều chỉnh pH = 5 bằng máy đo pH.
Dung dịch cơ chất 0,3%: cân chính xác 3g CMC, hòa tan trong dung dịch đệm acetat 0,1N, pH = 5, khuấy trong 2 giờ ở 450C để hòa tan cơ chất, thêm dung dịch đệm cho đủ 1000ml.
Dung dịch enzyme thô sau khi thu từ ly tâm (100ml), lấy khoảng 20ml đem đi đun sôi ở 1000C, sau đó làm lạnh nhanh.
Cách tiến hành
Bảng 2.2: Xác định hoạt độ cellulase Mẫu enzyme Mẫu chứng
CMC 0,3% 3ml 3ml
Dung dịch đệm 1ml 1ml
Dung dịch enzyme 1ml 1ml (đã bất hoat) Giữ ổn định trong 1h
Đun cách thủy trong 10 phút
Làm 3 ống nghiệm thử enzyme và 3 ống nghiệm chứng.
Hút 0,5ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 0,5ml DNS. Đun sôi cách thủy trong 3 phút
Thêm vào 5ml nước cất. Đo OD tại bước sóng 540nm. Cách tính
Đơn vị hoạt độ của enzyme cellulase được xác định như sau: một đơn vị hoạt độ enzyme tương ứng với 1µg glucose trong thời gian thủy phân cơ chất CMC 1 giờ.
HđCellulase (đvhđ/ml)
G = G (mẫu không bất hoạt) – G (mẫu bất hoạt)
G: là nồng độ glucose sinh ra trong quá trình thủy phân cơ chất của enzyme cellulase.