Peptone 10 Cao thịt 5 NaCl 5 Glucose 10 Agar 20 Nước cất 1000 pH = 5,5 – 7,8
2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính enzyme cellulase
NaCl 0,5%
Peptone 3%
Cao nấm 1%
CMC 1%
2.1.3.3. Môi trường nuôi thu enzyme cellulase
Peptone 5%
Cao nấm 2,5%
CMC 1%
Tất cả các môi trường đều được hấp ở 1atm trong 30 phút.
Pha chế thuốc thử Lugol
Cách pha: 1g I2 + 2g KI cho vào 100ml nước cất, khuấy cho tan hết (chỗ tối), sau đó đổ vào lọ tối màu, tránh ánh sáng và thoáng mát.
Cách chuẩn bị môi trường
Các thành phần môi trường được hòa tan trong nước cất. Đối với môi trường có agar cần được đun sôi quấy đều sau đó đem thanh trùng. Môi trường được thanh trùng trong điều kiện: áp suất 1 atm ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút.
2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp phân lập 2.2.1. Phương pháp phân lập
Trên mẫu thực phẩm lên men Natto, lấy một vòng que cấy dịch nhớt trên bề mặt hạt đậu. Cấy ria trên đĩa petri chứa môi trường thạch dinh dưỡng để phân lập vi khuẩn. Đem ủ trong tủ ấm hoặc để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ.
Sau khi ủ nhiều khuẩn lạc xuất hiện. Làm tiêu bản một phần khuẩn lạc và soi kính để xác định hình dạng của vi khuẩn. Giữ lại tất cả vi khuẩn Gram (+) có hình que, sinh bào tử. Đây là Bacillus spp.
Hình 2.1: Sơ đồ phân lập vi khuẩn Bacillus từ thực phẩm lên men Natto Natto
Môi trường NA
Khuẩn lạc
Vi khuẩn sinh bào tử Gram (+) Cấy ria Ủ 24h Tủ ấm Nhuộm Gram Bacillus spp
2.2.2. Phương pháp giữ giống
Các chủng vi sinh vật đã được phân lập nhiều lần sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng là môi trường giữ giống trong ống nghiệm. Bảo quản giống trong ngăn mát của tủ lạnh.
Tiến hành
Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm chờ thạch đông. Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn phân lập và cấy zic zăc trên bề mặt thạch nghiêng. Đậy nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 340C. Sau 24 giờ thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40C giữ giống.
Giống được cấy chuyển 2 tuần/lần và được hoạt hóa trước khi nhân giống.
Hình 2.2: Ống nghiệm giữ giống Bacillus
2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn
Các chủng được quan sát trên môi trường NA bằng mắt thường, và kính hiển vi quang học. Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái được đánh giá dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình dáng, màu sắc, bề mặt và mép khuẩn lạc.
2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường NA:
- Khả năng phát triển của khuẩn lạc.
- Bề mặt khuẩn lạc.
2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản cố định [3].
Thực hành vô trùng tạo vết bôi:
Trước tiên, khử trùng tay, bàn bằng cồn 700. Thực hiện các thao tác dưới ngọn lửa đèn cồn hoặc trong tủ cấy vô trùng.
Hơ nóng đỏ đầu que cấy và phần kim loại. Hơ nóng phần tay cầm. Làm nguội đầu que cấy ít nhất 5 giây, lấy một ít vi khuẩn trên khuẩn lạc rời ở đĩa petri. Đặt vòng cấy chứa vi khuẩn lên chính giữa lam kính và dàn đều vi khuẩn. Hơ que cấy nóng đỏ trước khi làm tiêu bản mới.
2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram [3].
Là kỹ thuật nhuộm để tách vi khuẩn ra là 2 nhóm: một nhóm là Gram (+) và một nhóm là Gram (-). Thủ tục dựa trên khả năng vi sinh vật giữ màu tím của crystal violet trong quá trình làm mất màu bằng alcohol. Vi khuẩn Gram (-) bị mất màu tím của crystal violet bởi alcohol. Vi khuẩn Gram (+) không bị mất màu tím và giữ lại màu tím của crystal violet. Sau khi mất màu tím, đỏ safranin được sử dụng tạo màu hồng cho vi khuẩn Gram (-) đã bị mất màu.
Tiến hành nhuộm
Lam kính với vết bôi đã cố định bằng nhiệt. Phủ crystal violet lên vết bôi và giữ trong 20 giây.
Sử dụng nước cất rửa sạch vết thuốc nhuộm trong một thời gian ngắn, làm ráo nước thừa.
Phủ vết bôi với dung dịch iodine của Gram và giữ 1 phút.
Đổ hết dung dịch của Gram và giội tràn vết bôi với ethy alcohol 95% trong 10 – 20 giây. Đây là bước quyết định. Vết bôi dày sẽ cần khoảng thời gian lâu hơn vết bôi mỏng. Sự mất màu xuất hiện khi dòng chảy hòa tan thuốc nhuộm không còn màu.
Dừng hoạt động của alcohol bằng cách rửa tiêu bản với nước.
Phủ safranin trên vết bôi và giữ trong 20 giây. Rửa nhẹ nhàng trong vài giây, để khô tự nhiên.
2.2.4. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme cellulase
Sử dụng phương pháp cấy điểm trên môi trường thạch dinh dưỡng có bổ sung CMC 1%, ủ ở nhiệt độ 300C trong 24h. Sau đó nhuộm bằng thuốc thử Lugol và đo đường kính vòng thủy phân.
2.2.5. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô
Nuôi cấy chủng Bacillus sinh enzyme mạnh nhất trong môi trường lỏng với CMC 1%, Peptone 5 %, Cao nấm 2,5 %. Ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/15 phút, thu dịch enzyme nổi và bỏ đi phần lắng sinh khối tế bào.
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase 2.2.6.1. Phương pháp đục lỗ thạch 2.2.6.1. Phương pháp đục lỗ thạch
Môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase là CMC 1%, Agar 2%. Lấy dịch enzyme nhỏ vào lỗ thạch, đem ủ trong tủ ấm ở 24 giờ. Sau đó nhuộm Lugol và đem đo đường kính thủy phân.
2.2.6.2. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử: phương pháp MILLER [12].
- Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử.
Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
- Hóa chất
Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate. Đun nhẹ cho tan rồi định mức tới 100ml.
Dung dịch glucose mẫu (500µg/ml): cân 0,5g D – glucose pha trong nước cất thành 1 lít.
- Cách tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ dung dịch glucose 500 (µg/ml), pha các dung dịch glucose có nồng độ từ 50 – 250 (µg/ml).
Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn glucose
Nồng độ Glucose (µg/ml) 0 50 100 150 200 250 Thể tích dung dịch glucose mẫu(ml) 0 10 20 30 40 50
Nước cất 100 90 80 70 60 50
Cho 0,5ml dung dịch glucose vào các ống nghiệm sạch và khô, thêm vào 0,5ml thuốc thử DNS. Đun nóng cách thủy trong 3 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Thêm vào mỗi ống 5ml nước cất và đo mật độ quang ở bước sóng 540nm với ống đối chứng là nước cất.
Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose.
Mẫu thí nghiệm
Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đường chuẩn Glucose.
Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng.
2.2.6.3. Phương pháp tính hoạt độ hệ enzyme cellulase [12].
Nguyên tắc
Để xác định hoạt tính enzyme cellulase, ta cần sử dụng CMC như cơ chất, ủ dịch chiết enzyme với CMC trong 60 phút pH = 5,0. Hệ enzyme cellulase sẽ tác dụng lên CMC, phóng thích các phân tử glucose, dựa vào hàm lượng glucose xác định hoạt độ cellulase.
Hóa chất
Dung dịch CH3COOHNa 0,1N: cân chính xác 8,2g CH3COONa, thêm nước cất và định mức tới 1000ml.
Dung dịch CH3COOH 0,1N: hút 5,77ml CH3COOH, thêm nước cất và định mức tới 1000ml.
Dung dịch đệm acetate 0,1N pH = 5: Cho từ từ dung dịch CH3COONa 0,1N vào dung dịch CH3COOH 0,1N, điều chỉnh pH = 5 bằng máy đo pH.
Dung dịch cơ chất 0,3%: cân chính xác 3g CMC, hòa tan trong dung dịch đệm acetat 0,1N, pH = 5, khuấy trong 2 giờ ở 450C để hòa tan cơ chất, thêm dung dịch đệm cho đủ 1000ml.
Dung dịch enzyme thô sau khi thu từ ly tâm (100ml), lấy khoảng 20ml đem đi đun sôi ở 1000C, sau đó làm lạnh nhanh.
Cách tiến hành
Bảng 2.2: Xác định hoạt độ cellulase Mẫu enzyme Mẫu chứng
CMC 0,3% 3ml 3ml
Dung dịch đệm 1ml 1ml
Dung dịch enzyme 1ml 1ml (đã bất hoat) Giữ ổn định trong 1h
Đun cách thủy trong 10 phút
Làm 3 ống nghiệm thử enzyme và 3 ống nghiệm chứng.
Hút 0,5ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 0,5ml DNS. Đun sôi cách thủy trong 3 phút
Thêm vào 5ml nước cất. Đo OD tại bước sóng 540nm. Cách tính
Đơn vị hoạt độ của enzyme cellulase được xác định như sau: một đơn vị hoạt độ enzyme tương ứng với 1µg glucose trong thời gian thủy phân cơ chất CMC 1 giờ.
HđCellulase (đvhđ/ml)
G = G (mẫu không bất hoạt) – G (mẫu bất hoạt) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
G: là nồng độ glucose sinh ra trong quá trình thủy phân cơ chất của enzyme cellulase.
2.2.7. Bố trí thí nghiệm
2.2.7.1. Thí nghiệm xác định các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase enzyme cellulase
Nhiệt độ Tiến hành
Nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus tuyển chọn ở môi trường lỏng thu enzyme: cao nấm 2,5%, peptone 5%, CMC 1% trong 48h trên máy lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem ly tâm lạnh ở 8000 vòng/15 phút để thu dịch enzyme. Ủ enzyme với cơ chất CMC ở các nhiệt độ khác nhau 300C, 400C, 500C, 600C trong 1 giờ. Làm tương tự với mẫu đã bất hoạt enzyme ở các nhiệt độ khác nhau. Đem đo quang ΔOD 540nm các mẫu thí nghiệm.
Làm 3 ống không bất hoạt enzyme và 3 ống đã bất hoạt enzyme ở các nhiệt độ khác nhau để so sánh hoạt tính của enzyme cellulase.
pH
Tiến hành
Nuôi chủng vi khuẩn Bacillus tuyển chọn ở môi trường lỏng thu enzyme: cao nấm 2,5%, peptone 5%, CMC 1% trong 48h trên máy lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem ly tâm lạnh ở 8000 vòng/15 phút để thu dịch enzyme. Ủ enzyme với cơ chất CMC ở các pH khác nhau pH = 5, 6, 7, 8, 9 trong 1 giờ. Làm tương tự với mẫu đã bất hoạt enzyme ở pH khác nhau. Đem đo quang ΔOD 540nm các mẫu thí nghiệm.
Làm 3 ống không bất hoạt enzyme và 3 ống đã bất hoạt enzyme ở các pH khác nhau để so sánh hoạt tính của enzyme cellulase.
Hình 2.3: Sơ đồ xác định các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase. Nuôi cấy Bacillus
tuyển chọn
Sinh khối vi khuẩn + dịch Enzyme Cellulase
Dịch Enzyme Cellulase thô
Mẫu bất hoạt Cơ chất CMC Xác định hoạt độ Cellulase Lắc 180 vòng/48h Ly tâm 8000 vòng/15 phút Đo ∆OD 540nm Nhiệt độ (0C) 30, 40, 50, 60 pH 5, 6, 7, 8, 9 Mẫu không bất hoạt
2.2.7.2. Thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh enzyme cellulase tốt nhất cellulase tốt nhất
pH
Tiến hành
Nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus được tuyển chọn trên môi trường dinh dưỡng lỏng: cao nấm 2,5%, peptone 5%, CMC 1%, đã được điều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch đệm Photphat. Khảo sát ở các môi trường pH khác nhau pH = 5 ,6 ,7 , 8, 9 đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase. Nuôi cấy vi khuẩn trên máy lắc 180 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 34h. Đem đo quang ΔOD 540nm để xác định hoạt độ enzyme cellulase.
Thời gian Tiến hành
Nuôi chủng vi khuẩn Bacillus tuyển chọn trên môi trường dinh dưỡng lỏng cao nấm 2,5%, peptone 5%, CMC 1%, pH = 6: ở các thời điểm 0h, 6h, 12h, 18h, 24h, 34h, trên máy lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ phòng sau đó xác định giá trị mật độ quang ở bước sóng 540nm.
Hình 2.4: Sơ đồ các điều kiện nuôi cấy Bacillus thích hợp để sinh tổng hợp enzyme cellulase
Nuôi cấy Bacillus
tuyển chọn
Điều kiện nuôi cấy
Dịch Enzyme thô Sinh khối vi khuẩn + dịch
Enzyme Cellulase
Đo ∆OD 540nm
Hoạt độ Enzyme Cellulase Thời gian (giờ)
6, 12, 18, 24, 30, 32, 34 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
pH 5, 6, 7, 8, 9
Ly tâm 8000 vòng/ 15 phút Lắc 180 vòng/ 36h
2.2.7.3. Ứng dụng enzyme cellulase của chủng Bacillus tuyển chọn vào việc thủy phân cellulose có trong bã sắn việc thủy phân cellulose có trong bã sắn
Nuôi chủng vi khuẩn Bacillus tuyển chọn trên môi trường lỏng: CMC 1%, peptone 5%, cao nấm 2,5% trong 48 giờ trên máy lắc để thu canh cấy dịch enzyme.
Tỷ lệ ủ enzyme cellulase với cơ chất là bã sắn: 50g bã sắn + 20ml enzyme cellulase có bổ sung chất kháng khuẩn Tetracylin và kháng nấm Natri Benzoat.
Ủ dịch enzyme với bã sắn ở nhiệt độ phòng tại các thời điểm 0h, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h..
Ở các mốc thời gian từ và 6h, 12h,18h , 24h, 30h lần lượt lấy 3g mẫu sắn ở hai mẫu 1, 2 bất hoạt sự hoạt động của enzyme cellulase phân giải cellulose có trong bã sắn. Tiếp theo pha loãng theo tỷ lệ 1:3 rồi lọc lấy dịch đem đi đo quang OD540nm.
Lưu ý: Mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là
Hình 2.5 : Ứng dụng enzyme cellulase vào việc thủy phân cellulose trong bã sắn. Nuôi cấy Bacillus
tuyển chọn
Ủ bã sắn + dịch Enzyme Cellulase
Pha loãng mẫu Thí nghiệm
Đo ∆OD 540nm
Canh cấy dịch Enzyme Cellulase
Bất hoạt mẫu Thí nghiệm
Dịch lọc Tetracylin + Natri Benzoat Tỷ lệ 1:3 Xác định lượng Glucose (mg/g bã sắn khô) Lắc 180 vòng/phút/48h Tỷ lệ Enzyme 40%
Thời gian (giờ) 0, 6, 12, 18,
PHẦN 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÂY DỰNG ĐỒ THỊ CHUẨN GLUCOSE THEO PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG MILLER
Xây dựng đường chuẩn glucose để xác định được nồng độ glucose của các mẫu thí nghiệm thông qua đo mật độ quang ΔOD 540nm.
Số liệu thí nghiệm được trình bày ở Phụ lục 1.
3.2. TUYỂN LỰA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH ENZYME
CELLULASE TỐT NHẤT
3.2.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ thực phẩm lên men Natto
Từ mẫu thực phẩm lên men Natto phân lập được vi khuẩn Bacillus. Phân lập được 11 chủng vi khuẩn Bacillus.
Hình 3.2: Cấy ria chủng Bacillus trên đĩa petri
3.2.2. Dựa vào vòng thủy phân CMC 1% tuyển lựa chủng Bacillus sinh enzyme cellulase
Dựa vào phương pháp cấy điểm trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung cơ chất CMC 1%, để 24h ở nhiệt độ phòng. Sau đó thử lugol, vùng phân giải CMC sẽ không bắt màu thuốc thử. Xác định được 11 chủng Bacillus sinh enzyme cellulase, và chọn ra 3 chủng sinh enzyme mạnh nhất để đi xác định hoạt độ enzyme. Ký hiệu 3 chủng là B1, B3, B7.
Bảng 3.1: Đường kính vòng thủy phân của các chủng Bacillus
D = D2 – D1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
D2: Đường kính vòng thủy phân + đường kính khuẩn lạc. D1: Đường kính khuẩn lạc.
D: Đường kính vòng thủy phân.
3.2.3. Đặc điểm hình thái của 3 chủng B1, B3, B7 3.2.3.1. Hình thái khuẩn lạc 3.2.3.1. Hình thái khuẩn lạc
Chủng B1 khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, mép nhăn, tạo thành bề mặt mịn lan trên bề mặt.
Chủng B3 khuẩn lạc tròn, lồi ở giữa, màu trắng đục, mép trơn.
Chủng B7 khuẩn lạc có bề mặt khô, mọc lan trên bề mặt thạch, màu xám trắng, tâm đậm màu, viền răng cưa.
3.2.3.2. Hình thái vi khuẩn
Khi nhuộm Gram quan sát dưới kính hiển vi, cả 3 chủng đều bắt màu tím tức 3 chủng là trực khuẩn Gram (+) và có cả bào tử.
Chủng Bacillus Đường kính vòng thủy phân D (cm)
B1 2,5 B2 1,3 B3 2,7 B4 2,0 B5 2,1 B6 1,4 B7 3,0 B8 1,8 B9 0,9 B10 1,5 B11 1,6
Hình 3.4: Tiêu bảng nhuộm Gram chủng B1
Hình 3.6: Tiêu bản nhuộm Gram chủng B7
3.2.4. Dựa vào hoạt tính enzyme cellulase của 3 chủng B1, B3, B7 để chọn chủng sinh enzyme mạnh nhất chủng sinh enzyme mạnh nhất
3.2.4.1. Xác định định tính hoạt tính cellulase
Tiến hành thí nghiệm trên môi trường thạch – CMC 1%. Để thử hoạt tính