Mục tiêu đề tài là đánh giá được thành phần hoá học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hoá, cũng như ức chế enzyme ?-amylase của mật hoa Trang son.. Đánh giá thành phần hoá học của mật
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Hợp chất thiên nhiên đóng nhiều vai trò trong việc phát triển các loại thuốc mới Nó là các sản phẩm hữu cơ được sinh ra từ quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Việc ứng dụng các hợp chất thiên nhiên đã có từ xa xưa ví dụ như Ai cập cổ đại đã biết sử dụng vỏ cây liễu để làm thuốc giảm đau (chất salicin trong vỏ cây có cấu trúc tương tự như aspirin); hay ở Trung Quốc, cây Diên hồ sách được dùng làm thuốc giảm đau vì do chứa dehydrocorybulbine, (Pullman, 2017)
Việt Nam là một trong 16 quốc gia đa dạng sinh học và có truyền thống phát triển hoa cây cảnh lâu đời bậc nhất thế giới Đến nay cả nước có khoảng 35.000 ha tập trung chuyên canh hoa cây cảnh, phân bổ đều ở cả hai miền Trong vòng 10 năm (2005 - 2015) diện tích hoa đã tăng hơn 2,3 lần, giá trị sản lượng tăng 7,2 lần đạt 6.500 tỷ đồng trong đó xuất khẩu trên 60 triệu USD (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 2021) Cây Trang son (Ixora coccinea Linn.) là một trong những loại cây thường được trồng làm cảnh ở nhiều quốc gia, tuy vậy nó vẫn có một số công dụng được ứng dụng trong cả y học dân gian và y học hiện đại, cũng như công nghiệp
Kháng kháng sinh là mối đe dọa sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới, ảnh hưởng đến sức khỏe và cuộc sống của người dân và sự phát triển tổng thể, bền vững của cả một quốc gia Việt Nam là một trong những các quốc gia, trong những năm gần đây đã phải chứng kiến mối đe dọa ngày càng gia tăng của kháng kháng sinh, do việc sử dụng kháng sinh không hợp lý tại các cấp của hệ thống chăm sóc sức khỏe, trong nuôi trồng thủy sản, trong chăn nuôi và trong cộng đồng (World Health Organization, n.d.) Ngoài ra, hiện nay tình trạng đái tháo đường ngày càng gia tăng, ước tính cho thấy từ năm 2021- 2045 Đông Nam Á sẽ tăng 27% số người mắc đái tháo đường (International Diabetes Federation, 2022) Ở Việt Nam tỷ lệ mắc đái tháo đường ở độ tuổi 20 – 79 là 7% và 93% chưa mắc hoặc chưa được chẩn đoán (Bộ Y
Tế, 2022) Từ đây thấy được cần tìm được hoạt chất thiên nhiên có tính kháng khuẩn từ đó giúp giảm các vi sinh vật (VSV) gây hại nhưng không làm vsv kháng kháng sinh cũng như có thể ức chế các enzyme phân cắt tinh bột hay giảm hấp thụ đường trong máu an toàn cho con người, dễ tìm kiếm nguyên liệu là cần thiết Mật hoa là hỗn hợp của đường và thường được xem như một phần thưởng nhằm thu hút các loài thụ phấn cho cây, vì thế nên đôi khi các loài thụ phấn có thể được xem là trung gian truyền bệnh (Jacquemyn et al., 2021) Các vi sinh vật trong mật hoa sẽ làm giảm khả năng sinh sản và thay đổi tần suất các loài thụ phấn khác ghé thăm (Vannette & Fukami, 2016); tuy nhiên đã có nhiều nghiên cứu cho thấy mật của nhiều loài hoa chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học (ví dụ như mật hoa cây thuốc lá) (Carter & Thornburg, 2007)
Vì vậy, việc khảo sát thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của mật hoa Trang son là cần thiết Chính vì thế đề tài “Khảo sát thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của mật hoa Trang son (Ixora coccinea L.)” được thực hiện.
Mục tiêu đề tài
Đánh giá được thành phần hoá học và hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hoá và ức chế enzyme α-amylase của mật hoa Trang son (Ixora coccinea L.).
Nội dung nghiên cứu
1 Khảo sát hình thái, vị trí tiết mật của hoa và thể tích mật hoa Trang son
2 Khảo sát thành phần của mật hoa Trang son
3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của mật hoa Trang son
4 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của mật hoa Trang son
5 Khảo sát khả năng ức chế enzyme 𝛼-amylase của mật hoa Trang son
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Tổng quan về cây Trang son
Trang son hay còn gọi là Nam mẫu đơn, Long thuyền hoa, Mẫu đơn đỏ, có tên khoa học là Ixora coccinea thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) (Bảng 2.1) Chúng là những cây gỗ hay cây bụi, cao 1–3 m Hoa của loài này thường nhỏ, lưỡng tính, đều, ra hoa quanh năm Đài ít phát triển, dính với bầu noãn, có 4 - 5 răng Tràng dính, hợp thành ống hẹp Số nhị thường sẽ bằng và nằm xen kẽ giữa các cánh hoa, dính với ống tràng hoặc miệng tràng Bộ nhuỵ gồm 2 lá noãn dính nhau, bầu dưới, 2 buồng và mỗi buồng từ 1 đến nhiều noãn, 1 vòi nhuỵ nhỏ có 2 nướm Quả nhân cứng, quả nang, có
2 múi sâu, khi non có màu xanh và chuyển sang đỏ hoặc đen khi chín Hạt có phôi nhỏ nằm trong nội nhũ Lá đơn, nguyên, mọc đối, luôn có lá kèm với nhiều hình dạng khác nhau (Hình 2.1) (Quân, 2022)
Bảng 2.1: Phân loại khoa học (National Center for Biotechnology Information, n.d)
Tên khoa học: Ixora coccinea L
Giới (kingdom) Plantae Ngành (phylum) Streptophyta Lớp (class) Magnoliopsida
Họ (family) Rubiaceae Chi (genus) Ixora
Hình 2.1: Hoa và quả cây Trang son (Ixora coccinea L.)
Ghi chú: 1a và 1b: hoa, 1c: quả(Nguồn: Baliga & Kurian, 2012)
Trang son được tìm thấy ở các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Phân bố tập trung chủ yếu ở châu Á, tìm thấy nhiều ở khu vực Đông Nam Á Trang son có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Đông Nam Á, bao gồm miền Nam Ấn Độ và Sri Lanka
Nó được trồng rộng rãi ở Indonesia, Malaysia, Việt Nam, Campuchia, Lào, Thái Lan, cũng như Puerto Rico (Chabert-Llompart, 2017).
Ngoài trồng làm cảnh hoặc lấy hoa để cúng thì Trang son được coi như một cây thuốc được dùng trong y học cổ truyền Trang son có vị ngọt nhẹ, tính mát Trong y học chúng có tác dụng hạ huyết áp, hoạt huyết, giảm sưng, giảm đau (Tựng, 2010) Theo Lợi (2004) rễ cây dùng làm thuốc lợi tiểu, cảm sốt, đau nhức, kiết lỵ; hoa thường được dùng làm thuốc chữa lỵ Hoa phơi khô đun với dầu dừa đến khi sắc được dùng làm thuốc bôi ngoài da chữa bệnh chàm (Sivaperumal et al., 2009) Nước được sắc từ rễ được cho là có thể ngăn buồn nôn, nấc và chán ăn Rễ được dùng trong chữa các vết loét Thuốc đắp từ lá và thân có thể trị bong gân, chàm, nhọt và bầm tím (Vadivu et al., 2010)
Trang son ngoài được dùng trong y học cổ truyền thì các hợp chất được chiết xuất từ nó cũng được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong y học hiện đại và công nghiệp Rễ cây được chiết xuất để làm nanocellulose (Unni et al., 2002) Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất chiết xuất từ rễ và lá cây có khả năng chống oxy hoá và kháng khuẩn, chiết xuất enthanolic (rễ) có tác dụng bảo vệ gan, ngừa tiêu chảy; chiết xuất hydromethanolic (70%) từ hoa có khả năng ức chế đáng kể gốc tự do trong điều kiện in vitro, dịch chiết từ hoa có khả năng làm giảm sự phát triển của khối u; một số chất phytochemical từ lá có khả năng ngăn quá trình lipid peroxidation, một số chất khác chiết xuất từ lá có khả năng chống viêm, chống dị ứng và chống oxy hoá mạnh, giảm loát dạ dày, chống tiêu chảy, kháng khuẩn, (Baliga & Kurian, 2012; Muhammad et al., 2020).
Tổng quan về mật hoa
Mật hoa là một chất dịch lỏng có vị ngọt, thành phần chủ yếu là đường thường có chức năng làm trung gian cho sự tương tác của thực vật đối với các loài thụ phấn, bảo vệ tế bào sinh sản của hoa khỏi vsv Mật hoa thu hút kiến, ký sinh trùng, đồng thời đóng vai trò bảo vệ chống lại động vật ăn cỏ Mật có thể tiết trên hầu hết các cơ quan thực vật trừ rễ, vị trí tiết mật thường trùng với chức năng của nó (Heil, 2011)
Có 2 loại mật hoa là mật trong hoa và mật ngoài hoa (Bảng 2.1) Chúng có thể khác nhau nguồn gốc, thành phần, vị trí tiết, tuy nhiên chức năng của chúng lại giống nhau và lượng mật tiết còn phụ thuộc vào độ ẩm tương đối trong không khí (Pacini & Nicolson, 2007)
Bảng 2.2: Điểm khác biệt của mật trong hoa và mật ngoài hoa (Pacini & Nicolson, 2007)
Mật trong hoa Mật ngoài hoa
Chức năng Thường là phần thưởng cho động vật, côn trùng thụ phấn
Thường dùng để bảo vệ khỏi động vật ăn cỏ
Vị trí tiết Ở các bộ phận khác nhau của hoa (nhị hoa, đài hoa, tràng hoa, đế hoa)
Thường ở lá (cuống lá, lá kèm, phiến lá) Ít thấy ở hoa
Chim (chim ruồi, các loài chim hút mật) Động vật có vú (dơi, loài thú có túi nhỏ)
Thời gian tiết Tiết mật trong quá trình nở hoa hoặc trước vài ngày
Vài ngày khi còn non, vài tuần (khi ra quả), vài tháng (mật ở lá) Không đi kèm với việc ra hoa Lượng mật
Nhỏ hơn 1 àL đến vài mL (tỷ lệ thuận với thể tích nhu mô tuyến mật)
Sự thay đổi chất lượng mật
Tính chất hoá, lý, độ nhớt của mật khác nhau phụ thuộc vào sinh vật tiêu thụ
Tính chất hoá, lý của mật ít thay đổi vì sinh vật tiêu thụ chủ yếu là kiến
Thành phần hoá học của mật hoa ở mỗi loài là khác nhau nhưng nhìn chung nó thường gồm:
- Nước: tùy thuộc vào cấu trúc mật hoa, nước có thể được tạo ra từ cả mạch gỗ và mạch rây hoặc chỉ mạch rây Hàm lượng nước trong mật hoa ít phụ thuộc vào khí hậu và có thể bị ảnh hưởng lớn bởi sự bốc hơi của những hoa tiếp xúc với môi trường Nồng độ mật hoa được xác định là độ nhớt của nó do đó ảnh hưởng đến phản ứng ăn uống của động vật; nước trong mật hoa cũng có thể là phần thưởng quan trọng cho các loài thụ phấn trong điều kiện khô ráo (Pacini & Nicolson, 2007; Nicolson, 2021)
- Carbohydrate: thành phần đường ở mật hoa đa số là một loại đường hoặc là sự kết hợp của sucrose, glucose, fructose và một số ít mật hoa có thành phần đường khác ví dụ như mannitol Đối với những loài hoa có hình ống dài, mật nằm sâu thường đường sucrose sẽ chiếm đa số, trong khi các loại hoa không được bảo vệ thì đường fructose và glucose sẽ chiếm ưu thế Tổng nồng độ của 3 loại đường chính giao động từ 7-70% w/w và chiếm đến 90% thành phần mật hoa (Pacini & Nicolson, 2007)
- Amino acid (aa) và protein: amino acid bao gồm các aa thiết yếu và không thiết yếu, cũng như một số non-protein amino acid (NPAA) (Petanidou et al., 2006) Nó dao
6 động trong khoảng vài àM đến vài mM (Nicolson, 2021) Hàm lượng aa ở hoa cú hỡnh ống dài, mật nằm sâu sẽ cao hơn so với hoa mở và mật hoa không được bảo vệ Hoa thụ phấn nhờ côn trùng sẽ có hàm lượng aa trong mật nhiều hơn hoa thụ phấn nhờ động vật có xương sống Protein trong mật hoa bao gồm enzyme và chất bảo quản (Carter
& Thornburg, 2004) Phần lớn protein có trong mật hoa đều có tác dụng bảo vệ hoặc có vai trò cân bằng nội môi và điều tiết (Pacini & Nicolson, 2007), NPAA được tìm thấy trong mật hoa có tác dụng chống stress, kháng nấm và vi khuẩn; nó chiếm 30- 50% thành phần aa của mật hoa (Sasu et al., 2010; Nepi, 2013; Barberis et al., 2023)
- Ion kim loại: có nguồn gốc từ mạch gỗ và/hoặc mạch rây, tuy nhiên thông tin về ion trong thành phần mật hoa là rất hiếm (Pacini & Nicolson, 2007) Một số ion kim loại được tìm thấy trong mật của hoa Mucuna sempervirens như Ca, Mg, S, Cu,… (Shah et al., 2013)
- Chất chống oxy hoá: các chất chống oxy hoá như ascorbate có liên quan tới cân bằng nội môi, nó hiện diện trong mật của nhiều loài hoa Ascorbic acid (vitamin C) là một chất chống oxy hoá cũng được tìm thấy trong mật hoa nhiều loài (Carter & Thornburg, 2004)
- Lipid: là nguồn cao năng nhưng hàm lượng trong mật hoa là rất nhỏ Một số loài hoa, dịch tiết ra từ tuyến dầu được dùng làm phần thưởng cho các loài thụ phấn thay cho mật hoa (Pacini & Nicolson, 2007)
- Chất chuyển hoá thứ cấp: một số hợp chất chuyển hoá thứ cấp được tìm thấy trong mật hoa như alkaloid, phenol, glycosid irdoid có tác dụng ức chế sự phát triển của vsv, chống lại các một số loài thụ phấn, đồng thời có thể thu hút một số loài khác (Heil, 2011)
- Chất hữu cơ dễ bay hơi (VOC): không chỉ được dùng để thu hút một số loài thụ phấn có lợi cho cây mà còn có tác dụng phòng thủ và bảo vệ mật hoa khỏi các kẻ cướp mật như kiến VOC được coi như là tín hiệu thu hút các loài thụ phấn (Heil, 2011) Terpenoid là thành phần quan trọng của hương hoa và có thể tích tụ trong mật hoa (Ragsuo, 2004; Pacini & Nicolson, 2007)
- Tàn dư tế bào chất: chủ yếu do sự tiết của các tuyến bài tiết bị phá vỡ (Pacini
Theo Heil (2011) chức năng của mật hoa bao gồm:
- Thu hút: mật hoa thu các sinh vật tương hỗ giúp hoa thụ phấn Các carbohydrate và aa tự do rất quan trọng trong việc thu hút Thành phần mật hoa quyết định bởi sở thích dinh dưỡng của các sinh vật tương hỗ
- Bảo vệ: hầu hết mật hoa đều có chức năng kháng khuẩn, chống lại vsv Đầu tiên, mật hoa thường bị nhiễm vsv, đặc biệt là nấm men, những hoạt động trao đổi chất của chúng có thể làm thay đổi đáng kể các thành phần, tính chất hoá học của mật
7 hoa Thứ hai, hoa có thể đóng vai trò là lối vào của các mầm bệnh để xâm nhập vào tế bào sinh sản vì vậy mật hoa có tác dụng kháng khuẩn để bảo vệ các mô khỏi sự tấn công của vsv
Tổng quan về một số vi khuẩn kháng kháng sinh
Staphylococcus aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng là vi khuẩn Gram dương, hỡnh cầu (khoảng 0,5–1,5 àm) thường xếp thành cụm như “quả nho”, hiếu khớ tuỳ nghi, không có chiêm mao và nha bào, thường không có vỏ (Hình 2.4) (Thành & Điệp, 2016) Nó là vi khuẩn gây ra nhiều bệnh lâm sàng và thường gây bệnh chính trên người với những biểu hiện lâm sàng khác nhau, nhiễm trùng do S aureus gây ra thường phổ biến ở ngoài cộng đồng lẫn trong bệnh viện Tụ cầu vàng thường ký sinh trên da, niêm mạc mũi, họng, đường sinh dục,… Việc điều trị vẫn còn nhiều thách thức khi có sự xuất hiện của các chủng đa kháng thuốc như Staphylococcus kháng methicillin (Taylor & Unankal, 2023)
Hình 2.4: Tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus
Escherichia coli là trực khuẩn Gram õm, dài khoảng 1 - 4 àm, rộng 0,4 – 0,7 àm, khụng sinh nha bào, cú lụng, di động được, khụng tạo bào tử, rất ớt chủng E coli có vỏ (Hình 2.5) Nó chiếm 80% vi khuẩn trong đường tiêu hoá, nó cộng sinh với cơ thể góp phần tiêu hoá thức ăn và sản xuất một số vitamin, đồng thời giữ cân bằng hệ sinh thái các vi khuẩn Tuy nhiên, E coli lại là một trong những vi khuẩn gây bệnh cơ hội gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết; ngoài ra nó còn gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương (Hinh, 2008)
Hình 2.5: Tế bào vi khuẩn Escherichia coli
(Nguồn: https://www.sciencephoto.com/search?q=e+coli, truy cập ngày 15/1/2024)
Cutibacterium acnes hay Propionibacterium acnes là một trong những vi khuẩn thuộc hệ sinh vật tự nhiên của da, chiếm 10 5 – 10 6 tế bào/cm 2 ở các vùng có nhiều tuyến bã nhờn và 10 2 ở các vùng khác Nó phát triển do sự bít tắc lỗ chân lông tạo môi trường kỵ khí C acnes là trực khuẩn Gram dương, kỵ khí, sống trên người, phần lớn là hội sinh, cú kớch thước từ 0,2 – 1,5 x 1 - 5 àm, khụng di động, khụng tạo bào tử (Hình 2.6) C acnes rất nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh, đặc biệt là penicillin (Nguyên, 2023)
Hình 2.6: Tế bào vi khuẩn Cutibacterium acnes
(Nguồn: https://www.micropia.nl/en/discover/microbiology/propionibacterium-acnes/, truy cập ngày
Các hợp chất thực vật tiêu biểu
Hợp chất phenolic là nhóm chất chuyển hoá thứ cấp được tạo ra bởi thực vật bậc cao, nó đóng nhiều vai trò thiết yếu trong sinh lý thực vật và có những đặc tính có lợi cho cây và cả sức khoẻ con người Nó là một chất chống oxy hoá, chống dị ứng, chống viêm và chống ung thư, hạ huyết áp, kháng khuẩn (Daglia, 2012) Chúng có cấu tạo chung là đều chứa một hay nhiều vòng thơm (vòng benzen) với một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH), có thể ở trạng thái tự do, ester hoá hay gắn với đường bằng liên kết glycosid Nó có hơn 8.000 hợp chất phenolic tự nhiên đã được tìm thấy từ các phân tử đơn giản như phenolic acid hay phức tạp như tannin (Hình 2.7) (Hoa, 2012)
Hình 2.7: Cấu tạo hoá học của các chất thuộc nhóm phenolic
Flavonoid là một trong những chất thuộc nhóm phenolic phân bố rộng rãi trong trái cây và rau quả nó đã được kiểm chứng là có khả năng chống oxy hoá tốt ở các mô hình thí nghiệm khác nhau Nó bao gồm nhiều phân tử khác nhau dẫn đến có đa dạng các hoạt động sinh học (Hidalgo et al., 2010) Nó bao gồm hơn 6000 hợp chất phenolic có trọng lượng phân tử thấp và dẫn xuất của flavan Phân nhóm chính gồm flavan, flavonol, flavonone, flavononol, flavan-3-ols, anthocyanin, isoflavone, chalcones Các phân nhóm của flavonoids được phân chia dựa vào vị trí gắn giữa vòng carbon B và C, cũng như mức độ không bão hòa và quá trình oxy hóa của vòng
C Các chất có vòng B liên kết ở vị trí 3 của vòng C được gọi là isoflavone, còn những chất vòng B được liên kết ở vị trí 4 được gọi là neoflavonoid, trong khi những chất vòng B được liên kết ở vị trí 2 có thể được chia nhỏ thành nhiều nhóm nhỏ dựa trên các đặc điểm cấu trúc của vòng C (Hình 2.8) Flavonoid được thực vật sản xuất dưới dạng các phân tử nhỏ và là chất chuyển hoá thứ cấp để đáp ứng các yếu tố sinh học lẫn phi sinh học Nó có vai trò đa dạng từ làm sắc tố đến góp phần vào quá trình phát triển, phòng chống bệnh tật (Panche et al., 2016)
Hình 2.8: Cấu trúc phân nhóm flavonoid
Đường khử và phương pháp DNS
Đường khử là nhóm đường có nhóm chức aldehyde (CHO) hoặc ketone (CO) trong cấu trúc phân tử, đóng vai trò là chất khử Hầu hết nhóm monosaccharide đều là đường khử; một số disaccharide, oligosaccharide, polysacchirde là đường khử như lactose, maltose,… do có các carbon dị thường có thể chuyển đổi thành dạng chuỗi mở bằng cách hình thành liên kết với nhóm aldehyde Các monosaccharide được phân thành hai nhóm: aldose (chứa nhóm chức aldehylde) và ketose (chứa nhóm chức ketone) (Hình 2.9) (Biology online, 2023)
Hình 2.9: Cấu trúc đường khử
3,5- dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng khi có mặt đường khử và được gia nhiệt sẽ chuyển thành 3-amino-5-nitrosalicylic acid có màu cam hoặc đỏ phụ thuộc vào nồng độ đường khử trong mẫu (Hình 2.10) và được đo ở bước sóng 540 nm Phương pháp này có thể phát hiện nồng độ glucose trong khoảng từ 0,5 mM (0,09% glucose w/v) đến 40 mM (0,72% glucose w/v) (National Centre for Biotechnology Education, 2016)
Hình 2.10: Sự đổi màu của 3,5-DNS khi có mặt đường khử
(Nguồn: National Centre for Biotechnology Education, 2016)
Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn
Phương pháp khuếch tán đĩa (khuếch tán giếng thạch, đục lỗ thạch) (Hình 2.11) sử dụng sự khuếch tán của dung dịch trên bề mặt đĩa thạch để xác định hoạt tính kháng khuẩn của mẫu Đây là phương pháp phổ biến nhất trong việc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Phương pháp này thường dùng trong kiểm tra sơ bộ và để lựa chọn hiệu quả dung dịch đem thử Nó thích hợp cho các nghiên cứu hàng loạt, tiết kiệm thời gian và mẫu thử Các dịch chiết bằng dung môi hữu cơ cũng cho hiệu quả vì chúng dễ bốc hơi, do đó chỉ còn chất thử khô trên mặt thạch Phương pháp này dùng cho cả định tính và cả định lượng khi đã biết rõ tính chất kháng khuẩn cũng như kích thước vòng kháng từ đó so sánh với mẫu mà nồng độ đã biết trong cùng điều kiện (Balouiri et al., 2016)
Hình 2.11: Phương pháp khuếch tán đĩa
Phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hoá
Phương pháp xác định khả năng trung hoà gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1- picryl-hydrazyl) được phát triển bởi Blois dựa trên sự thay đổi màu của dung dịch DPPH Đây là phương pháp đơn giản, các hợp chất cần đánh giá được trộn với dung dịch DPPH và độ hấp thụ quang sẽ được ghi trong khoảng thời gian xác định DPPH là một gốc tự do bền màu tím và có độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm Electron tự do của phân tử nitrogen trong DPPH bắt cặp với gốc hydro từ các chất chống oxy hoá sẽ làm mất màu tím của DPPH trong methanol (Hình 2.12) (Kedare & Singh, 2011)
Hình 2.12: Sự tạo thành DPPH-H khử
Phương pháp đánh giá sự kháng oxy hoá dựa vào khả năng bắt gốc ABTS + [2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] Phương pháp này có cùng cơ chế với phương pháp DPPH, tuy nhiên ABTS không phải gốc tự do nên đòi hỏi có ammonium [(NH4)2S2O3] hoặc potassium persulfate (K2S2O8) để tạo gốc ABTS + Khi bị mất điện tử và tạo ABTS + sẽ làm cho ABTS chuyển xanh và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 734 nm Nếu ABTS + bị khử bởi các chất chống oxy hoá sẽ trở lại thành ABTS và mất màu xanh (Hình 2.13) (Sadeer et al., 2020)
Hình 2.13: Sự tạo thành ABTS + và sự khử tạo ABTS
2.7.3 Phương pháp khảo sát năng lực khử
Phương pháp khảo sát năng lực khử sắt dựa trên quy tắc được phát triển bởi Benzie & Starin năm 1996 để đo khả năng khử sắt của huyết tương người đến năm 2000; Pulido, Bravo & Saura-Calixto đã điều chỉnh để định lượng khả năng chống oxy hoá của chiết xuất thực vật Phương pháp này đo khả năng chống oxy hoá khử phức hợp [Fe 3+ -(TPTZ)2] 2+ (sắt 2,4,6-tripyridyl-s-triazine) thành phức màu xanh đậm
Fe 2+ -(TPTZ)2 2+ [khử sắt (III) thành sắt (II)] và được làm trong điều kiện acid (pH=3,6) để duy trì khả năng hoà tan sắt Phản ứng ở pH thấp làm giảm khả năng ion hoá thúc đẩy sự chuyển đổi hydro và tăng oxy hoá khử Hoạt tính được xác định ở phổ hấp thụ là 593 nm (Hình 2.14) Phương pháp này cho kết quả nhanh (4–6 phút), đơn giản và ít tốn kém (Amarowicz & Pegg, 2019)
Hình 2.14: Sự khử sắt (III) thành sắt (II) trong phản ứng khử sắt với thuốc thử sắt 2,4,6- tripyridyl-s-triazine
Gần đây kali fericyanid [K3Fe(CN)6] là thuốc thử phổ biến được thay thế cho TPTZ Mẫu sẽ khử ion Fe 3+ trong K3Fe(CN)6 thành ion Fe 2+ Khi bổ sung thêm FeCl3 thì ion Fe 2+ sẽ tác dụng với ion ferrocyanide và tạo phức ferric ferrocyanide {K4[Fe(CN)6]3} có màu xanh dương, có độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm (Hình 2.15) Giá trị OD đánh giá được năng lực khử của mẫu, giá trị OD càng cao năng lực khử càng mạnh (Zhong & Shahidi, 2015)
Hình 2.15: Cơ chế phản ứng khử ion sắt (III) thành ion sắt (II) trong kali fericyanid
Tình hình nghiên cứu
Chơn và Dương (2019) đã nghiên cứu ảnh hưởng của dịch trích từ cây lồng đèn đến hoạt tính ức chế enzyme α-amylase thu được kết quả dịch chiết của lá ở nồng độ 2 mg/mL thu được phần trăm ức chế cao nhất là 86,68% Còn dịch chiết rễ và thân đạt khả năng ức chế cao nhất ở nồng độ 10 mg/mL (lần lượt là 74,47% và 61,67%) Kết quả định tính cho thấy rằng trong lá và thân cây đều có các hợp chất phổ biến như flavonoid, steroid, terpenoid, alkaloid (chỉ có ở lá)
Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá và chống viêm từ chiết xuất lá Trang to (Ixora duffii) của Định và ctv (2019) cho thấy hoạt tính chống oxy hoá dịch chiết tương đối cao với phần trăm ức chế gốc tự do DPPH từ 28,40–89,3% tương ứng với nồng độ dịch chiết từ 50–2000 àg/mL Lỏ Trang to cú sự hiện diện cỏc hợp chất alkaloid, flavonoid, anthraquinone, terpenoid, quinone, glycoside, coumarin và phenol; đặc biệt hàm lượng phenolic và flavonoid tổng khá cao Định và ctv (2019) đã xác định được trong cao chiết lá Gáo trắng (thuộc họ
Cà phê) có hàm lượng polyphenol là 375,43 mg GAE/g, hàm lượng flavonoid là 613,53 mg QE/g Thành phần cao lá Gáo trắng gồm alkaloid, flavonoid, glycoside, phenol, tannin, triterpenoid Hoạt tính kháng oxy hoá được khảo sát bằng phương pháp DPPH, và khử sắt (RP) thấy được cao Gáo trắng có khả năng chống oxy hoá khá tốt
Trang và ctv (2019) đã đánh giá khả năng kháng oxy hoá và ức chế enzyme 𝛼-amylase và 𝛼-glucosidase của cao chiết từ lá cây núc nác (Oroxylum indicum L.) thấy được thành phần hoá học chính của lá có chứa các hợp chất alkaloid, flavonoid, glycoside, tannin, steroid và triterpenoid Hàm lượng polyphenol là 60,56 mg GAE/g và flavonoid là 235,29 mg QE/g Cao chiết có khả năng ức chế 50% enzyme ở nồng độ tương đương 693,52 àg/mL Cỏc tỏc giả kết luận rằng hoạt động khỏng oxy hoỏ và ức chế enzyme của cao chiết có mối tương quan đến hàm lượng polyphenol và flavonoid trong thành phần
Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết hạt đu đủ ở nồng độ 25 mg/mL là 59%, hoạt tính bắt gốc ABTS của nó là 61,3% ở 2 mg/mL và 75,6% ở 2,5 mg/mL Các tác giả đánh giá rằng cao chiết hạt đu đủ có hoạt tính bắt gốc DPPH và ABTS tốt (Như và ctv., 2020)
Ngọc và ctv (2022) đã có một số phát hiện khi nghiên cứu về vỏ quả cà phê thấy được khả năng chống oxy hoỏ của dịch chiết ethanol 50% ở nồng độ 300 àg/mL cho kết quả ức chế được 86,27% DPPH
Thảo và ctv (2022) đã nhận thấy trong cao Tảo nâu cho hiệu quả ức chế enzyme 𝛼-amylase là 52,95 mg/L tương đương với chất chuẩn acarbose là 60,88 mg/L
Từ nghiên cứu trong nước thấy được vẫn chưa có nghiên cứu về mật của các loài hoa kể cả mật trong hoa và ngoài hoa Các nghiên cứu tập trung vào các bộ phận khác của cây như rễ, thân, lá, quả, hoa
Carter and Thornburg (2000) đã chứng minh rằng NEC1 có vai trò bảo vệ các mô sinh sản của hoa khỏi sự tấn công của vi sinh vật Tuy nhiên loại protein này chỉ có ở một số loài như Brugmansia candida, Camellia japonica, Nicotiana alata, Nicotiana tabacum,…; không thấy hiện diện ở Abutilon hybridum, Columnea longifolia, Ixora chinensis, Rhoeo spathaeae,… Ở chi Nicotiana thấy được hàm lượng protein gần 250 mg/mL và ở dạng NEC1 đến NEC5 Vào năm 2004, họ đã chỉ ra rằng có một lượng protein tích tụ trong mật hoa cây thuốc lá có tác dụng bảo vệ hoa tránh khỏi sự xâm nhập của vi sinh vật
Sasu et al (2010) đã thực hiện thí nghiệm thử hoạt tính kháng Escherichia coli và Erwinia tracheiphila (vi khuẩn gây héo trên các cây bầu bí) của mật hoa Cucurbita pepo Kết quả cho thấy với mật hoa Cucurbita pepo có khả năng ức chế vi khuẩn E coli trong 12 giờ và E tracheiphila trong 24 giờ đồng thời kết quả cho thấy khả năng kháng khuẩn giữa mật hoa và ampicillin không có sự khác biệt đáng kể
Trong nghiên cứu của Stahl et al (2012) cho thấy tổng nồng độ đường của mật hoa Ananas ananassoides là 252,9 mg/mL trong đó nồng độ sucrose là 138,9 mg/mL, glucose là 61,6 mg/mL, fructose là 52,7 mg/mL Có thể thấy là mật hoa chiếm ưu thế là sucrose Đường trong mật hoa này có nguồn gốc từ sự thuỷ phân tinh bột dự trữ trong nhu mô
Shah et al (2013) đã định lượng được hàm lượng phenol, đường tổng số và nồng độ protein trong mẫu mật Mucuna sempervirens lần lượt là 120,4 àg GAE/mL, 293,8 mg/mL, 620,3 àg/mL, trong đú nồng độ đường khử trong mẫu là 11,7 mg/mL Ngoài ra tác giả còn xác định được mật hoa Mucuna sempervirens có các loại protein như valine, tryptophan, lysine, aspartic acid,…; một số ion kim loại như Ca, Mg, S, Cu,…
Verónica et al (2014) đã phân tích các hợp chất phenol trong mật hoa hành tõy và nhận thấy rằng cú hàm lượng phenol dao động từ 6,52 – 11,78 àg/mL Trong thành phần phát hiện được các hợp chất thuộc nhóm phenol như vinylphenol, rutin, quercetin, catechin,…
Khi phân tích protein và alkaloid của mật hoa một số loài họ Solanaceous, Kerchner et al (2015) nhận thấy rằng hàm lượng protein của Brugmansia suaveolens,
Lycium barbarum, Nicotiana alata, Nicotiana rustica, Nicotiana tabacum lần lượt là
88 àg/mL, 131àg/mL, 84,5 àg/mL, 265,5 àg/mL Đồng thời xỏc định được cú 2 loại alkaloid là nicotine và sacpolamine trong thành phần các loại mật hoa trên
Nồng độ phenolic tổng số của cao chiết từ thân cây Trang son là 121,75 mg GAE/g, còn flavonoid là 38,71 mg QE/g Trong khi đó khả năng ức chế 50% gốc tự do DPPH của cao chiết thõn cõy Trang son là 162,81 àg/mL Cao chiết thõn cõy Trang thể hiện tốt khả năng ức chế gốc tự do DPPH (Rikhabchand & Dayaram, 2017)
Khi phân tích mật hoa chi Nicotiana nhận thấy được N bonariensis có nồng độ protein là 778 àg/mL, cũng như hàm lượng carotenoid cao Tỏc giả nhận xột rằng carotenoid và một số sắc tố khác có thể hoạt động như một chất bảo vệ cho mật hoa Đồng thời phát hiện được ascorbate (một chất chống oxy hoá có liên quan đến quá trình oxy hoá khử mật hoa) có mặt ở tất cả loài của chi (Silva et al 2018)
Anila and Hashim (2019) đã đánh giá hoạt tính chống đái tháo đường của chiết xuất methanol của hoa Trang son thấy được trong dịch chiết của hoa có các chất chuyển hoá thứ cấp như flavonoids, phenols, steroids và tannins Tổng hàm lượng phenol là 30,6 mg/g; cũng như nhận xét dịch chiết của hoa có khả năng ức chế enzyme α-amylase lờn đến 72% ở liều lượng là 100 àg/mL Cỏc tỏc giả chứng minh được rằng chiết xuất của hoa thể hiện hoạt động trị đái tháo đường có thể là do có lượng hợp chất hoạt tính sinh học cao như polyphenolics
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Đại học Cần Thơ
3.1.2 Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2024 đến tháng 04/2024
3.1.3 Mẫu và cách thu mẫu
Hoa Trang son được thu thập ở quận Ninh Kiều thành phố Cần Thơ Thu mẫu bằng cách cắt ở cành, bảo quản trong thùng giữ nhiệt để tránh va đạp gây nát mẫu và tránh cho mật hoa bay hơi
Mật hoa được thu ngay khi đem hoa về phòng thí nghiệm Sử dụng bơm kim tiêm thu mật, sau đó chuyển mật từ bơm kim tiêm sang ống eppendorf và bảo quản trong điều kiện lạnh
3.1.4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất
Thiết bị được dùng trong thí nghiệm được trình bày trong Bảng 3.1
Bảng 3.1: Một số thiết bị phòng thí nghiệm
Tên thiết bị Nhà cung cấp
Tủ vô trùng Daihan Labtech- Hàn Quốc
Cân điện tử Mettler toledo- Thuỵ Sỹ
Nồi khử trùng nhiệt ướt Hirayama- Nhật Bản
Tủ lạnh Panasonic- Nhật Bản
Máy đo quang phổ UV-vis Thermo Scientific- Mỹ
Máy ủ nhiệt Thermomixer comfort- Đức
Máy ly tâm Hermle Z232K- Đức
Máy khuấy từ AS One- Nhật Bản
Máy đo pH Hanna- Rumania
Kính nhìn nổi Carl Zeiss- Đức
Bơm kim tiêm 1 mL, eppendorf, đĩa petri, micropipet, đầu cone, bình tam giác, que cấy, cốc thuỷ tinh, chai thuỷ tinh, đèn cồn, ống đong, ống nghiệm, đĩa 96 giếng, ống falcon, que cấy
D-glucose (Xilong, Trung Quốc), tetracyclin (Sigma, Mỹ), DPPH (2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl) (Zhanyun, Trung Quốc), methanol (Xilong, Trung Quốc), FeCl3.6H2O (Xilong, Trung Quốc), CCl3COOH, K3Fe(CN)6 (Xilong, Trung Quốc), NaH2PO4 (Xilong, Trung Quốc), NaH2PO4.7H2O (GHTech, Trung Quốc), thuốc thử Coomassie Brilliant Blue (Merck, Đức), H3PO4 (Xilong, Trung Quốc), ABTS [2,2- azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] (Trung Quốc), gallic acid (Trung Quốc), DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) (Trung Quốc), KNaC4H4O6.4H2O (Xilong, Trung Quốc), quercetin (Trung Quốc), BSA (Albumin huyết thanh bò) (Sigma, Mỹ), thuốc thử Folin-Ciocalteu (Oxford, Ấn Độ), AlCl3 (Xilong, Trung Quốc) và một số hoá chất khác
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong trong môi trường Luria Broth (LB) có thành phần gồm: 5 g peptone; 2,5 g yeast extract; 10 g NaCl; 10 g agar, 500 mL nước cất, pH=7 ở 37˚C.
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Khảo sát hình thái, vị trí tiết mật và thể tích mật hoa Trang son a Mục đích
Xác định được hình thái, giai đoạn tiết và vị trí tiết mật cũng như thể tích mật của hoa Trang son b Thực hiện
Hoa sau khi thu sẽ được đem đi định danh, đo kích thước, sau đó cắt dọc hoa để xác định giai đoạn tiết mật cũng như vị trí tiết mật của hoa
Thu mật của mười bông hoa để đo thể tích của một bông c Chỉ tiêu phân tích
Hình thái sẽ được xác định dựa theo các nghiên cứu của Quân (2022)
Giai đoạn tiết mật được xác định dựa theo nghiên cứu của Pacini and Nicolson (2007) Vị trí tiết mật được xác định dựa theo nghiên cứu của Pacini and Nicolson (2007) và Heil (2011)
Thể tích mật sẽ được chạy thống kê để so sánh sự khác biệt về thể tích ở các giai đoạn và so sánh với nghiên cứu của Kulkarni et al (2022)
3.2.2 Khảo sát thành phần hoá học của mật hoa Trang son
3.2.2.1 Phương pháp định tính một số hợp chất có hoạt tính sinh học a Mục đích
Xác định sự hiện diện của các hợp chất sinh học trong thành phần của mật hoa theo phương pháp của Tiwari et al (2011), Vishwakarma et al (2014), Riaz et al (2018) b Thực hiện Định lượng các hợp chất sinh học bằng hoá chất theo Bảng 3.2 Đối chứng âm là nước cất
Bảng 3.2: Quy trình định tính các hợp chất sinh học bằng hoá chất
Hợp chất Thí nghiệm Hiện tượng
Phenolic 500 àL mẫu + 1-2 giọt FeCl3 10% Xuất hiện kết tủa xanh đen hoặc đỏ cam
Tannin 500 àL mẫu + 1-2 giọt gelatin- muối, đun nóng Xuất hiện kết tủa bông trắng
Flavonoid 750 àL mẫu + 250 àL NaOH
10% Xuất hiện màu vàng đậm
Saponin 250 àL mẫu + 250 àL dầu olive Xuất hiện nhũ tương (đục)
Alkaloid 250 àL mẫu + 1-2 giọt thuốc thử wagner Xuất hiện kết tủa nâu đỏ
Coumarin 500 àL mẫu + 750 àL NaOH
Quinone 500 àL mẫu + 1-2 giọt HCl đậm đặc Xuất hiện kết tủa màu vàng
Terpenoid 500 àL mẫu + 500 àL chloroform
+ 1-2 giọt H2SO4 Xuất hiện vòng đỏ nâu c Chỉ tiêu phân tích
Sự hiện diện các hợp chất được so sánh với mẫu đối chứng và hiện tượng ở Bảng 3.2
3.2.2.1 Phương pháp xác định phenolics tổng số a Mục đích
Xác định hàm lượng phenolics tổng số trong mẫu mật hoa theo mô tả của Yadav and Agarwala (2016)
Cân 0,1 mg gallic acid thêm vào 1 mL nước cất, lắc đều đến khi tan hoàn toàn, thu được dung dịch gallic acid 0,1 mg/mL Gallic acid được pha theo Bảng 3.3 để xây đường chuẩn
Bảng 3.3: Nồng độ pha loãng của gallic acid
Nồng độ gallic acid (àg/mL) Thể tớch nước cất (àL) Thể tớch gallic acid
Cho 100 àL mẫu và 250 àL thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% Để yờn trong 5 phỳt trong tối ở nhiệt độ phũng Sau đú thờm 200 àL Na2CO3 2%, ủ thờm 45 phỳt trong tối ở nhiệt độ phòng Đo độ hấp thụ ở bước sóng 765 nm Thực hiện tương tự gallic acid, mẫu trắng thay bằng nước cất Lặp lại 3 lần c Chỉ tiêu phân tích
Nồng độ phenolic tổng số trong mẫu dựa theo phương trình đường chuẩn gallic acid Hàm lượng phenol được xác định tương đương microgram gallic acid trên milliliter mật hoa (àg GAE/mL) Đồ thị chuẩn với trục tung là độ hấp thụ, trục hoành là nồng độ GAE (àg/mL) y = ax + b x: nồng độ phenolic (àg GAE/mL) y: giá trị ở bước sóng 765 nm a và b: hằng số
3.2.2.2 Phương pháp xác định flavonoids tổng số a Mục đích
Xác định hàm lượng flavonoids tổng số trong mẫu mật hoa theo mô tả của Djeridane et al (2006) b Thực hiện
Dung dịch quercetin: 0,1 mg quercetin cho vào 1 mL MeOH, hoà tan thu được dung dịch nồng độ 0,1 mg/mL Dãy nồng độ được pha theo Bảng 3.4
Bảng 3.4: Nồng độ pha loãng của quercetin
Nồng độ quercetin (àg/mL)
Thể tích dung dịch quercetin 0,1 mg/mL
Thể tích dung dịch MeOH
Hỳt 100 àL mẫu trộn với 100 àL AlCl3 2%, tiếp tục để yờn trong 15 phỳt trong tối ở nhiệt độ phòng Đo độ hấp thụ ở bước sóng 430 nm Dung dịch quercetin được dùng để xây đường chuẩn Thực hiện tương tự với dung dịch quercetin, mẫu trắng thay quercetin bằng MeOH Lặp lại 3 lần c Chỉ tiêu phân tích
Nồng độ flavonoid tổng số trong mẫu dựa theo phương trình đường chuẩn quercetin Hàm lượng flavonoid được xác định tương đương microgram quercetin trờn milliliter mật hoa (àg QE/mL) Đồ thị đường chuẩn với trục tung là độ hấp thụ, trục hoành là nồng độ QE (àg/mL) Lượng flavonoid được xỏc định dựa theo phương trình: y = ax + b x: nồng độ flavonoid (àg QE/mL) y: giá trị ở bước sóng 430 nm a và b: hằng số
3.2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử a Mục đích
Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu mật hoa theo mô tả của Miller (1959) b Thực hiện
Thuốc thử A: cân 2,5 g DNS (3,5-dinitrosalicylic acid), thêm vào 50 mL NaOH 2M, dùng máy khuấy từ có gia nhiệt nhẹ để hoà tan DNS
Thuốc thử B: Cân 7,5 g KNaC4H4O6.4H2O (muối Rochelle), thêm vào 125 mL nước cất, lắc đến khi hoà tan hết
Thêm thuốc thử A vào B, sau đó thêm nước cất đến khi đạt được thể tích 250 mL, bảo quản trong chai thuỷ tinh sẫm màu
Dung dịch D-glucose: cân 1 mg glucose thêm 1 mL nước cất thu được dung dịch chuẩn 1 mg/mL Pha loãng mẫu theo Bảng 3.5 để xây đường chuẩn
Bảng 3.5: Nồng độ pha loãng của D-glucose
Thể tích dung dịch D-glucose
1 mg/mL (àL) Thể tớch nước cất (àL)
Hỳt 250 àL mẫu mật thờm vào eppendorf sau đú thờm 500 àL DNS, đúng kớn, ủ ở 100˚C trong 2 phút và để nguội trong 2 phút, đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm Thực hiện tương tự với glucose, mẫu trắng là nước cất thay cho D-glucose Lặp lại 3 lần c Chỉ tiêu phân tích
Nồng độ đường khử trong mẫu dựa theo phương trình đường chuẩn D-glucose Hàm lượng đường khử được xác định tương đương microgram glucose trên milliliter mật hoa (àg/mL) Đồ thị đường chuẩn với trục tung là độ hấp thụ, trục hoành là nồng độ đường (àg/mL) Lượng đường khử được xỏc định dựa theo phương trỡnh: y = ax + b x: nồng độ đường (àg/mL) y: giá trị ở bước sóng 540 nm a và b: hằng số
3.2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein a Mục đích
Xác định hàm lượng protein trong thành phần trong mật hoa Trang son bằng khả năng tạo phức của thuốc thử với protein theo phương pháp Bradford (1976)
Thuốc thử Coomassie Brilliant Blue: cân 0,05 g Coomassie Brilliant Blue G-
250 thêm vào 25 mL ethanol 95% và 50 mL H3PO4 85%, khuấy đều trong tủ hút sau đó thêm nước cất đến khi đạt thể tích là 100 mL, đựng trong chai có nút đậy kín và giữ lạnh ở 4˚C Khi sử dụng lấy 10 mL thuốc thử gốc thêm 40 mL nước cất thu được thuốc thử 1X, sử dụng trong ngày
Albumin huyết thanh bò (BSA): cân 0,1 mg BSA pha với 1 mL nước cất, lắc đều thu được dung dịch 0,1 mg/mL, dựa theo Bảng 3.6 để xây đường chuẩn
Bảng 3.6: Nồng độ pha loãng của BSA
Nồng độ BSA (àg/mL) H2O (àL) Thể tớch BSA
Hỳt 50 àL mẫu và 250 àL thuốc thử cho vào eppendorf, lắc nhẹ để trộn đều dung dịch, sau 5 phút đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm Thực hiện tương tự với BSA, mẫu trắng sử dụng nước cất thay cho BSA Lặp lại 3 lần c Chỉ tiêu phân tích
Nồng độ protein tổng số trong mẫu dựa theo phương trình đường chuẩn BSA Hàm lượng protein được xác định tương đương microgram trên milliliter mật hoa (àg/mL) Đồ thị đường chuẩn với trục tung là độ hấp thụ, trục hoành là nồng độ BSA (àg/mL) Lượng protein được xỏc định dựa theo phương trỡnh: y = ax + b x: nồng độ protein (àg/mL) y: giá trị ở bước sóng 595 nm a và b: hằng số
3.2.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của mật hoa Trang son a Mục đích
Xác định mật hoa Trang son khả năng ức chế dòng vi khuẩn E coli và P aureus, C acnes để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của mật hoa (Trang và ctv., 2018) b Thực hiện
Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2019 để vẽ biểu đồ và tính toán các kết quả thu được
Sử dụng phần mềm SPSS 27 để phân tích One-way ANOVA bằng phép thử Duncan ở mức 95%
