nghiên cứu sự biến động về vi sinh vật trên đối tượng chim yến nuôi tại các vùng nam trung bộ và tây nguyên. khảo sát sự nhạy cảm kháng sinh trên loài vi sinh vật đã phân lập được

LỜI MỞ ĐẦU Chim yến loài động vật quý tồn thiên nhiên từ lâu mà chưa có tài liệu nghiên cứu cho biết rõ lồi chim có từ Chúng ta tìm hiểu lịch sử hình thành chim yến từ lịch sử tiêu thụ tổ chim yến quay người Trung Hoa, suốt 1.500 triều đại nhà Đường (618-907 sau công nguyên) Người ta tin tổ yến thủy thủ đường biển mang tư vùng Nan Vang, (vùng phía Nam Trung Quốc), sau giới thiệu vào cung vua Trung Quốc ăn cao lương mỹ vị hồng tộc Từ thời điểm người ta biết chim yến loài động vất quý giá trị tổ yến giải nước yến kết tinh mang lại cao loài chim có trước lâu Trong suốt thời đại có Đế Vương quan chức hồng triều có hội thưởng thức tổ yến Mãi cuối triều đại này, người dân thường giới thiệu chim yến tổ yến, giá trị nhu cầu tổ yến tăng lên kể từ khan dinh dưỡng cao tổ yến Từ tài liệu cho thấy có hiểu biết tiến triển loài chim yến xuyên thời gian Còn tài liệu vòng năm 1587 cho thấy số lượng chim yến, tổ yến nhập vào Trung Quốc đánh thuế Vào năm 1618 theo nhiều tài liệu cho thấy số lượng nhập tăng nhiều số lượng đánh thuế bị sụt giảm Vào thời tổ chim yến ưa chuộn thức ăn quý giá bỡi cư dân tỉnh Guangdong and Fujian Trung Quốc Kể từ nhiều tài liệu phủ kín nơi xuất phát nguồn gốc chim yến Hàng trăm năm sau tổ chim yến chấp nhận loại thức ăn quý giá Trung Quốc Ngày chấp nhận rộng rãi người Hoa có tính chữa bệnh hiệu Dựa vào nhà nghiên cứu đại, lượng protein chứa tổ yến có khả kích thích sống người tươi trẻ lại tự triệt tiêu tổ yến Các nhà nghiên cứu cho biết tổ chim yến chứa lượng yếu tố phát triển biểu bào Nguồn nước tổ chim yến kích thích cách trực tiếp phát triển tế bào, hồi sinh làm tăng hiệu tác nhân phân bào Và loại protein tổ yến có tác dụng thật tốt cho có hệ tiêu hóa kém( ví dụ người già…), người cần tái tạo phát triển tế bào cách nhanh chóng (như phụ nữ mang thai hay trẻ em phát triển…), cịn kích thích phát triển phân chia tế bào phạm vi miễn dịch Với giá trị dinh dưỡng lẫn kinh tế trên, nên ngày nay, nghề nuôi chim yến phát triển không nước giới, mà Việt Nam rầm rộ tỉnh miền Trung Nam Tuy vậy, chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu loại vi sinh vật có lồi chim để có bước phịng ngừa hay hạn chế tác nhân gây ảnh hưởng đến phát triển lồi yến Để từ đó, tạo loại tổ yến thượng hạng cung cấp phục vị nhu cầu người Ý thức xu hướng mà em chọn đề tài: “Nghiên cứu biến động vi sinh vật đối tượng chim yến nuôi vùng Nam Trung Bộ Tây Nguyên Khảo sát nhạy cảm kháng sinh loài vi sinh vật phân lập được” Đề tài thực với mục tiêu sau:  Phân lập đinh danh loại vi khuẩn diện đối tượng chim yến nuôi thử nghiệm sinh hóa  Khảo sát tính nhạy cảm kháng sinh loài vi sinh vật phân lập LỜI CÁM ƠN Trước tiên, xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang quan tâm, bảo giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tơi có kiến thức q báu suốt thời gian học tập trường Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc đến Ths Lê Nhã Uyên, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, định hướng, dìu dắt tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Trương Thị Thu Thủy, cán quản lý phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành đề tài Cuối cùng, tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, người quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời chỗ dựa tinh thần lớn giúp tơi hồn thành tốt cơng việc giao suốt thời gian học tập thực đồ án vừa qua Nha Trang, tháng năm 2012 Sinh viên Huỳnh Ngọc Hoàng Trang i MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU LỜI CÁM ƠN DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC HÌNH KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT v KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chim yến 1.1.1 Giới thiệu đặc điểm chim yến 1.1.1.1 Hình dạng kích thước chim yến .1 1.1.1.2 Tập quán sinh sống chim yến 1.1.1.3 Sự phân bố địa lý chim yến Việt Nam giới 1.1.2 Tiềm kinh tế .4 1.1.3 Phân loại chim yến 1.1.4 Yến sào .7 1.1.5 Giá trị dinh dưỡng tổ chim yến 1.1.6 Giá trị thị trường tổ chim yến 1.1.7 Tình trạng khai thác yến sào Việt Nam giới 1.1.8 Phân loại yến sào 10 1.1.8.1 Phân loại theo nguồn gốc 10 1.1.8.2 Phân loại theo màu sắc .11 1.1.8.3 Phân loại theo quan niệm dân gian 12 1.1.9 Phân biệt tổ yến thật giả .12 1.2 Tổng quan vi sinh vật .13 1.2.1 Sự sinh trưởng vi sinh vật yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống vi sinh vật 14 1.2.2 Một số vi sinh vật thường gặp động vật có lơng vũ 16 ii 1.3 Tổng quan kháng sinh 21 1.3.1 Đặt điểm chung chất kháng sinh 21 1.3.2 Định nghĩa chất kháng sinh 22 1.3.3 Đơn vị kháng sinh 22 1.3.4 Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu 22 1.3.5 Phổ kháng khuẩn kháng sinh 23 1.3.6 Cơ chế tác dụng kháng sinh 23 1.3.7 Phân loại kháng sinh 24 CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu 25 2.1.1 Mẫu 25 2.1.2 Phương pháp lấy mẫu chuẩn bị mẫu 25 2.1.2.1 Mục đích yêu cầu việc lấy mẫu 25 2.1.2.2 Lấy mẫu 25 2.1.3 Trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm 26 2.1.3.1 Thiết bị chuyên dùng 26 2.1.3.2 Hóa cất, mơi trường thuốc thử (xem phần phụ lục) 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3 Phân lập định danh vi khuẩn thử nghiệm sinh hóa .27 2.3.1 Phân lập vi khuẩn 27 2.3.2 Định danh vi khuẩn phân lập thử nghiệm sinh hóa 36 2.3.2.1 Vi khuẩn E.coli 36 2.3.2.1 Vi khuẩn Salmonella 39 2.3.2.2 Vi khuẩn Vibrio 42 2.4 Phương pháp xác định khả mẫn cảm vi khuẩn E.coli phân lập số loại khái sinh thông dụng 43 CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Phân lập vi khuẩn định danh vi khuẩn thử nghiệm sinh hóa 46 iii 3.1.1 Vi khuẩn Escherichia coli .46 3.1.2 Vi khuẩn Vibrio 51 3.1.3 Vi khuẩn Salmonella .53 3.1.4 Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn phương pháp nhuộm Gram57 3.1.4.1 Vi khuẩn E.coli 57 3.1.4.2 Vi khuẩn Vibrio 58 3.1.4.3 Vi khuẩn Salmonella 58 3.1.5 Nấm men, nấm mốc 59 3.1.6 Kết xác định khả mẫn cảm chủng E.coli phân lập với loại kháng sinh thông dụng 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Địa điểm lấy mẫu để phân lập 25 Bảng 2.2 Bảng tiêu chuẩn đánh giá vịng vơ khuẩn 45 Bảng 3.1 Số mẫu vi khuẩn E.coli phân lập từ phân chim yến 46 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm IMViC mẫu nghi ngờ E.coli 47 Bảng 3.3 Số mẫu nghi ngờ vi khuẩn Vibrio phân lập từ phân chim yến .51 Bảng 3.4 Kết thử nghiệm sinh hóa mẫu nghi ngờ Vibrio 52 Bảng 3.5 Số mẫu vi khuẩn Salmonella phân lập từ phân chim yến 54 Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính mẫu nghi ngờ Salmonella 54 Bảng 3.7 Kết định lượng nấm men, nấm mốc tổng số 59 Bảng 3.8 Kết xác định khả mẫn cảm E.coli số loại kháng sinh thông dụng 61 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Chim Yến Hình 1.2 Bản đồ phân bố chim yến tỉnh miền Trung miền Nam Hình 1.3 Tổ Yến Hình 1.4 Khai thác Yến hang 10 Hình 1.5 Đường cong sinh trưởng vi sinh vật 16 Hình 1.6 Tổng số vi khuẩn hiếu khí qua nồng độ pha lỗng 17 Hình 1.7 Coliforms 17 Hình 1.8 Escherichia Coli 18 Hình 1.9 Staphylococcus aureus 19 Hình 1.10 Salmonella 19 Hình 1.11 Vibrio Cholera Vibrio parahaemolyticus 20 Hình 1.12 Nấm Saccharomyces Cerevisiea 21 Hình 1.13 Vị trí tác dụng số chất kháng sinh 23 Hình 2.1 Sơ đồ cách tiếp cận nội dung nghiên cứu đề tài 27 Hình 2.2 Sơ đồ pha loãng mẫu 28 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình phát định danh E.coli 30 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình phát định danh V.brio 32 Hình 2.5 Sơ đồ quy trình phát định danh V.brio 34 Hình 3.1 Khuẩn lạc nghi ngờ E.coli phân lập mơi trường EMB 46 Hình 3.2 Kết thử nghiệm Indol dương tính E.coli 48 Hình 3.3 Kết thử nghiệm MR dương tính E.coli 49 Hình 3.4 Kết thử nghiệm VP âm tính E.coli 49 Hình 3.5 Kết thử nghiệm Citrate âm tính E.coli 50 Hình 3.6 Khuẩn lạc nghi ngờ ibrio parahaemolyticus mơi trường TCBS 51 Hình 3.7 Kết thử nghiệm KIA mẫu nghi ngờ Vibrio 52 Hình 3.8 Khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella môi trường XLD 54 Hình 3.9 Kết thử nghiệm KIA mẫu nghi ngờ Salmonella 55 Hình 3.10 Kết thử nghiệm Citrate dương tính mẫu nghi ngờ Salmonella 55 vi Hình 3.11 Kết theo thứ tự từ trái sang phải mẫu nghi ngờ Salmonella là: Manniltol(+), Glucose(+), Saccharose(-), Urease(-), Sorbitol(+) 56 Hình 3.12 Tế bào vi khuẩn E.coli sau nhuộm gram quan sát kính hiển vi độ phóng đại X-100 57 Hình 3.13 Tế bào vi khuẩn nghi nghờ Vibrio sau nhuộm gram quan sát kính hiển vi độ phóng đại X-100 58 Hình 3.14 Tế bào vi khuẩn nghi ngờ Salmonella sau nhuộm gram quan sát kính hiển vi độ phóng đại X-100 58 Hình 3.15 Kết nấm men, nấm mốc tổng số môi trường SDA 60 Hình 3.16 Kết làm kháng sinh đồ 61 vii KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT AP W Alkaline Peptone Water BPW Buffer Pepton Water BGBL Brilliant Green Lactose Bile Salt CFU/ML Colyny Forming Unit per mililit: số đơn vị khuẩn lạc mililit EMB Eosin Methylene Blue Lactose MP-VP Methyl Red-Voges Proskauer TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose TSA Trypticase Soy Agar SDA Sabouraud’s Dextrose Agar SCA Simmons Citrate Agar XLD Xylose Lysine Desoxycholate Agar 59 tẩy màu không bị bắt màu thuốc nhuộm cịn Gram (-) cồn dễ dàng tẩy lớp lipid lớp peptidoglycan mỏng nên gram (-) bị màu tím Khi rửa cồn nên rửa nhanh để đủ tẩy lớp lipid, lớp peptidoglican bên bắt màu đỏ hồng lần nhuộm tiếp Nếu dùng cồn q lâu khơng bắt màu fuchsin lần sau (do lỗ peptidoglican bị cồn làm co lại) 3.1.5 Nấm men, nấm mốc Bảng 3.7 Kết định lượng nấm men, nấm mốc tổng số Mẫu Mật độ tế bào (cfu/ml) Mẫu Mật độ tế bào (cfu/ml) 1.1 x 102 2.1 3.9 x 103 1.2 1.6 x 103 2.2 4.1 x 103 1.3 5.5 x 103 2.3 9.2 x 103 1.4 7.5 x 103 2.4 1.07 x 104 1.5 x 103 2.5 8.2 x 103 1.6 5.2 x 103 2.6 6.7 x 103 1.7 5.7 x 103 2.7 9.6 x 103 1.8 6.2 x 103 2.8 x 102 1.9 4.1 x 103 2.9 x 103 1.10 3.4 x 103 2.10 9.6 x 103 1.11 1.2 x 103 2.11 8.6 x 103 1.12 1.03 x 104 2.12 x 103 1.13 2.1 x 103 2.13 8.2 x 103 1.14 8.2 x 103 2.14 6.1 x 103 1.15 3.7 x 103 2.15 6.7 x 103 1.16 8.7 x 103 60 Hình 3.15 Kết nấm men, nấm mốc tổng số môi trường SDA Kết phân lập nấm men, nấm mốc tổng số mẫu 1.12; 2.3; 2.4; 2.10 cho kết tổng số nấm men, nấm mốc với số lượng cao: từ 9.2 x 10 (cfu/ml) mẫu 2.3 đến 1.07 x 104 (cfu/ml) mẫu 2.4 Từ kết này, cho ta thấy môi trường sống chim yến ni bị nhiễm bào tử nấm men, nấm mốc từ phân phát tán ra, ảnh hưởng đến sức khỏe chim yến chất lượng tổ yến thu hoạch 3.1.6 Kết xác định khả mẫn cảm chủng E.coli phân lập với loại kháng sinh thông dụng Để xác định khả mẫn cảm kháng kháng sinh số chủng E.coli phân lập từ phân chim yến nhà vùng Nam Trugn Bộ Tây Nguyên nhằm nghiên cứu khả kháng kháng sinh vi khuẩn E.coli với số loại kháng sinh thông dụng Chúng chọn đại diện số chủng phân lập để làm kháng sinh đồ Trong phần thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng 13 loại kháng sinh thông thường như: Ampicilline, Ciprofloxacine, Gentamicine, để đánh giá tính mẫn cảm E.coli theo bảng tiêu chuẩn đọc kết đường kính vịng ức chế Enterobacteriaceae Kết đánh giá thể qua bảng 3.8 61 Bảng 3.8 Kết xác định khả mẫn cảm E.coli số loại kháng sinh thông dụng STT Tên kháng sinh Số chủng Kháng Trung bình Mẫn cảm Tổng % Tổng % Tổng % 10 Amoxilin kiểm tra 0 10 90 clavualanic acid Ampicillin 10 40 0 60 Cefuroxime 10 10 100 0 0 Cephalexin 10 0 0 10 100 Ciprofloxacin 10 0 0 10 100 Chloramphenicol 10 10 0 60 Gentamicin 10 30 0 70 Ofloxacine 10 0 0 10 100 Streptomycin 10 0 20 80 10 Tetracyline 10 30 0 70 Hình 3.16 Kết làm kháng sinh đồ Kết bảng 3.8 cho thấy, tượng kháng thuốc lúc nhiều loại kháng sinh không nhiều chủng E.coli phân lập Các chủng E.coli 62 kháng hoàn toàn với Cefuroxime (100%), số kháng với Ampicillin, Chloramphenicol, Gentamicin, Tetracyline (từ 30-40%) Các chủng vi khuẩn kiểm tra mẩn cảm với loại kháng sinh như: Amoxilin/clavualanic acid, Ampicillin, Cephalexin, Ciprofloxacin, Chloramphenicol, Gentamicin, Ofloxacine, Streptomycin, Tetracyline với tỷ lệ từ 60-100% 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau phân lập định danh vi khuẩn phân chim yến nuôi vùng Nam Trung Bộ Tây Nguyên thử nghiệm sinh hóa phịng thí nghiệm, chúng tơi thu số kết sau: Chúng phân lập 38 mẫu vi khuẩn từ phân chim yến nuôi vùng Nam Trung Bộ Tây Nguyên Trong đó, có : a) 28 mẫu bị nhiễm E.coli b) mẫu nghi ngờ bị nhiễm V.parahaemolyticus c) mẫu nghi ngờ bị nhiễm Salmonella Khả mẫn cảm loại vi sinh vật phân lập với số loại kháng sinh thông dụng: Sau phân lập định danh, tiến hành thử tính mẫn cảm kháng sinh với số mẫu E.coli (1.4;1.5;1.15;2.3;2.6;2.10;2.11;2.12;2.13;2.15) cho kết sau: + Hiện tượng kháng thuốc chủng với nhiều loại kháng sinh khơng có + Tồn chủng kháng hoàn toàn với Cefuroxime (100%) + Một số chủng mẫn cảm với loại kháng sinh như: Amoxilin/clavualanic acid, Ampicillin, Cephalexin, Ciprofloxacin, Chloramphenicol, Gentamicin, Ofloxacine, Streptomycin, Tetracyline với tỷ lệ từ 60-100% KIẾN NGHỊ Định danh chủng E.coli sinh học phân tử Tiến hành thử nghiệm sinh hóa cịn lại chủng Vibrio Samonella Sau đó, định danh bằng sinh học phân tử Tiến hành thử khả mẫn cảm chủng định danh với số loại kháng sinh thơng dụng Nghiên cứu quy trình bổ sung chất kháng sinh vào thức ăn cho đối tượng chim yến nuôi 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Thực hành phân tích thực phẩm, trường đại học cơng nghiệp thực phẩm Tp Hồ Chí Minh 2010 Kháng sinh thú y, Võ Văn Minh, nxn Đà Nẵng Đại cương vi sinh vật thực phẩm, Trần Liên Hà, đại học bách khoa Hà Nội, nxb khoa học kỹ thuật Cẩm nang vi sinh vật y học, GS TS BS Lê Huy Chính, nxb y học Thí nghiệm vi sinh vật thực phẩm Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương Nhà xuất đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí Minh, 2008 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm Trần Linh Thước Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội, 2007 Bài giảng dược giảng dược lý thú y, TS Nguyễn Như Pho, ThS Võ Thị Trà An, Đại học nông lâm thành phố Hồ Chí Minh, 2010 Thực tập vi sinh vật chuyên ngành, PGS, TS Nguyễn Xuân Thành (chủ biên), đại học nông nghiệp Hà Nội, 2010 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật Y học Lê Lan Hương Nhà xuất Y học, Hà nội, 1991 Tài liệu tiếng Anh The White nest swiftlet and the Black nest swiftlet, Nguyen Quang Phach, Yen Vo Quang, Jean-Franỗois VOISIN, NXB N.Boubeộ 2002 Ti liu từ số trang web http://www.nuoichimyen.net http://www.saigonland.com.vn http://wwwnihe.org.vn http://vietsciences.free.fr http://vietsciences.org PHỤ LỤC Hóa cất, mơi trường thuốc thử a) Môi trường tăng sinh : Alkaline Peptone Water ( APW) Peptone Natri Clorua (NaCl ) 10g 30g Nước cất lít pH 8.5 ± 0.2 b) Môi trường tăng sinh : Buffer Pepton Water ( BPW) Peptone 10 g Sodium chloride 5g Disodium phosphate 3.5 g Potassium dihydrogen phosphate 1.5 g pH 7.2 ± 0.2 @ 25°C Nước cất lít Hịa tan 20g mơi trường vào lít nước cất Trộn rót váo dụng cụ thích hợp Hấp tiệt trùng 121°C vòng 15 phút Lưu ý : phải sử dụng nước cất chất lượng cao với hàm lượng khoáng thấp độ dẫn diện thấp c) Môi trường tăng sinh : Brilliant Green Lactose Bile Salt (BGBL) Peptone 10g Lactose 10g Mật bò 20g Brilliant Green 0.0133g Nước cất lít pH 7.2±0.2 Hào tan peptone lactose vào 500ml nước cất, mật bò vào khoảng 200ml Brilliant Green khoảng 100ml nước cất Trộn bà dung dịch để đạt thể tích cuối lít ; chỉnh pH mơi trường theo u cầu Rót vào ống nghiệm có chứa ống Durham 10ml BGBL Hấp 1100C 15 phút d) Môi trường tăng sinh : Rappaport-Vassiliadis (RV) Môi trường Trypton 5,0g NaCl 8,0g KH2 PO4 1,6g Nước cất lít Dung dịch Magnesium chloride MgCl2.6H2O 400g Nước cất lít Dung dịch Malachite green oxalate Malachite green oxalate Nước cất 0,4g 100 ml Mơi trường hồn chỉnh Mơi trường 1000ml Dung dịch MgCl2 100ml Dung dịch Malachite green oxalate Tổng thể tích 10ml 1110ml Mơi trường phải chuẩn bị ngày kết hợp thành phần để có mơi trường hồn chỉnh Vì MgCl2 hút ẩm mạnh nồng độ xác MgCl2 mơi trường RV quan trọng nên hịa tan hết lượng MgCl2 lọ mở vào nước cất Dung dịch MgCl2 giữ chai tối màu nhiệt độ phòng đến năm Dung dịch Malachite green oxalate giữ chai tối màu nhiệt độ phòng đến tháng Phân phối 10 ml mơi trường hồn chỉnh vào ống nghiệm Hấp khử trùng 1150C, 15 phút pH cuối 5,5 ± 0,2 Giữ tủ lạnh sử dụng vịng tháng Mơi trường nên chuẩn bị thành phần riêng biệt Không nên sử dụng môi trường thương mại dạng khô Môi trường thương mại dạng khô giữ tủ lạnh (4-80C), thời gian tháng e) Môi trường phân lập : Eosin Methylene Blue Lactose ( EMB) Pancreatic digest of gelatin 10g Lactose 10g K2HPO4 2g Eosin Y 0.4g Methylene blue 65mg Agar 15g pH 7.1+-0.2 Nước cất lít f) Môi trường phân lập : Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( TCBS) Peptone 10g Sucrose 20g Cao nấm men 5g Sodium thiosulfate.75H2O 10g Sodium citrate.72H2O 10g Sodium cholate 3g Oxgall 5g Natri clorua 10g Ferric citrate 1g Bromothymol blue 0.04g Thymol blue 0.04g Agar 15g Nước cất lít pH 8.4 Chuẩn bị erlen tích lớn ba laanfso với thể tích cần dùng Cho chất vào nước cất làm ấm đun nóng để hịa tan Chỉ để vừa sơi nhấc ran gay Không hấp khử trùng Để nguội đến 500C đổ đĩa g) Môi trường phân lập : Xylose Lysine Desoxycholate Agar ( XLD) Cao nấm men 3g L-lysine Xylose Lactose Sucrose Sodium desoxycholate 5g 3,75 g 7,5 g 7,5 g 2,5 g Ferric ammonium citrate 0,8 g Sodium thiosulfate 6,8 g NaCl 5g Thạch agar 15 g Phenol red 0,08 g Nước cất lít pH 7,4 ± 0,2 Đun sôi môi trường, không hấp, để nguội đến 500C đổ đĩa không giữ ngày h) Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) Môi trường TSA pha từ mơi trường TSB có bổ sung thêm thạch agar Nếu pha môi trường TSA để thử hoạt tính bổ sung thêm 10 g agar/ 1000ml, sau rót vào bình tam giác 200 ml môi trường Trypticase peptone 17g Phytone peptone 3g Natri clorua 5g K2HPO4 2.5g Glucose 2.5g Nước cất lít pH 7.3+_0.2 Đun nóng để hịa tan agar Hấp khử trùng 1210C 15 phút Để sử dụng cho chủng Vibrio spp ưa muối, ta cộng thêm Nacl vào để nồng độ muối đạt 2-3% i) Môi trường phân lập Sabouraud’s Dextrose Agar (SDA) Polypeptone neopeptone 10g Dextrose 40g Agar 15-20g Nước cất lít Hịa tan hồn tồn thành phần hấp vơ trùng 1210C 15 phút j) Môi trường thử hoạt tính Tryptone Tryptone trypticase 20g Nước cất lít pH 7.3+_0.2 Phân phối vào ống nghiệm 4ml Hấp khử trùng 1210C 15 phút k) Môi trường thử hoạt tính MP-VP Mơi trường Bufferes peptone water powder ( Difco BBL) 7g Glucose 5g K2HPO4 5g Nước cất lít Mơi trường Casein Pancreatic Digest 3.5g Dextrose 5g Peptic digest of animal tissue 3.5g Potassium phosphate 5g Nước cất lít Mơi trường Peptone 5g Glucose 5g Phosphate buffer 5g Nước cất lít Hịa tan thành phần nước, làm nóng nhẹ cần Phân phối 10ml vào ống nghiệm hấp vô trùng 1210C 15 phút pH cuối 6.9+_0.2 Để sử dụng cho Vibrio spp chịu mặn, thêm NaCl đến nồng độ cuối 2-3% l) Mơi trường thử hoạt tính Ure Broth Ure 20g Cao nấm men 0.1g Na2HPO4 9.5g KH2PO4 9.1g Phenol red 0.01g Nước cất lít pH cuối 6.8±0.2 Hịa tan thành phần nước cất Khơng đun nóng Vơ trùng lọc qua màng lọc 0.45µm Phân phối vào ống nghiệm vô trùng m) Môi trường thử hoạt tính Phenol Red Carbohydrate Broth Trypticase proteome peptone 10g NaCl 5g Cao thịt 1g Phenol red 0.018g Nước cất lít Carbohydrate 10g Rót 2.5ml mơi trường vào ống nghiệm chứa ống Durham kiểm tra lên men Hấp khử trùng 1210C 15 phút Hòa tan carbohydrate 200ml nước cất, khử trùng cách lọc qua màng lọc Thêm 0.5ml dịch lọc vô trùng vào ống nghiệm môi trường khử trùng, lắc n) Mơi trường thử hoạt tính Simmons Citrate Agar ( SCA) Sodium citrate 2g NaCl 5g K2HPO4 1g NH4H2PO4 1g Bromothymol blue 0.08g Agar 15g MgSO4 0.2g Nước cất lít pH 6.8+_0.2 Đun nóng nhẹ lắc Đun sơi 1-2 phút hịa tan Phân phối vào 1/3 ống nghiệm hấp 1210c 15 phút Đặt nghiêng ống nghiệm để tạo thạch nghiêng o) Dung dịch nước muối sinh lý : Hoà tan 8,5 g NaCl lít nước cất Hấp khử trùng nhiệt độ 121 0C 15 phút để nguội p) Thuốc nhuộm Tím Violet Tím violet: 1g Rượu ethylic: 1g Phenol tinh thể: 2g Nước cất: 100 ml Pha chế: Hịa tan g tím violet vào 10 ml cồn (dung dịch 1) Hòa tan g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2) Trộn chung dung dịch dung dịch lại với ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet q) Thuốc nhuộm Liugol Iod tinh thể 1g KI 2g Nước cất 200 ml Pha chế: Hòa tan iod vào nước cất, sau cho KI vào, bảo quản lọ tối màu r) Thuốc nhuộm Fuschin Fuschin kiềm 1g Rượu ethylic 95% 10 ml Phenol tinh thể 5g Nước cất 100 ml Pha chế: Hòa tan Fuschin vào 10 ml cồn 95% (dung dịch 1) Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2) Trộn dung dịch dung dịch đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuschin s) Dung dịch xanh methylen Xanh methylen chất màu sử dụng để tạo màu cho môi trường bổ sung thêm cho môi trường TSA Cân 0.04 g xanh methylen /1l môi trường thạch TSA p-Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) 10g Isoamyl alcohol 150ml HCl đậm đặc 50ml Hịa tan p-DMABA dung mơi, bổ sung khuấy phần nhỏ HCl đủ lượng Thuốc thử chứa chai màu tối tránh ánh sáng bảo quản 40C Có thể thay Isoamyl alcohol Amyl alcohol butanol t) Thuốc thử Kovac’s p-Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) 10g Isoamyl alcohol 150ml HCl đậm đặc 50ml Hịa tan p-DMABA dung mơi, bổ sung khuấy phần nhỏ HCl đủ lượng Thuốc thử chứa chai màu tối tránh ánh sáng bảo quản 40C Có thể thay Isoamyl alcohol amyl ancohol butanol u) Thuốc thử Methyl Red Methyl red 0.1g Ethanol 95% 300ml Nước cất (đủ) 500ml Hòa tan methyl red vào 300ml ethanol Thêm nước cất vào cho đủ thể tích 500ml ... tài: ? ?Nghiên cứu biến động vi sinh vật đối tượng chim yến nuôi vùng Nam Trung Bộ Tây Nguyên Khảo sát nhạy cảm kháng sinh loài vi sinh vật phân lập được? ?? Đề tài thực với mục tiêu sau:  Phân lập. .. hiểu vi sinh vật đối tượng chim yến ni để có nhìn tổng quan ảnh hưởng đến đối tượng 1.2.1 Sự sinh trưởng vi sinh vật yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống vi sinh vật Sự sinh trưởng quần thể vi sinh. .. nhân tố môi trường sinh trưởng vi sinh vật giúp ích nhiều cho vi? ??c khống chế vi sinh vật vi? ??c nghiên cứu phân bố sinh thái vi sinh vật 1.2.2 Một số vi sinh vật thường gặp động vật có lơng vũ Dựa