a. Thử nghiệm khả năng sinh Indol Mục đích
Nguyên lý
Tryptophan là một acid amin có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p- Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA). Nhân pyrrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzene của p-DMABA tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ.
Phản ứng dương tính : là khi xuất hiện lớp màu đỏ cánh sen trên bề mặt môi trường (do Indol kết hợp với p-dimethylaminobenzaldehyde trong thuốc thử Kovacs). Đôi khi có sự xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất methyl hóa của inodol gây nên.
Phản ứng âm tính : là khi không có màu hoặc có màu vàng cảu thuốc thử trên bề mặt môi trường.
Bố trí thí nghiệm
Sử dụng môi trường nước Trypton cho vào mỗi ống nghiệm 10 ml rồi mang đi hấp khử trùng.Sau đó sử dụng que cấy vòng, lấy sinh khối chủng thuần cấy vào mỗi ống Trypton pha trước đó. Ủ ở 370C trong vòng 24 – 48 giờ ( Với các chủng sinh Indol chậm: thử sau 48 giờ). Sau khi ủ xong, ta nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs vào các ống ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút rồi quan sát kết quả.
b. Thử nghiệm MR ( Methyl Red) Mục đích
Phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid bền.
Nguyên lý
Thử nghiệm MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về khả năng tạo ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid bền trong môi trường trong quá trình lên men glucose. Chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ ion H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này có
màu thay đổi khác nhau tùy dãy pH hay nồng độ ion H+ : đỏ khi pH thấp hơn 4,4; màu cam trong vùng pH từ 5,0 - 5,8; màu vàng khi pH trên 6,0.
Thử nghiệm MR dương tính là thử nghiệm sau khi bổ sung thuốc thử môi trường có màu đỏ. Thử nghiệm âm tính là thử nghiệm môi trường có màu vàng sau khi bổ sung thuốc thử. Trong trường hợp môi trường có màu cam,cần tiếp tục ủ các ống giống này trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm.
Bố trí thí nghiệm
Thử nghiệm được tiến hành trong các ống môi trường lỏng MR-VP đã được hấp khử trùng. Dùng que cấy vòng lấy một lượng nhỏ sinh khối từ khuẩn lạc chủng thuần, ủ ở 370C trong 2-5 ngày.
Sau đó, thêm vài giọt thuốc thử đỏ methyl red 0,02% trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, rồi đọc kết quả ngay.
c. Thử nghiệm VP ( Voges – Proskauer) Mục đích
Phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzym chuyển hóa 2,3 butanediol thành acetoin khi có ô xy và chuyển hóa tiếp acetoin thành diacetyl.
Nguyên lý
Thử nghiệm VP dựa trên sự oxy hóa acetoin ( acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3 butanediol thành diacetyl. Sự oxy hóa này được tăng cường nhờ xúc tác của α – naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong pepton kết tụ thành phức diacetyl-guadinine có màu đỏ.
Thử nghiệm VP dương tính là thử nghiệm có màu đỏ trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm âm tính là thử nghiệm không làm đổi màu trên bề mặt môi trường.
Bố trí thí nghiệm
Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP) có pH = 9, đã được hấp khử trùng và cho vào các ống nghiệm. Dùng que cấy vòng cho vào các ống môi trường một lượng sinh khối từ khuẩn lạc
chủng thuần đã được ủ 18 - 24 giờ trước khi tiến hành thử nghiệm. Ủ yên các ống môi trường này ở 370C trong 24 - 48 giờ hoặc đến 10 ngày khi cần thiết.
d. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate Mục đích
Xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat là nguồn hydratcarbon duy nhất.
Nguyên lý
Một số vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất để thu lấy năng lượng và vật chất. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và thay đổi màu của chỉ thị màu.
Phản ứng dương tính là khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh dương. Phản ứng âm tính khi không có khuẩn lạc và môi trường giữ nguyên màu xanh lục.
Bố trí thí nghiệm
Thử nghiệm này sử dụng môi trường SCA, môi trường này chứa sodium citrate làm nguồn carbon duy nhất, chỉ thị bromothymol blue, pH = 6,9. Sau khi hấp khử trùng ta để nguội đến khoảng 500C thì đổ thạch nghiêng vào các ống nghiệm. Sau khi thạch khô và cứng lại, ta tiến hành cấy ria các khuẩn lạc thuần vào các ống thạch nghiêng. Ủ ở 350C trong 24 - 48 giờ hoặc kéo dài đến 4 ngày khi cần thiết.