Các mẫu phân chim yến được pha loãng ở các nồng độ 10-1-10-3 . Mỗi nồng
độ pha loãng lấy 1ml cho vào các ống nghiệm BGBL để tăng sinh và ghi nhận các ống dương tính, sau đó lấy dịch huyền phù ở các ống dương tính cấy ria vào các đĩa thạch EMB. Kết quả cho thấy có 28 mẫu nghi ngờ là E.coli được phân lập từ phân chim yến.
Bảng 3.1 Số mẫu vi khuẩn E.coli được phân lập từ phân chim yến
STT Ngày phân lập Số chủng phân lập
1 06.03.2012 9
2 25.05.2012 19
Sau khi phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc thì tiến hành quá trình thử nghiệm sinh hóa để định danh vi khuẩn E.coli.
Chọn các khuẩn lạc điển hình trên môi trường EMB, cấy thuần sang môi trường TSA trước khi thử hoạt tính từ 18 – 24h. Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ E.coli
đã được thuần ở trên vào môi trường Trypton (đối với thử nghiệm Indol), MR-VP (đối với thử nghiệm Methyl Red, Voges-Proskauer), SCA (đối với thử nghiệm Citrate) rồi ủ ở 370C trong 24h. Sau đó, cho thuốc thử Kovac’s, Methyl Red, Barritt (gồm dung dịch A: 5% α-napthol, dung dịch B: 40% KOH) vào các ống môi trường đã được ủ. Kết quả của các thử nghiệm IMViC được thể hiện qua bảng 3.2:
Bảng 3.2 Kết quả thử nghiệm IMViC của các mẫu nghi ngờ E.coli
ST T
Tên mẫu Các thử nghiệm sinh hóa
Kết quả Đợt thu mẫu Kí hiệu mẫu Indol Methyl Red Voges- Proskauer Citrate 1 Đợt 1 1 + + - - + 2 2 + + - - + 3 3 + + - - + 4 4 + + - - + 5 5 + + - - + 6 6 + + - - + 7 7 + + - - + 8 8 + + - - + 9 9 + + - - + 10 Đợt 2 1.3 + + - - + 11 1.4 + + - - + 12 1.5 + + - - + 13 1.6 + + - - + 14 1.14 + + - - + 15 1.15 + + - - +
16 1.16 + + - - + 17 2.1 + + - - + 18 2.3 + + - - + 19 2.4 + + - - + 20 2.6 + + - - + 21 2.7 + + - - + 22 2.9 + + - - + 23 2.10 + + - - + 24 2.11 + + - - + 25 2.12 + + - - + 26 2.13 + + - - + 27 2.14 + + - - + 28 2.15 + + - - +
Hình 3.3 Kết quả thử nghiệm MR dương tính của E.coli
Hình 3.4 Kết quả thử nghiệm VP âm tính của E.coli
Đối với phép thử indol: Vi khuẩn E.coli có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Sản phẩm trung gian chính của phản ứng oxy hóa tryptophan là indolpyruvic acid (IPA). Tryptophanase xúc tác sự biến đổi của sản phẩm trung gian này theo hướng loại nhóm amin để tạo thành indol. Indol được phát hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p- Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA). Nhân pyrrol của indol chứa nhóm CH2
sẽ kết hợp với nhân benzene của p-DMABA tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ (phản ứng indol dương tính).
Hình 3.5 Kết quả thử nghiệm Citrate âm tính của E.coli
Đối với phép thử Methyl red: vi khuẩn E.coli lên men acid hỗn hợp, cho ra sản phẩm cuối cùng chủ yếu là H2 và CO2 mang tính acid. Do đó, làm cho môi trường bị acid hóa rõ rệt bằng phản ứng thay đổi màu môi trường trở thành đỏ khi cho thuốc thử Methyl red vào (phản ứng dương tính).
Đối với phép thử VP: như đã trình bày ở trên, sản phẩm cuối cùng trong quá trình lên men của E.coli không sinh 2,3-butanediol và môi trường hóa acid, nên không thể tạo thành sản phẩm trung tính là acetoin. Do đó, khổng thể tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử nghiệm này, môi trường giữ nguyên màu (phản ứng âm tính).
Đối với phép thử citrate: trong môi trường Simmon citrate, citrate là nguồn cacbon duy nhất và amoni dihydrophosphate (NH4H2PO4) là nguồn nitrogene duy nhất. Tuy nhiên, việc sử dụng citrate đòi hỏi sự hiện diện của protein vận chuyển citrate, trong khi đó, E.coli không có loại protein này. Vì vậy, E.coli không thể sử dụng citrate sinh ra CO2 làm kiềm hóa môi trường, cũng như không thể sử dụng muối amonium làm nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa môi trường. Như
vậy, sẽ không làm đổi màu chỉ thị bromothymol blue, môi tường không đổi màu (phản ứng âm tính).
Từ kết quả IMViC ở bảng 3.4 là + + - - cho ta khẳng định tất cả 28 mẫu nghi ngờ là E.coli đều là E.coli.
Như vậy, ta có thể kết luận rằng trong 40 mẫu phân ta phân lập có 28 mẫu bị nhiễm E.coli, đây có thể là một trong những nguyên nhân làm cho môi trường sống của chim yến bị ảnh hưởng, tác động đến sức khỏe của chim yến nuôi làm chất lượng tổ yến bị suy giảm.
3.1.2 Vi khuẩn Vibrio
Các mẫu phân sau khi pha loãng và tăng sinh sẽ được cấy ria trên môi trường TCBS. Kết quả cho thấy có 2 chủng Vibrio được phân lập từ phân chim yến.
Bảng 3.3 Số mẫu nghi ngờ là vi khuẩn Vibrio được phân lập từ phân chim yến
STT Ngày phân lập Số chủng phân lập
1 06.03.2012 0
2 25.05.2012 2
Hình 3.6 Khuẩn lạc nghi ngờ là ibrio parahaemolyticus trên môi trường TCBS
Sau khi phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc thì tiến hành quá trình thử nghiệm sinh hóa để định danh vi khuẩn Vibrio.
Trên môi trường TCBS, chỉ có 2 mẫu là 1.5 và 1.14 là cho khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus: khuẩn lạc có đường kính khoảng 2- 3mm, có màu xanh.
Hoạt hóa các mẫu nghi ngờ là Vibrio bằng cách chọn các khuẩn lạc điển hình trên môi trường TCBS sang môi trường TSA trước khi thử hoạt tính từ 18 – 24h. Sau đó, tiến hành kiểm tra sinh hóa đối với các mẫu này.
Bảng 3.4 Kết quả thử nghiệm sinh hóa của các mẫu nghi ngờ Vibrio
Thử nghiệm sinh hóa Mẫu 1.5 Mẫu 1.14
Indol + + KIA Đỏ/vàng Đỏ/vàng Sacharose - - Tính di động + + Tính ưa mặn 0% - - 3% + + 6% + + 8% + + 10% - -
Từ bảng 3.5, cho ta thấy được hai mẫu Vibrio phân lập được đều cho kết quả thử Indol dương tính; chỉ lên men đường Glucose, Manniol, không sử dụng đường Lactose, Succharose; có khả năng di động và chỉ sống được ở nồng độ muối là 3% và 6%. Từ đó, ta đưa ra kết luận tạm thời nghi ngờ đây là Vibrio parahaemolyticus.
Tương tự như E.coli, Vibrio cũng có enzyme tryptophanase nên cho dương tính với thử nghiệm indol.
Trong thử nghiệm KIA, Vibrio chỉ sử dụng glucose, không sử dụng lactose để lên men nên trên phần nghiêng của môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ, glucose được oxy hóa hoàn toàn thành H2O và CO2 để thu năng lượng. Để đáp ứng nhu cầu năng lượng cho tăng trưởng, Vibrio tiến hành dị hóa peptone giải phóng NH3 làm pH bề mặt môi trường hóa kiềm. Ở phần sâu trong môi trường không có điều kiện oxy đầy đủ, glucose được lên men kị khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường. Trong thành phần của môi trường KIA, có chất chỉ thị là phenol red, nên trên phần nghiêng môi trường sẽ có màu đỏ, phần sâu sẽ có màu vàng.
Vibrio không có enzyme saccharase nên không thể sử dụng nguồn saccharose làm nguồn cacbon để lên men đường được. Vì thế, trong môi trường chứa saccharose, Vibrio không thể sinh trưởng và phát triền được. Môi trường không chuyển màu (phản ứng âm tính).
Vibrio là phẩy khuẩn Gram âm, di động, không có khả năng sống trong môi trường không có muối, tăng trưởng tốt trong môi trường có đên 8% muối nhưng bị ức chế trong môi trường chứa 10% muối.
Từ các kết quả các thử nghiệm trên đây, chúng tôi đưa ra kết luận 2 mẫu
Vibrio phân lập được đều nghi ngờ là Vibrio parahaemolyticus. Vì điều kiện trong phòng thí nghiệm chúng tôi chỉ cho phép làm đến những phản ứng trên, nếu được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn, chúng tôi sẽ thực hiện những thử nghiệm đầy đủ để có thể đưa ra kết luận chính xác hơn.
3.1.3 Vi khuẩn Salmonella
Tại mỗi nồng độ pha loãng, sau khi tăng sinh hai lần và cấy ria sang môi trường XLD. Kết quả cho thấy có 8 mẫu nghi ngờ là Salmonella được phân lập từ phân chim yến.
Bảng 3.5 Số mẫu vi khuẩn Salmonella được phân lập từ phân chim yến
STT Ngày phân lập Số chủng phân lập
1 06.03.2012 0
2 25.05.2012 8
Hình 3.8 Khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella trên môi trường XLD
Trên môi trường XLD, chọn các khuẩn lạc điển hình có tâm đen cấy thuần trên môi trường TSA để hoạt hóa trước khi tiến hành thử hoạt tính từ 18 – 24h.
Bảng 3.6 Kết quả thử hoạt tính của các mẫu nghi ngờ là Salmonella
1.6 1.10 1.16 2.10 2.11 2.13 2.14 Indol - - - - VP - - - - Citrate + + + + + + + KIA Đỏ/ Đen Đỏ/ Đen Đỏ/ Đen Đỏ/ Đen Đỏ/ Đen Đỏ/ Đen Đỏ/ Đen Glucose + + + + + + + Mannitol + + + + + + + Sorbitol + + + + + + + Urease + + + + + - + Succharose - - - - Tính di động + + + + + + +
Hình 3.9 Kết quả thử nghiệm KIA của các mẫu nghi ngờ Salmonella
Hình 3.10 Kết quả thử nghiệm Citrate dương tính của các mẫu nghi ngờ là Salmonella
Hình 3.11 Kết quả theo thứ tự từ trái sang phải của các mẫu nghi ngờ Salmonella là: Manniltol(+), Glucose(+), Saccharose(-), Urease(-), Sorbitol(+)
Đối với thử nghiệm indol, VP, saccharose: Salmonella không có enzyme tryptophanase,enzyme saccharose,lên men không sinh sản phẩm trung tính là acetoin nên Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm indol, VP và saccharose.
Đối với thử nghiệm citrate: Salmonella có protein vận chuyển citrate, và có thể sử dụng amonium làm nguồn đạm duy nhất tạo NH3 làm kiềm hóa môi trường, Salmonella tạo phản ứng dương tính với thử nghiệm citrate, làm chỉ thị bromothymol blue chuyển màu môi trường SCA sang màu xanh da trời.
Thử nghiệm KIA: tương tự Vibrio, Salmonella cũng không sử dụng đường lactose, chỉ sử dụng đường glucose thông qua thử nghiệm KIA. Bên cạnh đó, thử nghiệm KIA còn cho ta biết rằng Salmonella có khả năng sử dụng sulfure làm nguồn năng lượng và sản sinh ra H2S, H2S sẽ kết hợp với ion sắt có trong môi trường tạo thành hợp chất FeS có màu đen. Vì màu đen của H2S quá nhiều, nên không thể nhận thấy màu vàng của phản ứng glucose dương tính nên chúng tôi tiến hành thử riêng đường glucose. Và kết quả là toàn bộ các ống đều chuyển sang màu vàng (dương tính).
Salmonella có khả năng sử dụng cả hai loại đường manniol và sorbitol làm nguồn năng lượng nên môi trường sau khi cấy bị acid hóa và chuyển sang màu vàng (phản ứng dương tính).
Salmonella không có enzyme urease nên không thể sử dụng ure làm nguồn năng lượng được. Nhưng khi tiến hành thử nghiệm ure cho các mẫu nghi ngờ là Salmonella thì kết quả đồng loạt dương tính (trừ mẫu số 2.13). Có kết quả không chính xác này có thể vì những nguyên nhân sau: không có môi trường ure tổng hợp, phải tự pha môi trường ure bằng ure không tinh khiết, bên cạnh đó, trong quá trình giữ mẫu trong tử lạnh có thể bị nhiễm các loại vi sinh vật khác nên khi tiến hành thử nghiệm urease cho kết quả dương tính (trừ mẫu S 2.13). Sau đó, để kiểm tra lại, chúng tôi đã tiến hành lấy sinh khối từ các môi trường urease dương tính cấy lại trên môi trường XLD-môi trường chọn lọc của Salmonella. Kết quả cho thấy: không có khuẩn lạc điển hình của Salmonella. Từ đó, khẳng định rằng, trong thử nghiệm urease, Salmonella là âm tính.
Từ bảng 3.6, ta thấy, các mẫu Salmonella đều đồng loạt âm tính với các phản ứng Indol, VP; dương tính với phản ứng Citrate. Chỉ sử dụng Glucose, Mannitol, Sorbitol, không sử dụng Lactose, Urease, Succharose; có khả năng di động. Vì trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi chỉ cho phép làm đến những phản ứng trên, nên đến đây, chúng tôi chỉ kết luận đây là các chủng nghi ngờ là Salmonella. Nếu được nghiên cứu sâu hơn, chúng tôi sẽ có những thử nghiệm đầy đủ để có thể kết luận chính xác hơn.