a. Thử nghiệm urease Mục đích
Phát hiện vi sinh vật tổng hợp enzym urease.
Nguyên lý
Một số vi sinh vật tổng hợp enzyme urease xúc tác sự thủy phân của urea. Sự phóng thích NH3 và CO2 làm tăng pH môi trường làm đổi màu của chất chỉ thị pH trong môi trường.
Thử nghiệm là dương tính khi môi trường trở thành màu đỏ tím. Thử nghiệm là âm tính khi môi trường có màu vàng cam không đổi.
Bố trí thí nghiệm
Môi trường urea lỏng Rustigian – Stuart’s Urea Broth đã được hấp khử trùng và phân phối vào các ống nghiệm vô trùng, mỗi ống 3 ml. Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc chủng thuần cho vào các ống nghiệm chứa môi trường, sau đó lắc nhẹ để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 370C trong 48 giờ. Sau đó ghi nhận sự chuyển màu của môi trường nuôi cấy.
Thử nghiệm là dương tính khi môi trường có màu đỏ tím. Thử nghiệm là âm tính khi môi trường có màu vàng cam hoặc không chuyển màu.
b. Thử nghiệm KIA, TSI Mục đích
Môi trường KIA và TSI được sử dụng để kết hợp thử nghiệm đồng thời khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau ( glucose, lactose) và khả năng sinh H2S của các chủng vi sinh vật.
Nguyên lý
Thử nghiệm khả năng sử dụng đường : Vi sinh vật sau khi được nuôi cấy trên môi trường KIA, có ba trường hợp có thể xảy ra với sự tăng trưởng của chủng vi sinh vật thử nghiệm : chỉ sử dụng glucose, sử dụng cả glucose và lactose, không sử dụng cả hai loại đường này. Các khả năng này của vi sinh vật có thể được xác định thông qua sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường, ở trên bề mặt và bên trong môi trường trong ống thạch nghiêng. Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, sau 18 – 24 giờ nuôi cấy phần môi trường bề mặt của ống thạch nghiêng trở nên pH kiềm và phần sau trong ống có pH acid.
Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, sau 18 – 24 giờ nuôi cấy toàn bộ môi trường đều trở nên có acid. Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian nuôi cấy quá 24 giờ thì bề mặt môi trường có thể chuyển thành màu đỏ do hết nguồn carbon và vi sinh vật phải sử dụng đến pepton.
Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này thì pepton được sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của
vi sinh vật. Do đó, trên bề mặt môi trường có pH kiềm và chỉ phần này có màu đỏ. Phần còn lại sâu trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng đổi màu.
- Thử nghiệm khả năng sinh H2S : Trong môi trường có chứa hợp chất sodium thiosulphate, vi sinh vật nào khử sulfate có thể khử hợp chất này để giải phóng H2S và làm thay đổi màu chỉ thị môi trường.
Thử nghiệm là dương tính khi xuất hiện tủa màu nâu đen bên trong môi trường. Thử nghiệm là âm tính khi không xuất hiện tủa nâu đen.
Bố trí thí nghiệm
Môi trường KIA hay TSI được pha chế, hấp khử trùng và chuyển vào các ống nghiệm vô trùng để tạo ống thạch nghiêng sao cho đỉnh thạch nghiêng cách nắp ống nghiệm khoảng 2,5cm và phần sâu có chiều cao khoảng 2,5cm. Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối của khuẩn lạc thuần chích sâu vào phần đáy của ống thạch nghiêng nhưng tránh chạm đáy ống, sau đó ria trên bề mặt thạch nghiêng. Sau khi cấy, các ống giống được ủ ở 370C trong vòng từ 18 – 24 giờ. Sau đó ghi nhận màu, sự sinh khí ở phần sâu, màu ở mặt thạch nghiêng, sự tạo thành màu nâu bởi FeS.
c. Thử nghiệm Indol
Tương tự như làm với E.coli.
d. Thử nghiệm citrate
Tương tự như làm với E.coli.
e. Thử nghiệm lên men các loại đường : Mannitol, sorbitol Mục đích
Xác định khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng.
Nguyên lý
Khi sử dụng các nguồn carbon để lên men, tùy phương thức lên men các sản phẩm được tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2… Trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm được tạo thành đều làm giảm pH của môi trường. Do
vậy, khả năng lên men được đánh giá là sự làm giảm pH của môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chất chỉ thị pH trong môi trường. Ngoài ra, CO2 được tạo thành sẽ được bẫy trong các ống durham và làm nổi các ống này.
Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi. Sinh acid dương tính là khi môi trường với chỉ thị đỏ phenol chuyển thành màu vàng, nếu âm tính thì môi trường có màu đỏ. Sinh hơi dương tính là khi có bọt khí trong ống durham, âm tính là khi không có bọt khí.
Bố trí thí nghiệm
Môi trường sử dụng là Phenol Red Broth có pH 7,4. Môi trường được bổ sung thêm 10% đường, sau đó mang đi hấp 1210C trong 15 phút. Sau khi được khử trùng và làm nguội,môi trường được phân phối thành các dung tích 5ml vào các ống nghiệm vô trùng. Tiến hành cấy chủng vào các ống môi trường bằng que cấy vòng từ các chủng đã được làm thuần trên TSA. Sau khi cấy, ủ các ống môi trường ở 370C trong 18 – 20 giờ rồi đọc kết quả.