Phân lập vi khuẩn

 Mẫu phân chim được pha loãng như sau :

- Rót 9 ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử trùng vào các ống nghiệm.

Pha loãng Khuẩn lạc

Mẫu

Phân lập

Cấy trang

Thử hoạt tính bằng các thử nghiệm sinh hóa truyền thống.

Cấy ria

Bảo quản Nhuộm Gram

Thử tính mẫn cảm với kháng sinh Xác định hoạt tính

- Hút 1 ml dịch mẫu phân chim được chứa trong các ống efpendoft 1,5ml bỏ vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý trên ta được mẫu với nồng độ 10-1, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều.

Hình 2.2 Sơ đồ pha loãng mẫu

- Từ ống nghiệm 10-1, pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cách hút 1 ml từ ống nghiệm 10-1 cho vào 9 ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử trùng ở ống nghiệm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm có độ pha loãng mẫu 10-2, tiếp tục làm tương tự, ta có các ống nghiệm có độ pha loãng mẫu 10-3 → 10-8. Làm tương tự với các mẫu còn lại.

a) Phân lập vi khuẩn Escherichia coli Mục đích

Để phát hiện sự hiện diện của Escherichia coli trong phân chim yến nuôi.

Nguyên tắc

Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần); mẫu có nồng độ thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa mối trường BGBL có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ được ủ ba ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi, đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm – đây là các ống dương tính. Dùng que cấy vòng cấy ria dịch mẫu từ các ống dương tính sang môi trường thạch EMB. Ghi nhận các khuẩn lạc đặc trưng. Thử nghiệm các khuẩn lạc đặc trưng là E.coli bằng các thử nghiệm iMViC.

Bố trí thí nghiệm

 Tăng sinh :

- Lấy các ống nghiệm pha loãng ở trên, mỗi ống lấy 1 ml dịch mẫu ở nồng độ 10-1 vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường tăng sinh BGBL đã được hấp khử trùng. Làm tương tự với các nồng độ 10-2, 10-3. Trước khi cấy cần phải khi rõ nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ làm lặp lại 2 lần. Lặp lại với các mẫu còn lại. Mọi thao tác đều thực hiện trong điều kiện vô trùng trong tủ cấy, bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. Sau khi cấy xong, nuôi trong tủ ấm 44.0±0.50C trong vòng 24 giờ thì tiến hành quan sát kết quả.

 Phân lập :

- Sau khi nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 44.0±0.50C trong vòng 24 giờ thì ta ghi nhận các ống nghiệm có phản ứng dương tính tức là các ống nghiệm có hiện tượng môi trường chuyển đục và sinh hơi.

Dùng thạch EMB trong bình tam giác đã hấp khử trùng và làm nguội đến khoảng 500C thì tiến hành đổ môi trường vào các đĩa petri 1 lớp mỏng vừa phải, và để thạch thật khô. Nhúng que cấy vòng vào cồn 960, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng que cấy, để nguội. Tiếp đến, dùng que cấy vòng, lấy sinh khối vi khuẩn từ các ống nghiệm dương tính được ghi nhận ở trên, cấy ria thành ba đường trên đĩa thạch cho đến khi các khuẩn lạc thuần được tạo ra.

Mỗi ống dương tính ta cấy ria sang hai đĩa EMB, và phải ghi rõ nồng độ của nó. Sau khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại, bao gói bằng giấy báo và nuôi trong trong tủ ấm ở 37±1.00C trong vòng 24±3 giờ thì đọc kết quả. Làm tương tự cho các mẫu dương tính còn lại. Sau khi nuôi cấy ở 37±1.00C trong vòng 24±3 giờ thì các khuẩn lạc xuất hiện. Khuẩn lạc có đặc điểm màu tím, ánh kim, tròn, bờ đều, đường kính khoảng 0.5 mm là khuẩn lạc đặc trưng của E.coli trên môi trường EMB. Chọn khuẩn lạc có hình thái điển hình đem cấy chuyển trên môi trường TSA để tạo khuẩn lạc thuần để sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa.

Lưu ý, hơ và khử trùng que cấy sau mỗi lần cấy dịch, mọi thao tác đều được tiến hành trong điều kiện vô trùng trong tủ cấy, bên cạnh ngọn lửa đèn cồn.

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình phát hiện và định danh E.coli

b) Phân lập Vibrio Mục đích

Để phát hiện Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus trong phân chim yến nuôi.

Nguyên tắc

Cấy một lượng mẫu xác định và nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc. Sau thời gian ủ, dịch mẫu được cấy chuyển sang môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc giống Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus sẽ được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.

Kết luận: E.coli

Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu để có nồng độ pha loãng là 10-1,10-2

Cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng vào các ống canh BGBL. Ủ 44.0±0.50C trong 24giờ

Chọn các ống canh (+) (sinh hơi)

Cấy vào môi trường thạch EMB. Ủ 370C trong 24 giờ

Thử nghiệm IMViC ++--

Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào các môi trường tryptone, MR-VP, SCA. Ủ ở 370C trong 24 giờ

Chọn khuẩn lạc điển hình,cấy vào TSA. Ủ trong 370C

Bố trí thí nghiệm

 Tăng sinh :

- Lấy 4 ml dịch mẫu pha loãng ở trên, cho vào 36 ml dung dịch APW chứa 2% NaCl đã được hấp khử trùng. Lặp lại tương tự với các nồng độ pha loãng tiếp theo. Trước khi cấy cần phải khi rõ nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ làm lặp lại 2 lần. Làm tương tự với các mẫu còn lại. Mọi thao tác đều thực hiện trong điều kiện vô trùng trong tủ cấy, bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. Sau khi cấy xong, trộn đều và ủ ở 42.0±1.00C trong 18±2 giờ thì tiến hành quan sát kết quả.

 Phân lập:

- Dùng thạch TCBS đã được đun nóng và làm nguội đến khoảng 500C thì tiến hành đổ môi trường vào các đĩa petri 1 lớp mỏng vừa phải, và để thạch thật khô. Khử trùng que cấy bằng cồn rồi hơ nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội. Ta dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi khuẩn sau khi được ủ ở 42.0±1.00C trong 18±2 giờ cấy ria thành ba đường trên đĩa thạch cho đến khi các khuẩn lạc thuần được tạo ra. Lặp lại với các mẫu còn lại. Mỗi nồng độ lặp lại hai lần. Sau khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại, bao gói bằng giấy báo và nuôi trong trong tủ ấm ở 37±1.00C trong vòng 24±3 giờ thì đọc kết quả.

- Sau khi nuôi cấy ở 37±1.00C trong vòng 24±3 giờ thì các khuẩn lạc xuất hiện. Khuẩn lạc V. cholera điển hình có dạng hình tròn, láng, hơi phẳng, có màu vàng, tâm đục và chung quanh khuẩn lạc có màu trắng đục, đường kính 2-3 mm; khuẩn lạc V. parahaemolyticus điển hình có dạng hình tròn lớn, có màu từ xanh đến xanh dương, đường kính từ 3-5 mm trên môi trường TCBS. Chọn ít nhất hai khuẩn lạc có hình thái điển hình khác nhau của mỗi chủng đem cấy chuyển trên môi trường PCA chứa 2% NaCl ủ ở 37±1.00C trong vòng 18-24 giờ để tạo khuẩn lạc thuần để sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa.

Chú ý, hơ và khử trùng que cấy sau mỗi lần cấy dịch, mọi thao tác đều được tiến hành trong điều kiện vô trùng trong tủ cấy, bên cạnh ngọn lửa đèn cồn.

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình phát hiện và định danh V.brio

c) Phân lập Salmonella Mục đích

Để phát hiện sự hiện diện của Salmonella trong phân chim yến nuôi.

Nguyên tắc

Quy trình phát hiện Salmonella gồm bốn bước. Những bước này đều rất cần thiết vì Salmonella thường xuất hiện với số lượng rất nhỏ, thỉnh thoảng bị tổn thương, và thường xuất hiện với rất nhiều loại vi khuẩn khác cũng thuộc họ Enterobacteriacea

có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.

- Tiền tăng sinh (Pre-enrichment) : Một lượng mẫu xác định được tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn lọc BPW ở 370C trong vòng 18 giờ. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tăng sinh là 1:9.

Kết luận

Tăng sinh 4ml dịch mẫu với 36ml APW. Ủ ở 42.0±1.00C trong 18±2 giờ

Cấy ria dịch tăng sinh trên môi trường TCBS. Ủ ở 37±1.00C trong vòng 24±3 giờ

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng:

- V.cholerae: khuẩn lạc vàng, θ 2-3mm

- V.parahaemolyticus: khuẩn lạc xanh, θ 3-4mm Ria lên TSA chứa 1% NaCl. Ủ qua đêm ở 370C Thử nghiệm sinh hóa: indol(+), lactose(-), tính ưa

- Tăng sinh ( Enrichment) : Một lượng mẫu tiền tăng sinh được chuyển sang môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng RV. Dịch mẫu được ủ ở 420C trong 24 giờ.

- Phân lập ( Plating out) : Cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang môi trường rắn chọn lọc là XLD. Ủ ở 370C trong khoảng 24 giờ.

- Khẳng định ( Confirmation) : Khuẩn lạc nghi là Salmonella được cấy chuyển sang một đĩa thích hợp và sẽ được khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa.

Bố trí thí nghiệm

 Tiền tăng sinh (Pre-enrichment) :

- Lấy 4 ml dịch mẫu pha loãng ở trên, cho vào 36 ml dung dịch BPW đã được hấp khử trùng. Lặp lại tương tự với các nồng độ pha loãng tiếp theo. Trước khi cấy cần phải khi rõ nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ làm lặp lại 2 lần. Làm tương tự với các mẫu còn lại. Mọi thao tác đều thực hiện trong điều kiện vô trùng trong tủ cấy, bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. Sau khi cấy xong, trộn đều và ủ ở 37.0±1.00C trong 24±2 giờ.  Tăng sinh ( Enrichment) :

- Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10 ml canh môi trường RV đã được hấp khử trùng. - Lắc để trộn đều dịch tăng sinh trước khi lấy mẫu, sau đó dùng pipet với đầu hút đã được hấp khử trùng chuyển 0.1 ml dịch mẫu tiền tăng sinh vào các ống nghiệm trên. Trước khi cấy cần phải khi rõ nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ làm lặp lại 2 lần. Lặp lại với các mẫu còn lại. Mọi thao tác đều thực hiện trong điều kiện vô trùng trong tủ cấy, bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. Sau khi cấy xong, trộn đều và ủ ở 41.5±0.50C trong 24±3 giờ.

 Phân lập ( Plating out) :

- Tiến hành đun nóng môi trường XLD, để nguội đến khoảng 500C thì tiến hành đổ môi trường vào các đĩa petri 1 lớp mỏng vừa phải, và để thạch thật khô.

- Khử trùng que cấy vòng bằng cồn rồi hơ nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội. Ta dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi khuẩn của dịch mẫu tăng sinh cấy ria thành ba đường trên đĩa thạch cho đến khi các khuẩn lạc thuần được tạo ra. Lặp lại

hai lần ở mỗi nồng độ, và lặp lại tương tự với các mẫu còn lại. Sau khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại, bao gói bằng giấy báo và nuôi trong trong tủ ấm ở 370C trong vòng 22-26 giờ thì đọc kết quả.

- Trên môi trường XLD : khuẩn lạc Salmonella điển hình là khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, hơi nhuốm đỏ do sự thay đổi chất chỉ thị trong môi trường, phần lớn có tâm đen. Bao giờ cũng có thể nhận thấy một vùng môi trường đỏ lớn hoặc nhỏ quanh khuẩn lạc.

 Khẳng định ( Confirmation) :

- Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyển ít nhất năm khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc như TSA, ử ở 37±1.00C trong 24 ±2 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này phải được kiểm tra bằng các xét nghiệm sinh hóa.

Hình 2.5 Sơ đồ quy trình phát hiện và định danh V.brio

Kết luận

Tiền tăng sinh 4ml dịch mẫu trong 36ml BPW. Ủ ở 37.0±1.00C trong 24±2 giờ

Cấy 0,1ml dịch mẫu tiền tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV. Ủ ở 41.5±0.50C trong 24±3 giờ

Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường XLD

Thử nghiệm sinh hóa: KIA: đỏ/vàng, có/không sinh H2S, có/không sinh hơi, Ure(-), indol(-),VP(-), mannitol(+),

sorbitol(+)

Cấy ria sang môi trường TSA. Ủ ở 370C trong 18-24 giờ

d) Phân lập nấm men và nấm mốc Mục đích :

Xác định sự hiện diện của nấm men và nấm mốc trong mẫu phân chim yến nuôi.

Nguyên lý :

Mật độ nấm men, nấm mốc trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng nấm mốc, nấm men bằng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên các môi trường chọn lọc.

Tính kết quả: Chỉ sử dụng các đĩa từ 25-250 khuẩn lạc. Tính số lượng vi sinh vật trong 1 gram hoặc 1 mililit sản phẩm N theo công thức sau:

Mi (cfu/ml) = Ai /Di x V

Trong đó, Ai là số khuẩn lạc trung bình trên một đĩa. Di là độ pha loãng.

Vi là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa.

Bố trí thí nghiệm

Hút 0.1ml dịch mẫu đã được pha loãng ở trên cho vào các đĩa môi trường SDA. Dùng que cấy trang trải đều dịch mẫu trên bề mặt môi trường cho đến khô. Đặt ngửa thạch để ở nhiệt độ phòng trong 5 – 7 ngày. Sau đó đếm và tính số lượng khuẩn lạc nấm men và nấm mốc trên tất cả các đĩa cấy.

Lưu ý : trong thời gian nuôi ủ nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán trong môi trường nuôi cấy tạo nên các khuẩn lạc mới. Để hạn chế hiện tượng này trong suốt thời gian ủ, không được chạm tay hoặc di chuyển các đĩa cho đến khi đếm kết quả. Mặt khác, khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để hạn chế sự phát tán của bào tử vào trong không khí, gây nhiễm vào mẫu hay môi trường nuôi cấy khác.

e) Xác định đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram Mục đích

Nguyên lý

Dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm gram, vi khuẩn gram dương sẽ giữ được phức hợp màu tím kết tinh lugol, trong khi vi khuẩn gram âm không giữ được phức hợp này nên có màu hồng của fucshin.

Tiến hành

- Dùng bút viết kính vẽ 1 đường tròn lên lam kính để giới hạn vùng phết vi khuẩn. - Nhỏ 1 giọt nước từ bình tia vào vòng tròn đã vẽ.

- Dùng que cấy thu sinh khối từ khuẩn lạc chọn lọc, rồi đưa vào lam kính, dàn đều vi khuẩn, để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn, tránh để lâu quá nóng sẽ làm tế bào vi khuẩn vỡ ra, làm lệch kết quả quan sát.

- Nhỏ vài giọt tím tinh thể (tím violet) lên tiêu bản, để trong 30 giây đến 1 phút. - Nghiêng đổ rồi rửa lại nước.

- Nhuộm màu tiêu bản bằng thuốc nhuộm Lugol trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa nhẹ với nước bằng bình tia.

- Rửa tiêu bản vừa nhuộm với cồn 90o cho đến khi phiến kính bạc màu trong khoảng 10-15 giây, rồi rửa lại với nước.

- Nhuộm tiếp tiêu bản với Fuchsin trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa lại với nước.

- Để khô tự nhiên hoặc dung giấy thấm lau tiêu bản cho sạch xung quanh vùng vi khuẩn, sau đó đưa lên vật kính dầu quan sát X -100.