khảo sát khả năng phát triển trứng và sự tạo thành phôi chó trong điều kiện phòng thí nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ THỊ MAI HƯƠNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN TRỨNG VÀ SỰ TẠO THÀNH PHÔI CHÓ TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ THỊ MAI HƯƠNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN TRỨNG VÀ SỰ TẠO THÀNH PHÔI CHÓ TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM (Sinh lý động vật) Mã số: 60 42 30 3 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. NGUYỄN THANH BÌNH 2. PGS. TS. TRẦN THỊ DÂN Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Chu kỳ động dục ở chó 3 2.1.1. Kỳ không động dục 3 2.1.2. Kỳ tiền động dục 3 2.1.3. Kỳ động dục 4 2.1.4. Kỳ đình dục 4 2.2. Sự thành thục của trứng chó in vivo 7 2.2.1. Các giai đoạn phát triển của trứng chó 7 2.2.2. Đặc điểm môi trường phát triển của trứng chó in vivo 8 2.3. Sự thành thục của trứng chó in vitro 10 2.3.1. Thử nghiệm mô phỏng điều kiện in vivo 11 2.3.2. Môi trường nuôi cấy 13 2.3.3. Các điều kiện nuôi cấy in vitro 17 2.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện sinh lý chó 19 2.4. Kết quả tạo phôi chó in vitro 20 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian 22 3.2. Nội dung nghiên cứu 22 3.3. Dụng cụ, thiết bị, và hóa chất 22 3.4. Phương pháp nghiên cứu 22 3.5. Chỉ tiêu đánh giá 27 iii 3.6. Xử lý số liệu 27 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1. Tỉ lệ trứng sống/ trứng thoái hóa 28 4.2. Nuôi thành thục trứng chó in vitro 30 4.3. Kết quả thúc đẩy sự thành thục của trứng chó khi đồng nuôi cấy với tinh trùng 33 4.4. Kết quả thụ tinh và tạo phôi 37 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 40 5.2. Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 46 vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ sống của trứng theo thời gian nuôi thành thục 28 Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ trứng chó ở các giai đoạn thành thục in vitro 31 Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 48 giờ nuôi 34 Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 60 giờ nuôi 35 Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 72 giờ nuôi 35 Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ thành thục nhân của trứng được thụ tinh 36 Biểu đồ 4.7: Tỉ lệ thụ tinh 37 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Diễn tiến hormone trong chu kỳ động dục chó 5 Hình 2.2: Hình ảnh tế bào học ống sinh sản chó trong chu kỳ động dục 6 Hình 2.3: Các giai đoạn phát triển nang buồng trứng 9 Hình 2.4: Trứng chó trước khi nuôi cấy và sau khi nuôi cấy 11 Hình 2.5: Phôi chó thu nhận in vitro ở các giai đoạn 21 Hình 3.1: Chó giống nội 22 Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 22 Hình 3.3: Các hình thái buồng trứng 24 Hình 3.4: Trứng được thu nhận cho thí nghiệm 25 Hình 3.5: Tinh hoàn và phó tinh hoàn 26 Hình 3.6: Trứng chó được nhuộm với Hoechst 33342 sau nuôi thành thục 27 Hình 4.1: Trứng chó sau nuôi cấy 29 Hình 4.2: Trứng chó sau nuôi thành thục và nhuộm với PI 32 Hình 4.3: Phôi chó thu nhận in vitro 38 Hình 4.4: Hợp tử với 2 tiền nhân 39 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT – THUẬT NGỮ ECG Equin Chorionic Gonadotropin Kích thích tố màng đệm ngựa FSH Follicle Stimulating hormone Hormone kích thích nang trứng GVBD Geminal Versicle Break Down Vỡ túi mầm HCG Human Chorionic Gonadotropin Kích thích tố màng đệm người IVF in vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm IVM in vitro maturation Nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm LH Luteinlazing hormone Hormone hoàng thể hóa MI Metaphase I Kỳ giữa giảm phân lần I MII Metaphase II Kỳ giữa giảm phân lần II PI Prophase I Kỳ đầu giảm phân lần I TCM 199 Tissue culture medium 199 Môi trường nuôi cấy mô Gonadotropin Chất kích thích tuyến sinh dục giải phóng từ tuyến Yên In vitro Trong ống nghiệm In vivo Trong cơ thể 1 MỞ ĐẦU Nghiên cứu về sinh lý sinh sản và công nghệ hỗ trợ sinh sản đã phát triển từ lâu trên đối tượng động vật có vú. Cơ chế sinh sản ở các loài này tương đối giống nhau (heo, bò, người, chuột ) tuy nhiên ở loài chó, có một số khác biệt với các loài động vật có vú khác. Thứ nhất là chu kỳ sinh dục của chó kéo dài khoảng 3 – 10 tháng tùy giống trong khi bò, người, heo là 20 – 28 ngày. Thứ hai là sự kiện chảy máu âm đạo ở giai đoạn tiền động dục. Sự chảy máu này không giống ở người là do bong tróc lớp niêm mạc dạ con khi không thụ tinh, ở chó sự chảy máu này là để bong lớp tế bào ngoài giúp tử cung sẵn sàng cho phôi làm tổ. Thứ ba là quá trình chín của trứng chó. Ở các loài động vật có vú khác, trứng tiến hành giảm phân trong nang trứng ở giai đoạn nang tiền rụng. Khi rụng, trứng ở giai đoạn Metaphase II và sẵn sàng cho thụ tinh. Tuy nhiên, ở chó không xảy ra như vậy, khi rụng trứng, trứng ở giai đoạn túi mầm (germinal versicle –GV) và quá trình giảm phân hoàn thành sau khoảng 48 giờ trong ống dẫn trứng [36]. Trên thực tế, chỉ có sự kiện thứ nhất và thứ ba là có ảnh hưởng nhiều tới những nghiên cứu về sinh sản in vitro của chó. Hiện nay, trên thế giới, kết quả của những nghiên cứu nuôi trưởng thành trứng in vitro còn rất hạn chế. Tỷ lệ nuôi chín trứng chó chỉ đạt khoảng 20% ngoại trừ nghiên cứu gần đây của tác giả Songsasen và Wildt đã báo cáo nuôi chín trứng thu nhận từ những nang trứng có kích thước > 2 mm đạt tỷ lệ 79,5% [14], [46]. Do đó, tỷ lệ phôi hình thành từ nguồn trứng nuôi trưởng thành in vitro này cũng rất hạn chế [14]. Ở Việt Nam, hiện nay chưa có quy trình nào hiệu quả cho việc nuôi thành thục trứng chó và tạo phôi chó in vitro. Năm 2005, nhóm tác giả Quách Tuyết Anh và Trần Thị Dân [35] đã báo cáo nuôi thành thục được trứng chó với tỉ lệ 0,75% ngoài ra không còn công bố nào có kết quả cao hơn. Với mục đích nghiên cứu về nuôi thành thục trứng và tạo phôi chó in vitro, tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát khả năng phát triển của trứng và sự tạo thành phôi chó trong điều kiện phòng thí nghiệm” Mục tiêu của đề tài là khảo sát thời gian tối ưu cho nuôi thành thục trứng và tạo phôi chó in vitro, đồng thời kiểm tra khả năng thúc đẩy trứng chó thành thục bằng việc đồng nuôi cấy với tinh trùng sau mỗi khoảng thời gian nuôi. Kết quả được đánh 2 giá thông qua các chỉ tiêu về tỉ lệ trứng sống/ thoái hóa; tần suất và mức độ thành thục nhân của trứng; tỉ lệ thụ tinh và khả năng tạo phôi. 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Chu kỳ động dục ở chó Ở chó, mỗi chu kỳ động dục kéo dài vài tháng; ngoài ra, biểu hiện về thời gian động dục ở mỗi con và mỗi giống rất khác nhau, đôi lúc những biểu hiện cũng khác nhau. Chu kỳ sinh dục bình thường của chó cái có thể phân chia thành 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn có hành vi, sinh lý và kiểu nội tiết riêng biệt. 2.1.1. Kỳ không động dục Kỳ không động dục (anaestrus) ở chó kéo dài 2-10 tháng [47]. Tuyến sinh dục của chó ở kỳ này không có hoạt động rõ rệt. Chúng không đòi hỏi giao phối hoặc không chấp nhận cho chó đực giao phối. Âm hộ nhỏ và không phồng lên. Phân tích tế bào học ống sinh dục của chó cái cho thấy các tế bào nhỏ chiếm đa số và một phần nhỏ các tế bào bạch cầu và các vi khuẩn. Nội soi âm đạo thấy các nếp gấp phẳng, mỏng và đỏ. Sinh lý của chó trong giai đoạn này vẫn chưa được hiểu rõ nhưng chắc chắn là có sự giảm chức năng thể vàng và giảm tiết prolactin. Ở kỳ này, kết quả đo nồng độ estrogen được công bố rất khác nhau nhưng đều cho rằng hàm lượng đạt mức độ cao hơn mức trung bình một tháng trước kỳ tiền động dục rồi tăng lên nhanh chóng [30]. Trong khi đó, nồng độ của Luteinizing hormone (LH) trong huyết thanh đạt ở mức thấp, dưới 1 ng/ml, chỉ bằng 2-20% so với nồng độ đỉnh. Ở giai đoạn đầu của kỳ không động dục, follicle stimulating hormone (FSH) luôn ở nồng độ căn bản (khoảng 20 ng/ml) và tăng lên vào giữa và cuối của kỳ (>30ng/ml) [8], [29]. Trong giai đoạn không động dục, chó cái không thấy có sự hoạt động chức năng của buồng trứng. 2.1.2. Kỳ tiền động dục Trong suốt kỳ tiền động dục (proestrus), chó cái bắt đầu hấp dẫn con đực nhưng vẫn không chấp nhận giao phối. Có sự bong lớp màng niêm mạc giả ở tử cung khiến chảy máu âm đạo, và âm đạo mở rộng ở mức trung bình. Phân tích tế bào âm đạo cho thấy, có sự thay đổi phát triển từ những tế bào nhỏ cận gốc thành các tế bào trung gian nhỏ và lớn, tế bào trung gian và cuối cùng là tế bào biểu mô bề mặt phản [...]... quanh trứng tới tận giai đoạn phôi nang [22] Trứng chó được thụ tinh di chuyển trong ống dẫn trứng khoảng 9-10 ngày sau đó mới tiến vào tử cung [22], [55] 2.2.2 Đặc điểm môi trường phát triển của trứng chó in vivo Môi trường nang trứng Trong buồng trứng của tất cả các loài động vật có vú, nang trứng là một đơn vị cấu trúc và chức năng Nang trứng chứa giữ trứng phát triển và thành thục Trong nang trứng. .. lý môi trường nang trứng hay ống dẫn trứng 2.3.1 Thử nghiệm mô phỏng điều kiện in vivo Nuôi cấy nang trứng Sự duy trì cấu trúc ba chiều của nang trứng cho phép bảo tồn chức năng và hình thái của đơn vị chứa và nuôi dưỡng trứng phát triển và thành thục một cách toàn vẹn Bolamba và cs (1998) ước lượng sự trưởng thành nhân của trứng chó thông Hình 2.4: Trứng chó trước khi nuôi cấy (A) và sau khi nuôi cấy... sống kéo dài trong ống dẫn trứng là nét đặc biệt của trứng chó Ống dẫn trứng của chó giúp trứng tồn tại trong thời gian 9 dài bao gồm sự thành thục hoàn toàn, sự thụ tinh và sự phát triển tới giai đoạn phôi nang Do vậy, tổng thời gian trứng chó trong ống dẫn trứng khoảng 8,5 tới 9 ngày, nhiều hơn 3-4 ngày so với các loài khác [22] Bởi thế, hình thái của ống dẫn trứng phải thích hợp cho sự tồn tại dài... tố) trong sự trưởng thành và khả năng sống của trứng chó Tiến hành tương tác với tinh trùng Như được quan sát trong in vivo, trong in vitro cũng thấy có sự tập trung tinh trùng chó ở màng trong suốt và ở khoảng không quanh trứng ngay cả khi trứng ở giai đoạn chưa thành thục Tuy nhiên, thông tin liên quan tới mối quan hệ giữa giai đoạn thành thục của trứng và đầu tinh trùng trong tế bào chất của trứng. .. ảnh hưởng tới sự trưởng thành nhân [45] 18 2.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện sinh lý chó Tuổi chó Theo nghiên cứu của Haenisch và cs (2003) cho thấy trứng thu nhận từ buồng trứng của những con chó chưa thành thục về tính (4-6 tháng) thì không có khả năng nuôi trưởng thành trong điều kiện in vitro Trứng từ những chó đã động dục (đã trải qua thành thục về tính) mới có khả năng phát triển hoàn tất tới giai... cứu Khảo sát khả năng phát triển của trứng và tạo phôi chó theo 3 khoảng thời gian nuôi trứng khác nhau 48, 60 và 72 giờ Kết quả thành thục nhân, tạo phôi được đánh giá tại thời điểm chấm dứt nuôi thành thục trứng ở mỗi lô và sau khi thụ tinh 3.3 Dụng cụ, thiết bị, và hóa chất (Xem phụ lục 1) 3.4 Phương pháp nghiên cứu Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Thụ tinh Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân 36h Phôi. .. hóa hoàn toàn và các tế bào tiết, chúng chiếm tới 40-50% các tế bào biểu mô Do vậy, ở chó, trứng được đặt trong môi trường các chất tiết và chất nhầy của ống dẫn trứng trong một thời gian dài, và có thể những chất này có vai trò chủ chốt trong sự kiện toàn của trứng Sự tương tác với tinh trùng trong ống dẫn trứng Trong cơ thể, trứng chó rụng duy trì khả năng thụ tinh ít nhất 4 ngày [55] Sự giao phối... phối [13] 2.3 Sự thành thục trứng chó in vitro Theo các báo cáo hiện nay, tỷ lệ IVM trên trứng chó chỉ đạt khoảng 20% và do đó tỉ lệ phát triển thành phôi cũng thấp trong các thử nghiệm IVF [21] Trong thập kỷ gần đây, các nhà khoa học đang cố gắng tìm hiểu sự thành thục và thụ tinh in 10 vitro ở trứng chó Đó là một thách thức vô cùng hấp dẫn đối với các nhà khoa học Đa số ý kiến cho rằng sự phân chia... buồng trứng giai đoạn động dục so với các giai đoạn khác Ngoài ra tác giả còn chứng minh trứng phải có đường kính 100-120 µm [32], [33] mới có khả năng hoàn tất giảm phân, và sự trưởng thành nhân ở các trứng có đường kính 120 µm cao hơn so với các trứng nhỏ hơn [33] 2.4 Kết quả tạo phôi chó in vitro Do những kết quả hạn chế trong nuôi thành thục trứng chó in vitro nên kết quả thụ tinh, và nuôi phôi chó. .. bào và được giữ ở cùng giai đoạn như ở động vật sống Một lợi ích khác của kiểu nuôi cấy này là sự điều chỉnh về không gian và những liên kết sinh lý giữa màng nhầy và trứng Điều này tạo vi môi trường khác với điều kiện nuôi cấy trong vi giọt hoặc trên lớp đơn tế bào ống dẫn trứng Việc nuôi cấy trứng chó trong đoạn loa của ống dẫn trứng đã được chứng minh là có ảnh hưởng tốt tới sự tồn tại, phát triển . thành thục trứng và tạo phôi chó in vitro, tôi tiến hành đề tài: Khảo sát khả năng phát triển của trứng và sự tạo thành phôi chó trong điều kiện phòng thí nghiệm Mục tiêu của đề tài là khảo. NGÔ THỊ MAI HƯƠNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN TRỨNG VÀ SỰ TẠO THÀNH PHÔI CHÓ TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM (Sinh lý động vật) Mã. GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ THỊ MAI HƯƠNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN TRỨNG VÀ SỰ TẠO THÀNH PHÔI CHÓ TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG