Hình 3.1: Chó giống nội Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Thụ tinh Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Phôi được nuôi tiếp
36h Buồng trứng 48h 60h 72h Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Thụ tinh Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân
Phôi được nuôi tiếp
36h Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Thụ tinh Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Phôi được nuôi tiếp
36h
Thu nhận buồng trứng
Buồng trứng được thu nhận từ những con chó đang ở độ tuổi sinh sản (1,5-4,5 tuổi) và đã từng qua sinh sản.
Tuổi của chó được đánh giá qua hình thái của răng (Bảng 3.4). Trạng thái sinh
sản của chó (đã từng sinh sản hay chưa) được xác định thông qua hình thái của núm
vú và dựa trên những nhận xét của nhân viên lò mổ.
Bảng 3.1: Thời gian mọc răng của chó
Răng Thời gian
Tất cả răng sữa 8 tuần
Răng cửa một, 1 số răng tiền hàm, hàm 4-5 tháng
Răng vĩnh viễn mọc đủ 6-7 tháng
Răng trắng sạch 1 năm
Đỉnh răng cửa dưới một mòn 1 năm rưỡi
Dơ và vàng ở các răng phía sau do cao răng 2 năm
Đỉnh răng cửa dưới 2 mòn 2 năm rưỡi
Đỉnh răng cửa trên một mòn 3 năm rưỡi
Đỉnh răng cửa trên hai mòn 4 năm rưỡi
(Nguồn: The Merck Veterinary manual, 2006)
Buồng trứng được thu nhận tại lò mổ và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong
nước muối sinh lý ấm bổ sung kháng sinh. Buồng trứng được thao tác ngay khi tới
phòng thí nghiệm (khoảng 30 phút – 1 giờ sau khi thu nhận từ lò mổ). Những buồng
trứng được lựa chọn cho thí nghiệm là những buồng trứng có nang nổi từ 0,5-2 mm. Những buồng trứng không có nang nổi hoặc nang nổi to (>4 mm) hoặc có thể vàng
đều không được lựa chọn cho thí nghiệm.
Tại lò mổ, buồng trứng được thu nhận ngay sau khi chó được giết và được tẩy
sạch lông. Một đường mổ dài khoảng 3 cm bắt đầu từ rốn kéo xuống bụng được
thực hiện với dao mổ số 11 và cán dao số 3. Buồng trứng được lấy ra khỏi ổ bụng
và rửa bằng nước muối sinh lý ấm có bổ sung kháng sinh ,rồi giữ trong dung dịch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thu nhận trứng
Tại phòng thí nghiệm, buồng trứng được rửa lại 2 lần bằng dung dịch nước muối
nêu trên. Trứng được thu nhận bằng phương pháp rạch buồng trứng với dao mổ số
21, cán dao số 4 trong môi trường TCM199. Dung dịch sau khi rạch được soi tìm trứng dưới kính hiển vi soi nổi. Các trứng có tế bào chất đen đều, có đường kính ≥ 100 µm và có nhiều hơn 2 lớp tế bào hạt bám đều xung quanh được thu nhận cho thí
nghiệm.
Nuôi chín trứng
Các trứng thu nhận từ mỗi buồng trứng được chia thành 3 lô thí nghiệm với thời
gian nuôi cấy khác nhau (48 giờ, 60 giờ và 72 giờ). Tổng số trứng được nuôi ở mỗi
lô khoảng 200 trứng và được lặp lại 9 lần. Trứng được tiến hành nuôi theo phương
pháp nuôi cấy 2 bước [48].
Bước 1: trứng được ủ trong môi trường TCM 199 + 25µM β-mercaptoethanol + 10 ng/ml EGF + 0,25 mM pyruvate + 2,0 mM glutamine + 0,1% polyvinyl alcohol + 0,03 mg/ml streptomycin + 0,03 mg/ml penicillin G sodium + 5IU/ml ECG trong 2 giờ ở điều kiện 5% CO2, 38,5oC, hơi nước bão hòa.
Bước 2: trứng được chuyển sang môi trường nuôi có thành phần giống môi trường trên nhưng không có hormone ECG.
Sau thời gian nuôi, ở mỗi lô trứng được chia làm 2 phần. Một phần được loại bỏ
các tế bào hạt xung quanh, nhuộm và đánh giá trạng thái nhân tại chính thời điểm đó. Một phần được chuyển sang vi giọt thụ tinh, thụ tinh với tinh trùng (mật độ tinh
trùng là 106 tinh trùng/ml) và tiếp tục được nuôi cấy trong điều kiện 5% CO2, 38,5oC, hơi nước bão hòa.
c b
a
Hình 3.3: Các hình thái buồng trứng. (a) buồng trứng không có nang nổi; (b) buồng trứng với nang nổi từ 0,5-2 mm; (c) buồng trứng có thể vàng
Đánh giá trứng
Về đánh giá hình thái tế bào, các trứng sau thời gian nuôi thành thục được đánh
giá tỉ lệ sống/thoái hóa thông qua hình thái tế bào chất. Những trứng có hình thái tế
bào chất đen đều, màng tế bào chất căng, trứng có hình khối cầu tròn được đánh giá
là trứng sống. Trứng có tế bào chất bị co lại, phân mảnh, có sự xuất hiện các không
bào hay hình dạng của trứng bị biến đổi (không còn dạng khối cầu) được đánh giá là trứng thoái hóa.
Chuẩn bị tinh trùng
Tinh hoàn chó được thu nhận từ lò mổ sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm
trong thời gian 1 giờ. Tinh trùng được thu nhận từ phó tinh hoàn của chó. Phó tinh hoàn được cắt nhỏ trong dung dịch PBS, rung lắc (vortex) nhẹ trong 1 phút. Dịch
thu nhận sau khi rung lắc được tiến hành phương pháp bơi lên (swim-up) với dung
dịch BO ấm. Sau 30 phút ủ trong điều kiện 38,50C, 5%CO2, bão hòa hơi nước, dung
dịch BO phía trên được thu nhận và ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 3 phút. Dịch nổi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phía trên của ống ly tâm được loại bỏ, cặn được huyền phù lại với dung dịch BO, được điều chỉnh tới mật độ 107 tinh trùng/ml. 10µl dung dịch này được thêm vào 90
µl vi giọt thụ tinh có sẵn trứng.
a b
Hình 3.4: Trứng được thu nhận cho thí nghiệm
Thụ tinh và tạo phôi
Sau mỗi thời gian nuôi cấy, trứng được chuyển vào vi giọt thụ tinh. Tinh trùng
được thêm vào vi giọt này với mật độ cuối cùng là 106 tinh trùng/ml. Trứng và tinh
trùng được đồng nuôi cấy trong tủ ủ CO2 ở điều kiện 38,50C, 5%CO2, bão hòa hơi nước. Sau 8-10 giờ nuôi ủ, trứng được chuyển sang môi trường nuôi phôi (cũng là
môi trường nuôi chín trứng). Sau 30 giờ, quan sát kết quả tạo phôi (phôi 2 tế bào và 4 tế bào). Các trứng còn lại được nhuộm để đánh giá hình thái nhân.
Quy trình nhuộm trứng/ phôi
Trứng/ phôi được nhuộm với thuốc nhuộm PI (propidium iodide) theo quy trình của Reyes và cs (2006). Quy trình nhuộm được tiến hành như sau: trứng/phôi được
loại bỏ hoàn toàn các tế bào cumulus bám xung quanh, sau đó được cố định trong
paraformadehyde 5% trong 30 phút. Các trứng/phôi này được rửa lại bằng dung
dịch PBS-1% paravinyl alcohol 2 lần và được ủ trong Triton-X100 0,1% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để tạo các lỗ thủng trên màng trong suốt và màng sinh chất của
trứng/phôi. Các phân tử propidium iodide đi vào tế bào chất và vào nhân qua các lỗ
này, bắt cặp với DNA trong nhân. Sau 2 giờ ủ, trứng/phôi được rửa lại 2 lần bằng
PBS-1% paravinyl alcohol trước khi chuyển vào thuốc nhuộm PI 200µg/ml. Trứng/phôi sau nhuộm được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng
480 nm [37].
Đánh giá hình thái nhân của trứng chó ở các giai đoạn phát triển được nhận định
dựa theo hình ảnh của Saikhun và cs, 2008 [48] (Hình 3.6)