Do những kết quả hạn chế trong nuôi thành thục trứng chó in vitro nên kết quả
thụ tinh, và nuôi phôi chó cũng rất hạn chế. Mahi và Yanagimachi (1976) là nhóm
đầu tiên báo cáo về thử nghiệm thụ tinh ống nghiệm ở loài này và thu được khoảng
20-30% trứng thụ tinh được đánh giá thông qua sự hiện diện của tiền nhân đực
trong các noãn bào [28]. Songsasen và cs (2002) đã thụ tinh trong ống nghiệm đối
với trứng nuôi cấy in vitro và thấy rằng 34% trứng có sự xâm nhập của tinh trùng (sự thụ tinhđược đánh giá bởi sự hiện diện của hai nhân nguyên và một đuôi tinh
trùng duy nhất trong tế bào chất trứng). Thông thường, sự thụ tinh được ghi nhận
chỉ khoảng 4% tổng số trứng. Trong nghiên cứu khác cũng của Songsasen và cs, tác giả thu được 7 phôi giai đoạn 2-12 tế bào sau khi thụ tinh 85 trứng (8,23%) [45]. Một nghiên cứu gần đây của Rodrigues và cs (2004) đạt được tỉ lệ thụ tinh 30%, một nửa trong số đó là thụ tinh đa tinh trùng. Các tác giả này cũng cho biết tỷ lệ thụ
tinh của trứng thu nhận từ chó giai đoạn động dục là 42,5%, giai đoạn không động
dục là 34,3% và giai đoạn hoàng thể hóa là 18,6%. Tổng số các phôi phát triển sau giai đoạn 8 tế bào trong các nghiên cứu khoảng 10% [41]. Trong nghiên cứu khác
của Saikhun và cs (2008), tỉ lệ phôi 2 tế bào thu được khi nuôi phôi trong môi trường SOF là 33,6% [43]. Cho tới nay, chỉ có Otoi và cs (2001) đã nuôi thành công 1 phôi chó tới giai đoạn phôi nang từ 217 trứng nuôi thành thục trong ống
nghiệm (0,46%).
Các công bố về chuyển phôi cũng rất hạn chế [33]. England và cs (2001) đã thu nhận trứng từ những chó được kích thích động dục sau đó nuôi cấy trong 24-72 giờ
quả là có một phôi được ghi nhận nhờ siêu âm vào ngày thứ 20 sau khi chuyển . Tuy nhiên, phôi này đã bị hỏng 2 ngày sau đó [trích dẫn 36].
Hiện nay, các nghiên cứu in vitro về sinh sản của chó ở Việt Nam còn hạn chế
cả về số lượng nghiên cứu và kết quả đạt được. Hiện chỉ có nhóm của tác giả Quách
Tuyết Anh, Trần Thị Dân trường Đại học Nông lâm Tp. HCM đã báo cáo kết quả
nuôi thành thục trứng chó in vitro đạt 0,75% [35]. Nghiên cứu này sẽ giúp tìm hiểu
thêm về các đặc điểm nuôi thành thục trứng chó và thụ tinh cho trứng chó in vitro.
Hình 2.5: Phôi chó thu nhận in vitro ở các giai đoạn 2 tế
bào (A); 4 tế bào (B); 8 tế bào (C); 16 tế bào (D). (Nguồn: Shaikhun
PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian
Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Tp HCM từ tháng 01/2010 đến tháng
12/2010.
Buồng trứng và tinh hoàn chó được thu nhận từ lò mổ của gia đình anh Hải, số nhà 15/8 Bùi Thị Xuân,
P3, Q. Tân Bình, Tp.HCM.
3.2. Nội dụng nghiên cứu
Khảo sát khả năng phát triển của trứng và tạo phôi chó theo 3 khoảng thời gian
nuôi trứng khác nhau 48, 60 và 72 giờ. Kết quả thành thục nhân, tạo phôi được đánh
giá tại thời điểm chấm dứt nuôi thành thục trứng ở mỗi lô và sau khi thụ tinh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3. Dụng cụ, thiết bị, và hóa chất (Xem phụ lục 1)
3.4. Phương pháp nghiên cứu
Hình 3.1: Chó giống nội Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Thụ tinh Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Phôi được nuôi tiếp
36h Buồng trứng 48h 60h 72h Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Thụ tinh Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân
Phôi được nuôi tiếp
36h Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Thụ tinh Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Phôi được nuôi tiếp
36h
Thu nhận buồng trứng
Buồng trứng được thu nhận từ những con chó đang ở độ tuổi sinh sản (1,5-4,5 tuổi) và đã từng qua sinh sản.
Tuổi của chó được đánh giá qua hình thái của răng (Bảng 3.4). Trạng thái sinh
sản của chó (đã từng sinh sản hay chưa) được xác định thông qua hình thái của núm
vú và dựa trên những nhận xét của nhân viên lò mổ.
Bảng 3.1: Thời gian mọc răng của chó
Răng Thời gian
Tất cả răng sữa 8 tuần
Răng cửa một, 1 số răng tiền hàm, hàm 4-5 tháng
Răng vĩnh viễn mọc đủ 6-7 tháng
Răng trắng sạch 1 năm
Đỉnh răng cửa dưới một mòn 1 năm rưỡi
Dơ và vàng ở các răng phía sau do cao răng 2 năm
Đỉnh răng cửa dưới 2 mòn 2 năm rưỡi
Đỉnh răng cửa trên một mòn 3 năm rưỡi
Đỉnh răng cửa trên hai mòn 4 năm rưỡi
(Nguồn: The Merck Veterinary manual, 2006)
Buồng trứng được thu nhận tại lò mổ và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong
nước muối sinh lý ấm bổ sung kháng sinh. Buồng trứng được thao tác ngay khi tới
phòng thí nghiệm (khoảng 30 phút – 1 giờ sau khi thu nhận từ lò mổ). Những buồng
trứng được lựa chọn cho thí nghiệm là những buồng trứng có nang nổi từ 0,5-2 mm. Những buồng trứng không có nang nổi hoặc nang nổi to (>4 mm) hoặc có thể vàng
đều không được lựa chọn cho thí nghiệm.
Tại lò mổ, buồng trứng được thu nhận ngay sau khi chó được giết và được tẩy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sạch lông. Một đường mổ dài khoảng 3 cm bắt đầu từ rốn kéo xuống bụng được
thực hiện với dao mổ số 11 và cán dao số 3. Buồng trứng được lấy ra khỏi ổ bụng
và rửa bằng nước muối sinh lý ấm có bổ sung kháng sinh ,rồi giữ trong dung dịch
Thu nhận trứng
Tại phòng thí nghiệm, buồng trứng được rửa lại 2 lần bằng dung dịch nước muối
nêu trên. Trứng được thu nhận bằng phương pháp rạch buồng trứng với dao mổ số
21, cán dao số 4 trong môi trường TCM199. Dung dịch sau khi rạch được soi tìm trứng dưới kính hiển vi soi nổi. Các trứng có tế bào chất đen đều, có đường kính ≥ 100 µm và có nhiều hơn 2 lớp tế bào hạt bám đều xung quanh được thu nhận cho thí
nghiệm.
Nuôi chín trứng
Các trứng thu nhận từ mỗi buồng trứng được chia thành 3 lô thí nghiệm với thời
gian nuôi cấy khác nhau (48 giờ, 60 giờ và 72 giờ). Tổng số trứng được nuôi ở mỗi
lô khoảng 200 trứng và được lặp lại 9 lần. Trứng được tiến hành nuôi theo phương
pháp nuôi cấy 2 bước [48].
Bước 1: trứng được ủ trong môi trường TCM 199 + 25µM β-mercaptoethanol + 10 ng/ml EGF + 0,25 mM pyruvate + 2,0 mM glutamine + 0,1% polyvinyl alcohol + 0,03 mg/ml streptomycin + 0,03 mg/ml penicillin G sodium + 5IU/ml ECG trong 2 giờ ở điều kiện 5% CO2, 38,5oC, hơi nước bão hòa.
Bước 2: trứng được chuyển sang môi trường nuôi có thành phần giống môi trường trên nhưng không có hormone ECG.
Sau thời gian nuôi, ở mỗi lô trứng được chia làm 2 phần. Một phần được loại bỏ
các tế bào hạt xung quanh, nhuộm và đánh giá trạng thái nhân tại chính thời điểm đó. Một phần được chuyển sang vi giọt thụ tinh, thụ tinh với tinh trùng (mật độ tinh
trùng là 106 tinh trùng/ml) và tiếp tục được nuôi cấy trong điều kiện 5% CO2, 38,5oC, hơi nước bão hòa.
c b
a
Hình 3.3: Các hình thái buồng trứng. (a) buồng trứng không có nang nổi; (b) buồng trứng với nang nổi từ 0,5-2 mm; (c) buồng trứng có thể vàng
Đánh giá trứng
Về đánh giá hình thái tế bào, các trứng sau thời gian nuôi thành thục được đánh
giá tỉ lệ sống/thoái hóa thông qua hình thái tế bào chất. Những trứng có hình thái tế
bào chất đen đều, màng tế bào chất căng, trứng có hình khối cầu tròn được đánh giá
là trứng sống. Trứng có tế bào chất bị co lại, phân mảnh, có sự xuất hiện các không
bào hay hình dạng của trứng bị biến đổi (không còn dạng khối cầu) được đánh giá là trứng thoái hóa.
Chuẩn bị tinh trùng
Tinh hoàn chó được thu nhận từ lò mổ sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm
trong thời gian 1 giờ. Tinh trùng được thu nhận từ phó tinh hoàn của chó. Phó tinh hoàn được cắt nhỏ trong dung dịch PBS, rung lắc (vortex) nhẹ trong 1 phút. Dịch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thu nhận sau khi rung lắc được tiến hành phương pháp bơi lên (swim-up) với dung
dịch BO ấm. Sau 30 phút ủ trong điều kiện 38,50C, 5%CO2, bão hòa hơi nước, dung
dịch BO phía trên được thu nhận và ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 3 phút. Dịch nổi
phía trên của ống ly tâm được loại bỏ, cặn được huyền phù lại với dung dịch BO, được điều chỉnh tới mật độ 107 tinh trùng/ml. 10µl dung dịch này được thêm vào 90
µl vi giọt thụ tinh có sẵn trứng.
a b
Hình 3.4: Trứng được thu nhận cho thí nghiệm
Thụ tinh và tạo phôi
Sau mỗi thời gian nuôi cấy, trứng được chuyển vào vi giọt thụ tinh. Tinh trùng
được thêm vào vi giọt này với mật độ cuối cùng là 106 tinh trùng/ml. Trứng và tinh
trùng được đồng nuôi cấy trong tủ ủ CO2 ở điều kiện 38,50C, 5%CO2, bão hòa hơi nước. Sau 8-10 giờ nuôi ủ, trứng được chuyển sang môi trường nuôi phôi (cũng là
môi trường nuôi chín trứng). Sau 30 giờ, quan sát kết quả tạo phôi (phôi 2 tế bào và 4 tế bào). Các trứng còn lại được nhuộm để đánh giá hình thái nhân.
Quy trình nhuộm trứng/ phôi
Trứng/ phôi được nhuộm với thuốc nhuộm PI (propidium iodide) theo quy trình của Reyes và cs (2006). Quy trình nhuộm được tiến hành như sau: trứng/phôi được
loại bỏ hoàn toàn các tế bào cumulus bám xung quanh, sau đó được cố định trong
paraformadehyde 5% trong 30 phút. Các trứng/phôi này được rửa lại bằng dung
dịch PBS-1% paravinyl alcohol 2 lần và được ủ trong Triton-X100 0,1% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để tạo các lỗ thủng trên màng trong suốt và màng sinh chất của
trứng/phôi. Các phân tử propidium iodide đi vào tế bào chất và vào nhân qua các lỗ
này, bắt cặp với DNA trong nhân. Sau 2 giờ ủ, trứng/phôi được rửa lại 2 lần bằng
PBS-1% paravinyl alcohol trước khi chuyển vào thuốc nhuộm PI 200µg/ml. Trứng/phôi sau nhuộm được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng
480 nm [37].
Đánh giá hình thái nhân của trứng chó ở các giai đoạn phát triển được nhận định
dựa theo hình ảnh của Saikhun và cs, 2008 [48] (Hình 3.6)
3.5. Chỉ tiêu đánh giá
- Tỷ lệ trứng sống theo thời gian nuôi
- Tỉ lệ trưởng thành nhân của trứng sau các khoảng thời gian nuôi
- Kết quả thúc đẩy sự thành thục của trứng chó khi đồng nuôi cấy với tinh
trùng (Thuật ngữ đồng nuôi cấy giữa trứng và tinh trùng trong luận văn được sử
dụng với mục đích thể hiện ảnh hưởng của tinh trùng tới sự hoàn tất giảm phân của trứng) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tỉ lệ thụ tinh
- Kết quả tạo thành phôi chó giai đoạn 2-4 tế bào
3.6. Xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê theo trắc nghiệm F sau khi chuyển dạng
số liệu sang căn bậc hai bằng phần mềm Statgraphics XV.
Hình 3.6:Trứng chó được nhuộm với Hoechst 33342 sau nuôi thành thục.
(A) Trứng giai đoạn túi mầm; (B) trứng giai đoạn vỡ túi mầm;
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tỉ lệ trứng sống/ trứng thoái hóa
Các trứng sau thời gian nuôi cấy ở 5 lần thí nghiệm lặp lại ngẫu nhiên được đánh giá tỉ lệ sống/ thoái hóa thông qua hình thái về tế bào chất của trứng.
Bảng 4.1: Tỷ lệ sống của trứng theo thời gian nuôi
Sống (%) Thoái hóa (%) Giờ nuôi trứng Tổng số n X ± SD n X ± SD 48 124 100 79,07a ± 7,73 24 20,93a ± 7,73 60 103 80 77,59a ± 5,22 23 22,41a ± 5,22 72 115 75 65,64b ± 3,99 40 34.36b ± 3,99 a, b
: Chỉ sự khác biệt theo cột với P< 0,01
Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ sống của trứng theo thời gian nuôi thành thục
0% 20% 40% 60% 80% 100%
48 giờ 60 giờ 72 giờ
thoái hóa
sống
Sau khi nuôi cấy trứng chó, kết quả sống / thoái hóa của trứng được ghi nhận ở
các thời điểm 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ nuôi cấy. Tại thời điểm 48 giờ sau nuôi thành thục, tỉ lệ trứng sống đạt cao nhất 79,07% tiếp theo là tại thời điểm 60 giờ đạt 77,59% và thấp nhất tại thời điểm 72 giờ đạt 65,64%. Kết quả trên cho thấy việc
kéo dài thời gian nuôi thành thục trứng chó với môi trường TCM 199 có bổ sung
các chất hỗ trợ đã làm giảm tỉ lệ sống của chúng đồng nghĩa với việc làm gia tăng tỉ
lệ trứng thoái hóa. Nhận xét này cũng được ghi nhận bởi Luvoni và cs (2003) [trích dẫn 22].
Theo Spanel-Borowski (1981), buồng trứng chó có sự tồn tại của các nang được định sẵn là thoái hóa song vẫn có hình thái tăng trưởng như nang bình thường. Các
nang này có trứng bên trong. Các trứng sẽ thoái hóa theo chương trình hoặc là sự
hoại tử của chính trứng, hoặc là sự hoại tử của các tế bào hạt xung quanh [49]. Đây
có thể là một nguyên nhân khiến luôn tồn tại một tỉ lệ nhất định trứng thoái hóa
(hoặc không có nhân) trong quá trình nuôi (Hewitt và England (1997) [18], Bolamba và cs (2006) [4], Cui và cs (2006) [10], Hatoya và cs (2006) [16]). Kết quả
nghiên cứu của các tác giả này cũng cho tỉ lệ thoái hóa nhất định của trứng chó sau
thời gian nuôi cấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phân tích thống kê cho thấy, không có sự khác biệt ý nghĩa giữa tỉ lệ thoái hóa
trứng tại thời điểm 48 giờ và 60 giờ. Tuy nhiên, so sánh tỉ lệ này giữa thời điểm 48
giờ và 60 giờ với thời điểm 72 cho thấy có sự khác biệt. Điều này chỉ ra rằng, khi nuôi cấy luôn tồn tại một tỉ lệ trứng thoái hóa nhất định nhưng nếu thời gian nuôi
cấy kéo dài, tỉ lệ trứng thoái hóa sẽ tăng lên và có nhiều khả năng do tác động của môi trường mà không phải do tính chất nội tại của trứng nuôi cấy.
c
a b
d
Hình 4.1: Trứng chó sau nuôi cấy; (a) trứng với lớp tế bào hạt nở rộng;
(b) trứng có tế bào chất thoái hóa; (c) trứng sống; (d) trứng có thể cực
4.2. Nuôi thành thục trứng chó in vitro
Bảng 4.2: Tỉ lệ thành thục nhân của trứng tại các thời điểm nuôi cấy
Giờ nuôi trứng 48 giờ 60 giờ 72 giờ
Tổng số n 237 209 224
Không xác định được nhân n 74 65 62
n 71 63 65
Giai đoạn túi mầm
% 29,80 ± 10,42 28,67 ± 12,6 29,02 ± 9,48
n 61 33 27
Giai đoạn vỡ túi mầm
% 25,45 ± 7,65a 16,38 ± 8,12b 13,11 ± 6,9b
n 25 35 38
Giai đoạn metaphase I
% 10,72 ± 5,88 16,54 ± 9,05 16,23 ± 4,78
n 6 13 32
Giai đoạn metaphase II
% 2,37 ± 2,45c 6,54 ± 4,11d 14,7 ± 4,95e
n 92 81 97
Thành thục nhân
(GVBD-metaphase II) % 38,54 ± 8,44 39,46 ± 6,07 44,04 ± 6,97
a,b,…,e (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
: Chỉ sự khác biệt theo hàng với P < 0,01
Sau quá trình nuôi thành thụcở 9 lần thí nghiệm lặp lại, trứng chó được nhuộm
với thuốc nhuộm PI và quan sát hình thái nhân. Kết quả thu được về tỉ lệ trứng
thành thục nhân (khi trứng đạt giai đoạn vỡ túi mầm (GVBD) tới giai đoạn
metaphase II) sau nuôi ủ 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ là 38,54 ± 8,44%; 39,46 ± 6,07% và 44,04 ± 6,97% tương ứng. So với nghiên cứu trong nước thì kết quả của
chúng tôi cao hơn rất nhiều, Quách Tuyết Anh và cs (2005) ghi nhận 0,75% [35]. Kết quả này cũng cao hơn một số tác giả khác ở nước ngoài như: Hewitt và England (1997) sau 96 giờ nuôi cấy đạt tỉ lệ GVBD- metaphase II là 38,7% [18]; Bolamba và cs (2006) nuôi trứng với môi trường có bổ sung LH, FSH và EGF thu được tỉ lệ
trứng đạt giai đoạn GVBD-metaphase II khoảng 30% [4]. Cui và cs (2006) sau 72 giờ nuôi trứng thu nhận từ buồng trứng giai đoạn không động dục là 24,9± 3,1% [10]; Willingham-Rocky và cs (2003) trong các thí nghiệm nuôi thành thục trứng
chó với việc bổ sung progesterone ở hàm lượng khác nhau cho kết quả từ 35-40% [57]. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi thấp hơn một số tác giả khác như Hatoya và
cs (2006) báo cáo 49% [16]; Hatoya và cs (2009) ghi nhận tỉ lệ 51,6% khi nuôi trứng sau 72 giờ với môi trường có bổ sung 1µg/ml estradiol, 1ng/ml EGF [17]; Saikhun và cs (2008) khi nuôi với môi trường SOF có bổ sung glucose, putrescine,