Sau khi nuôi thành thục trứng chó, tại các thời điểm 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ sau
nuôi, tinh trùng thu từ mào tinh hoàn chó được thêm vào vi giọt nuôi trứng với mật độ tinh trùng cuối cùng là 106 tinh trùng / ml. Sau 8-10 giờ đồng nuôi cấy với tinh
trùng, trứng được chuyển sang môi trường mới, tiếp tục nuôi trong cùng điều kiện
38,50C, 5% CO2, bão hòa hơi nước. Kết quả tạo thành phôi và phát triển phôi được
ghi nhận trong bảng 4.5.
Bảng 4.5: Kết quả thụ tinh
Tiền nhân Phôi Thụ tinh *
Giờ nuôi trứng Số trứng dùng trong thụ tinh n X ± SD n X ± SD n X ± SD 48 138 21 14,68 ± 4,04 2 1,09 ± 2,01 23 15,77a ± 4,66 60 129 26 19,95 ± 7,64 3 2,44 ± 5,43 29 22,39b ± 11,2 72 105 21 20,1 ± 6,92 3 2,26 ± 3,14 24 22,27b ± 6,16 a, b.
: Chỉ sự khác biệt theo cột với P < 0,05
*: Bao gồm tỷ lệ hình thành tiền nhân và tỉ lệ tạo phôi
Biểu đồ 4.7: Tỉ lệ thụ tinh Tỉ lệ thụ tinh 0 5 10 15 20 25
tiền nhân phôi thụ tinh
(%
)
48 giờ 60 giờ 72 giờ
Sau 9 lần thí nghiệm lặp lại, kết quả tạo thành phôi như sau:
Ở lô thụ tinh sau 48 giờ nuôi, có 2 lần thí nghiệm lặp lại thu nhận được phôi. Mỗi lần lặp lại thu nhận được 1 phôi giai đoạn 2 tế bào. Trung bình tỉ lệ trứng đạt giai đoạn tiền nhân thu được là 14,8% và tỉ lệ trứng thụ tinh là 15,77%.
Ở lô thụ tinh sau 60 giờ nuôi, thu nhận được tổng số 3 phôi từ 2 lần thí nghiệm
lặp lại. Trong đó có 2 phôi giai đoạn 4 tế bào và 1 phôi giai đoạn 2 tế bào. Tỉ lệ
trứng đạt giai đoạn tiền nhân là 19,95%; tỉ lệ thụ tinh là 22,39%.
Ở lô thụ tinh sau 72 giờ nuôi, thu nhận được 2 phôi giai đoạn 2 tế bào và 1 phôi
giai đoạn 4 tế bào từ 3 đợt thí nghiệm. Tỉ lệ trứng đạt giai đoạn tiền nhân là 20,1%; tỉ lệ trứng thụ tinh là 22,27%.
Các kết quả trên cho thấy trứng thụ tinh sau 60 giờ và 72 giờ nuôi thành thục
cho hiệu quả thụ tinh cao hơn ở cả 2 phương diện trứng đạt giai đoạn tiền nhân và tạo phôi. Do đó, kết quả thụ tinh cũng cao hơn. Tuy nhiên, không có sự khác biệt ý
nghĩa thống kê giữa các lô 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ ở các chỉ tiêu.
Kết quả thụ tinh với trứng chó nuôi trưởng thành in vitro của chúng tôi cao hơn
tác giả như Hatoya và cs (2006) đạt tỉ lệ hình thành tiền nhân là 8% [16]; nhưng
thấp hơn một số tác giả: Saikhun và cs (2008) đạt tỉ lệ tạo thành phôi 2 tế bào là 33,6%, tỉ lệ tạo thành phôi 8-16 tế bào là 4,1% [43]; Cui và cs (2006) đạt tỉ lệ hình
b a
c Hình 4.3: Phôi chó thu nhận in vitro. (a) Phôi 4 tế bào; (b) phôi 2 tế bào; (c) phôi 2, 4 tế bào (lô thụ tinh với
thành tiền nhân đực ở lô trứng nuôi thành thục 48 giờ là 32%; ở lô trứng nuôi 72 giờ
là 28% [10].
Cùng với tỉ lệ trứng sống / thoái hóa và tỉ lệ trứng thành thục, kết quả thụ tinh
cho thấy trứng sau nuôi 48 giờ chưa thực sự sẵn sàng cho thụ tinh tạo phôi in vitro
còn trứng được nuôi tới 72 giờ trong điều kiện in vitro có tỉ lệ trứng có nhân đạt metaphase II cao nhất nhưng tỉ lệ trứng thoái hóa cao nên cũng ảnh hưởng tới kết
quả tạo phôi và sức sống của phôi. Trứng được nuôi tới thời điểm 60 giờ đã thể hiện được những ưu thế hơn ở các thời điểm khác về các tiêu chí tỉ lệ trứng thoái hóa
không cao, tỉ lệ trứng tiến hành giảm phân tương đương các thời điểm khác, tỉ lệ thụ tinh cao tương đương kết quả của trứng nuôi ở 72 giờ; thêm vào đó trong các phôi
hình thành, đã có phôi phát triển tới phôi 4 tế bào.
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Từ các kết quả đạt được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
Việc nuôi thành thục trứng chó và tạo được phôi từ những trứng này trong điều
kiện in vitro của phòng thí nghiệm đã thành công bằng phương pháp nuôi cấy 2 bước cụ thể:
(1) Mức độ thành thục nhân của trứng chó nuôi cấy in vitro tỉ lệ thuận với thời
gian nuôi cấy từ 48 giờ đến 72 giờ trong khi tỉ lệ thành thục không đổi. Sau 48 giờ,
60 giờ và 72 giờ nuôi tỉ lệ trứng sống lần lượt đạt 79,07%; 77,59% và 65,64% tương ứng; tỉ lệ trứng thành thục đạt 38,54%; 39,46% và 44,04% tương ứng.
(2)Trong quá trình nuôi thành thục trứng chó in vitro có tồn tại một tỷ lệ trứng không xác định được nhân khi nhuộm với thuốc nhuộm PI 200 µg/ml.
(3)Việc đồng nuôi cấy trứng với tinh trùng giúp thúc đẩy tỷ lệ thành thục nhân ở
trứng chó nuôi in vitro.
(4)Tỷ lệ thụ tinh của trứng và tỷ lệ tạo phôi thấp nhất ở lô nuôi thành thục trứng
trong 48 giờ. Tỷ lệ thụ tinh lần lượt là 15,77%; 22,39% và 22,27%; tỷ lệ tạo phôi là 1,09%; 2,44% và 2,26% sau khi nuôi thành thục ở 48, 60, và 72 giờ.
(5)Thời điểm 60 giờ sau nuôi là thời điểm tối ưu cho nuôi thành thục và tạo
phôi chó in vitro.
(6)Nghiên cứu đã tạo được 5 phôi giai đoạn 2 tế bào và 3 phôi giai đoạn 4 tế
bào từ tổng số trứng thụ tinh.