Bảng 4.2: Tỉ lệ thành thục nhân của trứng tại các thời điểm nuôi cấy
Giờ nuôi trứng 48 giờ 60 giờ 72 giờ
Tổng số n 237 209 224
Không xác định được nhân n 74 65 62
n 71 63 65
Giai đoạn túi mầm
% 29,80 ± 10,42 28,67 ± 12,6 29,02 ± 9,48
n 61 33 27
Giai đoạn vỡ túi mầm
% 25,45 ± 7,65a 16,38 ± 8,12b 13,11 ± 6,9b
n 25 35 38
Giai đoạn metaphase I
% 10,72 ± 5,88 16,54 ± 9,05 16,23 ± 4,78
n 6 13 32
Giai đoạn metaphase II
% 2,37 ± 2,45c 6,54 ± 4,11d 14,7 ± 4,95e
n 92 81 97
Thành thục nhân
(GVBD-metaphase II) % 38,54 ± 8,44 39,46 ± 6,07 44,04 ± 6,97
a,b,…,e
: Chỉ sự khác biệt theo hàng với P < 0,01
Sau quá trình nuôi thành thụcở 9 lần thí nghiệm lặp lại, trứng chó được nhuộm
với thuốc nhuộm PI và quan sát hình thái nhân. Kết quả thu được về tỉ lệ trứng
thành thục nhân (khi trứng đạt giai đoạn vỡ túi mầm (GVBD) tới giai đoạn
metaphase II) sau nuôi ủ 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ là 38,54 ± 8,44%; 39,46 ± 6,07% và 44,04 ± 6,97% tương ứng. So với nghiên cứu trong nước thì kết quả của
chúng tôi cao hơn rất nhiều, Quách Tuyết Anh và cs (2005) ghi nhận 0,75% [35]. Kết quả này cũng cao hơn một số tác giả khác ở nước ngoài như: Hewitt và England (1997) sau 96 giờ nuôi cấy đạt tỉ lệ GVBD- metaphase II là 38,7% [18]; Bolamba và cs (2006) nuôi trứng với môi trường có bổ sung LH, FSH và EGF thu được tỉ lệ
trứng đạt giai đoạn GVBD-metaphase II khoảng 30% [4]. Cui và cs (2006) sau 72 giờ nuôi trứng thu nhận từ buồng trứng giai đoạn không động dục là 24,9± 3,1% [10]; Willingham-Rocky và cs (2003) trong các thí nghiệm nuôi thành thục trứng
chó với việc bổ sung progesterone ở hàm lượng khác nhau cho kết quả từ 35-40% [57]. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi thấp hơn một số tác giả khác như Hatoya và
cs (2006) báo cáo 49% [16]; Hatoya và cs (2009) ghi nhận tỉ lệ 51,6% khi nuôi trứng sau 72 giờ với môi trường có bổ sung 1µg/ml estradiol, 1ng/ml EGF [17]; Saikhun và cs (2008) khi nuôi với môi trường SOF có bổ sung glucose, putrescine,
MII là 88,9% [43]. Kết quả cao của các tác giả trên có thể do sự khác biệt về thành phần môi trường nuôi thành thục trứng chó so với thí nghiệm của chúng tôi.
Khi phân tích thống kê tỉ lệ thành thục nhân của trứng chó nuôi cấy với 3 thời
gian khác nhau, cho thấy tỷ số F (F-ratio) giữa mức phương sai giữa các nhóm
(nhóm 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ) so với trong mỗi nhóm (các lần lặp lại trong từng
nhóm) là 1,5 và giá trị P = 0,24 > 0,05 do đó không có sự khác biệt thống kê giữa các nhóm này. Điều này cho thấy, với phương pháp nuôi cấy 2 bước tỉ lệ trứng
thành thục không phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy (từ 48-72 giờ).
Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ trứng chó ở các giai đoạn thành thục in vitro
Nuôi thành thục trứng 0 10 20 30 40 50
Giai đoạn túi mầm
Giai đoạn vỡ túi mầm Giai đoạn metaphase I Giai đoạn metaphase II Thành thục nhân (%) 48 giờ 60 giờ 72 giờ
Mặc dù tỉ lệ trứng thành thục là như nhau khi kiểm tra ở 3 thời điểm, song mức độ thành thục nhân của trứng chó tỉ lệ thuận với thời gian nuôi cấy.Ở thời điểm 48
giờ sau nuôi cấy, trứng chó đạt tới giai đoạn metaphase II chỉ là 2,37 ± 2,45 % trong khi trứng chó nuôi tiếp tới 60 giờ là 6,54 ± 4,11 % và cao nhất là sau nuôi 72 giờ đạt 14,7 ± 4,95 %. Ở giai đoạn sớm hơn của sự thành thục trứng, giai đoạn
metaphse I, trứng kiểm tra ở thời điểm 60 giờ và 72 giờ cho tỉ lệ tương đương nhau
còn thời điểm 48 giờ vẫn thấp nhất. Tuy nhiên, ở giai đoạn vỡ túi mầm (giai đoạn
khởi động cho quá trình giảm phân) trứng chó kiểm tra sau 48 giờ nuôi cấy cho tỉ lệ
cao nhất 25,45 ± 7,65 %. Điều này cho thấy sau 48 giờ nuôi, trứng chó bắt đầu khởi động tiến trình giảm phân, trùng với nhận định của Holst và Phemister (1971) [22]; Tsutsui và cs (1989) [36]; Reynaud và cs (2005) [55].
Theo nghiên cứu của Saint-Diezier và cs (2001) mức độ thành thục về nhân của
trứng không thay đổi theo thời gian nuôi. Tại thời điểm 48 và 72 giờ sau nuôi, tỉ lệ
trứng thành thục tới giai đoạn GVBD / metaphase I / metaphase II là 31% / 7,3% /
2,1% và 27,4% / 8,1% / 2,1%, tương ứng [42]. Ngược lại, kết quả của chúng tôi cho
thấy mức độ thành thục nhân của trứng tỉ lệ thuận với thời gian nuôi (giai đoạn metaphase II đạt 2,37% / 6,54% / 14,7% tương ứng với 48, 60 và 72 giờ nuôi thành thục) i k d b a e c g h
Hình 4.2: Trứng chó sau nuôi thành thục và nhuộm với thuốc nhuộm PI. (a) trứng trước khi nuôi cấy; (b) trứng sau khi nuôi cấy; (c) trứng thành thục với sự xuất hiện
của thể cực thứ nhất; (d) trứng ở giai đoạn túi mầm; (e) trứng ở giai đoạn vỡ túi mầm;
(g) trứng ở giai đoạn metaphase I; (h) trứng ở giai đoạn anaphase I; (i) trứng ở giai đoạn metaphase II; (k) trứng thoái hóa nhân. (20X)
Tỉ lệ trứng đạt giai đoạn metaphase II thu được cao hơn kết quả của một số tác giả nước ngoài như Rodrigues và Rodrigues (2003) đạt 4,4% sau nuôi 72 giờ [37];
Kim và cs (2007) đạt 0,0% sau nuôi 72 giờ [23]; Hatoya và cs (2006) đạt 13% sau
72 giờ nuôi [16]; Hatoya và cs (2009) đạt 8,7% [17]. Tuy nhiên, kết quả còn thấp hơn so với Santos và cs (2006) là 4,7% sau nuôi 48 giờ [44]; Saikhun và cs (2008)
đạt 18,4% sau 48 giờ nuôi [43].
Kết quả nuôi thành thục trứng chó trên cho thấy, khi tăng thời gian nuôi cấy
trứng chó thu nhận từ buồng trứng giai đoạn không động dục đã làm tăng tỉ lệ trứng
chó phát triển tới giai đoạn MII song không làm tăng tỉ lệ trứng chó tiến tới giảm
phân.