tinh trùng
Sau mỗi thời gian nuôi thành thục, trứng được đồng nuôi cấy với tinh trùng trong 8-10 giờ. Sau đó, trứng được chuyển sang vi giọt môi trường khác có thành phần giống với môi trường nuôi thành thục.
Các trứng sau thụ tinh, không có sự phát triển thành phôi sau nuôi 24 giờ được
thu nhận và nhuộm với thuốc nhuộm PI 200 µg/ml.
Các giai đoạn của nhân trứng sau nhuộm được ghi nhận ở bảng 4.3.
Bảng 4.3: Tỷ lệ trứng thành thục nhân sau khi đồng nuôi cấy với tinh trùng
Giờ nuôi trứng 48 giờ 60 giờ 72 giờ
Tổng số n 211 209 224
Không xác định được nhân n 73 65 59
n 52 63 65
Giai đoạn túi mầm
% 36,90 ± 6,85a 23,13 ± 1,61b 21,30 ± 3,93b
n 29 30 16
Giai đoạn vỡ túi mầm
% 23,83 ± 13,24c 26,16 ± 11,41c 15,67 ± 13,82d
n 2125 25 19
Giai đoạn metaphase I
% 15,41 ± 8,97 18,93 ± 10,26 19,23 ± 8,96
n 13 15 24
Giai đoạn metaphase II
% 8,08 ± 15,26 9,39 ± 18,56 21,44 ± 9,41
n 21 26 21
Giai đoạn tiền nhân
% 14,68 ± 9,38 19,95 ± 11,24 20,10 ± 10,06 n 2 3 3 Phôi % 1,09 2,44 2,26 n 86 99 83 Thành thục nhân (GVBD-metaphase II) % 63,09 ± 1,61e 76,87 ± 3,01f 78,70 ± 8,59f
Tỷ lệ thành thục nhân của trứng nuôi in vitro và trứng được thụ tinh được trình bày tại bảng 4.4. Trong bảng 4.4, các số liệu trứng chỉ nuôi IVM được lấy từ bảng
4.2. Các số về trứng được thụ tinh (IVF) được lấy từ bảng 4.3 trong đó, số liệu
trứng có nhân đạt giai đoạn metaphase II (bảng 4.4) được tính là số trứng đạt MII
cộng với số trứng đã hình thành tiền nhân và số phôi (bảng 4.3).
Bảng 4.4: Tỉ lệ thành thục nhân của trứng nuôi in vitro và trứng được thụ tinh
48 giờ (%) 60 giờ (%) 72 giờ (%) Giờ nuôi trứng
Chỉ tiêu IVM IVF IVM IVF IVM IVF
Giai đoạn vỡ túi mầm 25,45 23,83 16,38 26,16 13,11 15,67
Giai đoạn metaphase I 10,72 15,41 16,54 18,93 16,23 21,44
Giai đoạn metaphase II 2,37 23,85 6,54 31,79 14,7 43,80 Thành thục nhân
(GVBD – metaphase II) 38,54
a
63,09b 39,46a 76,87b 44,04a 78,78b
a, b
: Chỉ sự khác biệt theo từng nhóm thời gian nuôi thành thục với P < 0,05
Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 48 giờ nuôi
0 10 20 30 40 50 60 70
GVBD metaphase I metaphase II Thành thục nhân
(%)
IVM IVF
Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 60 giờ nuôi 0 20 40 60 80 100
GVBD metaphase I metaphase II Thành thục nhân
(%)
IV M IV F
Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 72 giờ nuôi
0 20 40 60 80 100
GVBD metaphase I metaphase II Thành thục nhân
(%
) IVM
IVF
Kết quả tỉ lệ thành thục nhân của trứng IVM/IVF sau 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ nuôi được thể hiện ở 3 biểu đồ 4.3; 4.4 và 4.5. Cả 3 biểu đồ đều cho thấy, trứng sau khi được thụ tinh với tinh trùng có tỉ lệ thành thục nhân cao hơn trứng chỉ được nuôi
IVM, sự khác biệt này có ý nghĩa (P < 0,05). Như vậy, sự thụ tinh, sự tập trung của
tinh trùng xung quanh trứng có tác dụng thúc đẩy sự thành thục nhân ở trứng chó trong điều kiện in vitroở cả 3 mốc thời gian nghiên cứu là 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ.
Sự thúc đẩy này cũng được ghi nhận bởi Saint-Dizier và cs (2001). Tỉ lệ trứng
thành thục khi được đồng nuôi cấy với tinh trùng sau 72 giờ nuôi so với trứng không được thụ tinh là 53,3% và 37,6% tương ứng [42]. Kết quả chúng tôi đạt được
là 78,78% so với 44,04%, tương ứng. Tuy nhiên, vẫn còn tồn tại một tỉ lệ trứng đồng nuôi cấy với tinh trùng không thực sự khởi động quá trình giảm phân (vẫn ở giai đoạn túi mầm) nên sự tập trung tinh trùng quanh trứng chưa trưởng thành không phải là yếu tố duy nhất thúc đẩy sự thành thục ở trứng chó.
Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ thành thục nhân của trứng được thụ tinh
0 20 40 60 80 100
GVBD metaphase I metaphase II Thành thục nhân
(%)
48 giờ 60 giờ 72 giờ
Kết quả thành thục nhân ở của trứng chó được thụ tinh sau 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ nuôi thành thục là 63,09%; 76,88% và 78,78 % tương ứng. Phân tích thống kê cho thấy: sự cao hơn có ý nghĩa giữa tỉ lệ thành thục nhân của lô 60 giờ và 72 giờ so
với lô 48 giờ trong khi giữa lô 60 giờ và 72 giờ không có sự khác biệt. Điều này chỉ
ra việc thụ tinh cho trứng ở thời điểm 60 giờ và 72 giờ sau nuôi có hiệu quả thúc đẩy sự thành thục nhân ở trứng chó hơn ở thời điểm 48 giờ sau nuôi mặc dù tác động này ở cả 3 thời điểm đều có hiệu quả hơn so với việc chỉ nuôi thành thục in vitro.
Xét tổng các chỉ tiêu về tỉ lệ sống/thoái hóa, tỉ lệ thành thục, mức độ thành thục
nhân; tỉ lệ thụ tinh và tạo phôi cho thấy với phương pháp nuôi cấy 2 bước (ủ với môi trường có bổ sung hormone ECG trước khi nuôi) cho thấy thời điểm 60 giờ