báo cáo kiểm nghiệm vstp tình hình nhiễm và các phương pháp phân tích clostridium trong thực phẩm

Về tông quát, qua bài báo cáo này, nhóm nghiên cứu muốn tìm hiểu và chia sẻ thêm vẻ chủng Ciosfridium gây bệnh cho người và các vấn đề liên quan trong ngộ độc thực phẩm.. Cụ thê hơn, ta

TỎNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

TRUONG DAI HOC TON ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HOC UNG DUNG

BAO CAO MON KIEM NGHIEM VI SINH THUC

THANH PHO HO CHI MINH, NAM 2023

LỜI MỞ ĐẦU

Clostridium duoc phát hiện bởi nhà vi trùng học người Pháp Louis Pasteur vào

những năm 1860 như một bằng chứng về sự tồn tại của các vi sinh vật ky khí Khoảng

100 chủng Clos?ridium sp đã được xác định, nhưng chỉ có khoảng 25 đến 30 chủng thường gây bệnh cho người hoặc động vật.do hình thành độc tố Vì thé, dé tránh cho việc ngộ độc gây ảnh hưởng đến sức khỏe, thậm chí có thê gây chết người, ta cần

quan tâm đến tình trạng nhiém khuan Clostridium Dac biét, thyc pham la mot vat

pham thiét yeu dé duy tri sw sống của con người, việc sử dụng thực phâm là một nhu cầu không thể thiếu Thế nên, để đảm bảo chất lượng sống của con người, thực phâm cần phải đạt chuẩn an toàn về chất lượng cũng như là đảm bảo về số lượng tối thiểu mật độ các vi sinh vật được phép có mặt trong sản phâm thực phâm

Về tông quát, qua bài báo cáo này, nhóm nghiên cứu muốn tìm hiểu và chia sẻ thêm vẻ chủng Ciosfridium gây bệnh cho người và các vấn đề liên quan trong ngộ

độc thực phẩm Cụ thê hơn, ta có thê hiểu thêm về đặc điểm hình thái sinh lí, phương

pháp phân tích, các loại bệnh và mức độ hay cách phòng trị bệnh do ngộ độc thực pham do Clostridium gay nén

M.90811990110)00.— v

CHUONG 1 TONG QUAN (uo cessssssssssssssssssstsstsseesesusstsuesucsucsesscsussusaesussuesusansaesaeeseene 1

LL Khai quat v6 ClOStridieim 186 aa Ả 1

1.2 Vi khudn Clostridium botulinum c c c.cc.ccscsscssceseesessessessesseseessessessesesseesesseseeees 1 1.2.1 Tong quat về Clostridium botulinum .cccccccsccsscsssssssssssesssesseesseessesseessesssees 1 1.2.2 Tình hình nhiễm Clostridium botulinum trong thực phẩm 3

1.2.3 Ng6 déc do nhiém Clostrisium bOIHÏÌHMHH sec Sccccccccccccccee 4

1.3 Vi khuân Closfridiu p©ƒfÌH€HS 55 555cc 212k 8 1.3.1 Tổng quất V6 Clostridium perfringens o ccccccceccesssssvessessvessessessessessessessesees 8 1.3.2 Tinh hinh nhiém Clostridium perfringens trong thyrc pham HH key 9 1.3.3 Ngộ độc do nhiễm Ciostridium perƒfringens -cccccccce 10

CHUONG 2 CAC PHUONG PHAP PHAN TICH Clostridium TRONG THỰC

n0 0 ằ ae 13 2.1 Phương pháp phân tích truyền thống -2- 2-22 ©E¿©E+2E2Ez+EE+rxerxered 13

PC NH9) ha 0ì 13

2.2 Phương pháp phân tích hiện đại - ceceeseeseeeeeeeeeceeceeeeeeeeeaeeaeneeeaeeaes 15 2.2.1 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) 15 2.2.2 Kĩ thuật RPA (recombinase polymerase amplification) .- 16 2.2.3 Phương pháp thử nghiệm trên chuột bạch . -< <e2 17

CHƯƠNG 3 KẾT LUẬN 222 222ccEEEr.E re 18

TÀI LIỆU THAM KHẢO - S5: StS2 E131 1315111311 1111111111111115151555515 11151511 cey 19

iit

DANH MUC CHU VIET TAT

CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tam Kiém

soát và Phòng ngửa Dịch bệnh)

DNA Deoxyribonucleic acid

ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Thu nghiém hap thụ

mién dich gan két enzyme)

RPA Recombinase polymerase amplification (Khuéch dai nucleic acid

dang nhiét

iv

DANH MUC BANG

Bang 2.1 Môi trường, dụng cụ và thiết bị cho phương pháp truyền thống

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình dạng C botulinum quan sát được đưới kính hiển vi 2 Hình 1.2 Sản phâm bị phông hộp do sự sinh hơi của C botulinum 4 Hình 1.3 Ngộ độc qua thực phẩm 2- 2¿22+©22+EE+2EE+EEESEEvEEESEErzrkrsrkrrrrees 5 Hình 1.4 VỊ trí C botulinum xâm nhập 5 +- 5 5< ++x*+sSEEsessesrrrrrieeseexke 6 Hình 1.5 Vi khuẩn Clostridium pefringens dưới kính hiển vi -5 5¿ 8 Hình 1.6 Tống quan vẻ các bệnh do C perfringens gây ra - -s.- 10 Hình 2.1 Nguyên lí phương pháp ELIS A - - 2-5 SE + + *+ + sskrereeereeree 15 Hình 2.2 Nguyên ly phương pháp RPA -Ă TS SSSS SH re 16

CHƯƠNG 1 TONG QUAN

1.1 Khai quat vé Clostridium

Gidng Clostridium la cdc vi khuan gram duong, hinh que, ky khí, sinh bào tử,

phần lớn di động, phân bố rộng trong tự nhiên đặc biệt là trong đất, đồ đóng hộp,

Clostridium cing chính là nguyên nhân gây hư hỏng hàu, có thể phân giải saccharide

và protein trong các hoạt động thu năng lượng Những loài thủy giải saccharide có thé lên men các loại đường polysacchride tạo thanh acetic acid, butyric acid và rượu Nhiều loài có thể thủy giải protein và chuyển hóa không hoàn toàn các amino acid tạo thành mùi rất khó chịu trong sản phẩm Hầu hết giống Ciosridium, thuộc nhóm

ưa nhiệt vừa khoảng 25,5 — 36,59C, tuy nhiên có lại một số loài thuộc nhóm ưa nhiệt

và một số loài khác thuộc nhóm ưa lạnh

Các loài Clostridium hiện điện trong đất, một số loài trong nhóm này gây bệnh

cho người và động vật, một số loài khác gây hư hỏng thực phâm đặc biệt chúng dễ

xuất hiện trong đồ đóng hộp khi sản phâm đóng hộp đó chưa được tiệt trùng triệt dé,

chúng có khả năng khử sulphite thành sulphur tạo ra màu đen và gây mùi khó chịu Hiện nay chỉ xác định được ra hai chủng thường xuyên gây ngộ độc trong thực phẩm

là C botulinum va C perfringens Ngoai ra, loai C tetani tac nhân gây bệnh uốn ván 1.2 Vi khuan Clostridium botulinum

1.2.1 Tong quat vé Clostridium botulinum

C botulinum duoc E.van Ermengem mé ta lần đầu tiên năm 1897 trong một

vụ ngộ độc thực phẩm tại Ellezelles, Bi Thông thường đơn vị chung của liều chết

là miligam chất độc trên kilogam trong lượng cơ thê (mg/kg) nhưng đặc biệt độc tố botulinum lại gấp đơn vị chung đó gấp 1 triệu lần nên phải tính bằng đơn vị nanogam

Đó giống như là chỉ can 1 lượng chất độc botulinum bằng 1 hạt cát nó đủ để giết chết

10 nghìn người trưởng thành Tính khoảng chỉ cần 6 kg chất độc botulinum thì quét sạch toàn bộ nhân loại trên Trái Đất

Ì = oes ` 9 0:

Hinh 1.1 Hinh dang C botulinum quan sát được dưới kính hién vi

C botulinum Ia loai vi khuẩn ky khí bắt buộc chỉ phát triển khi không có oxy,

chỉ tăng trưởng duoc trong mdi truong trung tinh, C botulinum 1a vi khuan sinh déc

tố, khi có điều kiện thuận loi chting sé sinh bao tur, dat biét bao tr cua C botulinum

kháng nhiệt, chịu khô hạn, kháng hóa chất, vì thế khi chúng ta nau ăn thì bình thường

sẽ không tiêu diệt được chúng Bào tử sẽ nây mầm thành tế bào sinh dưỡng rồi sau

đó phát triển Cuối cùng khi gặp điều kiện nhiệt độ thuận lợi khoảng 30 — 37°C C

botulinum sinh độc tô, đây là loại độc tố thần kinh và chính là nguyên nhân gây tử C

botulinum khéng c6é sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác

Khi nhuém Gram, C botulinum bat mau Gram duong, co hinh que dang thang hoặc khá cong, có chiều đài tam 5 ym, dwong kinh tam 1 im các dòng khác nhau

trong loài này có các đặc điểm nuôi cây khác nhau và tạo ra 8 loại chất kháng nguyên gây độc tổ thần kinh khác nhau (từ type A đến G và F/A lai) Năm trong số các độc

tố loại A, B, E, và hiếm gặp là F và F/A lai (trước đây ghi là H) ảnh hưởng đến con

người Độc tô botulinum B là các protein gây độc cao có khả năng đề kháng với sự phân hủy của acid dịch vị và các enzyme phân hủy protein Type F/A lai là độc tố mạnh nhất được biết đến Khoảng 50% các vụ dịch bùng phát ngộ độc thực phâm ở Hoa Kỳ là đo độc té type A, tiép theo là các type B và E

Té bao C botulinum sé bi tiéu ở nhiệt độ 80°C đối với chủng A và ở 90°C đối

với chủng B Trong hầu hết truong hop C botulinum sinh ga và đều tạo mùi khó chịu

Từ đặc điểm này ta c6 thé loai bé thyc pham nhiém C botulinum mét cach dé dàng.

Tuy nhiên cần đề phòng một số trường hợp ngoại lệ, lúc này ta không nhận biết được bang cam quan vé sy nhiém vi khuan C botulinum cua thyc pham, do đó người sử dung sé bi nhiém déc té gây hội chứng botulinum (ngộ độc thịt)

1.2.2 Tinh hinh nhiém Clostridium botulinum trong thuc pham

1.2.2.1 Tân suất nhiễm

Nhiễm độc tố type A xuất hiện chủ yếu ở phía tây sông Mississippi, type B ở các bang phía đông, và type E ở Alaska và khu vực Great Lakes (type E thường liên quan đến việc ăn cá và các sản phẩm từ cá)

Đặc biệt, bảo vệ thực phẩm chay bằng bao bì hút chân không đang trở thành

phong trào Trong môi trường ky khí với nhiệt độ bảo quản thấp như vậy, thì đó là

điều kiện tối ưu để vi khuẩn phát triển và sinh độc tố botulinum

Cùng với sự phát triển của của khoa học và kỹ thuật, ty lệ tử vong do

botulinum ngày càng giảm Ví dụ vào những năm 1970 — 1973 chiếm khoảng 23%,

vào năm 1899 — 1994 tỷ lệ này chiếm trên 60% tại Mỹ Theo như thống kê của Trung

tâm kiểm soát dịch bệnh tại Hoa Kì, thì các sản phâm được làm thủ công hay còn là

gọi là đồ handmade là những sản phẩm dễ bị nhiễm C botulinum hon la cac san pham sản xuất theo quy mô nhà máy công nghiệp

1.2.2.2 Những loại thực phẩm dễ có nguy cơ nhiễm Clostridium botulinum

C botulinum phân bỗ hầu hết ở trong đất, đặc biệt những nơi như đất vườn,

đất ở những trang trại chăn nuôi gia súc, gia cầm Tôn tại trong các loại rau củ, quả,

kế cả mật ong cũng có thê chứa loại khuân này Chúng cũng có trong ruột của các thú nuôi trong nhà, ruột cá, đôi khi có cả trong ruột người chúng ta Do vi khuẩn này có nhiều trong tự nhiên nên rất đễ nhiễm vào thực phẩm trong quá trình sản xuất, chế biến, vận chuyên và bảo quản Đặc biệt chúng có khả năng lây nhiễm và phát triển mạnh trong các loại thực pham như thực pham đóng hộp, xúc xích, lạp xưởng, sữa

bột, phomalt

` rZS:2/

ANDARIN Oe

Hinh 1.2 San pham bj phéng hép do sy sinh hoi cua C botulinum

Đa phần thực phẩm chay có bản chất protein từ thực vật nên rất hạn chế sử dung chat bao quan NaCl va Nitrite, do là những chất ức ché vi khuan C botulinum hiệu quả trong bảo quản thực phẩm Thực phâm chay cũng rất khó để sử dụng nhiệt

độ 121°C, hay môi trường pH, nhằm diệt vi khuẩn và nha bào Hạn sử dụng thực

phâm chay lại kéo dài nhiều tháng

Qua một nghiên cứu mới đây của trường Đại học Helsinki Phần Lan được

đăng tải trên tạp chí Food Microbiology số 91, cho thấy tỉ lệ nhiễm C botulinum trong thực phẩm chay khá cao, chiếm 32% trong tông số 74 mẫu thực phẩm được thu thập xét nghiệm, số lượng nha bào lên tới 1200 trong mỗi kilogam thực phẩm 1.2.3 Ngộ độc do nhiễm Clostrisium botulinum

1.2.3.1 Benh do ngé doc Clostrisium botulinum

C botulinum là một trong vài loài Clostridia gây bệnh ở người Nhiễm botulinum là một rối loạn hiếm gặp, nguy hiểm đến tính mạng xảy ra khi độc tố

botulinum lan theo đường máu và gây ảnh hưởng không hồi phục giải phóng

acetylcholine ở các đầu mút dây thần kinh ngoại vi biểu hiện là yếu Nhiễm botulinum

là một cấp cứu y tế và đôi khi là trường hợp khẩn cấp về y tế cộng đồng

Déc té C botulinum sinh ra gay tê liệt việc truyền các xung thần kinh điều khiển quá trình co cơ từ đó dẫn đến nhược cơ và liệt cơ, thậm chí gây khó thở dẫn đến tử vong nếu không được điều trị kip thoi

Ngoai ra, cần đánh giá bệnh nhân về mức độ phản xạ yết hầu và ho, kiểm soát

tiết dịch họng thanh quản đê có biện pháp xử lý y tế thích hợp.

Mặc dù ngộ độc thịt do C Đofulinum diễn ra không thường xuyên, nhưng nó

lại thường dẫn đến những ca tử vong khi ngộ độc thịt

1.2.3.2 Triệu chứng, biểu hiện

Các triệu chứng ngộ độc vi khuan C botulinum thuong xuất hiện trong khoảng

12 — 36 giờ (thức ăn có sẵn độc tô), khoảng 3 — 10 ngày sau (thức ăn có nha bảo vi khuẩn C boulinum) Nhiễm botulinum có thê xảy ra khi độc tố thần kinh neurotoxin

được tạo ra trong cơ thể bằng C bofulinum hoặc khi nhiễm độc tổ thần kinh từ một

nguồn bên ngoài

bụng, tiêu chảy, khô miệng Triệu chứng đặc hiệu bắt đầu khi độc tố xâm nhập sâu

hơn là liệt cơ đối xứng từ trên phần đầu dọc xuống tay, chân, ngón chân, ngoài ra còn

có các đặc trưng như giảm thị giác, đặc biệt là sụp mí mắt, đồng tử mắt giãn to ra và bat dong ca 2 bén mắt, liệt mềm 2 cơ bên mặt, gây khó nuốt hoặc khó nói, nặng nhất

là tình trạng ảnh hưởng đến cơ quan hô hấp đặc biệt là cơ hoành không hoạt động sẽ

dẫn đến việc thở rất khó khăn, trường hợp tệ nhất là gây tử vong Độc tô không ảnh

hưởng đến vị giác

Người nhiễm độc tố botulinum hoàn toàn tỉnh táo vì độc tố của chúng tác động

lên hệ thống thần kinh ngoại ngoại biên chứ không có khả năng tác động lên hệ thông

thần kinh trung ương gồm phần não và tủy sống còn hệ thống thần kinh ngoại biên là những tế bào thần kinh từ não và tủy sống tủa ra các chỉ, các bộ phận để mà điều khiến các hoạt động có chủ đích của não

thần kinh trung

ương

Hệ thống thần kinh ngoại

&

) i bién

Hinh 1.4 Vi tri C botulinum x4m nhap Bệnh nhân khi ngộ độc C botulinum khéng bi sốt, không tang bạch cầu trong máu Huyết áp bệnh nhân sẽ bình thường

Giai đoạn cuối, chất độc có thê lan rộng, làm tê liệt các cơ, đặc biệt là tê liệt

cơ ngực gây suy hô hấp dẫn đến tử VONE

Phương pháp duy nhất đề chữa trị cho bệnh nhân khi ngộ độc độc tố botulinum

là sử dụng các chất kháng độc tố Tỷ lệ gây tử vong là 5 — 10% tức là cứ 100 người mắc phải độc tô botulinum thì có 5 đến 10 người tử vong, hầu hết là do họ chuẩn đoán

sai và quá trình điều trị không kịp thời

C botulinum lay nhiém qua vết thương Sau khi bị lở loét thì bào tử của chúng

có thé rơi vào vết thương va trong quá trình lành lại vô tình tạo môi trường ky khí để

chúng có điều kiện phát triển Thời gian ủ bệnh dài hơn tầm 10 ngày Khi mắc ngộ

độc botulism qua vết thương thường không có các tiền triệu chứng liên quan đến đường ruột như nôn mửa, tiêu chảy mà bệnh nhân lúc này sẽ bị sốt và tăng bạch cầu

do bội nhiễm với vi khuân gây bệnh khác Đa số thì các triệu chứng đặc hiệu tương

tự như ngộ độc qua thực phẩm

1.2.3.3 Cơ chế gây bệnh

Vi khuan C botulinum phát triển và sinh bào tử trong các loại thực phâm môi trường có độ acid thấp với độ pH lớn hơn 4,6; ít đường, ít muối, trong thịt và cá hộp chúng sẽ sinh độc tố Nếu ăn phải loại thực phâm này, các triệu chứng sẽ xuất hiện

sau 18 — 36 giờ Có trường hợp bệnh xuất hiện sớm sau ăn vải giờ hoặc muộn hơn,

Sau vài ngày

Nếu trong quá trình tiệt trùng thực phẩm việc tiêu diét bào tử không triệt để

mà bị sót lại thì trong điều kiện bảo quản sẽ gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm thành

các tế bảo sinh dưỡng, tế bào sinh dưỡng sẽ nhân lên với số lượng cực kì lớn, sau đó

chúng sẽ gây ra độc tố và độc tố có bản chất là protein, khi sử dụng thực phâm sẽ bị

hấp thu qua các thành vi lông mao của tế bào thành ruột non sau đó đi vào máu, máu

đi đến các cơ các bộ phận trên cơ thể từ đó dẫn đến hiện tượng liệt cơ, co cơ ở các bộ

phận trên cơ thể Độc to cua C botulinum khong mau, khong mii, vì thế khi người

tiêu dung su dung san pham đóng hộp họ mở ra họ thấy nó có mùi bình thường vì thé khi sử dụng họ dễ mắc nguy cơ ngộ độc

Độc tổ botulinum phân cắt các protein cân thiết để kích hoạt thần kinh khiến các tế bào không giải phóng được các túi chứa chất dẫn truyền thần kinh làm ngừng

tín hiệu thần kinh dẫn đến tê liệt Thời gian ủ bệnh càng ngăn độc tố càng nhiều và

nguy cơ tử vong càng cao Botulinum là độc tố mạnh nhất từng biết đến với liều lượng gây chết người (khoảng 1,2 — 1,3 ng/kg khi tiêm và 10 — 13 ng/kg khi hít vào) Có 8 chung C botulinum, tuy nhiên chỉ có 3 chủng thường gây độc là A, B, E

1.2.3.4 Đối tượng dễ mắc bệnh

C botulinum có thê gây ra ở trẻ sơ sinh dưới 1 tháng tuổi nhất là 6 tháng tuôi

đầu Ở độ tuôi này vi sinh vật đường ruột của trẻ chưa hoàn thiện Khi trẻ em vô tình

ăn hoặc hít phải bụi đất có chứa bào tử C børulimưm, bào tử này sẽ bám dính vào trẻ

va nay mam, phat triển trong màng thành ruột non, sinh ra độc tố Ngoài ra, đây là khoảng thời gian trẻ em phải tiêu thụ những thực phâm như mật ong, sữa, có nhiễm

C botulinum ở dang nha bào Sau khi chúng vào đường tiêu hóa sẽ phát triển và sinh ngoại độc tố

C botulinum cũng có thể gây bệnh khi nhiễm qua các vết thương Thể này hay gặp ở những người chích ma túy, những người bị các vết thương nhỏ nhưng không

chú ý vô khuẩn đầy đủ Vi khuân xâm nhập vào vết thương, nhân lên và sinh độc tố

gây hại

Khi mua và sử dụng không cần thận, người tiêu dùng có thể bị ngộ độc do ăn

phải mầm bệnh phát triển ở trong đồ hộp Nha bào của vi khuân có thể chịu được