(Tiểu luận) tình hình nhiễm và các phương pháp phân tích clostridium trong thực phẩm

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BÁO CÁO MƠN KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM (603137) TÌNH HÌNH NHIỄM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Clostridium TRONG THỰC PHẨM Người hướng dẫn: TS NGUYỄN NHƯ NHỨT Người thực hiện: 1/ ĐOÀN LÊ NGỌC THANH THÚY – 620H0141 2/ NGUYỄN PHẠM MỸ DUNG – 620H0265 Lớp : 20H60301 Khoá : K24 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 i LỜI MỞ ĐẦU Clostridium phát nhà vi trùng học người Pháp Louis Pasteur vào năm 1860 chứng tồn vi sinh vật kỵ khí Khoảng 100 chủng Clostridium sp xác định, có khoảng 25 đến 30 chủng thường gây bệnh cho người động vật.do hình thành độc tố Vì thế, để tránh cho việc ngộ độc gây ảnh hưởng đến sức khỏe, chí gây chết người, ta cần quan tâm đến tình trạng nhiễm khuẩn Clostridium Đặc biệt, thực phẩm vật phẩm thiết yếu để trì sống người, việc sử dụng thực phẩm nhu cầu thiếu Thế nên, để đảm bảo chất lượng sống người, thực phẩm cần phải đạt chuẩn an toàn chất lượng đảm bảo số lượng tối thiểu mật độ vi sinh vật phép có mặt sản phẩm thực phẩm Về tổng quát, qua báo cáo này, nhóm nghiên cứu muốn tìm hiểu chia sẻ thêm chủng Clostridium gây bệnh cho người vấn đề liên quan ngộ độc thực phẩm Cụ thể hơn, ta hiểu thêm đặc điểm hình thái sinh lí, phương pháp phân tích, loại bệnh mức độ hay cách phòng trị bệnh ngộ độc thực phẩm Clostridium gây nên ii MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v CHƯƠNG TỔNG QUAN .1 1.1 Khái quát Clostridium 1.2 Vi khuẩn Clostridium botulinum 1.2.1 Tổng quát Clostridium botulinum 1.2.2 Tình hình nhiễm Clostridium botulinum thực phẩm .3 1.2.3 Ngộ độc nhiễm Clostrisium botulinum 1.3 Vi khuẩn Clostridium perfringens 1.3.1 Tổng quát Clostridium perfringens 1.3.2 Tình hình nhiễm Clostridium perfringens thực phẩm .9 1.3.3 Ngộ độc nhiễm Clostridium perfringens 10 CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Clostridium TRONG THỰC PHẨM .13 2.1 Phương pháp phân tích truyền thống .13 2.1.1 Quy trình thực 13 2.1.2 Báo cáo kết .14 2.2 Phương pháp phân tích đại .15 2.2.1 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) 15 2.2.2 Kĩ thuật RPA (recombinase polymerase amplification) 16 2.2.3 Phương pháp thử nghiệm chuột bạch 17 CHƯƠNG KẾT LUẬN .18 TÀI LIỆU THAM KHẢO 19 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Kiểm sốt Phịng ngừa Dịch bệnh) DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn kết enzyme) RPA Recombinase polymerase amplification (Khuếch đại nucleic acid đẳng nhiệt iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Môi trường, dụng cụ thiết bị cho phương pháp truyền thống 13 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng C botulinum quan sát kính hiển vi Hình 1.2 Sản phẩm bị phồng hộp sinh C botulinum Hình 1.3 Ngộ độc qua thực phẩm .5 Hình 1.4 Vị trí C botulinum xâm nhập Hình 1.5 Vi khuẩn Clostridium pefringens kính hiển vi Hình 1.6 Tổng quan bệnh C perfringens gây 10 Hình 2.1 Ngun lí phương pháp ELISA 15 Hình 2.2 Nguyên lý phương pháp RPA 16 Document continues below Discover more from: nghệ sinh Công học CNSH01 Đại học Tôn Đức… 249 documents Go to course Atsh - Đề cương 19 31 Công nghệ sinh học 100% (5) THÍ NGHIỆM SINH HỌC TẾ BÀO Công nghệ sinh học 100% (5) Dược động - dược 25 động học Công nghệ sinh học 100% (4) Seminar-SHTB26 27 Nhóm5 đại học tơn… Cơng nghệ sinh học 100% (4) Sinh đai cương tới C13 Công nghệ sinh học 100% (3) Hoa - thực vật dược 39 Công nghệ CHƯƠNG TỔNG QUANsinh học 100% (3) 1.1 Khái quát Clostridium Giống Clostridium vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động, phân bố rộng tự nhiên đặc biệt đất, đồ đóng hộp, Clostridium ngun nhân gây hư hỏng hàu, phân giải saccharide protein hoạt động thu lượng Những lồi thủy giải saccharide lên men loại đường polysacchride tạo thành acetic acid, butyric acid rượu Nhiều lồi thủy giải protein chuyển hóa khơng hồn tồn amino acid tạo thành mùi khó chịu sản phẩm Hầu hết giống Clostridium, thuộc nhóm ưa nhiệt vừa khoảng 25,5 – 36,5oC, nhiên có lại số lồi thuộc nhóm ưa nhiệt số lồi khác thuộc nhóm ưa lạnh Các loài Clostridium diện đất, số lồi nhóm gây bệnh cho người động vật, số loài khác gây hư hỏng thực phẩm đặc biệt chúng dễ xuất đồ đóng hộp sản phẩm đóng hộp chưa tiệt trùng triệt để, chúng có khả khử sulphite thành sulphur tạo màu đen gây mùi khó chịu Hiện xác định hai chủng thường xuyên gây ngộ độc thực phẩm C botulinum C perfringens Ngoài ra, loài C tetani tác nhân gây bệnh uốn ván 1.2 Vi khuẩn Clostridium botulinum 1.2.1 Tổng quát Clostridium botulinum C botulinum E.van Ermengem mô tả lần năm 1897 vụ ngộ độc thực phẩm Ellezelles, Bỉ Thông thường đơn vị chung liều chết miligam chất độc kilogam lượng thể (mg/kg) đặc biệt độc tố botulinum lại gấp đơn vị chung gấp triệu lần nên phải tính đơn vị nanogam Đó giống cần lượng chất độc botulinum hạt cát đủ để giết chết 10 nghìn người trưởng thành Tính khoảng cần kg chất độc botulinum qt tồn nhân loại Trái Đất Hình 1.1 Hình dạng C botulinum quan sát kính hiển vi C botulinum lồi vi khuẩn kỵ khí bắt buộc phát triển khơng có oxy, tăng trưởng mơi trường trung tính, C botulinum vi khuẩn sinh độc tố, có điều kiện thuận lợi chúng sinh bào tử, đặt biệt bào tử C botulinum kháng nhiệt, chịu khơ hạn, kháng hóa chất, nấu ăn bình thường khơng tiêu diệt chúng Bào tử nẩy mầm thành tế bào sinh dưỡng sau phát triển Cuối gặp điều kiện nhiệt độ thuận lợi khoảng 30 – 37oC C botulinum sinh độc tố, loại độc tố thần kinh nguyên nhân gây tử C botulinum khơng có cạnh tranh với vi sinh vật khác Khi nhuộm Gram, C botulinum bắt màu Gram dương, có hình que dạng thẳng cong, có chiều dài tầm µm, đường kính tầm µ m dịng khác lồi có đặc điểm ni cấy khác tạo loại chất kháng nguyên gây độc tố thần kinh khác (từ type A đến G F/A lai) Năm số độc tố loại A, B, E, gặp F F/A lai (trước ghi H) ảnh hưởng đến người Độc tố botulinum B protein gây độc cao có khả đề kháng với phân hủy acid dịch vị enzyme phân hủy protein Type F/A lai độc tố mạnh biết đến Khoảng 50% vụ dịch bùng phát ngộ độc thực phẩm Hoa Kỳ độc tố type A, type B E Tế bào C botulinum bị tiêu nhiệt độ 80oC chủng A 90oC chủng B Trong hầu hết trường hợp C botulinum sinh ga tạo mùi khó chịu Từ đặc điểm ta loại bỏ thực phẩm nhiễm C botulinum cách dễ dàng Tuy nhiên cần đề phòng số trường hợp ngoại lệ, lúc ta không nhận biết cảm quan nhiễm vi khuẩn C botulinum thực phẩm, người sử dụng bị nhiễm độc tố gây hội chứng botulinum (ngộ độc thịt) 1.2.2 Tình hình nhiễm Clostridium botulinum thực phẩm 1.2.2.1 Tần suất nhiễm Nhiễm độc tố type A xuất chủ yếu phía tây sơng Mississippi, type B bang phía đơng, type E Alaska khu vực Great Lakes (type E thường liên quan đến việc ăn cá sản phẩm từ cá) Đặc biệt, bảo vệ thực phẩm chay bao bì hút chân khơng trở thành phong trào Trong mơi trường kỵ khí với nhiệt độ bảo quản thấp vậy, điều kiện tối ưu để vi khuẩn phát triển sinh độc tố botulinum Cùng với phát triển của khoa học kỹ thuật , tỷ lệ tử vong botulinum ngày giảm Ví dụ vào năm 1970 – 1973 chiếm khoảng 23%, vào năm 1899 – 1994 tỷ lệ chiếm 60% Mỹ Theo thống kê Trung tâm kiểm sốt dịch bệnh Hoa Kì, sản phẩm làm thủ cơng hay cịn gọi đồ handmade sản phẩm dễ bị nhiễm C botulinum sản phẩm sản xuất theo quy mô nhà máy công nghiệp 1.2.2.2 Những loại thực phẩm dễ có nguy nhiễm Clostridium botulinum C botulinum phân bố hầu hết đất, đặc biệt nơi đất vườn, đất trang trại chăn nuôi gia súc, gia cầm Tồn loại rau củ, quả, kể mật ong chứa loại khuẩn Chúng có ruột thú nuôi nhà, ruột cá, có ruột người Do vi khuẩn có nhiều tự nhiên nên dễ nhiễm vào thực phẩm trình sản xuất, chế biến, vận chuyển bảo quản Đặc biệt chúng có khả lây nhiễm phát triển mạnh loại thực phẩm thực phẩm đóng hộp, xúc xích, lạp xưởng, sữa bột, phomat Hình 1.4 Vị trí C botulinum xâm nhập Bệnh nhân ngộ độc C botulinum không bị sốt, không tang bạch cầu máu Huyết áp bệnh nhân bình thường Giai đoạn cuối, chất độc lan rộng, làm tê liệt cơ, đặc biệt tê liệt ngực gây suy hô hấp dẫn đến tử vong Phương pháp để chữa trị cho bệnh nhân ngộ độc độc tố botulinum sử dụng chất kháng độc tố Tỷ lệ gây tử vong – 10% tức 100 người mắc phải độc tố botulinum có đến 10 người tử vong, hầu hết họ chuẩn đốn sai q trình điều trị không kịp thời C botulinum lây nhiễm qua vết thương Sau bị lở loét bào tử chúng rơi vào vết thương trình lành lại vơ tình tạo mơi trường kỵ khí để chúng có điều kiện phát triển Thời gian ủ bệnh dài tầm 10 ngày Khi mắc ngộ độc botulism qua vết thương thường khơng có tiền triệu chứng liên quan đến đường ruột nôn mửa, tiêu chảy mà bệnh nhân lúc bị sốt tăng bạch cầu bội nhiễm với vi khuẩn gây bệnh khác Đa số triệu chứng đặc hiệu tương tự ngộ độc qua thực phẩm 1.2.3.3 Cơ chế gây bệnh Vi khuẩn C botulinum phát triển sinh bào tử loại thực phẩm môi trường có độ acid thấp với độ pH lớn 4,6; đường, muối, thịt cá hộp chúng sinh độc tố Nếu ăn phải loại thực phẩm này, triệu chứng xuất sau 18 – 36 Có trường hợp bệnh xuất sớm sau ăn vài muộn hơn, sau vài ngày Nếu trình tiệt trùng thực phẩm việc tiêu diệt bào tử khơng triệt bị sót lại điều kiện bảo quản gặp điều kiện thuận lợi nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng, tế bào sinh dưỡng nhân lên với số lượng lớn, sau chúng gây độc tố độc tố có chất protein, sử dụng thực phẩm bị hấp thu qua thành vi lông mao tế bào thành ruột non sau vào máu, máu đến phận thể từ dẫn đến tượng liệt cơ, co phận thể Độc tố C botulinum khơng màu, khơng mùi, người tiêu dung sử dụng sản phẩm đóng hộp họ mở họ thấy có mùi bình thường sử dụng họ dễ mắc nguy ngộ độc Độc tố botulinum phân cắt protein cần thiết để kích hoạt thần kinh khiến tế bào khơng giải phóng túi chứa chất dẫn truyền thần kinh làm ngừng tín hiệu thần kinh dẫn đến tê liệt Thời gian ủ bệnh ngắn độc tố nhiều nguy tử vong cao Botulinum độc tố mạnh biết đến với liều lượng gây chết người (khoảng 1,2 – 1,3 ng/kg tiêm 10 – 13 ng/kg hít vào) Có chủng C botulinum, nhiên có chủng thường gây độc A, B, E 1.2.3.4 Đối tượng dễ mắc bệnh C botulinum gây trẻ sơ sinh tháng tuổi tháng tuổi đầu Ở độ tuổi vi sinh vật đường ruột trẻ chưa hồn thiện Khi trẻ em vơ tình ăn hít phải bụi đất có chứa bào tử C botulinum, bào tử bám dính vào trẻ nảy mầm, phát triển màng thành ruột non, sinh độc tố Ngoài ra, khoảng thời gian trẻ em phải tiêu thụ thực phẩm mật ong, sữa,… có nhiễm C botulinum dang nha bào Sau chúng vào đường tiêu hóa phát triển sinh ngoại độc tố C botulinum gây bệnh nhiễm qua vết thương Thể hay gặp người chích ma túy, người bị vết thương nhỏ không ý vô khuẩn đầy đủ Vi khuẩn xâm nhập vào vết thương, nhân lên sinh độc tố gây hại Khi mua sử dụng khơng cẩn thận, người tiêu dùng bị ngộ độc ăn phải mầm bệnh phát triển đồ hộp Nha bào vi khuẩn chịu nhiệt độ 120oC phút C Botulinum sống đất, bùn, bụi bẩn, ruột cá, ruột gia súc đặc biệt phát triển mạnh thức ăn thiu, mơi trường kín thịt hộp để lâu ngày (đã có vụ ngộ độc hàng loạt độc tố C botulinum ăn thịt hộp) 1.3 Vi khuẩn Clostridium perfringens 1.3.1 Tổng quát Clostridium perfringens C perfringens William H Welch, MD, phát lần vào năm 1891 Bệnh viện Johns Hopkins sau khám nghiệm tử thi người đàn ông 38 tuổi, ban đầu đặt tên Bacillus aerogenes capsulatus Sau đó, gọi Bacillus welchii cuối đổi tên thành Clostridium perfringens C perfringens lồi kỵ khí khơng bắt buộc, tạo bào tử môi trường nuôi cấy nhân tạo, quan sát bào tử ni mơi trường Ellner, mơi trường có bổ sung muối mật bicarbonate hay quinoline Loài có sáu kiểu kháng nguyên ký hiệu từ A – F Kiểu kháng nguyên A thường gây hoại tử cho vết thương gây ngộ độc thực phẩm C perfringens nguyên nhân phổ biến gây ngộ độc thực phẩm Khi ăn với số lượng lớn, vi khuẩn tạo chất độc (độc tố) ruột người gây bệnh Chúng hình thành bào tử liên quan đến nhiễm trùng đường tiêu hóa cấp tính mức độ nghiêm trọng từ tiêu chảy đến viêm ruột hoại tử hoại tử người Hình 1.5 Vi khuẩn Clostridium pefringens kính hiển vi C perfringens phát triển khoảng từ 15 đến 50oC với mức tối ưu 45oC hầu hết chủng Thời gian hệ hầu hết chủng nhiệt độ từ 33 đến 49oC 20 phút thời gian hệ phút báo cáo 1.3.2 Tình hình nhiễm Clostridium perfringens thực phẩm 1.3.2.1 Tần suất nhiễm Vi khuẩn C perfringens nguyên nhân phổ biến gây ngộ độc thực phẩm CDC ước tính vi khuẩn gây gần triệu ca bệnh thực phẩm Hoa Kỳ năm Vi khuẩn C perfringens tìm thấy tự nhiên mơi trường, chẳng hạn như: đất, bụi, nước thải Các đợt bùng phát xảy quanh năm, với tỷ lệ mắc bệnh cao vào tháng 11 tháng 12, nhiều người số họ sử dụng thực phẩm phổ biến ngày lễ, chẳng hạn gà tây thịt bò nướng Độc tố loại A loại C biết gây bệnh cho người Loại A chịu trách nhiệm cho hầu hết ngộ độc thực phẩm liên quan đến C perfringens bệnh tiêu chảy không thực phẩm Theo liệu giám sát dịch tễ học CDC đợt bùng phát bệnh thực phẩm, C perfringens chiếm 5% số vụ bùng phát, 10% số ca bệnh 4% số ca nhập viện Quy mơ ổ dịch trung bình hàng năm 24, với bệnh liên quan đến ổ dịch trung bình gần 1200 1.3.2.2 Những loại thực phẩm dễ có nguy nhiễm Clostridium perfringens Trong điều kiện định, chẳng hạn thực phẩm giữ nhiệt độ khơng an tồn, vi khuẩn phát triển, bào tử C perfringens biến đổi thành vi khuẩn hoạt động, chúng nhân lên thực phẩm Sau ăn thực phẩm có chứa C perfringens, tạo độc tố (chất độc) gây tiêu chảy Thực phẩm nấu theo mẻ lớn bảo quản nhiệt độ không an toàn thường liên quan đến bùng phát ngộ độc thực phẩm C perfringens Các loại thực phẩm cụ thể thường liên quan đến ngộ độc thực phẩm C perfringens bao gồm: Gia cầm, chẳng hạn gà tây gà; thịt, chẳng hạn thịt bò thịt lợn; nước thịt 10 Bùng phát ngộ độc thực phẩm C perfringens có xu hướng xảy nơi chế biến thực phẩm để phục vụ cho nhiều người gây khó khăn việc giữ thực phẩm nhiệt độ thích hợp – ví dụ: bệnh viện, nhà ăn trường học, nhà tù, viện dưỡng lão kiện lớn có phục vụ thực phẩm 1.3.3 Ngộ độc nhiễm Clostridium perfringens 1.3.3.1 Bệnh ngộ độc Clostridium perfringens C perfringens nguyên nhân gây nên số bệnh người động vật, vi khuẩn có khả sinh độc tố gây hoại tử cơ, ngộ độc thực phẩm, nhiễm trùng huyết sau phá thai, viêm vú hoại tử, viêm ruột hoại tử, nhiễm độc ruột hay viêm ruột hoại tử… Tuy nhiên, bệnh ngộ độc xuất người ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy hoại tử clostridial (hoại thư khí) Hình 1.6 Tổng quan bệnh C perfringens gây 1.3.3.2 Triệu chứng, biểu Viêm dày ruột nhẹ phổ biến nhất, hầu hết người bị nhiễm C perfringens bị tiêu chảy co thắt dày vòng đến 24 sau ăn thực phẩm bị ô nhiễm Bệnh thường bắt đầu đột ngột kéo dài 24 Tiêu chảy gây nước, điều quan trọng phải uống nhiều nước Nhiễm trùng 11 thường không gây sốt nôn mửa truyền từ người sang người khác Hoại tử clostridial (hoại tử khí) bệnh nhiễm trùng mô mềm (cơ) hoại tử gây tử vong cao, đặc trưng hoại tử xương, khí phế thũng, phù da, suy đa quan tỷ lệ tử vong cao Sản xuất khí da hoại tử dấu hiệu chính, dấu hiệu khác xuất vài ngày, chẳng hạn hình thành vết loét đen da, bong bóng đen kèm theo tiếng lạo xạo, mùi hôi mô bị phân hủy phù nề chân tay Tiếp theo biến chứng toàn thân, chẳng hạn nhịp tim nhanh, sốt, sưng tấy, vàng da, đông máu nội mạch rải rác, nhiễm độc máu, sốc huyết động, hạ huyết áp, suy thận, viêm phúc mạc nhiễm trùng huyết 1.3.3.3 Cơ chế gây bệnh Trong hai loại bệnh, triệu chứng độc tố vi khuẩn tạo gây Khi lượng lớn vi khuẩn C perfringens sinh dưỡng ăn vào, vi khuẩn sống sót điều kiện acid ruột phát triển ruột, hình thành bào tử giải phóng độc tố ruột dẫn đến tiêu chảy Thịt bị nhiễm C perfringens để nhiệt độ phịng chí đun nóng đến 60°C (đem hâm nóng) khoảng thời gian vi khuẩn nảy mầm nhân lên, tạo số lượng lớn vi khuẩn Trong đường tiêu hoá, C perfringens sản sinh độc tố ruột hoạt động ruột non Chỉ có C perfringens type A xác định xác liên quan đến hội chứng ngộ độc thực phẩm Mặt khác, ngộ độc thực phẩm liên quan đến C perfringens gây tử vong thường người già suy nhược Viêm ruột hoại tử xảy số trường hợp hoi với loại độc tố ruột C perfringens khác C perfringens gây hoại tử khí chủ yếu thơng qua việc sản xuất CPA.Trong đó, vết thương chấn thương mô sâu cung cấp môi trường thuận lợi với nhiều amino acid peptide, giảm áp suất oxy cho phát triển nhanh chóng vi khuẩn kỵ khí tiết độc tố ngoại bào để giải phóng thêm chất 12 dinh dưỡng từ mô chủ Khi C perfringens đưa vào vết thương sâu, độc tố tạo gây tổn thương cho da mô sâu 1.3.3.4 Đối tượng dễ mắc bệnh Bất kỳ bị ngộ độc thực phẩm C perfringens Trẻ nhỏ người lớn tuổi có nguy mắc bệnh nghiêm trọng cao Dữ liệu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh cao chút nam giới (65%), với phần lớn trường hợp xuất từ 20 đến 49 tuổi 13 CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Clostridium TRONG THỰC PHẨM 2.1 Phương pháp phân tích truyền thống Phương pháp đếm khuẩn lạc: Mật độ vi khuẩn Clostridium xác định cách sử dụng môi trường chứa ferric ammonium citrate disodium sulfite, ủ 37oC từ đến ngày, ủ 50oC nghi ngờ có Clostridium ưa nhiệt Khuẩn lạc Clostridium có màu đen phản ứng S2- Fe2+ có môi trường Bảng 2.1 Môi trường, dụng cụ thiết bị cho phương pháp truyền thống Dụng cụ Môi trường Thiết bị Iron sulfite agar (ISA) Túi dập mẫu Máy dập mẫu Nước peptone đệm (Buffered Peptone Water) Đĩa Petri Máy đếm khuẩn lạc (nếu có) Perfringgens Selective Agar hay Shahidi Ferguson Perfringens (SFP) Đầu tube ml micropipette Bình ủ kỵ khí Mẫu đất đối chứng Bình cầu Mẫu thực phẩm mang kiểm nghiệm Erlen Nến 2.1.1 Quy trình thực Đồng mẫu cách cân lượng mẫu mong muốn với lượng nước muối sinh lí vơ trùng vừa đủ cho vào túi PE (nhựa polyetylen), sau cho vào máy dập mẫu Cơng thức tính độ pha lỗng cho mẫu rắn: 𝑥 = 10−1 𝑥+𝑦 Trong đó: x khối lượng chất rắn (g) 14 y thể tích cần dùng để pha x gam chất rắn (ml) Mẫu sau đồng pha loãng theo dãy thập phân 10-1, 10-2, 10-3, xử lí nhiệt 70 đến 80oC 20 phút để diệt bớt tế bào dinh dưỡng vi sinh vật khác Cấy vào đĩa vô trùng ml dịch mẫu, đổ 15 ml ISA hay PSA, lắc Sau canh trường đông, đổ thêm lên bề mặt khoảng 10 ml môi trường Một phương pháp khác cho mẫu vào ống nghiệm vô trùng, sau thêm 12 ml ISA hay PSA Agar ủ ấm 45oC, trộn Sau canh trường đông, đổ thêm lên bề mặt 10 ml ISA hay PSA Ủ 37oC 24 – 48 h bình kỵ khí 2.1.2 Báo cáo kết Đếm số khuẩn lạc hình thành, đếm khuẩn lạc có màu đen Chọn đĩa có khuẩn lạc từ 20 – 200 để đếm tính kết Tính tốn kết theo cơng thức: A (CFU/g hay CFU/ml) = 𝑁 𝑛1 𝑉𝑓1 + +𝑛𝑖 𝑉𝑓𝑖 Trong đó: A số tế bào vi khuẩn (đơn vị hình thành khuẩn lạc) ml mẫu hay g N tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn V thể tích cấy vào đĩa hay ống nghiệm (ml) ni số lượng số đĩa hay ống nghiệm có số khuẩn lạc chọn (Độ pha lỗng thích hợp để số lượng khuẩn lạc nằm khoảng 20 – 200) fi độ pha lỗng tương ứng Sau tính tốn kết quả, so sánh với tiêu chuẩn Việt Nam để đánh giá mức độ nhiễm độ an tồn có hợp lệ để lưu thông thị trường hay không Tuy nhiên, phải xét thêm yếu tố ngoại cảnh (điều kiện môi trường tiến hành nuôi cấy, thao tác nuôi cấy, bảo quản mẫu trước tiến hành kiểm nghiệm,…) có đạt chuẩn hay khơng để đảm bảo độ xác thực nghiệm 15 2.2 Phương pháp phân tích đại 2.2.1 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) Phương pháp dùng để phát độc tố thần kinh botulinum type A, B, E F môi trường nuôi cấy chất chiết nấm men glucose peptone tryptone (TPGY) môi trường canh thang thịt (CMM) nguyên chất, sử dụng kỹ thuật ELISA (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn kết enzyme) Nguyên tắc kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngồi đĩa giếng (microplate) Nếu có diện kháng nguyên mục tiêu mẫu, kháng nguyên giữ lại bề mặt giếng Các kháng nguyên phát cách sử dựng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase Khi bổ sung chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi đổi màu, phát diện định lượng lượng kháng nguyên Các độc tố bị bắt giữ kháng thể immunoglobin G (IgG) phủ đĩa vi giếng (microtiter plate) phát cách sử dụng IgG biotinyl hóa chất cộng hợp phosphatase kiềm streptavidin Enzyme gắn kết quan sát cách sử dụng chất khuếch đại Hình 2.1 Ngun lí phương pháp ELISA 16 2.2.2 Kĩ thuật RPA (recombinase polymerase amplification) RPA thay quy trình biến nhiệt phương pháp PCR, bao gồm ba protein chính, protein tái tổ hợp (recombinase) T4 UvsX làm tách mạch DNA sợ đô ban đầu, protein liên kết DNA sợi đơn T4 gp32 giúp mồi gắn vào vị trí tương đồng DNA mục tiêu, sau DNA polymerase (Sau Bsu polymerase) hoạt độn kéo dài mồi tổng hợp mạch khuyếch đại tạo sản phẩm tồn q trình phản ứng xảy nhiệt độ Kĩ thuật RPA công cụ phân tử hiệu quả, xác định tác nhân gây bệnh cách xác, nhanh chóng, tiết kiệm chi phí chuẩn bị mẫu đơn giản, nhiệt độ thấp, không cần máy điều nhiệt tiện lợi có sẵn kit thương mại đơng khơ Ngồi ra, có phương pháp đọc kết RPA khác điện di gel agarose, huỳnh quang định lượng thời gian thực (Real-time quantitative fluorescence) que thử lateral low – đơn giản dùng đọc kết RPA dựa nguyên tắc kháng nguyên kháng thể, theo sản phẩm RPA đánh dấu kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể có ue thử, nhờ phản ứng dương tính thể vạch que thử quan sát trực tiếp mắt thường Hình 2.2 Nguyên lý phương pháp RPA 17 2.2.3 Phương pháp thử nghiệm chuột bạch Mẫu huyết nghi ngờ nhiễm trước tiêm truyền cho chuột ly tâm vận tốc 12.000 vòng/phút vòng 20 phút Lấy phần nước bên lọc màng lọc 0,45 μm (syringe filter) Chia dịch bệnh phẩm sau lọc làm phần: phần (1 ml) không xử lý nhiệt (lô I), phần (1 ml) xử lý nhiệt cách đun cách thủy dịch bệnh phẩm 100oC/10 phút (lô II) phần (tổng cộng ml cho loại kháng độc tố) trộn với kháng độc tố chuẩn với type C, D, E theo tỷ lệ 1:1 (lô III) Theo dõi diễn biến chuột thí nghiệm ngày sau tiêm Tất mẫu huyết lô trước đem tiêm cho chuột cấy lên đĩa thạch máu ủ điều kiện kỵ khí hiếu khí để kiểm tra đảm bảo khơng có diện vi khuẩn mẫu Nếu kết tiêm cho chuột lô I làm chuột có biểu liệt chi, khơng vận động chuột chết chuột lô II, lô IV sống hoạt động bình thường, kết luận mẫu nghi ngờ có mang độc tố botulinum Nếu kết tiêm cho chuột lô III không làm chuột chết khơng có biểu bất thường type kháng độc tố huyết chứa độc tố loại 18 CHƯƠNG KẾT LUẬN Qua báo cáo này, chúng em biết thêm nhiều thơng tin hữu ích chủng Clostridium thực phẩm, vấn đề cần quan tâm trình kiểm nghiệm, đồng thời biết mức độ nguy hiểm loài khác chủng Clostridium gây bệnh cho người thực phẩm Clostridium botulinum Clostridium perfringens Khơng thế, chúng em cịn tìm hiểu phương pháp nghiên cứu phân tích Clostridium có thực phẩm, từ chúng em nhận thấy phát triển khoa học nay, có nhiều phương pháp khác để phân tích loại vi sinh vật, đồng thời biết quốc gia có tiêu chuẩn mật độ vi sinh vật cho phép có mặt khác 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Trần Hồng Diễm, Lâm Ngọc Ngân Anh (2021), Phát nhanh Clostridium perfrigens kĩ thuật RPA (recombinase polymerase amplification) khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt, Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ số 13, tập 50 [2] Trần Quốc Huy (2013), Vi sinh vật học thực phẩm, Nxb Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm TP HCM [3] Đàm Sao Mai (2013), Vi sinh thực phẩm, Nxb Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh [4] Trần Linh Thước (2004), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, Nhà xuất Giáo dục, Tp Hồ Chí Minh [5] Nguyễn Thu Tâm, Nguyễn Đức Hiền (2018), Phân lập vi khuẩn clostridium botulinum xác định diện độc tố botulin vịt bị liệt mềm cổ thu thập số tỉnh đồng sông Cửu Long, Tập 54, Số chuyên đề: Nông nghiệp: 143 – 147, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ [6] Bùi Anh Võ (2019), Giáo trình thí nghiệm kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm, Đại học Tôn Đức Thắng [7] Tiêu chuẩn quốc gia, TCVN 11135:2015, Vi sinh vật thực phẩm – phát độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E VÀ F Tiếng Anh [8] C Du, C Webb (2011), Comprehensive Biotechnology, Second Edition, Volume 2, Pages 11 – 23 [9] Jesus G.M, Silvia G.A., Ana I.A., Francisco R.V, (1999), Use of 16S -23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity, Journal Microbiol Methods [10] S Brynestad, P E Granum (2001), Clostridium perfringens and foodborne infections, International Journal of Food Microbiology, Department of Pharmacology, Microbiology and Food Hygiene, The Norwegian School of Veterinary Science 20 [11] Vijay K Juneja, John N Sofos (2010), Pathogens and Toxins in Foods – challenges and inventions, Washington, DC 20036-2904, USA [12] Ying Fu, Tahrir Alenezi Xiaolun Sun (2022), Clostridium perfringens-Induced Necrotic Diseases, Center of Excellence for Poultry Science, University of Arkansas, Fayetteville, AR 72701, USA Internet [13] (2022), Prevent Illness From C perfringens, Centers for Disease Control and Prevention, U.S Department of Health & Human Services, truy cập 22:12, 26/2/2023, https://www.cdc.gov/foodsafety/diseases/clostridium-perfringens.html# [14] (2023), Clostridium perfringens, Provincial Health Services Authority, British Columbia, truy cập 13:04, 27/2/2023, http://www.bccdc.ca/health-info/diseases-conditions/clostridiumperfringens#:~:text=C.,when%20ingested%20in%20sufficient%20numbers [15] Larry M Bush , Maria T (2021) Vazquez-Pertejo, Ngộ độc thực phẩm Clostridium perfringens, Cẩm nang MSD Manuals, Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA, truy cập 19:48, 25/3/2023, https://www.msdmanuals.com/vi-vn/chuy%C3%AAn-gia/b%E1%BB%87nhtruy%E1%BB%81n-nhi%E1%BB%85m/vi-khu%E1%BA%A9n-k%E1%BB%B5kh%C3%AD/vi%C3%AAm-ru%E1%BB%99t-ho%E1%BA%A1it%E1%BB%AD-do-clostridial [16] Phil Yao; Pavan Annamaraju (2022), Clostridium perfringens, StatPearls Publishing LLC, National Library of Medicine, truy cập 18:37, 24/2/2023, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK559049/