Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp phân tích flavonoid trong chế phẩm chứa cao lạc tiên Passiflora incarnata bằng UPLC” nhằm góp
TỔNG QUAN
Tổng quan về dược liệu Lạc tiên (Passiflora incarnata L.)
1.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật và phân bố a Đặc điểm hình thái thực vật
Passiflora incarnata L (tên tiếng Việt: lạc tiên tây, mắc mát…) là một loại cây dây leo thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae) Đây là loại cây leo, đường kính thường nhỏ hơn 8 mm, thân có rãnh dọc, vỏ màu xám nhạt sau chuyển màu đỏ tía, khi non có lông mịn Lá cây mọc so le, chia 3 thùy, thùy giữa là thùy chính, mép có răng rất nhỏ, tua cuốn mọc ở kẽ lá Gân giữa nổi bật ở mặt dưới, cuống lá có lông nhung mang 2 tuyến mật màu sẫm ở gần phiến lá [17]
Hoa có màu trắng, thơm, thường mọc đơn độc với cuống dài, lá bắc 3, xẻ rất sâu, vòng tua phần phụ cánh hoa có màu tím tía hoặc hồng Quả hình trứng, khi chín màu có màu vàng, chứa nhiều hạt dẹt, màu vàng nâu, bề mặt lỗ rỗ, ăn được [25] b Phân bố
Passiflora incarnata L được trồng chủ yếu ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở châu Mỹ [27] Ở Việt Nam, loài này được trồng tại một số vùng trồng tại Hà Nội, Lâm Đồng… [4]
Hình ảnh ngoài tự nhiên của thực vật Lạc tiên tây được trình bày ở Hình 1.1
Hình 1.1 Thực vật Lạc tiên Passiflora incarnata L ngoài tự nhiên
Hai thành phần hóa học chính của cây Passiflora incarnata L cũng giống như các loài khác thuộc chi Passiflora L là flavonoid và alcaloid
Các flavonoid C-glycosylat được tìm thấy ở P incarnata bao gồm chủ yếu là nhóm glucose liên kết trực tiếp với nhân thơm chỉ ở vị trí 6 và 8 của khung flavonoid [11] Dịch chiết cao lạc tiên có đặc tính hóa học bởi một số các flavonoid C-glycosid như: vitexin (1), isovitexin (2), schaftosid (3), isoschaftosid (4), orientin (5), iso-orientin (6) và swertisin (7) Hơn nữa, các flavonoid tự do cũng được tìm thấy: apigenin (8), luteolin (9), quercetin (10), kaempferol (11) và chrysin (12) Hình ảnh cấu trúc các flavonoid cho trong P incarnata được mình họa trong Hình 1.2 [34]
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học các flavonoid của P incarnata
Ngoài ra, P incarnata chứa khoảng 0,04% các β-carboline alkaloid như: harmin, harman, harmalol… Passiflora incarnata cũng bao gồm nhiều hoạt chất như: diệp lục, dẫn xuất pectin, saponin, vitamin, oxycoumarin, coumarin, quinon [30]
1.1.3 Tác dụng dược lý và công dụng a Tác dụng dược lý
Các nghiên cứu được thực hiện trên P incarnata đã cho thấy chiết xuất của cây có nhiều hoạt tính sinh như an thần ngủ ngon, giảm căng thẳng lo âu, chống tăng huyết áp, rối loạn nhịp tim, kháng khuẩn, kháng nấm và tăng hoạt động, chất lượng tình dục
Thành phần hóa học có trong P incarnata phần lớn là các alkaloid và các flavonoid có tác dụng ức chế men monoamine oxidase
Các thử nghiệm trên động vật cho thấy chiết xuất này có tác động tới hệ thần kinh trung ương, gây ra những phản ứng hoặc kích thích hoặc ức chế tùy vào liều lượng sử dụng Thử nghiệm trên chuột dùng nước chiết toàn cây cho thấy hoạt động của chuột giảm xuống trong các bài test về mê lộ (đường di chuyển quanh co nhiều chướng ngại vật) Một thử nghiệm khác cũng trên chuột cho thấy tác dụng an thần của P incarnata có thể do sự phối hợp của flavonoid chung với alkaloid [16]
Một số nghiên cứu khác cho thấy hoạt chất apigenin có trong chiết xuất lạc tiên tây có khả năng liên kết với các thụ thể benzodiazepin trung ương, từ đó tạo ra tác động an thần mà không gây ra các phản ứng bất hoạt trí nhớ hay rối loạn hoạt động di chuyển
Ngoài ra, dịch chiết Lạc tiên cũng làm giảm các kích động quá mức về thần kinh gây ra bởi amphetamine [32]
Giảm căng thẳng lo âu
Một số thử nghiệm trên người đã được thực hiện để nghiên cứu về tác dụng giảm lo âu của chiết xuất P incarnata
Thử nghiệm dùng chiết xuất Lạc tiên cho bệnh nhân trước giải phẫu để làm giảm căng thẳng, được ghi nhận là có kết quả tốt [36]
Thử nghiệm mù đôi có đối chứng trên 91 bệnh nhân cho thấy nhóm dùng chiết xuất Lạc tiên có kết quả tích cực trong trị liệu các rối loạn tâm thần, tính cách so với nhóm chỉ dùng giả dược [9]
Nhờ có tác dụng an thần, chiết xuất lạc tiên tây được dùng trong một số trường hợp như bệnh suyễn, nhịp tim bất thường, huyết áp cao… [12] Tuy nhiên cần có thêm những nghiên cứu lâm sàng để xác nhận các đặc tính trị bệnh này
Thử nghiệm trong ống nghiệm (in vitro) cho thấy Passion flower extract diệt được nhiều loại vi khuẩn và nấm gây bệnh [28]
Passion flower được sử dụng trong dân gian như một phương thức “gây hưng phấn, kích thích tình dục” Một nghiên cứu năm 2003 trên chuột cho thấy dịch chiết lạc tiên tây làm tăng hoạt động tình dục, tăng số lượng tinh trùng và khả năng thụ tinh [13] b Công dụng Đọt non ăn được có tác dụng an thần Quả chín ăn được chữa mất ngủ, đau dây thần kinh, đau bụng đi ngoài, kiết lị, trĩ, bại liệt và nhiễm độc Morphin [1].
Tổng quan về isovitexin
Các nghiên cứu thành phần hóa học của Passiflora incarnata L chỉ ra rằng isovitexin là hoạt chất chính với hàm lượng cao nhất trong số các flavonoid Dược điển châu Âu đã đặt ra tiêu chuẩn chất lượng cho Lạc tiên dựa trên hàm lượng flavonoid, cụ thể là xác định điểm trội và quy đổi thành hàm lượng isovitexin Do đó, trong bài viết này, chúng tôi sẽ trình bày một số thông tin về hoạt chất isovitexin.
1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất
Isovitexin có danh pháp IUPAC: 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-6-
[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]chromen-4-one
Công thức cấu tạo của vitexin được thể hiện ở Hình 1.3
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của isovitexin
Khối lượng phân tử: 432,4 g/mol [31]
Isovitexin có nhiều tác dụng dược lý đã được nghiên cứu chứng minh, bao gồm tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm và bảo vệ thần kinh Trong đó, tác dụng điều trị bệnh tiểu đường của isovitexin cũng rất đáng chú ý.
Isovitexin đã được nghiên cứu về tác dụng trong bệnh đái tháo đường và các biến chứng của nó
Phương pháp: Nghiên cứu tổng hợp các kết quả từ các nghiên cứu in vitro và in vivo được thực hiện với các dẫn xuất vitexin và isovitexin liên quan đến bệnh đái tháo đường và các biến chứng
Kết quả: Dữ liệu thu thập được cho thấy vitexin và isovitexin hoạt động qua các con đường chuyển hóa sinh lý bệnh, cũng như có các cơ chế mức độ phân tử liên quan tới biểu hiện lâm sàng của bệnh đái tháo đường [7] b Tác dụng điều trị ung thư
Isovitexin đã được chứng minh là có tác dụng hiệp đồng với các thuốc hóa trị liệu thông thường bằng cách làm tăng nhạy cảm các tế bào đích ung thư (CSC), từ đó giúp cải thiện hiệu quả điều trị
Nghiên cứu này đánh giá toàn diện tiềm năng chống ung thư của apigenin và isovitexin, hai hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong các loại ung thư khác nhau Nghiên cứu xem xét các bằng chứng khoa học hiện có về hoạt động chống ung thư của các hợp chất này và thảo luận về cơ chế tác động tiềm năng của chúng.
Kết quả: Nghiên cứu chứng minh rằng apigenin hoặc isovitexin ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa CSC và làm giảm CSC thông qua các cơ chế khác nhau, bao gồm ức chế đường dẫn tín hiệu Wnt/β-catenin, ức chế sản sinh protein factor-κB và điều hòa chu kỳ tế bào thông qua việc điều hòa lại p21 và các kinase phụ thuộc cyclin [18] c Tác dụng chống nhiễm khuẩn Staphylococcus Aureus
Isovitexin có tiềm năng trở thành một loại thuốc chống nhiễm khuẩn ức chế các loài Staphylococcus Aureus
Phương pháp: Nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính ức chế SrtA của isovitexin bằng cách thông qua các thử nghiệm về ức chế quá liên kết fibrinogen và quá hình thành màng sinh học
Kết quả: Điều trị bằng Isovitexin làm giảm lượng protein tụ cầu nhóm A (SpA) trên bề mặt tế bào [35] d Tác dụng bảo vệ thần kinh
Isovitexin đã được nghiên cứu về tác dụng bảo vệ thần kinh và được chứng minh là có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi bị hư hại do các yếu tố như stress oxy hóa và viêm nhiễm gây ra
Phương pháp: Nghiên cứu bao gồm các thí nghiệm in vitro và in vivo để kiểm tra tác dụng bảo vệ thần kinh của isovitexin
Kết quả: Nghiên cứu cho thấy isovitexin có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương và có khả năng khiến trở thành một phương pháp điều trị được kỳ vọng cho các bệnh thoái hóa thần kinh [14] e Tác dụng chống viêm
Isovitexin đã được phát hiện có đặc tính chống viêm Nó có thể ức chế việc sản xuất các cytokine gây viêm - là những chất thúc đẩy tình trạng viêm
Phương pháp: Nghiên cứu bao gồm việc thử nghiệm tác động của isovitexin đối với tình trạng viêm bằng phương pháp nuôi cấy tế bào
Kết quả: Kết quả cho thấy isovitexin có thể làm giảm viêm một cách hiệu quả, cho thấy tiềm năng sử dụng của nó trong điều trị các bệnh viêm nhiễm Đặc biệt là các bệnh như: viêm loét đại tràng, viêm cầu thận… [19] f Tác dụng chống oxy hóa
Isovitexin đã được tìm thấy có đặc tính chống oxy hóa Nó có thể vô hiệu hóa các gốc tự do có hại trong cơ thể, từ đó ngăn ngừa tổn thương tế bào
Phương pháp: Nghiên cứu bao gồm việc thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa của isovitexin trong các mô hình thí nghiệm khác nhau
Kết quả: Nghiên cứu cho thấy isovitexin có đặc tính chống oxy hóa mạnh, cho thấy tiềm năng sử dụng của nó trong việc ngăn ngừa các bệnh liên quan đến stress oxy hóa [20] g Tác dụng giảm nguy cơ loãng xương
Theo các nghiên cứu trên chuột bị cắt bỏ buồng trứng, Isovitexin cho thấy tác dụng hữu hiệu trong việc làm giảm nguy cơ loãng xương Tác động này được đánh giá là mạnh hơn teriparatide và có khả năng mang lại lợi ích lâu dài trong việc ngăn ngừa và điều trị loãng xương.
Phương pháp: Nghiên cứu bao gồm việc thử nghiệm tác dụng giảm nguy cơ loãng xương của isovitexin ở chuột bị cắt bỏ buồng trứng
Tổng quan cao khô dược liệu Lạc tiên và yêu cầu về chất lượng
1.3.1 Quy trình sản xuất cao khô Lạc tiên
Theo Dược điển châu Âu 11.0, cao khô lạc tiên được chiết xuất từ các bộ phận trên mặt đất của dược liệu lạc tiên, dung môi chiết xuất có thể là hỗn hợp của nước với ethanol, methanol hoặc aceton
Chúng tôi đã tham khảo quy trình sản xuất cao khô lạc tiên trong Luận văn Thạc sĩ:
"Nghiên cứu xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cao khô lạc tiên" của tác giả Khuất Văn Mạnh
Quy trình sản xuất cao khô lạc tiên được tiến hành như sau:
Dược liệu Lạc tiên được đưa qua máy cắt khoảng 5 cm, sau đó cho qua máy rửa sạch, để ráo nước rồi đem sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50 o C
Cho dược liệu vào thiết bị chiết – cô tuần hoàn áp suất giảm và thêm ethanol 60% (tỉ lệ dược liệu : dung môi = 1 : 6) , chiết suất ở nhiệt độ sôi của dung môi Chiết đến khi nhìn thấy ống thủy màu trắng thì ngừng quá trình chiết Thời gian chiết tuần hoàn: 2,5 giờ Dịch chiết được cô cách thủy tới khi có tỉ trọng từ 1,05 – 1,15 Sau đó chuyển toàn bộ dịch vào thiết bị lắng, để yên trong 24 giờ Thu lấy phần dịch, loại bỏ cắn không tan ở đáy bình lắng Tiếp đó, dịch chiết được bơm vào hệ thống cô chân không, cô tới khi thành cao đặc (độ ẩm ≤ 20%) Sấy cao đặc ở nhiệt độ 65 – 70 o C trong tủ sấy tĩnh Trong quá trình sấy thỉnh thoảng đảo cao cho khô đều tới khi thu được cao có độ ẩm dưới 5% thì ngừng sấy Sau khi cao khô, tán và rây qua rây cỡ 0,8 mm Bột mịn thu được đem đóng gói kín, ghi nhãn và bảo quản nơi khô ráo thoáng mát [3]
Về tỉ lệ chiết xuất khối lượng dược liệu : cao khô sẽ tùy thuộc vào đặc điểm thực vật của dược liệu, bộ dùng dùng của cây, dung môi chiết… [2] Dưới đây là thông tin về tỉ lệ chiết xuất dược liệu : cao của một mẫu cao lạc tiên:
- Chiết xuất trong Luận văn Thạc sĩ - tác giả Khuất Văn Mạnh: tỉ lệ 4,5 : 1
- Chiết xuất hãng Greentech: tỉ lệ 2 - 5 : 1 (đạt chứng nhận của EDQM)
- Chiết xuất hãng Euromed: tỉ lệ 4 - 6,5 : 1 (đạt chứng nhận của EDQM)
- Chiết xuất trong thuốc Sedanxio 200mg: tỉ lệ 2 : 1
Mỗi một chế phẩm sẽ có thành phần cao lạc tiên được điều chế khác nhau với tỷ lệ chiết xuất khác nhau [15] Vì vậy, không thể so sánh hàm lượng cao có trong các chế phẩm dựa trên con số khối lượng cao được ghi trên nhãn
Quy trình điều chế cao khô lạc tiên được mô tả qua sơ đồ Hình 1.4 sau [3]:
Hình 1.4 Sơ đồ điều chế cao khô Lạc tiên từ dược liệu Lạc tiên
Hình ảnh cao khô Lạc tiên được trình bày ở Hình 1.5
Hình 1.5 Chiết xuất cao khô lạc tiên Passiflora incarnata L
1.3.2 Hướng dẫn EMEA/CVMP/815/00 về tiêu chuẩn chất lượng cao dược liệu Để đảm bảo chất lượng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu, các tổ chức như WHO, EMEA (Ủy ban đánh giá thuốc châu Âu), và các cơ quan quản lý Y tế các nước đều có hướng dẫn về xây dựng các chỉ tiêu đánh giá Ủy ban đánh giá thuốc châu Âu (EMEA) 2006 đã đưa ra khuyến cáo trong kiểm soát chất lượng các sản phẩm chứa thảo dược lưu hành tại châu Âu Theo hướng dẫn này các dạng cao dược liệu gồm cao khô hoặc cao lỏng, đơn thành phần đến đa thành phần
Các chuyên luận chung cho cao dược liệu được quy định trong Dược điển Châu Âu được đánh giá qua các chỉ tiêu sau đây: Định nghĩa chế phẩm: đưa ra được định nghĩa về nguồn gốc thực vật và dạng chế phẩm (như cao khô hoặc cao lỏng) Tỷ lệ thành phần các dược liệu phải ghi rõ Đặc điểm: đưa ra các đặc điểm cảm quan đặc trưng của chế phẩm thảo dược Định tính: Đánh giá nhận dạng phải cụ thể cho mỗi cao dược liệu, và nên tối ưu để có thể phân biệt được các dược liệu có khả năng thay thế hoặc giả mạo
Các phép thử: Độ ẩm, dung môi tồn dư, giới hạn nhiễm khuẩn, kim loại nặng và các tạp chất khác, phù hợp đối với từng loại dược liệu Định lượng:
Trong trường hợp các cao dược liệu có các thành phần hoạt chất đã biết hoặc có những chất đánh dấu tinh khiết thì phải tiến hành định lượng với quy trình phân tích thích hợp Nếu có thể, một quy trình ổn định, phải đánh giá được thành phần hoạt chất của các dược liệu thành phẩn trong cao Trong trường hợp không có phương pháp nào đánh giá được đặc hiệu hoạt chất thì có thể sử dụng phương pháp đánh giá lượng toàn phần
Trong trường hợp chưa rõ các hoạt chất có trong cao hoặc không có chất đánh dấu hoạt tính của cao, thì có thể định lượng bằng chất đánh dấu phân tích hoặc bằng phương pháp định lượng khác Sự phù hợp của phương pháp định lượng khác được lựa chọn cần phải được biện giải [15]
1.3.3 Tiêu chuẩn chất lượng cao khô Lạc tiên
Trong Dược điển châu Âu đã xây dựng tiêu chuẩn cao khô dược liệu Lạc tiên (P incarnata) như sau: Định nghĩa: Cao khô được sản xuất từ dược liệu Lạc tiên
Yêu cầu hàm lượng: tối thiểu 1,5% tổng số flavonoid, được quy đổi qua hàm lượng isovitexin (C21H20O10; M = 432,4) (chiết xuất cao khô)
Dung môi chiết: Dịch chiết được sản xuất từ thuốc thảo dược bằng phương pháp thích hợp, dung môi có thể sử dụng là ethanol (40-90% V/V), methanol (60% V/V) hoặc aceton (40% V/V)
Hình thức: bột vô định hình, màu nâu lục [33] Định lượng:
Phương pháp: Sắc kí lỏng
Dung môi: H2O : methanol (tỉ lệ 20:80)
+ Mẫu thử: Cho 0,450 g dịch chiết cao dược liệu vào ống nhựa có nắp vặn, thêm
25,0 ml hỗn hợp dung môi Siêu âm trong 40 phút, lắc ống sau mỗi 10 phút và lắc khi kết thúc siêu âm Sau đó, ly tâm trong 5 phút với tốc độ khoảng 9.000 - 10.000 vòng/phút Chuyển dịch nổi phía trên vào vial
+ Đối chiếu (a): Hòa tan 5,0 mg isovitexin chuẩn trong hỗn hợp dung môi, pha loãng thành 50,0 ml bằng dung môi Siêu âm trong 10 phút
+ Đối chiếu (b): Hòa tan 0,5 mg orientin và 0,5 mg homoorientin chuẩn trong hỗn hợp dung môi, pha loãng thành 10,0 ml bằng dung môi Siêu âm trong 10 phút
+ Đối chiếu (c): Pha loãng 1,0 ml dung dịch đối chiếu (a) thành 50,0 ml bằng hỗn hợp dung môi
- Pha tĩnh: Silicagel octadecylsilyl end-capped cho sắc ký R (1,8 μm);
Pha động: Hệ gradient pha động gồm:
- Pha động A: acid formic (TT), nước cho sắc ký R (0,1:100 V/V);
Tốc độ dòng: 0,7 mL/phút
Phát hiện: Máy đo quang phổ ở bước sóng 338nm
Phù hợp hệ thống: Dựa trên độ phân giải của dung dịch chuẩn (b), tối thiểu 3,0 giữa hai pic của orientin và homoorientin
Ngưỡng phát hiện: 0,01% - đối chiếu (c)
Tính toán kết quả: Hàm lượng % tổng số flavonoid được biểu thị bằng isovitexin sử dụng biểu thức sau:
A1: tổng diện tích pic của flavonoid với thời gian lưu trong khoảng từ 0,64 – 1,12 đối với isovitexin trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu;
A2: diện tích pic của isovitexin trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a); m1: khối lượng dược liệu cần để pha dung dịch thử (g); m2: khối lượng isovitexin dùng để pha dung dịch đối chiếu (a) (g); p: hàm lượng % của isovitexin.
Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng
Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra High Performance Liquid Chromatography - UPLC) là phương pháp phát triển từ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhưng sử dụng các cột có kích thước hạt nhỏ và áp suất cao hơn, giúp nâng cao hiệu quả và tăng tốc độ phân tích
Nguyên tắc: UPLC tuân thủ các nguyên tắc cơ bản của sắc ký lỏng truyền thống, dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sự khác biệt quan trọng nằm ở việc sử dụng các cột có kích thước hạt nhỏ hơn đáng kể, nâng cao hiệu quả phân tách [23] Ưu điểm của UPLC so với HPLC:
Tốc độ phân tích của UPLC vượt trội hơn HPLC nhờ vào việc sử dụng hạt phân tích với kích thước nhỏ hơn, tạo điều kiện cho sự phân tách diễn ra nhanh chóng và hiệu quả hơn Điều này đặc biệt có lợi khi phân tích các mẫu có thành phần phức tạp, giúp rút ngắn thời gian phân tích, tăng năng suất và hiệu quả làm việc trong phòng thí nghiệm.
- Độ phân giải: Kích thước hạt nhỏ hơn góp phần mang lại độ phân giải cao hơn, cho phép tách các pic rửa giải gần nhau và mang lại các pic sắc ký sắc nét hơn
- Độ nhạy: UPLC thường tăng cường độ nhạy, đặc biệt thuận lợi cho việc phân tích ở mức độ vết
- Công suất mẫu: Thời gian chạy nhanh hơn và hiệu suất được cải thiện sẽ làm tăng số lượng mẫu được xử lý trong một khung thời gian nhất định [6], [23]
Hệ thống UPLC bao gồm: bơm, hệ thống tiêm mẫu, dectector và cột được thiết kế cho áp suất cao, kích thước hạt nhỏ hơn Hệ thống này được tích hợp liền mạch với các công cụ phân tích khác để thu thập dữ liệu toàn diện [23] Hình 1.6 mô phỏng sơ đồ hệ thống UPLC
Hình 1.6 Cấu tạo máy UPLC Ứng dụng:
- UPLC được ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau, bao gồm dược phẩm, phân tích môi trường và thử nghiệm thực phẩm và đồ uống, trong đó việc phân tách nhanh chóng, chính xác là rất quan trọng, giúp tăng năng suất và giảm chi phí phân tích
- UPLC được ứng dụng trong định tính, định lượng và tinh chế chất phân tích trong nhiều nền mẫu (chế phẩm, dược liệu, dịch sinh học, thực phẩm, môi trường…)
- UPLC có thể được sử dụng trong các ứng dụng sau: lọc nước, phát hiện tạp chất trong ngành dược phẩm, định tính định lượng hoạt chất trong hỗn hợp [23]
1.4.2 Các thông số đặc trưng trong quá trình sắc ký a Hệ số dung lượng k’
Vs: thể tích pha tĩnh
Vm: thể tích pha động
Qs: lượng chất trong pha tĩnh
Qm: lượng chất trong pha động tR: thời gian lưu t’R: thời gian lưu hiệu chỉnh to: thời gian chết Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1 ≤ k’ ≤ 8 b Hệ số chọn lọc 𝜶
𝑡 $' Quy ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên α > 1 Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 c Hệ số đối xứng pic F
Trong đó: W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic d Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột
W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic e Độ phân giải R s
Trong đó: tRB, tRA: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)
WB, WA: độ rộng pic đo ở các đáy pic
W1/2B, W1/2A: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic k’ là thừa số dung lượng trung bình của 2 cấu tử A và B cạnh nhau cần phân tích [5].
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1 Đối tượng Đối tượng nghiên cứu: các hoạt chất nhóm flavonoid trong lạc tiên Đối tượng phân tích: chế phẩm chứa cao khô lạc tiên Passiflora incarnata L
- Isovitexin: Purifa, số lô PRF21030502, hàm lượng 99,47%
- Orientin: Purifa, số lô PRF20070842, hàm lượng 99,42%
- Homoorientin: Purifa, số lô PRF20068241, hàm lượng 99,35%
Do đảm bảo tính bảo mật, tên thương mại của một số chế phẩm không được đề cập trong khóa luận này Tuy nhiên, dạng bào chế và các thông số cần thiết cho quá trình kiểm nghiệm vẫn được cung cấp đầy đủ để phục vụ mục đích nghiên cứu.
- Mẫu cao lạc tiên Euromed: Thông tin về mẫu cao khô dược liệu được nhà sản xuất cung cấp trong bảng dưới đây
Bảng 2.1 Thông tin về mẫu cao khô lạc tiên được nhà sản xuất cung cấp
THÔNG TIN VỀ NGUYÊN LIỆU CAO LẠC TIÊN EUROMED
Thực vật Dược liệu lạc tiên
Bộ phận dùng Phần trên mặt đất được cắt nhỏ, phơi khô của cây lạc tiên Passiflora incanata L
Dư lượng thuốc trừ sâu, kim loại nặng, aflatoxin và giới hạn nhiễm khuẩn (EP 11.0) được thử nghiệm trên thuốc thảo dược
Tuân thủ các giới hạn của EP 11.0
THÔNG SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT
Phương pháp chiết xuất Chiết xuất dựa trên chuyên luận “Extract” của EP 11.0
Tỉ lệ dược liệu : cao khô 4 – 6,5 : 1
40% cao khô dược liệu 58% maltodextrin 2% silica khô dạng keo
Hình dạng và đặc tính Bột mịn, màu nâu nhạt, hút ẩm Định tính (EP 11.0) Tuân thủ phép thử TLC của EP 11.0 Độ ẩm Không quá 5%
Hàm lượng flavonoid quy đổi theo isovitexin (EP 11.0) Ít nhất 1,5%
Dư lượng dung môi chiết Không quá 0,5% ethanol
Giới hạn nhiễm khuẩn Tuân thủ các giới hạn của EP 11.0
BẢO QUẢN: Nơi khô ráo, thoáng mát, trong bao bì kín
- Chế phẩm viên nang: hàm lượng 0,250 g cao lạc tiên Euromed,
- Chế phẩm viên nén: hàm lượng 0,500 g cao lạc tiên Euromed,
- Chế phẩm thuốc Sedanxio: hàm lượng 0,200 g cao lạc tiên (cao tỉ lệ 2:1),
Số lô: 22B01 Hạn dùng: 02/2025 (Tilman, Bỉ)
- Acetonitril, methanol loại dùng cho sắc ký lỏng (Merck, Đức); formic acid
- Nước cất 2 lần (dùng ngay sau khi cất)
2.1.4 Thiết bị - dụng cụ a Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng Agilent Technologies Series 1260 Infinity II với detector DAD và phần mềm OpenLAB (Agilent, Mỹ)
- Cột sắc ký: ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm ì 2,1 mm; 1,8 àm)
- Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Elma, Đức)
- Máy lắc xoáy Labinco L46 (Đài Loan)
- Cân phân tích A&D, Model GR – 200 (Nhật Bản), d = 0,1 mg
- Máy ly tâm KUBOTA 6500 (Nhật Bản)
- Máy đo độ ẩm Karl - Fischer HI931 (Hanna, Ý) b Dụng cụ
- Micropipet loại 10 – 100 àl Nichipipet ABMATE pro và loại 100 – 1000 àl Nichipet14 EX (Ba Lan)
- Đầu cụn cho micropipet (loại 10 - 100 àL và 100 – 1000 àL)
- Ống falcon 50 ml, ống vial dùng cho hệ thống sắc ký
- Các dụng cụ thuỷ tinh khác: đũa thủy tinh, cốc có mỏ, bình nón, pipet chính xác 10 ml, bình định mức, ống nghiệm thủy tinh (Trung Quốc).
Nội dung nghiên cứu
- Xây dựng phương pháp phân tích flavonoid trong chế phẩm chứa cao khô lạc tiên
Passiflora incarnata L bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC, tham khảo EP 11.0
- Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp theo hướng dẫn của ICH và AOAC (2016) [22] [8]
- Ứng dụng phương pháp trên định lượng flavonoid trong một số chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên Passiflora incarnata L.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Chuẩn bị mẫu chạy sắc ký
Dựa vào chuyên luận “Passionflower Herb Dry Extract” trong Dược điển Châu Âu
- European Pharmacopoeia 11 và dựa trên điều kiện thực tế tại phòng thí nghiệm, chúng tôi thực hiện quy trình xử lý mẫu như sau:
Hỗn hợp dung môi pha mẫu: nước : methanol (tỉ lệ 20:80) a Dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn gốc isovitexin (a): Hòa tan 6,0 mg isovitexin chuẩn trong hỗn hợp dung môi pha mẫu, pha loãng thành 50,0 ml bằng dung môi Siêu âm trong 10 phút Nồng độ của dung dịch chuẩn gốc được tính trong bảng dưới đây:
Bảng 2.2 Thông số thực nghiệm của mẫu chuẩn gốc isovitexin
Hàm ẩm %HL m cân thực tế C% (mg/ml)
- Dung dịch chuẩn orientin – homoorientin (b): Hòa tan 0,5mg orientin và 0,5mg homoorientin chuẩn trong hỗn hợp dung môi, pha loãng thành 10.0ml bằng dung môi Siêu âm trong 10 phút
- Dung dịch chuẩn isovitexin (c): Pha loãng 1,0 ml dung dịch chuẩn isovitexin (a) thành 100,0 ml bằng hỗn hợp dung môi b Dung dịch thử
Cân lượng chế phẩm tương đương với khoảng 0.090g cao khô dược liệu, thêm 10.0ml hỗn hợp dung môi Siêu âm 40 phút, lắc ống mỗi 10 phút và lắc khi kết thúc siêu âm Ly tâm 5 phút, tốc độ 3.000 vòng/phút Chuyển dịch phía trên vào vial
Khối lượng cân từng mẫu thử đã được tính toán để đạt tương đương với 0.090g cao khô dược liệu, thông tin tính được có trong Bảng 2.3 sau:
Bảng 2.3 Khối lượng cân các mẫu thử
Chế phẩm Khối lượng viên
HL cao dược liệu/viên
Khối lượng cân ~0.090g cao dược liệu
2.3.2 Điều kiện sắc ký Điều kiện sắc ký được chúng tôi tham khảo theo chuyên luận “Passionflower Herb Dry Extract” trong Dược điển Châu Âu - European Pharmacopoeia 11 Theo đó, các điều kiện sắc ký được tiến hành như sau:
- Pha tĩnh: Silicagel octadecylsilyl end-capped (1,8 μm);
- Pha động A: acid formic : nước (0,1:100 V/V);
Bảng 2.4 Chương trình gradient pha động theo EP 11.0
Tốc độ dòng: 0,7 mL/phút
Quang phổ: phát hiện tại bước sóng 338nm
Xác định pic: Sử dụng sắc ký đồ của dung dịch chuẩn isovitexin để xác định, lựa chọn các pic flavonoid với thời gian lưu tương đối từ 0,64 – 1,12 so với isovitexin
Phù hợp hệ thống: Dựa trên độ phân giải của dung dịch chuẩn (b), tối thiểu 3.0 giữa hai pic của orientin và homoorientin
Ngưỡng phát hiện: 0,01% - dung dịch chuẩn isovitexin (c)
2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại của phương pháp theo ICH và AOAC (2016) [22] [8] a) Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử; xác định khả năng định tính và định lượng chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác trong mẫu
Cỏch tiến hành: Tiờm 2,0 àL mỗi dung dịch mẫu chuẩn isovitexin, mẫu cao dược liệu, mẫu thử và placebo vào hệ thống sắc ký và ghi nhận lại sắc ký đồ
Kết quả đạt tiêu chuẩn nếu phù hợp các yêu cầu:
- Sắc ký đồ của mẫu giả dược (placebo) không xuất hiện pic sắc ký
- Sắc ký đồ giữa mẫu thử, mẫu cao dược liệu và mẫu chuẩn cho pic tương ứng với thời gian lưu
Theo hướng dẫn của ICH và AOAC, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu trung bình giữa mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu cao dược liệu phải nằm trong giới hạn cho phép Độ phù hợp hệ thống đánh giá sự ổn định của toàn bộ hệ thống phân tích, bao gồm cả máy móc và thiết bị, giúp đảm bảo độ tin cậy của kết quả phân tích.
Cách tiến hành: Tiêm 6 lần liên tiếp dung dịch mẫu chuẩn isovitexin vào hệ thống sắc ký Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích Ngoài ra, theo EP 11.0, độ phù hợp cần đạt độ phân giải tối thiểu 3,0 giữa hai pic orientin và homoorientin khi phân tích dung dịch chuẩn orientin – homoorientin (b)
Kết quả đạt tiêu chuẩn nếu phù hợp các yêu cầu:
- Số đĩa lý thuyết N ≥ 4000 đĩa
- Độ phân giải > 3,0 giữa hai pic orientin và homoorientin c) Khoảng tuyến tính Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định Nó được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b với hệ số tương quan r
Cách tiến hành: Pha dãy chuẩn có các nồng độ khác nhau f0, f2, f5, f10, f20, f50, f100 để xác định khoảng tuyến tính Tiến hành tiêm mẫu, vẽ đồ thị khảo sát sự tương quan giữa đại lượng y (diện tích pic mỗi mẫu dung dịch chuẩn) và x (nồng độ isovitexin)
Kết quả đạt yêu cầu nếu giá trị của hệ số tương quan: 0,99 ≤ R 2 ≤ 1
+ Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Y ≤ 15% trong đó:
Riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn 20% d) Độ chính xác Độ lặp lại Độ lặp lại là mức độ gần nhau giữa các kết quả riêng lẻ của các phép đo theo đúng quy trình thử nghiệm được lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)
Cách tiến hành: Tiêm sắc ký 6 dung dịch mẫu thử và tính % hàm lượng flavonoid trong chế phẩm
Yêu cầu: RSD ≤ 3,7% theo AOAC (2016) Độ chính xác trung gian
Xác định giá trị trung bình và % độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) của hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu bằng cách thực hiện tương tự như độ lặp lại nhưng khác ngày phân tích.
Kết quả đạt tiêu chuẩn nếu đạt yêu cầu %RSD theo AOAC e) Độ đúng Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Độ thu hồi là tỷ lệ phần trăm giữa các giá trị thu được so với giá trị lý thuyết
Cách tiến hành: Thêm chính xác 0,5ml dung dịch isovitexin chuẩn nồng độ 0,1160 mg/ml (~4% lượng flavonoid toàn phần) vào các mẫu viên nang, viên nén, mỗi loại chuẩn bị 6 mẫu Sau đú, xử lý mẫu, tiờm 2,0 àL cỏc dung dịch mẫu vào hệ thống sắc ký Dựa vào kết quả thu được, tính % tỷ lệ độ phục hồi của các mẫu thử tại mỗi nồng độ
Yêu cầu: Độ thu hồi trong khoảng từ 95 - 105% RSD (%) đạt theo quy định tại
2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu
Theo Dược điển châu Âu (EP 11.0), phương pháp định lượng flavonoid toàn phần bằng cách lựa chọn các pic lấy trong khoảng 0,64 – 1,12 so với thời gian lưu của isovitexin và so sánh điểm với mẫu chuẩn isovitexin, chúng tôi lựa chọn so sánh điểm tại nồng độ f2
%HL flavonoid được tính bằng cách so sánh với diện tích pic isovitexin:
(sau đây viết tắt fla = flavonoid, iso = isovitexin)
(với p là % hàm lượng isovitexin trong chuẩn)
%HL cao lạc tiên so với nhãn trong chế phẩm được tính thông qua quy đổi từ hàm lượng flavonoid có trong mẫu cao lạc tiên nguyên liệu:
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT
Chuẩn bị các mẫu dung dịch
Mẫu dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc isovitexin (a), pha dãy mẫu chuẩn có các nồng độ khác nhau với độ pha loãng lần lượt f2, f5, f10, f20, f50, f100 bằng hỗn hợp dung môi nước : methanol (tỉ lệ 20:80)
Các mẫu dung dịch thử: Mẫu thử viên nang, mẫu thử viên nén, mẫu placebo viên nang, mẫu placebo viên nén, mẫu cao khô lạc tiên
Cân chính xác khoảng khối lượng bột chế phẩm tương đương 0.090g cao khô dược liệu (đã tính toán với từng mẫu ở Bảng 2.3) cho vào ống falcon, thêm 10.0ml hỗn hợp dung môi nước : methanol (tỉ lệ 20:80) Siêu âm 40 phút, lắc ống mỗi 10 phút và lắc khi kết thúc siêu âm Ly tâm 5 phút, tốc độ 3.000 vòng/phút Chuyển dịch phía trên vào vial.
Điều kiện sắc ký
Dựa trên chương trình sắc ký tại chuyên luận “Passionflower Herb Dry Extract”- Dược điển Châu Âu, kết hợp với điều kiện thực nghiệm tại phòng thí nghiệm, chúng tôi khảo sát các điều kiện sắc ký và chương trình gradient pha động phù hợp với quá trình chạy mẫu như sau:
Cột sắc ký: ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm ì 2,1 mm; 1,8 àm) (Waters, Mỹ) Pha động: Acid formic : nước (0,1:100 V/V) – acetonitril – methanol
Bảng 3.1 Chương trình gradient pha động
Detector: DAD, bước sóng phát hiện 338 nm
Tốc độ dũng: 0,7 ml/phỳt Thể tớch tiờm: 2 àl
Chương trình sắc ký này có thành phần pha động, tỷ lệ pha động và gradient pha động từ 0 – 26,5 phút, giống trong chuyên luận “Passionflower Herb Dry Extract” EP 11
Chúng tôi đã thêm phần gradient từ 26,5 – 40,0 phút để rửa giải các chất lưu giữ tốt trong cột và ổn định pha động về điều kiện ban đầu Tổng thời gian phân tích 40 phút Chúng tôi lựa chọn điều kiện này và tiến hành thẩm định phương pháp.
Thẩm định phương pháp phân tích
3.3.1 Độ phù hợp hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần mẫu chuẩn isovitexin nồng độ 0,1160 mg/ml và ghi lại giá trị thời gian lưu, diện tích pic Độ phù hợp hệ thống được đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic Đồng thời, tiêm mẫu chuẩn orientin – homoorientin (b) để đánh giá độ phân giải giữa hai pic của hoạt chất này Kết quả các lần tiêm mẫu chuẩn isovitexin được ghi ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả tiêm lặp lại mẫu chuẩn isovitexin
Lần tiêm t (phút) S (mAU.s) Số đĩa lý thuyết
RSD 0,12 0,3 Đạt (< 1%) (< 2%) Độ phân giải mẫu chuẩn orientin – homoorientin (b): R s = 4.07 (>3.0%) Sắc ký đồ mẫu chuẩn orientin – homoorientin (b) có ở Hình 3.1
Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn orientin – homoorientin
Ref-off I 2302:230or-homo EP-2.dx
Retention time {mini u njection Results X
Kết quả nghiên cứu cho thấy hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng và các điều kiện sắc ký được chọn đã phù hợp, đảm bảo tính ổn định của quá trình phân tích định lượng các hợp chất flavonoid trong chế phẩm.
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn isovitexin 0,0192 mg/ml (f5), mẫu cao khô lạc tiên, mẫu thử chế phẩm (nang-nén) và mẫu placebo (nang-nén) theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn Các sắc ký đồ thu được ở Hình 3.2 (A, B, C, D, E, F) và kết quả ở Bảng 3.3
Hình 3.2A Sắc ký đồ mẫu chuẩn isovitexin
Hình 3.2B Sắc ký đồ mẫu cao khô lạc tiên
Hình 3.2C Sắc ký đồ mẫu thử viên nang
Hình 3.2D Sắc ký đồ mẫu thử viên nén
Hình 3.2E Sắc ký đồ mẫu placebo viên nang
Hình 3.2F Sắc ký đồ mẫu placebo viên nén Hình 3.2 Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu
Bảng 3.3 Thời gian lưu của các mẫu thẩm định độ đặc hiệu
Mẫu Thời gian lưu pic isovitexin (phút) RSD (%)
Mẫu cao khô lạc tiên 23,708
- Kết quả thu được cho thấy pic isovitexin của mẫu chuẩn xuất hiện tại thời gian lưu tR~23,7 phút
- Trên sắc ký đồ mẫu placebo, không thấy xuất hiện tín hiệu pic tại thời gian lưu này
- Trên sắc ký đồ mẫu cao khô lạc tiên các mẫu thử đều có tín hiệu pic tại thời gian này Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu trung bình giữa mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu cao khô lạc tiên đạt 0.189% Điều này chứng tỏ, phương pháp có độ đặc hiệu với chất phân tích trong chế phẩm
Chuẩn bị một dãy gồm các dung dịch mẫu chuẩn isovitexin có nồng độ từ 0,0012 mg/ml đến 0,1160 mg/ml rồi tiến hành chạy sắc ký Kết quả khảo sát đường chuẩn và phương trình hồi quy được trình bày dưới đây
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
Spic(mAu.s) 978,91 488,75 203,21 101,01 50,51 21,27 12,30 Phương trình hồi quy y = 8409,1x + 3,0182 R² = 0,9999
Hình 3.2 Đường chuẩn và phương trình hồi quy của isovitexin Bảng 3.5 Kết quả nồng độ mẫu chuẩn isovitexin tính lại từ đường chuẩn
Nồng độ tìm lại (mg/ml) Độ chệch (%)
Kết quả khảo sát cho thấy với khoảng nồng độ từ 0,0012 mg/ml đến 0,1160 mg/ml có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic (y) và nồng độ của isovitexin (x) thể hiện qua phương trình hồi quy tuyến tính: y = 8409,1x + 3,0182 (hệ số tương quan r = 0,9999) Độ chệch giữa các điểm nồng độ đạt yêu cầu theo AOAC (≤ 15%)
Kết luận: Phương pháp đã khảo sát có khoảng tuyến tính đạt yêu cầu
3.3.4 Độ chính xác a) Độ lặp lại
Theo Dược điển châu Âu (EP 11.0), các pic flavonoid được lựa chọn để tính tổng lượng flavonoid toàn phần lấy trong khoảng 0,64 – 1,12 so với thời gian lưu của isovitexin
Cân 6 mẫu chế phẩm nang/nén khác nhau theo khối lượng đã tính toán Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình, tiêm vào hệ thống sắc ký, lựa chọn pic flavonoid phù hợp và tính giá trị trung bình Độ lặp lại được đánh giá thông qua % RSD (độ lệch chuẩn tương đối) hàm lượng flavonoid trong mẫu thử.
Bảng 3.6 Kết quả độ lặp lại mẫu viên nang
Tổng diện tích pic flavonoid (mAu.s) m flavonoid (mg)
Bảng 3.7 Kết quả độ lặp lại mẫu viên nén
Tổng diện tích pic flavonoid (mAu.s) m flavonoid (mg)
Kết quả khảo sát cho thấy, các mẫu chế phẩm viên nang có (HL = 0,927%, RSD 2,30%), mẫu chế phẩm viên nén có (HL = 0,867 mg/g, RSD = 2,15%)
Theo quy định của AOAC 2016, phương pháp đạt tiêu chí độ lặp lại khi độ lệch chuẩn tương đối của hàm lượng nhỏ hơn 3,7% Như vậy phương pháp có độ lặp lại tốt b) Độ chính xác trung gian
Thực hiện tương tự độ lặp lại, nhưng làm trong ngày phân tích khác so với các mẫu độ lặp lại Kết quả của mẫu viên nén và viên nang được trình bày ở Bảng 3.8 và Bảng 3.9
Bảng 3.8 Kết quả độ chính xác trung gian mẫu viên nang
Tổng diện tích pic flavonoid (mAu.s) m flavonoid (mg)
Bảng 3.9 Kết quả độ chính xác trung gian mẫu viên nén
Tổng diện tích pic flavonoid (mAu.s) m flavonoid (mg)
Kết quả khảo sát cho thấy, các mẫu chế phẩm viên nang có (HL = 0,927%, RSD 2,30%), mẫu chế phẩm viên nén có (HL = 0,867 mg/g, RSD = 2,15%)
Theo quy định của AOAC 2016, phương pháp đạt tiêu chí độ lặp lại khi độ lệch chuẩn tương đối của hàm lượng nhỏ hơn 3,7% Như vậy phương pháp có độ lặp lại tốt
Chuẩn bị 6 mẫu thử viên nang, viên nén và thêm chính xác 0,50 ml dung dịch chuẩn isovitexin nồng độ 0,1160 mg/ml vào mỗi mẫu (lượng flavonoid toàn phần chiếm khoảng 4%) Sau khi xử lý mẫu, tiêm 2,0 μL dung dịch mẫu vào hệ thống sắc ký để tiến hành phân tích.
Nồng độ isovitexin được xác định từ đường chuẩn Kết quả được tổng hợp trong
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng mẫu viên nang
Tổng diện tích pic (mAu.s) m flavonoid (mg)
Lượng chuẩn tìm lại (mg) Độ thu hồi (%)
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ đúng mẫu viên nén
Tổng diện tích pic (mAu.s) m flavonoid (mg)
Lượng chuẩn tìm lại (mg) Độ thu hồi (%)
Nhận xét: Độ thu hồi nằm trong khoảng 95 - 105% Như vậy phương pháp đạt độ đúng theo hướng dẫn của AOAC (2016).
Ứng dụng xác định hàm lượng flavonoid trong chế phẩm
Áp dụng phương pháp trên định lượng flavonoid trong 2 mẫu chế phẩm viên nang, viênnén chứa cao lạc tiên Euromed và 1 mẫu thuốc Sedanxio 200 mg (Tilman, số lô 22B01, hạn dùng 05/2025)
Cân lượng chế phẩm tương đương với khoảng 0.090g cao khô dược liệu, thêm 10.0ml hỗn hợp dung môi Siêu âm 40 phút, lắc ống mỗi 10 phút và lắc khi kết thúc siêu âm Ly tâm 5 phút, tốc độ 3.000 vòng/phút Chuyển dịch phía trên vào vial
Khối lượng cân từng mẫu chế đã được tính toán để đạt tương đương với 0.090g cao khô dược liệu, thông tin tính được có trong Bảng 3.12
Bảng 3.12 Khối lượng cân các mẫu chế phẩm định lượng flavonoid
Chế phẩm Khối lượng viên
HL cao dược liệu/viên
Khối lượng cân ~0.090g cao dược liệu
Kết quả được định lượng được trình bày trong Bảng 3.13
Bảng 3.13 Kết quả định lượng flavonoid trong các mẫu chế phẩm
Tổng diện tích pic flavonoid (mAu.s) m flavonoid (mg)
Chế phẩm viên nang và viên nén có cùng thành phần cao Euromed nguyên liệu nhưng cho kết quả định lượng flavonoid chênh lệch nhau
Thuốc Sedanxio 200 mg sử dụng cao thành phần khác (tỉ lệ cao 2:1) nên dù hàm lượng thấp hơn mẫu viên nang 250 mg nhưng vẫn có hàm lượng flavonoid cao hơn ð Không thể so sánh hàm lượng flavonoid của các mẫu chế phẩm dựa trên hàm lượng cao lạc tiên thành phần.
Xác định hàm lượng cao khô lạc tiên có trong các mẫu chế phẩm
Mẫu cao khô lạc tiên chính là nguyên liệu thành phần trong công thức của các chế phẩm viên nang, viên nén của nhà cung cấp Vì vậy, để định lượng được hàm lượng cao lạc tiên có trong các chế phẩm, trước tiên cần phải biết hoặc tính toán được hàm lượng flavonoid có trong mẫu cao khô lạc tiên nguyên liệu này
Do không có thông tin về %flavonoid và hàm ẩm của cao nguyên liệu nên chúng tôi đã xác định hàm ẩm của nguyên liệu theo phương pháp Karl - Fischer Tiến hành 2 lần đo độ ẩm của mẫu cao khô lạc tiên theo phương pháp này cho kết quả trung bình là 5,93% Để xác định %flavonoid trong mẫu cao nguyên liệu, chúng tôi đã ứng dụng phương pháp phân tích flavonoid được thẩm định ở trên Kết quả cụ thể như sau:
3.5.1 Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong mẫu cao khô lạc tiên
Cân chính xác khoảng 0.090g mẫu cao khô lạc tiên cho vào ống falcon, thêm 10.0ml hỗn hợp dung môi nước : methanol (tỉ lệ 20:80) Siêu âm 40 phút, lắc ống mỗi 10 phút và lắc khi kết thúc siêu âm Ly tâm 5 phút, tốc độ 3.000 vòng/phút Chuyển dịch nổi phía trên vào vial
Tiến hành phân tích HPLC trên 3 mẫu cao khô lạc tiên theo quy trình đã xây dựng, xác định và tính toán hàm lượng flavonoid trong các mẫu дослі nghiệm.
Bảng 3.14 Hàm lượng flavonoid của mẫu cao khô lạc tiên
Mẫu cao khô lạc tiên
Tổng diện tích pic (mAu.s) m flavonoid (mg) Độ ẩm (%)
Nhận xét: Hàm lượng flavonoid trung bình trong mẫu cao khô dược liệu là 1,71%, đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn tại chuyên luận “Passionflower Herb Dry Extract” trong Dược điển Châu Âu - European Pharmacopoeia 11 ( ≥ 1.5%)
3.5.2 Xác định hàm lượng cao khô lạc tiên trong mẫu viên nang, viên nén
Dựa trên kết quả hàm lượng flavonoid trong mẫu cao khô lạc tiên ở trên, chúng tôi tính toán lại hàm lượng cao khô có trong từng mẫu thử viên nang, viên nén và so sánh kết quả này với hàm lượng ghi trên nhãn để đánh giá chỉ tiêu chất lượng chế phẩm a) Chế phẩm viên nang (chứa 0.250 g cao lạc tiên, M viên = 0.450 g)
Kết quả tính lại hàm lượng cao khô lạc tiên của 12 mẫu thử viên nang được tính toán trong Bảng 3.15
Bảng 3.15 Hàm lượng cao lạc tiên so với nhãn của chế phẩm viên nang
Mẫu viên nang m cân (g) m flavonoid
1 viên nang (mg) m cao lạc tiên/
NANG6 0,1629 1,4908 4,118 0,2413 96,5 b) Chế phẩm viên nén (chứa 0.500 g cao lạc tiên, M viên = 0.800 g)
Kết quả tính lại hàm lượng cao khô lạc tiên của 12 mẫu thử viên nang được tính toán trong Bảng 3.16
Bảng 3.16 Hàm lượng cao lạc tiên so với nhãn của chế phẩm viên nén
Mẫu viên nén m cân (g) m flavonoid
1 viên nén (mg) m cao lạc tiên/
Kết luận: Kết quả định lượng bước đầu cho thấy hàm lượng cao lạc tiên ở mẫu viên nang đạt yêu cầu (95-105%) so với nhãn, mẫu viên nén chưa đạt yêu cầu.
Bàn luận
3.6.1 Xây dựng, thẩm định phương pháp định lượng flavonoid trong chế phẩm
Về việc lựa chọn điều kiện sắc ký
Phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này được tham khảo từ Chuyên luận
“Passiflower Herb Dry Extract” trong EP 11.0
Không như các phương pháp thông thường khác, phương pháp theo EP không đánh giá qua một hay một vài chất đối Trong chuyên luận này, chất lượng của cao lạc tiên được đánh giá thông qua hàm lượng flavonoid, dựa trên việc so sánh diện tích pic của các flavonoid có thời gian lưu tỷ đối trong khoảng 0,64 – 1,12 so với pic isovitexin
Bài luận chỉ đề cập đến việc sử dụng ba hợp chất chuẩn là isovitexin, orientin và homoorientin, không xác định các đỉnh flavonoid khác Các đỉnh flavonoid này được xác định dựa trên thời gian lưu tương đối so với isovitexin Do đó, nếu thay đổi điều kiện sắc ký như pha tĩnh hoặc pha động có thể dẫn đến thay đổi thứ tự giải ly của các flavonoid và diện tích các đỉnh này.
Khi đó, chúng ta sẽ không xác định được giá trị tỉ đối của các pic flavonoid so với isovitexin Vì vậy, phương pháp cần được thực hiện chính xác theo các điều kiện của EP
Về việc lựa chọn phương pháp Sắc ký lỏng siêu hiệu năng Để sử dụng được pha tĩnh, pha động như trong chuyên luận “Passiflower Herb Dry Extract” trong EP 11.0, thiết bị sắc ký lỏng cần phải có khả năng chịu được áp suất cao vì hạt nhồi là rất nhỏ (1,8 um) Do đó, thiết bị UPLC với khả năng chịu áp đến 800 bar được sử dụng trong nghiên cứu này là phù hợp
Phương pháp định lượng flavonoid trong cao lạc tiên của EP 11.0 sử dụng hệ pha động 0,01% formic acid – acetonitril – methanol Đây là hệ pha động sử dụng hoá chất thông dụng
Phương pháp xây dựng sở hữu khoảng tuyến tính rộng, thích hợp áp dụng định lượng các chế phẩm lạc tiên tương tự trên thị trường Các tiêu chí thẩm định khác như độ đặc hiệu, độ đúng và độ lặp lại đều đảm bảo, đáp ứng yêu cầu phân tích.
Về ảnh hưởng của placebo trên nền mẫu Điểm thuận lợi trong nghiên cứu này là theo công thức bào chế của nhà sản xuất viên nén và viên nang chứa cao lạc tiên Euromed được nghiên cứu, placebo sử dụng trong chế phẩm không chứa flavonoid Điều này đã được chứng minh khi thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp, trong mẫu placebo của viên nén và viên nang đều không xuất hiện pic nào trùng thời gian lưu với các pic flavonoid
Với mẫu chế phẩm Sedanxio 200 mg mua ngoài thị trường, không có mẫu cao lạc tiên nguyên liệu và không có thông tin về placebo Chính vì điều này nên chưa thể đưa ra kết quả phân tích chắc chắn vì không đánh giá được ảnh hưởng của placebo lên các pic flavonoid, đồng thời cũng không thể tính toán hàm lượng cao lạc tiên so với nhãn của mẫu này
3.6.2 Kiểm nghiệm chế phẩm chứa cao dược liệu
Từ hàm lượng flavonoid trong chế phẩm và hàm lượng flavonoid trong mẫu cao lạc tiên nguyên liệu, đề tài đã đề xuất cách xác định được hàm lượng của cao lạc tiên trong chế phẩm so với nhãn
Tuy nhiên, thông tin hàm lượng flavonoid trong cao lạc tiên nguyên liệu không được công bố trên nhãn sản phẩm, do đó sẽ khó khăn cho cơ quan quản lý và nhà phân tích trong việc xác định chính xác hàm lượng cao lạc tiên trong các chế phẩm này khi không có mẫu cao nguyên liệu
Quy trình sản xuất cao lạc tiên với tỷ lệ chiết với dung môi dao động, tạo ra các dạng cao có tỷ lệ dược liệu : cao khác nhau Do đó, không thể áp dụng được hàm lượng flavonoid từ mẫu nguyên liệu cao chế phẩm này sang mẫu khác Giá trị hàm lượng flavonoid trong các chế phẩm có thể khác nhau và giá trị này không phản ánh được hàm lượng cao lạc tiên so với nhãn
Thành phần cao lạc tiên nguyên liệu có độ phức tạp và tỉ lệ chiết xuất không cố định Điều này gây khó khăn trong quá trình phân tích và định lượng hàm lượng hoạt chất trong các lô sản phẩm khác nhau.
Vì vậy, mỗi một lô chế phẩm cần có thông tin chính xác về hàm lượng flavonoid trong cao lạc tiên mới có thể dễ dàng kiểm nghiệm được chế phẩm
Trong nghiên cứu này sử dụng đúng mẫu nguyên liệu cao lạc tiên được dùng để sản xuất chế phẩm nên đã tính được hàm lượng của cao lạc tiên so với nhãn Kết quả cho thấy viên nang có hàm lượng kết quả cao, đạt yêu cầu còn viên nén có hàm lượng kết quả thấp.