Ứng dụng phương pháp phân tích để phân tích hàm lượng một số kháng sinh diệt cầu trùng trong thực phẩm .... Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều phương pháp xác định và phân tích hàm lượn
TỔNG QUAN
Tổng quan về kháng sinh có tác dụng diệt cầu trùng
Bệnh cầu trùng (Coccidiosis) là một bệnh ký sinh ở đường ruột của động vật do kí sinh trùng đơn bào gây ra Bệnh lây lan từ động vật này sang động vật khác do tiếp xúc với phân bị nhiễm bệnh hoặc ăn phải mô bị nhiễm bệnh Triệu chứng chính của bệnh là tiêu chảy, có thể ra máu trong trường hợp bệnh nặng Động vật còn non hoặc bị suy giảm miễn dịch có thể bị các triệu chứng nghiêm trọng và tử vong
Mặc dù bệnh cầu trùng có thể lây nhiễm sang nhiều loài động vật khác nhau, bao gồm cả con người, chim và gia súc nhưng chúng thường đặc trưng cho từng loài Đối với gia cầm, bệnh thường xảy ra khi nuôi trong môi trường ẩm ướt với mật độ cao và là nguyên nhân chính làm giảm năng suất chăn nuôi gia cầm (đặc biệt ở gà) [14] Ở Việt Nam, bệnh cầu trùng là căn bệnh phổ biến trên gà, hầu như đàn gà nào cũng khó tránh khỏi, đặc biệt là trong chăn nuôi gà công nghiệp và gà được nuôi ở chuồng nền Bệnh không gây tỉ lệ chết cao như các bệnh truyền nhiễm khác nhưng gây thiệt hại lớn về kinh tế do khiến gà chậm lớn, tăng chi phí thức ăn, thuốc điều trị và làm suy giảm miễn dịch ở gà khiến gà dễ mắc các bệnh truyền nhiễm khác [31]
Năm 1948, sulfaquinoxalin - một kháng sinh thuộc nhóm sulfonamid được giới thiệu thương mại dưới dạng thuốc điều trị bệnh cầu trùng cho gia cầm Sulfaquinoxalin có hoạt tính chống lại kí sinh trùng sốt rét Plasmodium spp và có thời gian bán hủy trong huyết tương dài nhưng có độc tính cao đối với con người Sau đó, loại thuốc này được phát hiện có tác dụng ưu việt hơn trong việc chống lại một loại kí sinh trùng khác,
Eimeria spp., được biết đến là tác nhân gây bệnh cầu trùng ở gà [12]
Một số kháng sinh khác thuộc nhóm này cũng có tác dụng diệt cầu trùng như: sulfadiazin, sulfamerazin, sulfamethazin, succinylsulfathiazol…Các kháng sinh này được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi nhờ giá thành rẻ cũng như hiệu quả diệt cầu trùng mạnh Tuy nhiên, việc lạm dụng sulfonamid dẫn tới tồn dư các chất này ở mức nồng độ đáng kể trong sản phẩm có nguồn gốc động vật và có thể trở thành mối nguy hiểm cho người tiêu dùng Việc tiêu thụ các sản phẩm nhiễm dư lượng có thể dẫn đến phản ứng dị ứng, tương tác thuốc - thuốc, nguy cơ phá vỡ hệ vi sinh vật bình thường trong ruột [25], [33], ngộ độc, gây ung thư và gây quái thai [35]
Kháng sinh diệt cầu trùng được chia làm hai nhóm: nhóm coccidiostats ionophore (Lasalocid, Maduramicin, Monensin, Salinomycin, Semduramicin, Narasin) - những hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ sản phẩm trao đổi chất của Streptomyces spp và Actinomadura spp [10] và nhóm coccidiostats tổng hợp (Diclazuril, Decoquinat,
Halofuginon, Nicarbazin, Robenidin) - những chất được tổng hợp nhờ phản ứng hóa học [15] Nhóm nghiên cứu đã lựa chọn 4 kháng sinh diệt cầu trùng gồm có 3 kháng sinh thuộc nhóm coccidiostats tổng hợp (Diclazuril, Nicarbazin, Robenidin) và 1 kháng sinh thuộc nhóm coccidiostast ionophore (Salinomycin) để tiến hành xây dựng phương pháp phân tích
Hình 1 1 Công thức cấu tạo của Diclazuril
Danh pháp IUPAC: 2 - (4 - Chlorophenyl) - 2 - [2, 6 - dichloro - 4 - (3, 5 - dioxo - 1,2,4 - triazin - 2 - yl) phenyl] acetonitril
Công thức phân tử: C17H9Cl3N4O2
Khối lượng phân tử: 407,64 g/mol
Hằng số phân ly: pKa = 5,89
Có dạng tinh thể màu trắng, vàng nhạt hoặc cam nhạt
Hình 1 2 Công thức cấu tạo của Nicarbazin
Danh pháp IUPAC: 1, 3 - Bis (4 - nitrophenyl) urea - 4, 6 - dimethyl - 1H - pyrimidin - 2 - one
Khối lượng phân tử: 426,38 g/mol
Dạng bột màu vàng nhạt
Hình 1 3 Công thức cấu tạo của Robenidin
Danh pháp IUPAC: 1, 2 - Bis [(4 - chlorophenyl) methyleneamino] guanidin Công thức phân tử: C15H13Cl2N5
Khối lượng phân tử: 334,1 g/mol
Hình 1 4 Công thức cấu tạo của Salinomycin
Danh pháp IUPAC: (2R) - 2 - [(2R, 5S, 6R) - 6 - [(2S, 3S, 4S, 6R) - 6 - [(3S, 5S, 7R, 9S, 10S, 12R, 15R) - 3 - [(2R, 5R, 6S) - 5 - ethyl - 5 - hydroxy - 6 - methyloxan - 2 - yl]
- 15 - hydroxy - 3, 10, 12 - trimethyl - 4, 6, 8 - trioxadispiro [4.1.5 7 3 5 ] pentadec - 13 - en - 9 - yl] - 3 - hydroxy - 4 - methyl - 5 - oxooctan - 2 - yl] - 5 - methyloxan - 2 - yl] butanoic acid
Khối lượng phân tử: 750,1 g/mol
Dạng tinh thể màu trắng.
Tình hình sử dụng và quy định sử dụng kháng sinh diệt cầu trùng trong chăn nuôi
Theo FAO (Food and Agriculture Organization) và WHO (World Health Organization), hàm lượng kháng sinh diệt cầu trùng tồn dư tối đa (MRLs) trong các sản phẩm từ động vật được quy định trong “CXM 2-2023”[17] Hàm lượng kháng sinh diệt cầu trùng tồn dư tối đa trong các sản phẩm từ động vật theo quy định FAO trong Bảng 1.1
Bảng 1 1 Hàm lượng kháng sinh diệt cầu trùng tồn dư tối đa trong các sản phẩm từ động vật theo FAO-WHO CXM 2-2023
Tên kháng sinh Loại sản phẩm MRLs
Lượng tiêu thụ hàng ngày chấp nhận
Thịt gia cầm, thịt thỏ, thịt cừu 500
0 - 30 àg/kg cân nặng Gan gia cầm, gan thỏ, gan cừu 3000
Thận gia cầm, thận thỏ, thận cừu 2000
Mỡ/da gia cầm, mỡ thỏ, mỡ cừu 1000
0 - 0,9 mg/kg cân nặng dựa trên độc tính Đối với gà thịt
Theo FDA (Food and Drug Administration) [7], hàm lượng kháng sinh diệt cầu trùng tồn dư tối đa trong các sản phẩm từ động vật được quy định như trong Bảng 1.2
Bảng 1 2 Hàm lượng kháng sinh diệt cầu trùng tồn dư tối đa trong các sản phẩm từ động vật theo FDA
Tên kháng sinh Loại sản phẩm MRLs
Lượng tiêu thụ hàng ngày chấp nhận
25 àg/kg cõn nặng/ngày
Nicarbazin Gan 52 ppm 200 àg/kg cõn nặng/ngày Gà
5àg/kg cõn nặng/ngày
Các mô ăn được khác Gà (ngoại trừ trứng) 0,1 ppm
Tại Việt Nam, hàm lượng tồn dư tối đa trong thực phẩm có nguồn gốc động vật của các kháng sinh diệt cầu trùng được quy định trong thông tư số 24/2013/TT-BYT “Quy định mức giới hạn tối đa dư lượng thuốc thú y trong thực phẩm” Hàm lượng tồn dư tối đa trong thực phẩm có nguồn gốc động vật của các kháng sinh diệt cầu trùng theo thông tư số 24/2013/TT-BYT [4] được thể hiện trong Bảng 1.3
Bảng 1 3 Hàm lượng tồn dư tối đa trong thực phẩm có nguồn gốc động vật của các chất kháng sinh diệt cầu trùng theo thông tư 24/2013/TT-BYT
Tên kháng sinh Loại sản phẩm MRLs
Thịt gia cầm, thịt thỏ, thịt cừu 500 Gan gia cầm, gan thỏ, gan cừu 3000 Thận gia cầm, thận thỏ, thận cừu 2000 Mỡ/da gia cầm, mỡ thỏ, mỡ cừu 1000
Nicarbazin Thịt gà, Gan gà, Thận gà, Mỡ/da gà 200 Áp dụng với các loại gà thịt
Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi để ngăn ngừa bệnh cầu trùng là thiết yếu, tuy nhiên cần phải kiểm soát tốt hàm lượng tồn dư theo các quy định hiện hành để đảm bảo sản phẩm có nguồn gốc động vật không gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người dùng Vì vậy, cần phải có các phương pháp phân tích để xác định hàm lượng các chất kháng sinh nói trên trong sản phẩm có nguồn gốc động vật.
Một số phương pháp phân tích kháng sinh diệt cầu trùng
1.3.1 Phương pháp tiêu chuẩn để phân tích các kháng sinh diệt cầu trùng ở Việt Nam Hiện nay đã có phương pháp theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN), để phân tích hàm lượng kháng sinh diệt cầu trùng Nicarbazin trong thực phẩm [1]
Bảng 1 4 TCVN xác định hàm lượng kháng sinh có tác dụng diệt cầu trùng trong thực phẩm
Phương pháp phân tích Điều kiện sắc ký Nguyên tắc Tài liệu
Thịt và sản phẩm thịt (sản phẩm gia cầm)
CH3COONH4 5 mM với HCOOH 0,1% trong H2O; (B):
CH3COONH4 5 mM với HCOOH 0,1% trong MeOH
Mẫu thử được đồng hóa đông lạnh sâu với natri sulfat dạng rắn và chiết hai lần bằng ACN
Sử dụng chất chuẩn nội là DNC-d8
Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút
Chưa có TCVN phân tích hàm lượng các kháng sinh diệt cầu trùng Diclazuril, Salinomycin và Robenidin trong mẫu thực phẩm
Nguyên tắc: dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch có khả năng hấp thụ ánh sáng trực tiếp trong vùng tử ngoại (UV) và vùng khả kiến (VIS) hoặc phức tạo thành giữa ion cần xác định với một thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường thích hợp để tạo ra phức chất có khả năng hấp thụ ánh sáng thích hợp
Một nhóm nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm nghiên cứu phụ gia thực phẩm tại Pháp đã sử dụng phương pháp này để xác định hàm lượng Robenidin Robenidin được xác định tại bước sóng 464 nm trong dung môi dimethylformandehyd Độ thu hồi của Robenidin trong khoảng 95,5% - 106% [11]
Phương pháp điện hóa là các phương pháp phân tích dựa vào phản ứng trên bề mặt điện cực liên quan đến chất phân tích gồm phương pháp đo thế, phương pháp điện phân, phương pháp cực phổ và von-ampe
Ivakh và các cộng sự đã ứng dụng phương pháp điện hóa sử dụng điện cực giọt thủy ngân tĩnh (SMDE) và điện cực hỗn hống rắn bằng bạc (p-AgSAE) để xác định Robenidin trong thức ăn chăn nuôi và thịt gia cầm Giới hạn định lượng của hai phép đo với hai điện cực lần lượt là: 9,5 mg/kg với SMDE và 2,5 mg/kg với p-AgSAE Độ thu hồi của Robenidin nằm trong khoảng 88,5% - 101,5% [22]
Sắc ký là phương pháp tách các chất khỏi nhau, quá trình sắc ký bao gồm các phản ứng xảy ra liên tục trong cột từ khi nạp mẫu vào đầu cột ở dạng hỗn hợp cho tới khi đi ra khỏi cột lần lượt là các chất riêng rẽ Đó là quá trình hấp thu và giải hấp thu xảy ra liên tục giữa ba thành phần: pha tĩnh, pha động và chất phân tích trong hệ sắc ký Pha tĩnh có thể là một chất rắn (hạt xốp/mịn) hay là một chất lỏng (được giữ trên chất mang) Khi pha động là lỏng thì phương pháp được gọi là sắc ký lỏng (LC), khi pha động là khí thì phương pháp được gọi là sắc ký khí (GC)
Phương pháp sắc ký lỏng được ứng dụng rộng rãi với độ tin cậy cao Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để phân tích, xác định hàm lượng các kháng sinh diệt cầu trùng Các nghiên cứu này được tóm tắt trong Bảng 1.5
Bảng 1 5 Các nghiên cứu xác định hàm lượng các kháng sinh diệt cầu trùng sử dụng phương pháp sắc ký
Chất phân tích Nền mẫu
Phương pháp sắc ký Điều kiện sắc ký Kết quả Tài liệu tham khảo
Cột tách: Acquity UPLC BEH C18 (100 mm x 2,1 mm, 1,7 àm) Pha động: (A): acid formic 0,1% và (B): MeOH
• Với Salinomycin: Độ thu hồi: 85,2 - 120,1%,
• Với Robenidin: Độ thu hồi: 94,4 - 124,9%
• Với Diclazuril: Độ thu hồi: 87,2 - 103%
• Với Nicarbazin: Độ thu hồi: 79,5 - 109,9%
100 mm, 2,7àm) Pha động: (A): ammonium format 0,01M, pH = 4,0 và (B): hỗn hợp Acetonitril, MeOH và pha động A với tỉ lệ 60:35:5 (v:v:v)
• Với Salinomycin: Độ thu hồi: 90 - 111%, LOD = 73 àg/kg, LOQ = 130 àg/kg
• Với Robenidin: Độ thu hồi: 96 - 123%, LOD = 8 àg/kg, LOQ = 14 àg/kg
• Với Diclazuril: Độ thu hồi: 93 - 156%, LOD: 3 àg/kg, LOD = 5 àg/kg
• Với Nicarbazin: Độ thu hồi: 97 - 121%, LOD = 140 àg/kg, LOQ = 220 àg/kg
Mô động vật và trứng
Cột tách: Acquity UPLC BEH HILIC (100 mm x 2,1 mm, 1,7àm) Pha động: (A): Acetonnitril và (B): ammonium format 1mM chứa 0,1% acid formic
• Với Salinomycin: Độ thu hồi: 91,7 - 104%, LOD = 0,087 àg/kg
• Với Robenidin: Độ thu hồi: 96,8 - 103%, LOD = 0,104 àg/kg
• Với Diclazuril: Độ thu hồi: 92,2 - 104%, LOD = 0,102 àg/kg
• Với Nicarbazin: Độ thu hồi: 96 - 105%, LOD = 0,092 àg/kg
Gia cầm, vật nuôi và mô thủy sản
Cột tách: Agilent Poroshell 120SB-C18 (2,7 àm, 3,0 mm x 150 mm) Pha động: (A): ammonium format 5mM chứa 0,1% acid formic và (B): MeOH chứa 0,1% acid formic
• Với Robenidin: Độ thu hồi: 98,5 - 104%, LOQ = 0,5 àg/kg
• Với Diclazuril: Độ thu hồi: 92,8 - 96,7%, LOQ = 0,5 àg/kg
• Với Nicarbazin: Độ thu hồi: 76,2 - 120,8%, LOQ = 0,5 àg/kg
PhenylHexyl (3 àm, 2,0 mm x 150 mm) Pha động: (A): Acetonitril và (B): MeOH
• Với Salinomycin: Độ thu hồi: 98,6 - 105,2%, LOD = 0,92 àg/kg, LOQ = 2,57 àg/kg
• Với Robenidin: Độ thu hồi: 98,0 - 99,6%, LOD = 1,41 àg/kg, LOQ = 4,00 àg/kg
• Với Diclazuril: Độ thu hồi: 92,1 - 96,5%, LOD = 0,66 àg/kg, LOQ = 1,97 àg/kg
Thịt và trứng gia cầm
Cột tách: Poroshell 120 EC-C18 (2,7 àm, 50 mm x 3,0 mm)
Pha động: (A): Nước và (B): Acetonitril
• Với Salinomycin: Độ thu hồi: 107,35 - 111,76%, CCα = 62,65 àg/kg, CCβ 75,29 àg/kg
• Với Robenidin: Độ thu hồi: 96,68 - 112,14%, CCα = 62,19 àg/kg, CCβ 74,38 àg/kg
• Với Diclazuril: Độ thu hồi: 89,96 - 102,24%, CCα = 58,48 àg/kg, CCβ 66,97 àg/kg
• Với Nicarbazin: Độ thu hồi: 102,45 - 107,78%, CCα = 55,52 àg/kg, CCβ 61,03 àg/kg
Cột tách: Agilent Eclipse XDB-C8 (3 mm x 150 mm, 3,5 àm)
Pha động: (A): Nước và (B): ACN 0,1% HCOOH
• Với Salinomycin: Độ thu hồi: 89,8 - 97,7%, LOD = 0,01 àg/kg, LOQ = 0,10 àg/kg
• Với Robenidin: Độ thu hồi: 99,7 - 101,1%, LOD = 0,05 àg/kg, LOQ = 0,50 àg/kg
• Với Diclazuril: Độ thu hồi: 82,6 - 102,5%, LOD = 0,10 àg/kg, LOQ = 1,00 àg/kg
Cột tách: Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8 (3 mm x
150 mm, 3,5 àm) với tiền cột Agilent Zorbax Eclipse Plus C8 (2,1 mm x 12,5 mm, 5 àm)
Pha động: (A): Nước và (B): ACN 0,1% HCOOH
• Với Salinomycin: Độ thu hồi: 91,6 - 101,6%, LOD = 0,01 àg/kg, LOQ = 0,05 àg/kg
• Với Robenidin: Độ thu hồi: 91,6 - 101,2%, LOD = 0,5 àg/kg, LOQ = 1,0 àg/kg
• Với Diclazuril: Độ thu hồi: 82,5 - 114%, LOD = 0,005 àg/kg, LOQ = 0,01 àg/kg
PhenylHexyl (2 mm x 150 mm, 3àm) với tiền cột Luna Phenyl (2 mm x 4 mm)
MeOH và (C): đệm amoni format pH 4,0 (A : B : C 25 : 30 : 45, v:v:v)
• Với Salinomycin: Độ thu hồi: 98,4 - 116,8%, LOD = 0,65 àg/kg, LOQ = 1,86 àg/kg
• Với Robenidin: Độ thu hồi: 102,1 - 106,7%, LOD = 2,77 àg/kg, LOQ = 7,3 àg/kg
• Với Diclazuril: Độ thu hồi: 92,5 - 123,5%, LOD = 1,13 àg/kg, LOQ = 3,21 àg/kg
• Với Nicarbazin: Độ thu hồi: 92,0 - 112,6%, LOD = 2,12 àg/kg, LOQ = 5,38 àg/kg
Cột tách: Acquity BEH C8 (2,1 mm x 50 mm, 1,7 àm) với tiền cột Acquity UPLC BEH C8 (2,1 mm x 5 mm, 1,7 àm)
Pha động: (A): HCOOH 0,1% trong H2O và (B):
• Với Salinomycin: Độ thu hồi: 115 - 131%, CCα = 2,6 àg/kg, CCβ = 4,0 àg/kg
• Với Robenidin: Độ thu hồi: 103 - 111%,
CCα = 5,8 àg/kg, CCβ = 6,8 àg/kg
• Với Diclazuril: Độ thu hồi: 98 - 108%,
CCα = 5,8 àg/kg, CCβ = 7,5 àg/kg
• Với Nicarbazin: Độ thu hồi: 97 - 116%,
CCα = 5,8 àg/kg, CCβ = 6,6 àg/kg
Như vậy, nhiều phương pháp đã được sử dụng để xác định riêng lẻ hoặc đồng thời các kháng sinh có tác dụng diệt cầu trùng trên nhiều nền mẫu khác nhau Trong đó, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) cho thấy khả năng ứng dụng cao Sự ghép nối sắc ký lỏng và khối phổ là một biện pháp tăng cường hiệu quả của phương pháp do kết hợp khả năng tách tốt của sắc ký lỏng (LC) và khả năng nhận biết tốt của khối phổ (MS) Phương pháp LC-MS/MS đã được sử dụng phổ biến trong việc phân tích hàm lượng cũng như dư lượng các chất kháng sinh trong các nền mẫu phức tạp nhờ khả năng phân tách, độ nhạy tốt, giới hạn phát hiện thấp và độ tin cậy cao
Trong nghiên cứu này, phương pháp LC-MS/MS được lựa chọn để xác định đồng thời các kháng sinh Diclazuril, Nicarbazin, Salinomycin và Robenidin trong mẫu thực phẩm.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng trong nghiên cứu là 4 kháng sinh diệt cầu trùng: Diclazuril, Nicarbazin, Salinomycin và Robenidin
- Đối tượng phân tích: các thực phẩm mua trên địa bàn Hà Nội.
Nguyên vật liệu, thiết bị
- Diclazuril (LGC, Anh), độ tinh khiết 97,65%, số lô G1103115
- Nicarbazin (LGC, Anh), độ tinh khiết 98,93%, số lô G1156363
- Salinomycin sodium (LGC, Anh), độ tinh khiết 79,60%, số lô 1224352
- Robenidin hydrochlorid (LGC, Anh), độ tinh khiết 93,43%, số lô G1208660
- Methanol (CH3OH) (Merck, Đức)
- Acid formic (HCOOH) (Merck, Đức)
- Nước cất 2 lần lấy từ máy lọc nước siêu tinh khiết Milli-Q
- Magnesium sulfat khan (MgSO4) (Xilong, Trung Quốc)
- Chất hấp phụ sử dụng cho chiết pha rắn: Bondesil (octadecyl silica) - C18 (Aligent, Mỹ)
- Micropipet tựy chỉnh: 2,0 - 20,0 àL; 10,0 - 100 àL; 20,0 - 200 àL; 100 - 1000 àL;
- Ống ly tâm nhựa: 15 mL; 50 mL có nắp kín
- Lọ thủy tinh tối màu đựng dung dịch chuẩn 20 mL
- Hệ thống sắc ký lỏng SCIEX Exion LC 20AD ghép nối detector khối phổ AB SCIEX Triple Quad 6500+
- Cột sắc ký pha đảo Symmetry C18 (2,1 x 150 mm, 3,5 àm)
- Máy đồng nhất mẫu Philips
- Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg, Mettler Toledo
- Cân kỹ thuật chính xác đến 0,01 g, Mettler Toledo
- Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 6000 vòng/phút, Mikro 200R, Hettich
- Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 13000 vòng/phút đối với ống 2 mL
- Máy lắc xoáy vortex, IKA
2.2.5 Chuẩn bị các dung dịch
❖ Dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000 ppm:
Cân chính xác khoảng 10 mg các chất chuẩn bằng cân phân tích có độ chính xác đến 0,1 mg vào cốc có mỏ Hòa tan bằng MeOH (đối với Robenidin thì hòa tan bằng DMSO) và chuyển vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch và lắc đều Các dung dịch chuẩn được bảo quản ở -18°C trong lọ tối màu
Chú ý: Nồng độ dung dịch chuẩn gốc cần được tính thực tế theo lượng chuẩn cân được và độ tinh khiết của từng chất chuẩn
❖ Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 4 kháng sinh có tác dụng diệt cầu trùng nồng độ 10,0 ppm:
Dựng micropipet hỳt chớnh xỏc 100 àL cỏc dung dịch chuẩn gốc cho vào bỡnh định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng MeOH và lắc đều Bảo quản dung dịch chuẩn trung gian 10 ppm ở -18°C trong lọ tối màu
❖ Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 4 kháng sinh có tác dụng diệt cầu trùng nồng độ 1ppm:
Dựng micropipet hỳt chớnh xỏc 1000 àL dung dịch chuẩn trung gian 10,0 ppm vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng MeOH và lắc đều Bảo quản dung dịch ở -18°C trong lọ tối màu.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS
- Điều kiện khối phổ: Xác định các điều kiện tối ưu của MS để chọn ra ion mẹ và các ion con phù hợp để định tính và định lượng
- Khảo sát điều kiện sắc ký:
+ Lựa chọn cột sắc ký
+ Khảo sát và lựa chọn thành phần, chương trình gradient pha động
2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
Khảo sát quy trình chiết, dung môi chiết, thể tích dung môi chiết, thành phần muối chiết, thành phần chất hấp phụ trong d-SPE
2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu Đánh giá tương quan giữa đường chuẩn pha trên nền dung môi và đường chuẩn trên nền mẫu trắng
2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích
Tiến hành thẩm định theo hướng dẫn của AOAC 2016 [23] và theo tài liệu hướng dẫn chuyên khảo [6], gồm các thông số thẩm định như sau: Độ ổn định hệ thống Độ đặc hiệu
Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Khoảng nồng độ tuyến tính và đường chuẩn Độ đúng (độ thu hồi) Độ lặp lại (độ chụm)
2.3.5 Áp dụng phương pháp để phân tích mẫu trên thị trường
Số lượng mẫu: 31 mẫu (23 mẫu thịt và 8 mẫu sữa)
Các mẫu thực được mua ngẫu nhiên trên thị trường tại các chợ dân sinh và tạp hóa quanh địa bàn Hà Nội.
Nội dung nghiên cứu
2.4.1 Quy trình lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ
Lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên Mẫu được lấy tại các chợ dân sinh và tạp hóa trên địa bàn Hà Nội Sau khi lấy mẫu:
• Mẫu thịt được loại bỏ xương và đồng nhất đến khi thu được mẫu kích thước nhỏ, mịn và đồng đều Đóng gói mẫu vào các túi PE, điền thông tin và bảo quản tủ đông
• Mẫu sữa được điền đầy đủ thông tin và bảo quản tủ mát
2.4.2 Quy trình xử lý mẫu dự kiến
Một số quy trình xử lý mẫu dự kiến được trình bày trong Bảng 2.1
Bảng 2 1 Một số quy trình xử lý mẫu dự kiến
Quy trình dự kiến Các bước tiến hành Tài liệu tham khảo
Cân 5,0 g mẫu vào ống 50 mL
Thêm 5,0 mL H2O (mẫu lỏng không cần thêm), lắc xoáy 1 phút
Thêm 10,00 mL ACN, lắc xoáy 3 phút
Thêm hỗn hợp muối chiết gồm 4 g MgSO4 và 1 g NaCl, lắc xoáy 1 phút
Hút 1,0 mL vào ống d-SPE chứa 0,15 g MgSO4 và 0,05 g C18, lắc xoáy 1 phút
Hỳt 600 àL vào vial, đem phõn tớch LC-MS/MS
Cân 1 g mẫu vào ống 50 mL
Thêm 8 mL H2O (với mẫu rắn), lắc xoáy 1 phút
Thêm 30 mL ACN 0,1% HCOOH, lắc xoáy 1 phút
Thêm muối chiết 1 (4 g Na2SO4, 1g NaCl, 1 g Trisodium citrat dihydrat, 0,5g Sodium citrat dibasic sesquihydrat), lắc xoáy 1 phút Ly tâm 6000 rpm trong
Hút 6 mL dịch chiết thu được vào ống 15 mL chứa muối chiết 2 (0,9 g Na2SO4, 0,15 g C18 và 0,05 g PSA), lắc xoáy 1 phút Ly tâm 6000 rpm, 5 phút
Hút 3 mL dịch đi thổi khô không nhiệt Hòa cắn bằng 1mL dung dịch MeOH 15%/H2O, lắc xoáy 1 phút, ly tâm lạnh 6000 rpm trong 5 phút
Hỳt 600 àL vào vial, đem đi phõn tớch trờn LC- MS/MS
Tiến hành tương tự quy trình số 1 nhưng ở bước cuối cùng, pha loãng 1 mL dịch chiết với 1mL nước, lắc đều và chuyển vào vial, đem phân tích LC-MS/MS
Quy trình 4 Tiến hành tương tự quy trình số 1 nhưng thay dung môi
Cân 2,0 g mẫu vào ống 50 mL
Thêm 5 mL ACN, lắc xoáy Ly tâm 6000 rpm, 5 phút
Chuyển sang ống 15 mL chứa 4 mL H2O Ly tâm 6000 rpm, 5 phút Đem đi chiết pha rắn với cột Oasis HLB Hoạt hóa bằng 2 mL MeOH và 2 mL H2O Nạp mẫu Loại tạp bằng 3 mL hexan Rửa giải bằng 2,5 mL MeOH Thu dịch và đem đi thổi khô không nhiệt
Hoàn nguyên bằng 1,0 mL ACN/H2O (50:50) Ly tâm
Chuyển vào vial, đem phân tích LC-MS/MS
Tiến hành tương tự quy trình số 1 đến hết bước ly tâm
Hút 6 mL dịch vào ống 15 mL chứa 0,9 g MgSO4 và 0,3 g C18 Lắc xoáy 1 phút, ly tâm 6000 rpm, 5 phút
Lấy 2,5mL dịch chiết đi thổi khô không nhiệt
Hoàn nguyên bằng 1,0 mL MeOH/H2O (50:50) Ly tâm 6000 rpm, 5 phút
Chuyển vào vial, đem phân tích LC-MS/MS
Sau khi lựa chọn được quy trình xử lý mẫu, tiến hành khảo sát các yếu tố có thể ảnh hưởng tới hiệu suất chiết trong quy trình, cụ thể:
- Khảo sát dung môi chiết lần lượt là ACN, HCOOH 0,1% trong ACN, HCOOH 1% trong ACN
- Khảo sát thể tích dung môi chiết lần lượt là: 10, 20, 30 mL
- Khảo sát khối lượng thành phần muối chiết: sử dụng khối lượng NaCl lần lượt là 0,5 g; 1,0 g; 1,5 g và 2 g
- Khảo sát khối lượng thành phần chất hấp phụ trong d-SPE: khảo sát khối lượng MgSO4 khan với khối lượng lần lượt là 0,1 g; 0,15 g và 0,2 g Khảo sát khối lượng C18 lần lượt là 0,05 g; 0,075 g và 0,1 g
Việc khảo sát được tiến hành theo phương pháp khảo sát lần lượt từng yếu tố (OFAT) [18], tức là chỉ thay đổi một điều kiện trong khi giữ nguyên các điều kiện khác, sau khi tìm được điều kiện tối ưu thì sử dụng điều kiện đó để khảo sát các điều kiện tiếp theo Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện Kết quả khảo sát được tính toán và do sánh dựa trên độ thu hồi của chất phân tích
2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng nền
Xây dựng đồng thời 2 đường chuẩn: Đường chuẩn trên nền dung môi và đường chuẩn trên nền mẫu trắng cho 4 chất phân tích Xác định ảnh hưởng của nền mẫu lên tín hiệu của chất phân tích bằng cách so sánh 2 hệ số góc của 2 đường chuẩn
Trong đó: am : hệ số góc của đường chuẩn trên nền mẫu trắng as : hệ số góc của đường chuẩn pha trên dung môi
Nếu ME > 0: ảnh hưởng nền dương làm tăng tính hiệu chất phân tích
ME < 0: ảnh hưởng nền âm làm giảm tín hiệu chất phân tích
2.4.4.1 Độ ổn định hệ thống
Cách xác định: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 chất phân tích vào hệ thống LC-MS/MS và tính toán độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích
Yêu cầu: Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic ≤ 2,0%
Tiến hành phân tích 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn pha trong dung môi Phương pháp đạt yêu cầu về độ đặc hiệu khi:
- Mẫu trắng không cho tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích Mẫu thêm chuẩn cho tín hiệu tại thời gian lưu gần với thời gian lưu ở mẫu chuẩn pha trong dung môi, chênh lệch không quá ± 0,1 phút
- Ngoài ra, khi sử dụng kỹ thuật MS, cần đáp ứng yêu cầu về điểm IP (điểm nhận dạng - identification point) và tỷ lệ ion Hội đồng Châu Âu (EU 2021/808) quy định cách tính điểm IP đối với kỹ thuật LC-MS/MS như sau: kỹ thuật tách LC được tính 1 điểm, ion mẹ được tính 1 điểm, mỗi ion con được tính 1,5 điểm
- Tỉ lệ ion của hai ion con thu được ở mẫu thêm chuẩn so với tỉ lệ ion của hai ion con ở mẫu chuẩn không được vượt quá giới hạn trong Bảng 2.2
Bảng 2 2 Tỷ lệ ion đối với LC-MS/MS
(so với ion chính) LC-MS/MS
≤10% ± 50% Độ lệch giữa tỉ lệ ion mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn được tính bằng công thức:
Trong đó: Rdiff : độ lệch tương đối
IRspk : tỉ số ion trong mẫu thêm chuẩn
IRstd : tỉ số ion trong mẫu chuẩn dung môi
2.4.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ hoặc hàm lượng chất có thể phát hiện được với một mức đảm bảo đo hợp lý LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà có thể định lượng được với kết quả có độ chính xác mong muốn bằng phương pháp đó LOD và LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ S/N, trong đó S là tín hiệu của chất phân tích, N là tín hiệu nhiễu của đường nền LOD được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2 - 3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3 LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 - 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10, có thể tính từ LOD qua công thức:
LOQ = 3,3 x LOD Theo yêu cầu của Codex (Bảng 2.3), LOQ cần phải thấp hơn hoặc bằng 1/5 lần giới hạn tối đa (nếu giới hạn này ≥ 0,1 mg/kg) và 2/5 lần giới hạn tối đa (nếu giới hạn này
Bảng 2 3 Mức chấp nhận của LOD, LOQ ở các giới hạn tối đa cho phép khác nhau theo Codex
Giới hạn tối đa Đơn vị Tỷ lệ chất LOD tối đa LOQ tối đa
2.4.4.4 Khoảng nồng độ tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ mà tại đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Đường chuẩn là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đại lượng đo được với nồng độ chất phân tích Đường chuẩn được chấp nhận khi:
• Hệ số tương quan: 0,995 ≤ R ≤ 1 hoặc 0,99 ≤ R 2 ≤ 1
• Độ chệch ∆i tại các điểm chuẩn không vượt quá ± 15%, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%
Trong đó: ∆i : Độ chệch của điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn
Ct : Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của điểm chuẩn
Cc : Nồng độ của điểm chuẩn
Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn được thực hiện với mẫu chuẩn được pha trên nền mẫu trắng
Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm Analysis version 1.7 (AB SCIEX, Mỹ) Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng và thẩm định phương pháp LC-MS/MS
3.1.1 Xây dựng phương pháp LC-MS/MS
3.1.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ
Tiêm không qua cột vào hệ thống MS lần lượt các dung dịch chuẩn từng chất phân tích với nồng độ 50,0 ppb Lựa chọn kĩ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) để xác định các ion mẹ và ion con của từng chất Lựa chọn ion con có tín hiệu cao nhất để định lượng và ion con có tín hiệu lớn thứ hai để định tính Kết quả ion mẹ, mảnh ion con và các thông số tối ưu cho từng mảnh được trình bày ở Bảng 3.1 Phổ khối của các chất phân tích được trình bày trong Phụ lục 12
Bảng 3 1 Kết quả phân tách và điều kiện tối ưu cho các mảnh của chất phân tích
Chất phân tích ESI KLPT
Các thông số của thiết bị được tối ưu tự động sau khi đã chọn được các mảnh mẹ và ion con cho các chất phân tích bao gồm: thế ion hóa (IS), nhiệt độ nguồn ion (TEM), áp suất khí nguồn 1 (GS1), áp suất khí nguồn 2 (GS2), áp suất khí màng (CUR), áp suất khí (CAD), thế phân nhóm (DP) và thế đầu vào (EP) Các thông số tối ưu của thiết bị được tổng hợp trong Bảng 3.2
Bảng 3 2 Các thông số tối ưu cho thiết bị MS
Giá trị tối ưu Đối với Diclazuril, Nicarbazin Đối với Salinomycin, Robenidin
2 Nhiệt độ nguồn ion (TEM) 450 °C 400 °C
3 Áp suất khí màng (CUR) 35 psi 35 psi
4 Áp suất khí (CAD) 8 psi 8 psi
5 Áp suất khí nguồn 1 (GS1) 50 psi 50 psi
6 Áp suất khí nguồn 2 (GS2) 50 psi 50 psi
7 Thế phân nhóm (DP) 60 eV 140 eV
8 Thế đầu vào (EP) 10 eV 10 eV
3.1.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng
Dựa theo các tài liệu tham khảo tại Bảng 1.5, theo cấu trúc hóa học của các chất cần phân tích và theo điều kiện phòng thí nghiệm, lựa chọn cột sắc ký pha đảo C18 Lựa chọn cột cú sẵn trong phũng thớ nghiệm: Symmetry C18 (2,1 x 150 mm, 3,5àm)
❖ Khảo sát và lựa chọn chương trình pha động
Các hệ dung môi pha động được lựa chọn để khảo sát bao gồm:
- Pha động (A) H2O : HCOOH 0,1% và (B) ACN
- Pha động (A) HCOONH4 10,0 mM : HCOOH 0,1% và (B) ACN
- Pha động (A) H2O : HCOOH 0,1% và (B) ACN : HCOOH 0,1%
- Pha động (A) H2O : HCOOH 0,1% và (B) MeOH
- Pha động (A) HCOONH4 10,0 mM : HCOOH 0,1% và (B) MeOH
- Pha động (A) H2O : HCOOH 0,1% và (B) MeOH : HCOOH 0,1%
Kết quả khảo sát pha động đối với dung dịch chuẩn 50,0 ppb được trình bày trong Hình 3.1, 3.2, 3.3 và 3.4
Hình 3 1 Sắc ký đồ của Diclazuril với các hệ pha động khác nhau
Hình 3 2 Sắc ký đồ của Nicarbazin với các hệ pha động khác nhau
Hình 3 3 Sắc ký đồ của Salinomycin với các hệ pha động khác nhau
Hình 3 4 Sắc ký đồ của Robenidin với các hệ pha động khác nhau
(1) Pha động (A) HCOONH 4 10,0 mM : HCOOH 0,1% và (B) ACN (2) Pha động (A) HCOONH 4 10,0 mM : HCOOH 0,1% và (B) MeOH (3) Pha động (A) H 2 O : HCOOH 0,1% và (B) ACN
(4) Pha động (A) H 2 O : HCOOH 0,1% và (B) ACN : HCOOH 0,1%
(5) Pha động (A) H 2 O : HCOOH 0,1% và (B) MeOH : HCOOH 0,1%
(6) Pha động (A) H 2 O : HCOOH 0,1% và (B) MeOH
Nhận xét: Kết quả cho thấy sắc ký đồ của Diclazuril, Nicarbazin và Robenidin đều xuất hiện ở cả 6 hệ pha động Riêng Salinomycin thì sắc ký đồ chỉ xuất hiện ở hệ pha động (2), (5), (6) và tại (6) cho sắc ký đồ của Salinomycin gọn, nhọn và cân xứng nhất Ngoài ra, hệ pha động (6) ở 3 chất phân tích còn lại cũng cho sắc ký đồ gọn, nhọn và cân xứng tương đương hoặc hơn các hệ (2), (5)
Vì vậy, hệ pha động (6) được lựa chọn với thành phần bao gồm: (A): H2O : HCOOH 0,1% và (B): MeOH
Từ các kết quả khảo sát, điều kiện sắc ký tối ưu được lựa chọn như sau:
Cột sắc ký pha đảo Symmetry C18 (2,1 x 150 mm, 3,5 àm)
Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút
Thời gian phân tích: 9 phút
Pha động: Kênh A là H2O: HCOOH 0,1% và kênh B là MeOH
Chương trình gradient pha động được tối ưu cho phân tích và được thể hiện trong Bảng 3.3
Bảng 3 3 Chương trình gradient pha động
Thời gian (phút) Kênh A Kênh B
Khảo sát, tối ưu quy trình xử lý mẫu
Chuẩn bị mẫu trắng thêm chuẩn: nền mẫu thịt và sữa không phát hiện 4 chất phân tích Cân chính xác khoảng 5,0 g mẫu đã được đồng nhất vào ống falcon 50 mL Thêm chính xác 25 L dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 kháng sinh coccidiostats nồng độ 10 ppm
3.2.1 Khảo sát các quy trình chiết
Tiến hành khảo sát 6 quy trình dự kiến trong Bảng 2.1 đối với 4 chất phân tích trên nền thịt và sữa Tại mỗi quy trình, làm lặp lại 3 lần với mỗi nền Tính toán độ thu hồi theo như công thức tại mục 2.4.4.5 Tính hiệu suất thu hồi trung bình của 3 lần Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.4, 3.5 và Phụ lục 1
Bảng 3 4 Độ thu hồi của 6 quy trình chiết dự kiến trên mẫu thịt
Quy trình Độ thu hồi (%)
Bảng 3 5 Độ thu hồi của 6 quy trình chiết dự kiến trên mẫu sữa
Quy trình Độ thu hồi (%)
Nhận xét: Từ kết quả trong bảng, nhận thấy quy trình số 2, 3, 4, 6 cho hiệu suất rất thấp đối với Salinomycin và Robenidin (0,00 - 22,70%) ở cả nền thịt và sữa Quy trình số 5 chiết pha rắn SPE khi làm trên mẫu thịt gây tắc cột HLB nên không lựa chọn sử dụng Vì vậy, quy trình số 1 (chiết QuEChERS) được lựa chọn làm quy trình chiết dự kiến cho cả 4 chất phân tích do có độ thu hồi khá cao trên cả nền thịt và sữa (68,93 - 96,67% trên nền thịt và 75,80 - 98,27% trên nền sữa)
3.2.2 Khảo sát dung môi chiết
Sau khi chọn được quy trình chiết dự kiến, tiến hành khảo sát mẫu trắng thêm chuẩn bằng các dung môi chiết: ACN, HCOOH 0,1%/ACN và HCOOH 1%/ACN Tại mỗi dung môi khảo sát, tiến hành làm lặp lại 3 lần Tính toán độ thu hồi theo như công thức tại mục 2.4.4.5 Tính hiệu suất thu hồi trung bình của 3 lần Kết quả được thể hiện trong Hình 3.5, 3.6 và Phụ lục 2
Hình 3 5 Kết quả khảo sát dung môi chiết trên nền thịt
Hình 3 6 Kết quả khảo sát dung môi chiết trên nền sữa
ACN ACN 0.1% HCOOH ACN 1% HCOOH Độ thu hồi (%)
Khảo sát dung môi chiết trên nền thịt
ACN ACN 0.1% HCOOH ACN 1% HCOOH Độ thu hồi (%)
Khảo sát dung môi chiết trên nền sữa
Nhận xét: Từ kết quả trên đồ thị, ở cả nền mẫu thịt và sữa, nhận thấy việc sử dụng dung môi chiết ACN cho hiệu suất cao nhất ở hầu hết các chất trừ Nicarbazin Tuy nhiên, hiệu suất của Nicarbazin khi dùng ACN cũng tương đối cao (86,3% trên nền thịt và 85,5% trên nền sữa) Vì vậy, dung môi chiết ACN được lựa chọn để sử dụng cho phương pháp
3.2.3 Khảo sát thể tích dung môi chiết
Tiến hành khảo sát các thể tích ACN lần lượt là 10,0 mL; 20,0 mL và 30,0 mL Tại mỗi thể tích dung môi, tiến hành làm lặp lại 3 lần Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn và sử dụng dung môi ACN Tính toán độ thu hồi theo công thức tại mục 2.4.4.5 Tính hiệu suất thu hồi trung bình của 3 lần Kết quả thu được được thể hiện trong Hình 3.7, 3.8 và Phụ lục 3
Hình 3 7 Kết quả khảo sát thể tích dung môi trên nền thịt
Hình 3 8 Kết quả khảo sát thể tích dung môi trên nền sữa
10mL ACN 20mL ACN 30mL ACN Độ thu hồi (%)
Khảo sát thể tích ACN trên nền thịt
10mL ACN 20mL ACN 30mL ACN Độ thu hồi (%)
Khảo sát thể tích ACN trên nền sữa
Nhận xét: Từ kết quả trên đồ thị, ở cả nền mẫu thịt và sữa, việc sử dụng thể tích chiết là 10 mL ACN cho hiệu suất cao nhất ở hầu hết các chất trừ Nicarbazin Tuy nhiên, hiệu suất của Nicarbazin khi sử dụng 10 mL ACN cũng tương đối cao (99,3% trên nền thịt và 91,7% trên nền sữa) Vì vậy, thể tích 10 mL ACN được lựa chọn cho phương pháp
3.2.4 Khảo sát thành phần muối chiết
Hỗn hợp muối chiết có vai trò ổn định pH và tăng độ phân cực của pha nước trong quy trình chiết QuEChERS Hỗn hợp này bao gồm MgSO4 có vai trò loại nước trong dịch chiết và NaCl giúp tăng khả năng điện ly của dung dịch, giúp cho các chất được chiết vào dung môi chiết và tách ra khỏi pha nước
Sau khi lựa chọn được dung môi chiết, tiến hành khảo sát thành phần NaCl lần lượt là 0,5 g; 1,0 g; 1,5 g và 2 g NaCl trong hỗn hợp muối chiết Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn với 10 mL dung môi chiết ACN Tại mỗi hỗn hợp muối chiết, tiến hành làm lặp lại
3 lần Tính toán độ thu hồi theo công thức tại mục 2.4.4.5 Tính hiệu suất thu hồi trung bình của 3 lần Kết quả được thể hiện trong hình 3.9, 3.10 và Phụ lục 4
Hình 3 9 Kết quả khảo sát thành phần NaCl trong hỗn hợp muối chiết trên nền thịt
0.5g NaCl 1g NaCl 1.5g NaCl 2g NaCl Độ thu hồi (%)
Khảo sát khối lượng NaCl trên nền thịt
Hình 3 10 Kết quả khảo sát thành phần NaCl trong hỗn hợp muối chiết trên nền sữa
Nhận xét: Từ kết quả trên đồ thị, ở cả trên nền thịt và sữa, nhận thấy quy trình sử dụng 2 g NaCl cho hiệu suất cao nhất ở tất cả 4 chất (đều trên 80,0%) Điều này có thể giải thích là do NaCl giúp tăng khả năng điện ly, việc tăng dần khối lượng NaCl giúp chất phân tích được chiết sang dung môi chiết và tách khỏi pha nước tốt hơn Vì vậy, thành phần 2 g NaCl được lựa chọn cho bước khảo sát tiếp theo
3.2.5 Khảo sát thành phần d-SPE d-SPE trong quy trình xử lý mẫu có vai trò loại bỏ các chất đồng tan với chất phân tích, tăng độ sạch của nền mẫu, giảm ảnh hưởng của các chất đồng tan đến sự phát hiện chất phân tích của thiết bị Hỗn hợp d-SPE bao gồm MgSO4 giúp loại nước lẫn trong lớp dung môi hữu cơ và C18 là chất hấp phụ pha đảo, kỵ nước, giúp loại bỏ chất không phân cực như lipid Tiến hành khảo sát lần lượt khối lượng của C18 và khối lượng MgSO4 trong hỗn hợp d-SPE
Khảo sát thành phần C18 với khối lượng lần lượt là 0,05 g; 0,075 g; 0,1 g và khối lượng MgSO4 là 0,15 g Tiến hành làm lặp lại 3 lần tại mỗi hỗn hợp muối khảo sát Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn với 10 mL dung môi ACN, muối chiết chứa 4 g MgSO4 khan và 2 g NaCl Tính toán độ thu hồi theo công thức tại mục 2.4.4.5 Tính hiệu suất thu hồi trung bình của 3 lần Kết quả khảo sát khối lượng C18 được thể hiện trong Hình 3.11, 3.12 và Phụ lục 5
0.5g NaCl 1g NaCl 1.5g NaCl 2g NaCl Độ thu hồi (%)
Khảo sát khối lượng NaCl trên nền sữa
Hình 3 11 Kết quả khảo sát thành phần C18 trong d-SPE trên nền thịt
Hình 3 12 Kết quả khảo sát thành phần C18 trong d-SPE trên nền sữa
Nhận xét: Từ kết quả trên đồ thị, ở cả nền thịt và sữa, nhận thấy quy trình sử dụng 0,05g C18 cho độ thu hồi cao nhất đối với hầu hết các chất trừ Nicarbazin Tuy nhiên, hiệu suất của Nicarbazin khi sử dụng 0,05 g C18 cũng tương đối cao (87,1% trên nền thịt và 98,2% trên nền sữa) Điều này có thể giải thích là do khi tăng dần khối lượng C18 có nguy cơ chất phân tích bị hấp phụ một phần khiến hiệu suất thu hồi giảm đi
Vì vậy, thành phần 0,05 g C18 được lựa chọn cho phương pháp
Khảo sát thành phần MgSO4 trong d-SPE với khối lượng lần lượt là 0,1 g; 0,15 g; 0,2 g và khối lượng thành phần C18 là 0,05 g Tiến hành làm lặp lại 3 lần tại mỗi hỗn hợp muối khảo sát Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn với 10 mL dung môi ACN, muối chiết chứa 4 g MgSO4 khan và 2 g NaCl Tính toán độ thu hồi theo công thức tại mục 2.4.4.5
Khảo sát khối lượng C18 trong d-SPE trên nền thịt
Khảo sát khối lượng C18 trong d-SPE trên nền sữa
Tính hiệu suất thu hồi trung bình của 3 lần Kết quả khảo sát khối lượng MgSO4 được thể hiện trong Hình 3.13, 3.14 và Phụ 6
Hình 3 13 Kết quả khảo sát thành phần MgSO 4 trong d-SPE trên nền thịt
Hình 3 14 Kết quả khảo sát thành phần MgSO 4 trong d-SPE trên nền sữa
Thẩm định phương pháp phân tích
3.3.1 Độ ổn định hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm 4 chất phân tích nồng độ 20,0 ppb vào hệ thống LC-MS/MS Kết quả phân tích được trình bày tại Bảng 3.7 và Phụ lục 8
Bảng 3 7 Kết quả đánh giá độ ổn định thời gian lưu, diện tích pic của chất phân tích
Chất phân tích Diclazuril Nicarbazin Salinomycin Robenidin
Nhận xét: Từ kết quả ở Bảng 3.7, nhận thấy RSD của thời gian lưu và RSD của diện tích pic đều < 2% Như vậy, hệ thống đáp ứng theo yêu cầu AOAC 2016
3.3.2 Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu được xác định bằng cách tiến hành phân tích 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn ở 20,0 ppb và mẫu chuẩn có nồng độ 20,0 ppb trên nền dung môi
- Mẫu trắng: Sử dụng nền mẫu thịt và sữa không phát hiện 4 chất phân tích và xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng ở Hình 3.15
- Mẫu trắng thêm chuẩn: Sử dụng nền mẫu thịt và sữa không phát hiện 4 chất phân tích, thêm chính xác 200uL dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 chất phân tích nồng độ 1 ug/mL (ppm) vào nền mẫu Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng tại Hình 3.15
- Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 chất phân tích nồng độ 20 ng/mL (ppb) trong dung môi ACN
Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn trên nền dung môi của
4 chất phân tích trên nền thịt và sữa được thể hiện trong Hình 3.16, 3.17, 3.18, 3.19 Số điểm IP của 4 chất được trình bày tại Bảng 3.8 Tỷ lệ cường độ giữa hai ion con của 4 chất trong các mẫu được trình bày tại Bảng 3.9, 3.10
Hình 3 16 Sắc ký đồ độ đặc hiệu của Diclazuril tại 20,0 ppb
Hình 3 17 Sắc ký đồ độ đặc hiệu của Nicarbazin tại 20,0 ppb
Hình 3 18 Sắc ký đồ độ đặc hiệu của Salinomycin tại 20,0 ppb
Hình 3 19 Sắc ký đồ độ đặc hiệu của Robenidin tại 20,0 ppb Trong đó (1): mẫu trắng
(2): mẫu chuẩn 20,0 ppb trên nền dung môi
(3): mẫu trắng thêm chuẩn 20,0 ppb
Nhận xét: Các sắc ký đồ Hình 3.16, 3.17, 3.18, 3.19 cho thấy thời gian lưu ở mẫu thêm chuẩn với thời gian lưu ở mẫu chuẩn trên nền dung môi ở cả mẫu thịt và sữa gần như trùng nhau (chỉ lệch nhau 0,01 - 0,04 phút) và ở mẫu trắng gần như không xuất hiện peak tại thời gian lưu tương ứng, đáp ứng yêu cầu theo tiêu chuẩn của Hội đồng Châu Âu
Bảng 3 8 Tỷ lệ cường độ giữa hai ion con của chất phân tích trên mẫu thịt
Tỷ lệ tín hiệu giữa 2 ion con % Sai lệch thực tế
Kết luận Mẫu chuẩn Mẫu trắng thêm chuẩn
Bảng 3 9 Tỷ lệ cường độ giữa hai ion con của chất phân tích trên mẫu sữa
Tỷ lệ tín hiệu giữa 2 ion con % Sai lệch thực tế
Kết luận Mẫu chuẩn Mẫu trắng thêm chuẩn
Nhận xét: Kết quả đưa ra tại Bảng 3.9 và 3.10 cho thấy % sai lệch tỷ lệ ion giữa các mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn trong dung môi ở cả hai nền thịt và sữa, đều nằm trong giới hạn cho phép theo yêu cầu của Hội đồng Châu Âu
Số điểm IP đối với phương pháp LC-MS/MS của các chất phân tích như sau:
Bảng 3 10 Số điểm IP của các chất phân tích
Ion mẹ Ion con Tổng điểm
Nhận xét: Cả 4 chất phân tích đều có một ion mẹ và hai ion con nên điểm IP đạt 5 điểm, đáp ứng yêu cầu phân tích khối phổ theo Hội đồng Châu Âu (EU 2021/808) Kết luận: Vậy phương pháp đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, phù hợp để áp dụng phân tích
4 chất Diclazuril, Nicarbazin, Salinomycin và Robenidin trong nền mẫu thịt và sữa
Thêm chuẩn vào mẫu để xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng ở các mức nồng độ 10, 15, 20, 50, 100 ng/mL (ppb) Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan của
4 chất được trình bày tại Bảng 3.11, 3.12 và Phụ lục 9
Bảng 3 11 Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan trên nền thịt
Chất phân tích Nồng độ Diện tích pic chuẩn
Nồng độ tính được theo đường chuẩn Độ chệch Phương trình đường chuẩn
Bảng 3 12 Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan trên nền sữa
Chất phân tích Nồng độ Diện tích pic chuẩn
Nồng độ tính được theo đường chuẩn Độ chệch Phương trình đường chuẩn
Nhận xét: Kết quả cho thấy phương trình đường chuẩn của 4 chất đều có hệ số tương quan R > 0,995 Do đó trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ tương ứng Độ chệch tại tất cả các điểm nồng độ đều không vượt quá ± 15%, đáp ứng yêu cầu
3.3.4 Độ đúng (độ thu hồi) và độ lặp lại (độ chụm)
Phân tích các mẫu thêm chuẩn ở mức nồng độ: 10 ppb, 20 ppb và 100 ppb Mỗi mức nồng độ thực hiện phân tích 6 lần trên mỗi nền mẫu thịt và sữa, tính từ bước cân mẫu Kết quả phân tích độ đúng và độ lặp lại được thể hiện trong Bảng 3.13, 3.14 và Phụ lục
Bảng 3 13 Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại trong nền mẫu thịt
Hàm lượng trên mẫu (ug/kg) Độ thu hồi (%)
Bảng 3 14 Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại trong nền mẫu sữa
Hàm lượng trên mẫu (ug/kg) Độ thu hồi
Nhận xét: Độ thu hồi nằm trong khoảng 81,5 - 107,0% và RSD trong khoảng 1,89 - 9,77% trong nền mẫu thịt Độ thu hồi nằm trong khoảng 81,2 - 109% và RSD trong khoảng 1,77 - 10,13% trong nền mẫu sữa Theo quy định của AOAC 2016, đối với mức nồng độ 10 - 100 ppb thì độ thu hồi yêu cầu là 80 - 110% và độ lặp lại yêu cầu RSD tối đa là 15% Vì vậy, phương pháp phân tích đáp ứng được yêu cầu về độ đúng và độ lặp lại theo tiêu chuẩn của AOAC 2016
3.3.5 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ 3 ng/g trên mẫu tương đương với 1,5 ng/mL trên dịch phân tích để xác định giá trị S/N
Sắc ký đồ xác định LOD của các chất được thể hiện trong Hình 3.20, 3.21
Hình 3 20 Sắc ký đồ LOD của Nicarbazin trên nền mẫu sữa
Hình 3 21 Sắc ký đồ LOD của Salinomycin trên nền mẫu sữa và thịt
Qua kết quả khảo sát, phòng thí nghiệm đề xuất LOD và LOQ của phương pháp đối với phân tích đồng thời 4 chất coccidiostats tương ứng là 3 ng/g và 10 ng/g.
Ứng dụng phương pháp phân tích để phân tích hàm lượng một số kháng
Các mẫu thịt và sữa được thu thập ngẫu nhiên từ các chợ trên địa bàn thành phố Hà Nội
Bảng 3 15 Bảng mã hóa mẫu thực phân tích
Mã mẫu Loại mẫu Ngày lấy mẫu Địa điểm lấy mẫu
M1 Thịt gà 01/05/2024 Chợ phố 8/3, phường Quỳnh Mai M2 Thịt gà 01/05/2024 Chợ Gốc đề, phường Minh Khai
M3 Thịt gà 01/05/2024 Chợ ngõ 197 Hoàng Mai
M4.1 Thịt gà 01/05/2024 Chợ Lĩnh Nam
M4.2 Thịt gà 01/05/2024 Chợ Lĩnh Nam
M5.1 Thịt gà 01/05/2024 Chợ Phủ, Quốc Oai
M5.2 Thịt gà 01/05/2024 Chợ Phủ, Quốc Oai
M6.1 Thịt gà 02/05/2024 Chợ Tam Trinh
M6.2 Thịt gà 02/05/2024 Chợ Tam Trinh
M7 Thịt gà 02/05/2024 Chợ ngõ 299 Hoàng Mai
M8.1 Thịt gà 02/05/2024 Chợ Trần Khát Chân
M8.2 Thịt gà 02/05/2024 Chợ Trần Khát Chân
M9.1 Thịt gà 02/05/2024 Chợ dốc Thọ Lão
M9.2 Thịt gà 02/05/2024 Chợ dốc Thọ Lão
M10 Thịt gà 02/05/2024 Chợ Nguyễn Công Trứ
M11.1 Thịt lợn 01/05/2024 Chợ Phạm Thận Duật
M11.2 Thịt lợn 01/05/2024 Chợ Phạm Thận Duật
M12.1 Thịt bò 01/05/2024 Chợ Phủ, Quốc Oai
M12.2 Thịt bò 01/05/2024 Chợ Phủ, Quốc Oai
M13.1 Giò 01/05/2024 Chợ Phủ, Quốc Oai
M13.2 Giò 01/05/2024 Chợ Phủ, Quốc Oai
M14.1 Chả 01/05/2024 Chợ Phủ, Quốc Oai
M14.2 Chả 01/05/2024 Chợ Phủ, Quốc Oai
M18.1 Sữa chua uống 02/05/2024 Tạp hóa
M18.2 Sữa chua uống 02/05/2024 Tạp hóa
3.4.2 Kết quả phân tích mẫu thực tế
Tiến hành phân tích các mẫu đã thu thập theo quy trình đã tối ưu trong Hình 3.15 Kết quả phân tích mẫu thực tế được thể hiện trong Bảng 3.16 và Phụ lục 11
Bảng 3 16 Kết quả phân tích mẫu thực tế
Hàm lượng (ppb) Diclazuril Nicarbazin Salinomycin Robenidin
Trong đó kí hiệu “-“ tức là hàm lượng < LOD
Kết quả phân tích cho thấy các mẫu thịt và sản phẩm từ thịt, sữa và sản phẩm từ sữa đều có hàm lượng 4 chất phân tích nhỏ hơn LOD.
Bàn luận
3.5.1 Về phương pháp phân tích:
Thời gian xử lý mẫu nhanh: do áp dụng phương pháp QuEChERS, tổng thời gian xử lý mẫu chỉ khoảng 15 - 20 phút
Quy trình đơn giản, không có các kỹ thuật khó nên rất dễ thực hiện
Chi phí thấp hơn so với kỹ thuật chiết pha rắn do lượng dung môi và hóa chất sử dụng ít, không tốn chi phí cho cột chiết pha rắn
Phương pháp chưa sử dụng chất chuẩn nội để giảm sai số do mất mẫu khi xử lý mẫu và giảm ảnh hưởng nền mẫu lên kết quả phân tích
3.5.2 Về thẩm định phương pháp:
Phương pháp được thẩm định và đạt các tiêu chí theo hướng dẫn thẩm định của AOAC
2016 về độ ổn định hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại và độ thu hồi
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp này chưa đạt được như các nghiên cứu trước đây trên thế giới Tuy nhiên, với LOD = 3 ppb và LOQ = 10 ppb, phương pháp phân tích này vẫn đạt yêu cầu theo quy định của Việt Nam,
Mỹ và Canada về hàm lượng tồn dư tối đa của kháng sinh diệt cầu trùng trong thực phẩm (MRLs > 100 ppb)
3.5.3 Về kết quả phân tích:
Phương pháp được xây dựng là phương pháp đơn giản, thuận lợi cho việc ứng dụng phân tích tại phòng thí nghiệm với nền mẫu và thịt và sữa Thịt và sữa là hai loại thực phẩm có nhu cầu tiêu thụ rất lớn và phổ biến tại thị trường Việt Nam, vì vậy, việc kiểm soát hàm lượng kháng sinh diệt cầu trùng giúp nâng cao chất lượng của các thực phẩm này và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, đặc biệt là khi những loại thuốc thú y này không thuộc danh mục thuốc phải kê đơn và được sử dụng rộng rãi như hiện nay Ứng dụng phương pháp đó, 31 mẫu thực (gồm 23 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt, 8 mẫu sữa và sản phẩm từ sữa) đã được phân tích và đều cho kết quả âm tính.
