nguyễn thu hường xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng patulin trong táo và sản phẩm từ táo bằng lc msms

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AOAC Association of Official Analytical Communities Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức APCI Atmospheric Pressure Photonization Ion hóa ở áp suất khí quy

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HƯỜNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG PATULIN TRONG

TÁO VÀ SẢN PHẨM TỪ TÁO

BẰNG LC – MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HƯỜNGMã sinh viên: 1901288

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG PATULIN TRONG

TÁO VÀ SẢN PHẨM TỪ TÁO

BẰNG LC – MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: 1 ThS Nguyễn Thị Thùy Linh 2 CN Phùng Công Lý

Nơi thực hiện: 1 Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm

thuốc 2 Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực

phẩm Quốc gia

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, cho phép em được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS Nguyễn Thị Thùy Linh và CN Phùng Công Lý, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo tại khoa Hóa Phân tích và Kiểm nghiệm thuốc, các anh/ chị tại khoa Độc học và dị nguyên – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, ban lãnh đạo và đặc biệt là ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc và ThS Vũ Ngọc Tú đã quan tâm và giúp đỡ em nhiệt tình trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ và ủng hộ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Trong quá trình thực hiện đề tài, dù đã rất nỗ lực nhưng đề tài vẫn còn những thiếu sót và hạn chế, em rất mong sẽ nhận được những ý kiến đóng góp cho khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 02 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Nguyễn Thu Hường

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

1.2 Tổng quan phương pháp xác định Patulin 4

1.2.1 Một số phương pháp xác định Patulin trên thế giới 4

1.2.2 Một số phương pháp xác định Patulin ở Việt Nam 9

1.3 Phương pháp LC- MS/MS 10

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11

1.3.2 Khối phổ 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

1.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên liệu và trang thiết bị nghiên cứu 14

1.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

1.1.2 Chất chuẩn 14

1.1.3 Dung môi, hóa chất 14

1.1.4 Thiết bị, dụng cụ 14

1.2 Nội dung nghiên cứu 14

1.3 Phương pháp nghiên cứu 14

1.3.1 Xây dựng phương pháp nghiên cứu 14

1.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 16

1.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 20

1.3.4 Áp dụng phương pháp xác định mẫu thực tế trên thị trường 20

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21

3.1 Xây dựng quy trình phân tích bằng LC – MS/MS 21

3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích 21

3.1.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 24

3.1.3 Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu lên tín hiệu của chất phân tích 27

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 28

3.2.1 Độ ổn định hệ thống 28

3.2.2 Độ chọn lọc 29

3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 31

3.2.4 Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện 32

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official

Analytical Communities

Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức

APCI Atmospheric Pressure

Photonization Ion hóa ở áp suất khí quyển BW Body Weight Trọng lượng cơ thể

CE Collision Energy Năng lượng va chạm CXP Collision cell Exit Potential Thế thoát khỏi ô va chạm

DNA Deoxyribonucleic Acid Axit deoxyribonucleic

EC European Commission Ủy ban Châu Âu ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử

EU European Union Liên minh Châu Âu

FIA The Flow Injection Analysis Kỹ thuật phân tích dòng chảy

GC – MS Gas Chromatograpy/ Mass

Spectroscopy

Phương pháp sắc ký khí kết hợp phép đo khối phổ

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC – PDA

High-Performance Liquid Chromatography with Photodiode Array Detection

Sắc ký lỏng hiệu năng cao với phát hiện bằng dãy diode quang

LC – MS/MS

Liquid chromatography- tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần

LD50 Lethal Dose 50 Liều lượng của chất phơi nhiễm gây ra

cái chết cho 50% (một nửa) LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Qualification Giới hạn định lượng

m/z Mass to charge ratio Khả năng phân tích số khối

ME Matrix Effect Ảnh hưởng nền mẫu

MPL Maximum Residue Limit Giới hạn dư lượng tối đa

MRM Multiple Reaction Monitoring Chế độ theo dõi đa phản ứng

MS Mass Spectrometry Phép đo khối phổ

RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Mức giới hạn tối đa cho phép trong táo và các sản phẩm từ táo 4

Bảng 1.2 Các phương pháp xác định Patulin trên thế giới 4

Bảng 1.3 Phương pháp xác định Patulin ở Việt Nam 9

Bảng 2 1 Yêu cầu về độ lệch tương đối (𝑅𝑑𝑖𝑓𝑓 %) 17

Bảng 2 2 Độ thu hồi và độ lặp lại theo quy định AOAC 19

Bảng 3 1 Các điều kiện phân tích Patulin bằng ESI (-) – MS/MS 21

Bảng 3 2 Các thông số tối ưu cho thiết bị MS 21

Bảng 3 3 Chương trình gradient pha động 22

Bảng 3.4 Kết quả phương trình đường chuẩn của Patulin trên các nền 28

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá ảnh hưởng nền 28

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ ổn định hệ thống 29

Bảng 3.7 Bảng so sánh tỉ số ion 29

Bảng 3.8 Kết quả phương trình đường chuẩn của Patulin trên các nền mẫu 31

Hình 3.11 Sắc ký đồ giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của Patulin trên nền mẫu 32

Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của Patulin trên nền mẫu 32

Bảng 3.10 Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại của Patulin trên nền mẫu 33

Bảng 3.11 Kết quả độ tái lặp nội bộ của chất phân tích trên các nền mẫu 34

Bảng 3.12 Kết quả định tính trên 27 mẫu thực 35

Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát dung môi pha động 23

Hình 3.3 Biểu đồ khảo sát dung môi chiết 24

Hình 3.4 Biểu đồ khảo sát thể tích chiết 25

Hình 3.5 Biểu đồ khảo sát điều kiện cô mẫu 25

Hình 3.6 Biểu đồ khảo sát dung môi hoàn nguyên 26

Hình 3.7 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 27

Hình 3.8 Biểu đồ đường chuẩn trên nền dung môi và mẫu trắng của Patulin 28

Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn Patulin và mẫu trắng thêm chuẩn trên nền mẫu rắn 30

Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn Patulin và mẫu trắng thêm chuẩn trên nền mẫu lỏng 30

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Patulin là một loại độc tố nấm mốc được tạo ra bởi một số loại nấm (Penicillium,

Aspergillus, Byssochlamys) Nấm mốc Penicillium expansum xâm nhập vào những quả táo

bị thương, gây ra nấm mốc xanh phân hủy và sau đó sản sinh ra Patulin - một loại độc tố nấm mốc ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người [34] Patulin có thể xuất hiện trong nhiều loại trái cây, ngũ cốc và các thực phẩm khác bị mốc, tuy nhiên nguồn cung cấp Patulin chính là táo và các sản phẩm từ táo như nước táo, giấm táo, mật táo… [31] Việc sử dụng các thực phẩm tiếp xúc với Patulin có thể dẫn đến một số biến chứng về sức khỏe như ức chế miễn dịch; gây ung thư; viêm, loét và chảy máu đường tiêu hóa; gây đột biến và nhiễm độc phôi và có tác dụng gây quái thai[28] Một số biện pháp chỉ loại bỏ sự tồn tại của mầm bệnh mà không loại bỏ sự hiện diện của Patulin nên thực phẩm làm từ táo phải được giám sát chặt chẽ [34] Quy định của Liên minh Châu Âu (EU) số 2023/915 và quy định của Bộ Y tế Viêt Nam đưa ra giới hạn dư lượng tối đa (MRL) là 50 µg/kg trong nước táo và rượu táo, 25 µg/kg trong các sản phẩm táo dạng rắn và 10 µg/kg trong các sản phẩm dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (trẻ dưới 36 tháng tuổi) [3], [32]

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về xác định hàm lượng Patulin trong táo và sản phẩm từ táo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [24], [25], [26], [30] , sắc ký khí khối phổ (GC-MS) [20] hoặc sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) [21], [22], [29], [33] Ở Việt Nam có nghiên cứu về vấn đề trên bằng phương pháp HPLC [1] nhưng chưa có nghiên

cứu sử dụng phương pháp LC – MS/MS

Giới hạn dư lượng tối đa cho phép của Patulin rất nhỏ, nền mẫu khá phức tạp gây khó khăn cho quá trình phân tích Vì vậy, phân tích bằng LC-MS/MS có độ nhạy, độ chọn lọc cao được ưu tiên lựa chọn

Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng Patulin trong táo và sản phẩm từ táo bằng LC-MS/MS” được thực hiện với mục

tiêu như sau: 1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Patulin trong táo và sản phẩm từ

táo bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS) 2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng Patulin trong một số

mẫu táo và sản phẩm từ táo trên thị trường

2

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Patulin

1.1.1 Tổng quan về Patulin

a Định danh

- Công thức phân tử: C7H6O4- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Patulin

- Tên hóa học: 4-hydroxy-4,6-dihydrofuro[3,2-c] pyran-2-on - Tên gọi khác: 2-Hydroxy-3,7-dioxabicyclo[4.3.0]nona-5,9-dien-8-on; Clairformin; Expansin; Gigantin; Leucopin; Patulin [35]

b Tính chất vật lý, hóa học

- Khối lượng phân tử: 154,12 g/mol - Trạng thái vật lý: chất rắn kết tinh, màu trắng, không mùi - Nhiệt độ nóng chảy: 111,0°C

- Độ tan: tan trong nước và các dung môi phân cực như methanol, ethanol, acetonitril, ethyl acetat, … Patulin khá ổn định trong môi trường acid nhưng

không bền trong môi trường kiềm - Hệ số log Kow (n-octanol/nước): 1,4 – 1,6 [35]

1.1.2 Độc tính

Giá trị LD50 qua đường uống của Patulin ở chuột nhắt và chuột cống thay đổi từ 20 – 100 mg/kg Giá trị này cao hơn nhiều so với nồng độ Patulin thực tế mà sinh vật tiếp xúc Trong các nghiên cứu cấp tính, Patulin gây xuất huyết, hình thành phù nề và giãn nở đường ruột ở động vật thí nghiệm [12] Trong các nghiên cứu cận mãn tính, tăng biểu mô tá tràng và suy giảm chức năng thận được coi là độc tính chính Các dấu hiệu độc hại được báo cáo nhất quán trong tất cả các nghiên cứu là kích động, trong một số trường hợp là co giật, khó thở, tắc nghẽn phổi, phù nề, loét, sung huyết đường tiêu hóa [13]

Ở cấp độ tế bào, Patulin đã được chứng minh là có tác dụng bao gồm phá vỡ màng huyết tương, ức chế tổng hợp protein, ức chế vận chuyển acid amin kết hợp Na+, ức chế phiên mã và dịch mã, ức chế tổng hợp DNA [10] và ức chế interferon γ sản xuất tế bào T-

3 helper loại 1 [18] Hơn nữa, sự mất glutathion tự do trong tế bào sống có liên quan đến phơi nhiễm Patulin [8] và việc điều trị bằng cystein và glutathion ngoại sinh đã ngăn ngừa độc tính của nó trong biểu mô ruột [10]

Ức chế các enzym khác nhau: Patulin tạo thành một chất kết hợp với thiol chứa các thành phần tế bào như glutathion và protein chứa cystein [8] Thật vậy, nhiều enzym có nhóm sulfhydryl ở vị trí hoạt động rất nhạy cảm với Patulin ATPase phụ thuộc Na + - K +, RNA polymerase, aminoacyl-tRNA synthetase và aldolase cơ đều đã được chứng minh là bị ức chế bởi Patulin Tuy nhiên, các enzym thiếu nhóm sulfhydryl như urease cũng nhạy cảm với Patulin [14]

Độc tính miễn dịch: Patulin gây tăng hô hấp và viêm phổi tăng bạch cầu ái toan do đó làm tăng phản ứng miễn dịch dị ứng [16] Patulin tiếp xúc với chuột đực trong 60 đến 90 ngày gây xuất huyết, tăng sản xuất tế bào plasma, giãn nở và xơ hóa vỏ não, mô kẽ phì đại giữa các tiểu thùy tuyến ức, mô mỡ phì đại, vỏ não mỏng đi và mờ vỏ - tủy ranh giới trong tuyến ức ở nồng độ 0,1 mg/kg [7] Phơi nhiễm Patulin dẫn đến giảm biểu hiện IL-4, IL-13, IFN-gamma, IL-10 và sự suy giảm GSH nội bào trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi của con người [9]

Độc tính trên cơ quan: Patulin gây tổn thương đường ruột, nhiễm độc gan, có độc tính trên thần kinh và thận Patulin được báo cáo là gây loét đường ruột, viêm và chảy máu [17] Những con chuột tiếp xúc với Patulin trong 8 tuần cho thấy hàm lượng Glutathione Disulfide, các chất phản ứng với axit thiobarbituric và hàm lượng protein carbonyl tăng lên Hơn nữa, PAT còn làm giảm hoạt động của glutathione peroxidase và glutathione reductase Trong tế bào thần kinh-2a, Patulin gây ra sự suy giảm ATP và rối loạn chức năng ty thể và lysosomal [11] Chất độc có thể tập trung ở mô thận do quá trình tái hấp thu ở ống thận Khi nồng độ của chất độc trong lòng thận và các tế bào thận xung quanh khá cao gây độc tính do patulin [28]

Khả năng gây ung thư: Có rất ít dữ liệu được báo cáo về khả năng gây ung thư của Patulin, do đó nó được phân loại vào nhóm 3 vì nó không gây ung thư cho con người, tuy nhiên, việc tiếp xúc lâu dài với Patulin ở chuột cống và chuột nhắt cho thấy khả năng gây ung thư Ở chuột, người ta quan sát thấy sự gia tăng đáng kể tỷ lệ mắc khối u giữa động vật đối chứng và động vật được điều trị bằng Patulin dẫn đến ung thư sarcoma tại chỗ tiêm Khi tiêm dưới da, cả chuột đực và chuột cái được tiêm liều cao nhất (1,5 mg/kg) đều không sống sót Trong suốt thời gian nghiên cứu, chứng minh tính độc hại của Patulin bằng việc bôi Patulin tại chỗ một lần ở nồng độ 400 nM gây ra sự hình thành khối u trên da chuột sau 14 tuần Từ đó cho thấy vai trò của nó như là tác nhân khởi đầu khối u [15]

4

1.1.3 Quy định hiện hành

Patulin có đặc tính kháng sinh nhưng đã được chứng minh là gây ung thư và gây đột biến trên động vật do đó một số quốc gia đã ban hành các hạn chế về Patulin trong các sản phẩm táo Patulin đã được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế phân loại là chất gây ung thư nhóm 3, nhóm này bao gồm các hợp chất không có đủ dữ liệu để cho phép phân loại Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cáo mức tối đa là 50 µg/L nước táo [27]

EU và Bộ Y tế Việt Nam có quy định giới hạn tối đa của Patulin là giống nhau [3], [32] được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Mức giới hạn tối đa cho phép trong táo và các sản phẩm từ táo

(µg/kg)

Nước ép trái cây, nước ép trái cây cô đặc và mật hoa quả 50 Đồ uống có cồn: rượu táo và các đồ uống lên men khác làm từ

Các sản phẩm táo dạng rắn được đưa ra thị trường (Bao gồm

Nước ép táo và các sản phẩm táo đặc dành cho trẻ sơ sinh và

1.2 Tổng quan phương pháp xác định Patulin

1.2.1 Một số phương pháp xác định Patulin trên thế giới

Bảng 1.2 Các phương pháp xác định Patulin trên thế giới

Nền mẫu - TLTK

Phương pháp xử lý mẫu Phương pháp phân tích

Táo và sản phẩm từ

táo [22]

Chiết lỏng - lỏng 5 mL nước táo đã đồng nhất thêm 20 mL ethyl acetat Siêu âm 15 phút Dịch chiết ethyl acetat được làm bay hơi dung môi bằng máy cô quay chân không đến cắn Hòa tan cắn trong 1 mL dung dịch methanol/nước/acid acetic (83,5:16:0,5, v/v/v)

LC - MS/MS -Pha tĩnh: cột Nova-Pak C18 (150 mm × 3,9 mm × 4 μm) (Waters, Milford, USA)

- Pha động: kênh A: CH3COOH 0,1%/ MeOH 10%/H2O; kênh B: CH3COOH 0,1%/MeOH 100% - Tốc độ dòng: 0,25 mL/phút

5

- Chương trình gradient: Ban đầu với 0% B, giữ trong 1 phút, sau đó tăng đến 85% B trong 2 phút, giữ trong 1 phút, cột được cân bằng trong 2 phút với 100 % B cho đến lần tiêm tiếp theo

- Ion hóa ESI (-) - m/z: ion mẹ (153,1); ion con (109 và 81)

- LOD= 1 µg/kg LOQ= 5 µg/kg

Sản

phẩm trái cây

[25]

Chiết lỏng – lỏng - Với táo gai khô: 4 g mẫu đã đồng nhất, thêm 4 mL nước cùng 75 μL pectinase Ủ ở 40℃ trong 2 giờ để thực hiện phản ứng enzym

- Với nước táo: 4 g mẫu đã đồng nhất - Chiết bằng 20 mL ACN, lắc xoáy 2 phút Ly tâm 6793 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng

Thu dịch chiết, thêm 1g PSA và 3g MgSO4 Lắc nhanh bằng tay trong 1 phút Ly tâm 6793 vòng/phút trong 3 phút Hút 9 mL dịch phía trên đưa qua cột đa chức năng PriboFast® 228 để làm sạch 4 mL dịch chiết đã làm sạch được làm khô bằng khí nitơ ở 45 ℃ Hoàn nguyên bằng 1 mL ACN: H2O pH=4 (10:90, v/v) Lọc qua màng lọc 0,22 µm

HPLC - UV - Pha tĩnh: Cột Waters Xbridge™ C18 (250 mm × 4,6 mm × 5,0 μm), tiền cột Xbridge™ C18 (4,6 mm × 20 mm × 5,0 μm)

- Pha động: ACN: H2O (10:90, v/v) - Bước sóng: 276 nm

- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút - Thể tích tiêm: 50 μL - Nhiệt độ cột: 30℃

- LOD= 2,6 µg/kg; LOQ= 8,0µg/kg

Nước ép táo [29]

Chiết lỏng- lỏng Cân 10 g mẫu đã đồng nhất, thêm 20 mL ethyl acetat Lắc đều và siêu âm 15 phút Ly tâm 4000 vòng/phút trong

LC-MS/MS - Pha tĩnh: cột pha đảo C18 (50 mm × 2,1 mm × 2,6 µm) Nhiệt độ cột 40℃

6 5 phút thu lớp dịch trên Thổi khô bằng khí nitơ ở 50℃ Hoàn nguyên bằng 1 mL methanol Lọc qua màng lọc 0,22 µm

CH3COONH4/H2O 40 mM; kênh B: CH3COONH4/MeOH 40 mM

- Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút - Ion hóa ESI (-)

- m/z: ion mẹ (153,1); ion con (109,15 và 81,10)

- LOD= 9,85 µg/kg; LOQ= 19,7 µg/kg

Nước ép táo [20]

Chiết lỏng- lỏng Cân 5 g mẫu đã đồng nhất thêm đồng thời 40 µL chất chuẩn nội 13C5-7patulin 2 mg/L và 0,5 g Na2CO3 Thêm tiếp 5 mL dd ethyl acetat: n- hexan (95:5, v/v), lắc mạnh bằng tay trong 1 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển lớp trên vào lọ 25 mL Chiết lặp lại 3 lần Thêm 150 µL acid acetic vào bình chứa dịch chiết Thổi khô bằng khí nitơ

GC-MS - Pha tĩnh: cột Supelco SLB-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm), tiền cột có cùng đường kính

-Tốc độ dòng khí mang heli: 1 mL/phút

- Áp suất xung 40psi, 60 giây - Chương trình nhiệt độ lò: 100℃ trong 1 phút, tăng lên 180℃ với tốc độ 10℃ /phút Tăng lên 280℃ với tốc độ 30℃/phút và giữ trong 12,67 phút Tổng thời gian chạy là 25 phút - LOD= 0,4 µg/kg

LOQ= 1,6 µg/kg

Nước ép táo [21]

1mL mẫu đã đồng nhất thêm 10mL ACN, lắc ngang 20 phút Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 10℃ Thu 5 mL dịch chiết Thổi khô bằng khí nitơ ở 40℃ Hoàn nguyên cặn

bằng 0,2 mL ACN

LC- MS/MS - Pha tĩnh: cột pha đảo C18 (150 mm × 4,6 mm × 5,0 μm)

- Pha động: kênh A: H2O: CH3COOH (99:1, v/v); kênh B: ACN/ CH3COOH (99:1, v/v)

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút - Thể tích tiêm: 50 μL - Chương trình gradient: Ban đầu với 1 % B, giữ trong 1 phút, sau đó tăng

7

đến 100% B trong 3,5 phút, sau đó giảm đến 99% B trong 1 phút cột được cân bằng với 1% B trong 4,5 phút cho đến lần tiêm tiếp theo - Ion hóa APCI (-)

- m/z: ion mẹ (152,9); ion con (108,9; 134,8 và 124,8) - LOD = 0,5 µg/L LOQ = 4 µg/L

Trái cây, nước ép

và sinh tố [24]

Chiết lỏng- lỏng 50 mL mẫu lỏng hoặc 50 g mẫu rắn được thêm 100 mL nước Chiết bằng 50 mL ethyl acetat, lắc mạnh 15 phút bằng máy lắc Ly tâm 4500 vòng/phút trong 10 phút Thu lớp hữu cơ phía trên, pha nước chiết lại 2 lần với 20 mL ethyl acetat Gộp dịch chiết, thêm 2 mL natri carbonat 1,5%, lắc mạnh Thêm 5 mL ethyl acetat vào dd Na2CO3, lắc mạnh trong 5 phút Dịch chiết được chỉnh pH=4 bằng acid caetic băng Làm bay hơi đến khô ở 60℃, hòa cắn bằng 5 mL dd ACN 5%, lọc qua màng lọc 0,22 µm Làm bay hơi đến khô ở 60℃, hòan nguyên bằng 500 µL methanol

HPLC – UV - Pha tĩnh: cột pha đảo C18 (250 mm × 4,6 mm × 5 μm)

- Pha động: ACN: H2O (90:10) - Bước sóng: 276 nm

- Tốc độ dòng: 1 mL/ phút - Chạy chế độ đẳng dòng - LOD= 0,04 mg/kg LOQ= 0,12 mg/kg

Trái cây (táo)

[30]

Chiết lỏng – lỏng Chiết 1g mẫu đã đồng nhất bằng 2 mL ethyl acetat, lắc xoáy 5 phút Thêm 2 mL Na2CO3 1,5%, lắc xoáy 1 phút Thêm 20 µL acid acetic, lắc trong máy lắc quỹ đạo 250 vòng/phút trong 5 phút Để yên để tách pha, thu dịch

HPLC - PDA - Pha tĩnh: cột Kinetex XB-C18 (150 mm × 4,6 mm × 3,5 µm)

(Phenomenex, Torrance, CA, USA) - Pha động: CH3COONH4 0,02M: ACN (9:1, v/v)

- Bước sóng: 276 nm

8 chiết phía trên Dịch chiết được làm khô bằng khí nitơ ở nhiệt độ 50℃ Hoàn nguyên bằng CH3COONH4 0,02 M: ACN (9:1, v/v) Lọc qua màng lọc PTFE 0, 22 µm

- Nhiệt độ cột: 30℃ - Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút - LOD= 0,006 µg/g

LOQ= 0,018 µg/g

Thức ăn trẻ em có thành

phần từ táo [26]

Chiết pha rắn - 10 g mẫu được thêm 10 mL nước - Thêm 25 mL ethyl acetat, lắc xoáy 10 phút Thu lớp dịch trên, thêm 9 mL Na2CO3 1,5%, lắc mạnh Thêm 10 mL ethyl acetat vào lớp Na2CO3 ở phía dưới để chiết lần 2 Gộp dịch chiết 2 lần, khử nước bằng 4 g Na2SO4 khan - Dịch chiết hữu cơ được làm bay hơi đến khô bằng thiết bị cô quay Hòa cặn bằng 2 mL chloroform

- Qua cột HLB (Waters Oasis cân bằng lipophilic):

+ Hoạt hóa: 1 mL MeOH, 1mL H2O + Nạp mẫu: nạp toàn bộ mẫu, tốc độ 2-3 mL/phút

+ Rửa tạp: 1 mL Na2CO3, 1mL acid acetic

+ Rửa giải: 2 mL ethyl acetat: hexan (3:2)

n Dịch rửa giải được làm khô bằng khí nitơ đến cắn

- Hoàn nguyên bằng 0,2 mL pha động, lọc qua màng cellulose 0,45 µm

HPLC – PDA - Pha tĩnh: Cột Gemini C18 110Å (250 mm × 4,6 mm × 3,0 µm) - Pha động: ACN: H2O với CH3COOH 15 mM (pH = 4) - Bước sóng: 276 nm

- Nhiệt độ cột: 25 – 40 ℃ - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - Thể tích tiêm: 20 µL - LOD = 9,66×10-6 µg/mL LOQ = 2,93×10-5 µg/mL

Chiết pha rắn - Xử lý đĩa Oasis MAX 96 giếng: 200 μL MeOH và 200 μL H2O, áp suất thường

LC – MS/MS - Pha tĩnh: Cột Acquity UPLC® HSS T3 (100 mm × 2,1 mm × 1,7 μm)

9 Nước

trái cây (Nước ép táo) [33]

- 1 mL nước ép đã đồng nhất được thêm vào ống ly tâm 1,5 mL, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút Hút 200 μL dịch phía trên sang đĩa Oasis MAX 96 giếng (Nạp mẫu)

- Rửa tạp: 50 μL amoni hydroxit 0,8% trong nước và 100 μL nước, áp suất 6 psi

- Rửa giải: 200 μL MeOH, áp suất 6 psi trong 3 phút

- Dung dịch rửa giải được pha loãng với 200 μL nước để phân tích LC-MS/MS

- Pha động: kênh A: H2O; kênh B: ACN

- Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút - Thể tích tiêm: 10 μL - Nhiệt độ cột: 35℃ - Chương trình gradient: Ban đầu với 10 % B, giữ trong 1 phút, sau đó tăng đến 60% B trong 2 phút, giữ trong 1 phút, cột được cân bằng trong 2 phút với 10 % B cho đến lần tiêm tiếp theo

- Ion hóa ESI (-) - m/z: ion mẹ (153,0); ion con (108,9 và 80,9)

- LOD = 0,3 µg/L LOQ = 1,0 µg/L

1.2.2 Một số phương pháp xác định Patulin ở Việt Nam

Bảng 1.3 Phương pháp xác định Patulin ở Việt Nam

Nền

Nước trái cây

[1]

Chiết lỏng-lỏng Chiết 20 mL mẫu nước trái cây bằng 20 ml ethyl acetat thu dịch chiết Chiết lần 2 bằng 20 mL ethyl acetat, gộp dịch chiết Thêm 4mL Na2CO3, lắc 30 giây, thu lấy lớp trên Lọc qua phễu chứa Na2SO4 khan Dịch lọc cô quay chân không (V < 1 mL) Thổi khô bằng khí nitơ, thêm 1 mL nước, lọc qua màng lọc 0,45 µm

HPLC – UV - Pha tĩnh: Cột pha đảo C18 (150 mm × 4,6 mm, 5µm)

- Pha động: H2O: CH3CN (90:10, v/v)

- Bước sóng: 276 nm - Nhiệt độ phòng - Thể tích tiêm mẫu: 20 µL - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - LOD= 0,016 ppm

LOQ= 0,053 ppm

- Pha tĩnh: cột C18 octyldecylsilan

10 Táo và

sản phẩm từ táo [2]

+ Nước ép táo đục: 20,0 mL thêm 150 µL dd enzym endogalacturonaza (hoạt độ 1400 U/g) Để qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc để 2 h ở 40 0C, ly tâm 4500 v/p trong 5 phút

+ Puree táo: 10,0 g thêm 150 µL dd enzym endogalacturonaza (hoạt độ 1400 U/g) và 10 mL nước, lắc kỹ Để qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc để 2 h ở 40 0C, ly tâm 4500 v/p trong 5 phút

- Chiết lỏng - lỏng: Thêm 20 ml etyl axetat, lắc trong 1 phút Thu lớp trên, chuyển phần nước vào lại phễu chiết và chiết 3 lần bằng 20 ml etyl axetat Gộp dịch chiết 3 lần, tráng bình nón bằng 5 ml etyl axetat mới và gộp nước rửa này vào dịch chiết etyl axetat trong phễu chiết Thêm 4 ml dd Na2CO3, lắc trong 30 giây Lọc lớp trên qua giấy lọc có chứa khoảng 15 g natri sulfat khan Tráng 3 lần phễu chiết bằng 15 ml etyl axetat và cho qua natri sulfat vào bình cầu đáy tròn Thổi khô dung môi bằng khí Nitơ Hoàn nguyên bằng 1,0 mL H2O (pH = 4), lọc qua màng lọc 0,2 µm

- Pha động: H2O: ACN: HClO4(95:5:0,095, v/v/v)

- Bước sóng: 276 nm - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - Khoảng làm việc:

+ Nước táo trong: 26 - 128 mg/l + Nước táo đục: 26 - 106 mg/l + Puree táo: 23 - 121 mg/kg

1.3 Phương pháp LC- MS/MS

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC – MS (Liquid chromatography – mass spectrometry) hoạt động dựa trên nguyên tắc tách phân lập các chất trong hỗn hợp nhờ hệ thống sắc ký lỏng (LC) và phát hiện các chất dựa vào tỷ lệ khối lượng và điện tích của ion mẹ (m/z) của bộ phận khối phổ (MS/MS) [6]

11

Hình 1.2 Mô hình hệ thống LC-MS/MS

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [4]

1.3.2 Khối phổ

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng cách phân tách các ion phân tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa… các ion tạo thành được tách theo tỷ số m/z và được phát hiện tại detector Từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [6]

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm: nguồn ion hóa, bộ phận phân thích khối phổ, bộ phận phát hiện và bộ phận ghi và xử lý số liệu

a Nguồn ion hóa

Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn đến nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử Các kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ là ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization – ESI) và ion hóa ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APCI) Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật ion hóa ESI

12 Kỹ thuật ESI chuyển các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí Dung dịch mẫu được dẫn vào vùng có trường điện tử mạnh được duy trì ở hiệu điện thế khoảng 1 – 5 Kv Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới khối vào của thiết bị phân tích khối phổ Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi Có hai chế độ bắn phá: chế độ ion dương ESI (+) và ion âm ESI (-) Đối với chế độ ESI (+) ion được tạo thành thường là ion (M+H) + Còn với chế độ ESI (-), ion tạo thành thường là ion (M-H)-

b Bộ phận phân tích khối phổ[6]

Các ion được đưa đến bộ phận phân tích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện bắn phá thêm để thu được các ion con Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phận phân tích tứ cực, bộ phận phân tích bẫy ion, bộ phận phân tích thời gian bay

Bộ tứ cực (Quandrupole) dựa trên nguyên tắc các ion có khối lượng khác nhau sẽ dao động khác nhau theo điện áp tổng hợp một chiều và xoay chiều đặt vào môi trường di chuyển của nó Những ion có tỷ số m/z phù hợp mới có thể đi qua bộ lọc này

Bộ tứ cực chập ba được sử dụng với ba bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 được sắp xếp như hình 1.3

Hình 1.3 Cấu tạo bộ tứ cực chập ba

Vai trò của từng bộ tứ cực: Q1: Tách các ion, lựa chọn ra các tiền ion (ion mẹ) Những ion khác bị loại đi vì va đập vào các bản điện cực trái dấu

Q2: Ở điều kiện áp suất cao, các tiền ion bị phân ly do va chạm với khí trơ Nhờ va chạm mà năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con và được dẫn đến Q3

Q3: Tách các ion con thích hợp để chuyển tới detector

c Bộ phận phát hiện ion (detector)

Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion dương tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng điện tích di chuyển

Bộ phát hiện electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao Các ion sau khi qua Q3 sẽ đập vào bề mặt diod tiếp theo tạo ra các electron thứ cấp Tín hiệu

13 được khuếch đại và được ghi lại, tín hiệu này tỷ lệ thuận với lượng ion nên tỷ lệ với nồng độ chất phân tích ban đầu

d Bộ phận ghi và xử lý số liệu

Tín hiệu điện tử từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số, phục

vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu như: ghi phổ khối, so sánh với thư viện phổ, định lượng, …

14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên liệu và trang thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Patulin - Đối tượng mẫu khảo sát: Mẫu táo và các sản phẩm từ táo (bao gồm nước ép táo, giấm táo, rượu táo, sản phẩm táo đặc dành cho trẻ dưới 36 tháng tuổi)

2.1.2 Chất chuẩn

- Chuẩn Patulin có độ tinh khiết 99,0%, Pribolab

2.1.3 Dung môi, hóa chất

- Các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết dùng cho phân tích - Dung môi tiêu chuẩn LC-MS: Methanol, acetonitril, amoni acetat (Merck, Đức) - Dung môi tiêu chuẩn phân tích: Ethyl acetat, acid acetic, natri carbonat, natri sulfat (Merck, Đức); nước cất 2 lần

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng HPLC 20 AXL của Shimadzu gắn đầu dò khối phổ SciexTriple Quad 5500; Thiết bị siêu âm Elma S 180H; Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Mettler Toledo; Máy ly tâm lạnh HERMLE- 326K; Máy vortex IKA vortex Genius 3; Thiết bị đuổi dung môi bằng khí N2 Organomation 8125 N-EVAP 112; Máy đo pH, Mettler Toledo

Dụng cụ: Micropipet có thể điều chỉnh được 1000- 5000 µL, 100- 1000 µL, 20- 200 μL, 10- 100 μL, 2- 20 μL; Pipet Pasteur; Ống ly tâm Falcon 50 mL; Giấy lọc; Vial loại 1,5 mL; Màng lọc 0,2 µm

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, đề tài được thực hiện với 3 nội dung chính như sau:

- Khảo sát quy trình xử lý mẫu, điều kiện khối phổ, điều kiện sắc ký để tách Patulin ra khỏi nền mẫu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)

- Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: Độ ổn định hệ thống, độ chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ chính xác của phương pháp theo hướng dẫn của AOAC 2016 và EC (2021)

- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng vào phân tích mẫu thực

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp nghiên cứu

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn

15 - Dung dịch chuẩn gốc 10 µg/mL: dùng micropipet hút chính xác 1000 µL dung dịch chuẩn gốc Patulin 200 µg/mL vào bình định mức 20 mL Định mức vừa đủ bằng ACN, bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8℃, bền trong 3 tháng

- Dung dịch chuẩn trung gian 1 µg/mL: dùng micropipet hút chính xác 1000 µL dung dịch chuẩn gốc Patulin 10 µg/mL vào bình định mức 10 mL Định mức vừa đủ bằng ACN, bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8℃, bền trong 3 tháng

- Dung dịch chuẩn làm việc: từ dung dịch chuẩn 10 µg/mL và 1 µg/mL, tiến hành pha loãng bằng MeOH: H2O pH=4 (1:1, v/v) để thu được dãy đường chuẩn 30ppb - 50ppb – 100ppb – 200ppb – 500ppb – 1000ppb – 2000ppb, bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8℃, bền trong 7 ngày

2.3.1.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Quy trình xử lý mẫu dự kiến được xây dựng dựa trên tham khảo một số quy trình nghiên cứu trước đó [21], [22], [29], [33]

Bước 1: Cân chính xác khoảng 10,00 (g) mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL, thêm 10,00 mL dung dịch acid acetic 2%, lắc xoáy trong 2 phút

Bước 2: Thêm 20,00 mL ethyl acetat, lắc xoáy trong 5 phút, siêu âm trong 15 phút ở nhiệt độ thường Cho ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút bằng máy li tâm lạnh và tách riêng pha lỏng vào ống li tâm 50 mL khác Lặp lại nước này với 20,00 mL ethyl acetat Gộp dịch chiết 2 lần

Bước 3: Thêm 5,00 mL Na2CO3 1,5% vào dịch chiết, lắc xoáy trong 1 phút, ly tâm 6000 vòng/phút trong 3 phút Lớp dịch phía trên được lọc qua giấy lọc chứa Na2SO4 khan Bước 4: Chuyển 20,0 mL dịch lọc vào bình cầu 100 mL, cô quay chân không đến cạn Bước 5: Hoàn nguyên bằng 1,00 mL CH3COOH 0,1%/ H2O Lọc qua màng lọc 0,2 µL vào vial 1,5 mL

Các yếu tố cần khảo sát trong quy trình xử lý mẫu gồm: - Khảo sát dung môi chiết

- Khảo sát thể tích chiết - Khảo sát điều kiện cô mẫu - Khảo sát dung môi hoàn nguyên

2.3.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng

Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký khác nhau để có thể tách và phát hiện chất nghiên cứu:

- Khảo sát cột sắc ký - Khảo sát thành phần pha động

16

2.3.1.4 Khảo sát điều kiện khối phổ

- Ion hóa bằng nguồn ESI - Xác định và lựa chọn ion mẹ và ion con phù hợp sử dụng chế độ ion âm tạo ion mẹ (M-H) -, sử dụng chế độ theo dõi đa phản ứng (MRM) để xác định tín hiệu

- Tối ưu hóa các điều kiện MS/MS

2.3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của nền

Xây dựng đồng thời đường chuẩn trên nền dung môi và đường chuẩn trên nền mẫu trắng cho chất phân tích

Xác định ảnh hưởng của nền mẫu lên tín hiệu của chất phân tích bằng cách so sánh hệ số góc của 2 đường chuẩn:

Độ chọn lọc là khái niệm rộng hơn độ đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy trình Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc

Để đánh giá chọn lọc của phương pháp, tiến hành so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn

Yêu cầu:

17 - Sắc ký đồ của mẫu trắng không được xuất hiện tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích

- Sắc ký đồ của mẫu chuẩn phải có tín hiệu của chất phân tích - Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn hoặc chênh lệch không quá 0,1 phút

- Mỗi chất phân tích cần được xác nhận bằng sự có mặt của 2 ion con, đạt yêu cầu về độ đặc hiệu của phương pháp LC-MS/MS với số điểm IP là 5 [19]

- Tỉ số ion của hai ion thu được ở mẫu thêm chuẩn phải tương đồng với tỉ số ion ở mẫu chuẩn hoặc chênh lệch không quá quy định theo hướng dẫn của Hội đồng Châu Âu (EC 2021)

𝑅𝑑𝑖𝑓𝑓 (%) =𝐼𝑅𝑠𝑝𝑘 − 𝐼𝑅𝑠𝑡𝑑

𝐼𝑅𝑠𝑡𝑑 × 100% Trong đó: 𝑅𝑑𝑖𝑓𝑓: độ lệch tương đối

𝐼𝑅𝑠𝑝𝑘: tỉ số ion trong mẫu thêm chuẩn 𝐼𝑅𝑠𝑡𝑑: tỉ số ion trong mẫu chuẩn dung môi

IR = Spic của mảnh định tínhSpic của mảnh định lượng

Bảng 2 1 Yêu cầu về độ lệch tương đối (𝑅𝑑𝑖𝑓𝑓 %)

Cường độ tương ứng (so với ion chính) (IR) LC - MS/MS

2.3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của thiết bị và nồng độ của chất phân tích có trong mẫu

Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Để xác định đường chuẩn, tiến hành: - Chạy sắc ký một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi - Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính và đánh giá đường chuẩn dựa trên hệ số tương quan (R) và độ chệch của các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn (∆𝑖 )

18 Phương trình hồi quy: y = ax + b

Trong đó: a: giá trị độ dốc b: giá trị hệ số chặn

Yêu cầu:

- Hệ số tương quan hồi quy R: R ≥ 0,995 hay 0,99 ≤ R2 ≤1

𝑅 = ∑(𝑥𝑖− 𝑥̅)(𝑦𝑖− 𝑦̅)√∑(𝑥𝑖 − 𝑥̅)2∑(𝑦𝑖 − 𝑦̅)2

- Độ chệch của các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn: không được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%

∆𝑖 = 𝐶𝑡 − 𝐶𝑐

𝐶𝑐 × 100% Trong đó: ∆𝑖 (%): Độ chệch của từng điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn 𝐶𝑡: Nồng độ xác định được từ đường chuẩn của các điểm chuẩn

𝐶𝑐: Nồng độ lý thuyết của các điểm chuẩn

2.3.2.4 Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp là sự kết hợp giữa độ đúng và độ chụm - Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Độ đúng có thể xác định thông qua xác định độ thu hồi của phương pháp Độ thu hồi là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết

- Độ chụm chỉ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình Đánh giá độ chụm của phương pháp thông qua độ lặp lại và độ tái lặp nội bộ Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn

Để xác định độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp, tiến hành thêm chuẩn vào mẫu trắng ở 3 mức nồng độ khác nhau, tính toán kết quả theo công thức:

Độ thu hồi (%) = Cthực

Cspk × 100%Trong đó: Cthực: Nồng độ chất phân tích có trong mẫu, được tính qua đường chuẩn Cspk: Nồng độ chất phân tích được thêm vào mẫu trắng

Độ lặp lại được biểu thị thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):

𝑆𝐷 = √∑ (𝑥𝑖 − 𝑥̅)

2𝑁

𝑖=1

𝑁 − 1

19 𝑅𝑆𝐷 (%) =𝑆𝐷

𝑥̅ × 100%Trong đó: 𝑥𝑖: Nồng độ lần thử nghiệm thứ i

𝑥̅: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm 𝑁: Số lần thử nghiệm

SD: Độ lệch chuẩn - Độ chính xác trung gian: Tiến hành phân tích 6 lần ở một mức nồng độ tương tự trong độ lặp lại tại thời điểm khác, được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đồi RSD (%)

Yêu cầu: Độ thu hồi, độ lặp lại và độ chính xác trung gian phải đáp ứng yều cầu tương

ứng nồng độ theo AOAC 2016 [23]

Bảng 2 2 Độ thu hồi và độ lặp lại theo quy định AOAC

TT Hàm lượng (%) Đơn vị RSD (%) Độ thu hồi (%)

2.3.2.5 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng [5]

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn

Xác định giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp bằng cách tính tỉ số tín hiệu nhiễu đường nền (S/N) Thực hiện phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = signal to noise ratio)

20 LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần đường nhiễu nền, thông thường lấy S/N = 10 LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp khoảng 3 lần đường nhiễu nền, thông thường lấy S/N = 3

Trong đó: N: nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền, nhiễu lân cận hai

bên của pic, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của pic tại nửa chiều cao

S: chiều cao tín hiệu của chất phân tích

2.3.4 Áp dụng phương pháp xác định mẫu thực tế trên thị trường

Các mẫu táo và sản phẩm từ táo được mua ngẫu nhiên tại các chợ, siêu thị trên địa bàn Hà Nội và trên các sàn thương mại điện tử

Mẫu khi được chuyển đến phòng thí nghiệm được đồng nhất, xử lý mẫu theo quy trình và thực hiện phân tích bằng thiết bị LC-MS/MS

21

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng quy trình phân tích bằng LC – MS/MS

3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích

3.1.1.1 Điều kiện khối phổ

Kỹ thuật FIA (the flow injection analysis): dung dịch chuẩn Patulin 1ppm được bơm trực tiếp vào máy MS/MS cùng với dòng pha động mà không qua cột sắc ký Thực hiện khảo sát bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) với chế độ bắn ion âm

a Lựa chọn ion phân tử và ion sản phẩm

Lựa chọn ion mẹ có dạng (M-H)- sau đó phân mảnh ion mẹ để thu được các ion con Ion con có cường độ cao nhất được lựa chọn làm ion định lượng, các ion con có cường độ thấp hơn được sử dụng để định tính Năng lượng va chạm (CE) được tối ưu tự động theo từng ion con dựa vào phần mềm thiết bị như bảng 3.1

Bảng 3 1 Các điều kiện phân tích Patulin bằng ESI (-) – MS/MS

Chất phân tích Ion mẹ Ion con CE (eV) CXP (V) Ghi chú

b Tối ưu hóa các điều kiện MS/MS

Các thông số thiết bị tối ưu cho chất phân tích được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3 2 Các thông số tối ưu cho thiết bị MS

Áp suất khí mang Curtain gas(CUR) 20 Psi Áp suất khí va chạm Collision gas (CAD) 8 Psi

Thế ion hóa Ionspray Voltage (IS) -4500 V Nhiệt độ nguồn ion Temperature (TEM) 450 ℃ Áp suất khí nguồn 1 Ion source gas 1 (GS1) 50 Psi Áp suất khí nguồn 2 Ion source gas 2 (GS2) 50 Psi Thế cổng vào Entrance Potential (EP) -9 V Nhận xét: Từ 2 bảng trên xác định được điều kiện MS/MS để phân tích Patulin Kết quả khảo sát cho thấy ion mẹ ở dạng [ M-H]- có số khối nhỏ hơn khối lượng phân tử 1 đơn vị (m/z = M-1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất Do đó, chất phân tích được xác định bằng một ion mẹ và hai ion con dùng để định lượng và định tính Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS theo tiêu chuẩn của EC (2021/808) với số điểm nhận dạng (IP) là 5 (kỹ thuật tách LC – 1 điểm; 1 ion mẹ – 1 điểm và 2 ion con – mỗi ion 1,5 điểm) [19]

22

3.1.1.2 Điều kiện sắc ký lỏng a Khảo sát và lựa chọn cột sắc ký

Phân tích mẫu chuẩn Patulin nồng độ 0,1 µg/mL với các cột sắc ký: (1) Cột sắc ký Kinetex XB – C18 (150 mm × 4,6 mm × 3,5 µm) (Phenomenex) (2) Cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm × 2,1 mm × 3,5 µm) (Waters)

(3) Cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm × 3,0 mm × 3,5 µm) (Waters)

Hình 3.1 Sắc ký đồ Patulin cột sắc ký

Từ sắc ký đồ, cột (3) cho tín hiệu diện tích pic của chất phân tích cao nhất, pic nhọn, cân xứng nên lựa chọn cột Symmetry C18 (150 mm × 3,0 mm × 3,5µm) (Waters)

b Khảo sát và lựa chọn thành phần pha động

Pha động trong LC-MS/MS ảnh hưởng đến hiệu quả tách, quá trình ion hóa và tín hiệu của các chất phân tích

Phân tích dung dịch chuẩn Patulin 1 µg/mL trong MeOH với các hệ pha động: (1) Kênh A: HCOOH 0,1% trong H2O; Kênh B: MeOH

(2) Kênh A: HCOOH 0,1% và HCOONH4 5 mM trong H2O; Kênh B: MeOH (3) Kênh A: HCOOH 0,1% và HCOONH4 10 mM trong H2O; Kênh B: ACN (4) Kênh A: CH3COONH4 40 mM trong H2O;

Kênh B: CH3COONH4 40 mM trong MeOH (5) Kênh A: CH3COONH4 10 mM trong H2O;

Kênh B: CH3COONH4 10 mM trong MeOH Với hệ pha động (5) phân tích dung dịch chuẩn Patulin 1 µg/mL trong MeOH và CH3COOH 0,1%/ H2O

Các hệ pha động trên được chạy theo chương trình gradient ở bảng 3.3 theo tài liệu tham khảo

Bảng 3 3 Chương trình gradient pha động

23 Kết quả khảo sát dung môi pha động được biểu diễn ở hình 3.2

Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát dung môi pha động

Các hệ pha động đều xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Tuy nhiên, pic của chất phân tích ở sắc ký đồ (1), (2) và (3) không tách được hoàn toàn, pic bị chẻ, nhiễu nền cao; Pic của chất phân tích ở sắc ký đồ (4) và (5) - MeOH bị đổ đầu, không cân xứng Sắc ký đồ (5) – CH3COOH 0,1 % có tín hiệu của chất phân tích cao hơn các sắc ký đồ còn lại, pic cân đối và rửa giải ra giữa khoảng thời gian phân tích

Vì vậy, lựa chọn hệ pha động kênh A: CH3COONH4 10 mM trong H2O; kênh B: CH3COONH4 10 mM trong MeOH để tiến hành phân tích và dùng CH3COOH 0,1 % để pha chuẩn làm việc Patulin 1 µg/mL

 Điều kiện sắc ký được lưạ chọn như sau:

- Pha tĩnh: Cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm × 3,0 mm × 3,5 µm) - Pha động: Chạy theo chương trình gradient trong bảng 3.3 với kênh: A: CH3COONH4 10 mM trong H2O; kênh B: CH3COONH4 10 mM trong MeOH

- Tốc độ dòng pha động: 0,4 mL/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20 µL

- Thời gian phân tích: 10 phút

(5) - MeOH (4)

(A)

(B)

(C)

(3) (A)

(B) (C)

(1) (A)

(B) (C)

(2)