DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AOAC Association of Official Analytical Communities Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức APCI Atmospheric Pressure Photonization Ion hóa ở áp suất khí quy
TỔNG QUAN
Tổng quan về Patulin
1.1.1 Tổng quan về Patulin a Định danh
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Patulin
- Tên hóa học: 4-hydroxy-4,6-dihydrofuro[3,2-c] pyran-2-on
- Tên gọi khác: 2-Hydroxy-3,7-dioxabicyclo[4.3.0]nona-5,9-dien-8-on; Clairformin; Expansin; Gigantin; Leucopin; Patulin [35] b Tính chất vật lý, hóa học
- Khối lượng phân tử: 154,12 g/mol
- Trạng thái vật lý: chất rắn kết tinh, màu trắng, không mùi
- Độ tan: tan trong nước và các dung môi phân cực như methanol, ethanol, acetonitril, ethyl acetat, … Patulin khá ổn định trong môi trường acid nhưng không bền trong môi trường kiềm
- Hệ số log Kow (n-octanol/nước): 1,4 – 1,6 [35]
Giá trị LD50 qua đường uống của Patulin ở chuột nhắt và chuột cống thay đổi từ 20 – 100 mg/kg Giá trị này cao hơn nhiều so với nồng độ Patulin thực tế mà sinh vật tiếp xúc Trong các nghiên cứu cấp tính, Patulin gây xuất huyết, hình thành phù nề và giãn nở đường ruột ở động vật thí nghiệm [12] Trong các nghiên cứu cận mãn tính, tăng biểu mô tá tràng và suy giảm chức năng thận được coi là độc tính chính Các dấu hiệu độc hại được báo cáo nhất quán trong tất cả các nghiên cứu là kích động, trong một số trường hợp là co giật, khó thở, tắc nghẽn phổi, phù nề, loét, sung huyết đường tiêu hóa [13] Ở cấp độ tế bào, Patulin đã được chứng minh là có tác dụng bao gồm phá vỡ màng huyết tương, ức chế tổng hợp protein, ức chế vận chuyển acid amin kết hợp Na + , ức chế phiên mã và dịch mã, ức chế tổng hợp DNA [10] và ức chế interferon γ sản xuất tế bào T-
3 helper loại 1 [18] Hơn nữa, sự mất glutathion tự do trong tế bào sống có liên quan đến phơi nhiễm Patulin [8] và việc điều trị bằng cystein và glutathion ngoại sinh đã ngăn ngừa độc tính của nó trong biểu mô ruột [10] Ức chế các enzym khác nhau: Patulin tạo thành một chất kết hợp với thiol chứa các thành phần tế bào như glutathion và protein chứa cystein [8] Thật vậy, nhiều enzym có nhóm sulfhydryl ở vị trí hoạt động rất nhạy cảm với Patulin ATPase phụ thuộc Na + - K + , RNA polymerase, aminoacyl-tRNA synthetase và aldolase cơ đều đã được chứng minh là bị ức chế bởi Patulin Tuy nhiên, các enzym thiếu nhóm sulfhydryl như urease cũng nhạy cảm với Patulin [14] Độc tính miễn dịch: Patulin gây tăng hô hấp và viêm phổi tăng bạch cầu ái toan do đó làm tăng phản ứng miễn dịch dị ứng [16] Patulin tiếp xúc với chuột đực trong 60 đến 90 ngày gây xuất huyết, tăng sản xuất tế bào plasma, giãn nở và xơ hóa vỏ não, mô kẽ phì đại giữa các tiểu thùy tuyến ức, mô mỡ phì đại, vỏ não mỏng đi và mờ vỏ - tủy ranh giới trong tuyến ức ở nồng độ 0,1 mg/kg [7] Phơi nhiễm Patulin dẫn đến giảm biểu hiện IL-4, IL-13, IFN-gamma, IL-10 và sự suy giảm GSH nội bào trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi của con người [9] Độc tính trên cơ quan: Patulin gây tổn thương đường ruột, nhiễm độc gan, có độc tính trên thần kinh và thận Patulin được báo cáo là gây loét đường ruột, viêm và chảy máu [17] Những con chuột tiếp xúc với Patulin trong 8 tuần cho thấy hàm lượng Glutathione Disulfide, các chất phản ứng với axit thiobarbituric và hàm lượng protein carbonyl tăng lên Hơn nữa, PAT còn làm giảm hoạt động của glutathione peroxidase và glutathione reductase Trong tế bào thần kinh-2a, Patulin gây ra sự suy giảm ATP và rối loạn chức năng ty thể và lysosomal [11] Chất độc có thể tập trung ở mô thận do quá trình tái hấp thu ở ống thận Khi nồng độ của chất độc trong lòng thận và các tế bào thận xung quanh khá cao gây độc tính do patulin [28]
Khả năng gây ung thư: Có rất ít dữ liệu được báo cáo về khả năng gây ung thư của Patulin, do đó nó được phân loại vào nhóm 3 vì nó không gây ung thư cho con người, tuy nhiên, việc tiếp xúc lâu dài với Patulin ở chuột cống và chuột nhắt cho thấy khả năng gây ung thư Ở chuột, người ta quan sát thấy sự gia tăng đáng kể tỷ lệ mắc khối u giữa động vật đối chứng và động vật được điều trị bằng Patulin dẫn đến ung thư sarcoma tại chỗ tiêm Khi tiêm dưới da, cả chuột đực và chuột cái được tiêm liều cao nhất (1,5 mg/kg) đều không sống sót Trong suốt thời gian nghiên cứu, chứng minh tính độc hại của Patulin bằng việc bôi Patulin tại chỗ một lần ở nồng độ 400 nM gây ra sự hình thành khối u trên da chuột sau
14 tuần Từ đó cho thấy vai trò của nó như là tác nhân khởi đầu khối u [15]
Patulin có đặc tính kháng sinh nhưng đã được chứng minh là gây ung thư và gây đột biến trên động vật do đó một số quốc gia đã ban hành các hạn chế về Patulin trong các sản phẩm táo Patulin đã được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế phân loại là chất gây ung thư nhóm 3, nhóm này bao gồm các hợp chất không có đủ dữ liệu để cho phép phân loại
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cỏo mức tối đa là 50 àg/L nước tỏo [27]
EU và Bộ Y tế Việt Nam có quy định giới hạn tối đa của Patulin là giống nhau [3], [32] được trình bày trong bảng 1.1
Bảng 1.1 Mức giới hạn tối đa cho phép trong táo và các sản phẩm từ táo
Nền mẫu Mức giới hạn tối đa
Nước ép trái cây, nước ép trái cây cô đặc và mật hoa quả 50 Đồ uống có cồn: rượu táo và các đồ uống lên men khác làm từ táo hoặc chứa nước táo 50
Các sản phẩm táo dạng rắn được đưa ra thị trường (Bao gồm cả nước ép táo và táo xay nhuyễn) 25
Nước ép táo và các sản phẩm táo đặc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (trẻ dưới 36 tháng tuổi) 10
Tổng quan phương pháp xác định Patulin
1.2.1 Một số phương pháp xác định Patulin trên thế giới
Bảng 1.2 Các phương pháp xác định Patulin trên thế giới
Phương pháp xử lý mẫu Phương pháp phân tích
Táo và sản phẩm từ táo
5 mL nước táo đã đồng nhất thêm 20 mL ethyl acetat Siêu âm 15 phút
Dịch chiết ethyl acetat được làm bay hơi dung môi bằng máy cô quay chân không đến cắn Hòa tan cắn trong 1 mL dung dịch methanol/nước/acid acetic (83,5:16:0,5, v/v/v)
LC - MS/MS -Pha tĩnh: cột Nova-Pak C18 (150 mm × 3,9 mm × 4 μm) (Waters, Milford, USA)
- Pha động: kênh A: CH3COOH 0,1%/ MeOH 10%/H2O; kênh B:
- Tốc độ dòng: 0,25 mL/phút
Chương trình gradient trong kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bắt đầu với 0% pha B trong 1 phút Sau đó, nồng độ pha B tăng dần lên 85% trong 2 phút và giữ nguyên trong 1 phút Tiếp theo, cột sắc ký được cân bằng với 100% pha B trong 2 phút trước khi tiêm mẫu tiếp theo.
- m/z: ion mẹ (153,1); ion con (109 và 81)
- LOD= 1 àg/kg LOQ= 5 àg/kg
- Với táo gai khô: 4 g mẫu đã đồng nhất, thêm 4 mL nước cùng 75 μL pectinase Ủ ở 40℃ trong 2 giờ để thực hiện phản ứng enzym
- Với nước táo: 4 g mẫu đã đồng nhất
- Chiết bằng 20 mL ACN, lắc xoáy 2 phút Ly tâm 6793 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng
Thu dịch chiết, thêm 1g PSA và 3g
MgSO4 Lắc nhanh bằng tay trong 1 phút Ly tâm 6793 vòng/phút trong 3 phút Hút 9 mL dịch phía trên đưa qua cột đa chức năng PriboFast® 228 để làm sạch 4 mL dịch chiết đã làm sạch được làm khô bằng khí nitơ ở 45 ℃
Hoàn nguyên bằng 1 mL ACN: H2O pH=4 (10:90, v/v) Lọc qua màng lọc
- Pha tĩnh: Cột Waters Xbridge™ C18 (250 mm × 4,6 mm × 5,0 μm), tiền cột Xbridge™ C18 (4,6 mm × 20 mm × 5,0 μm)
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
- LOD= 2,6 àg/kg; LOQ= 8,0àg/kg
Chiết lỏng- lỏng Cân 10 g mẫu đã đồng nhất, thêm 20 mL ethyl acetat Lắc đều và siêu âm
15 phút Ly tâm 4000 vòng/phút trong
- Pha tĩnh: cột pha đảo C18 (50 mm × 2,1 mm ì 2,6 àm) Nhiệt độ cột 40℃
5 phút thu lớp dịch trên Thổi khô bằng khí nitơ ở 50℃ Hoàn nguyên bằng 1 mL methanol Lọc qua màng lọc 0,22 àm
- Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút
- m/z: ion mẹ (153,1); ion con (109,15 và 81,10)
Chiết lỏng- lỏng Cân 5 g mẫu đã đồng nhất thêm đồng thời 40 àL chất chuẩn nội 13 C5-7 patulin 2 mg/L và 0,5 g Na2CO3
Thêm tiếp 5 mL dd ethyl acetat: n- hexan (95:5, v/v), lắc mạnh bằng tay trong 1 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển lớp trên vào lọ
25 mL Chiết lặp lại 3 lần Thêm 150 àL acid acetic vào bỡnh chứa dịch chiết Thổi khô bằng khí nitơ
- Pha tĩnh: cột Supelco SLB-5MS (30 m ì 0,25 mm ì 0,25 àm), tiền cột cú cùng đường kính
-Tốc độ dòng khí mang heli: 1 mL/phút
- Áp suất xung 40psi, 60 giây
- Chương trình nhiệt độ lò: 100℃ trong 1 phút, tăng lên 180℃ với tốc độ 10℃ /phút Tăng lên 280℃ với tốc độ 30℃/phút và giữ trong 12,67 phút Tổng thời gian chạy là 25 phút
- LOD= 0,4 àg/kg LOQ= 1,6 àg/kg
1mL mẫu đã đồng nhất thêm 10mL
ACN, lắc ngang 20 phút Ly tâm
Thu 5 mL dịch chiết Thổi khô bằng khí nitơ ở 40℃ Hoàn nguyên cặn bằng 0,2 mL ACN
- Pha tĩnh: cột pha đảo C18 (150 mm × 4,6 mm × 5,0 μm)
- Pha động: kênh A: H2O: CH3COOH (99:1, v/v); kênh B: ACN/
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút
- Chương trình gradient: Ban đầu với
1 % B, giữ trong 1 phút, sau đó tăng
7 đến 100% B trong 3,5 phút, sau đó giảm đến 99% B trong 1 phút cột được cân bằng với 1% B trong 4,5 phút cho đến lần tiêm tiếp theo
- m/z: ion mẹ (152,9); ion con (108,9; 134,8 và 124,8)
Trái cây, nước ép và sinh tố
50 mL mẫu lỏng hoặc 50 g mẫu rắn được thêm 100 mL nước Chiết bằng
50 mL ethyl acetat, lắc mạnh 15 phút bằng máy lắc Ly tâm 4500 vòng/phút trong 10 phút Thu lớp hữu cơ phía trên, pha nước chiết lại 2 lần với 20 mL ethyl acetat Gộp dịch chiết, thêm
2 mL natri carbonat 1,5%, lắc mạnh
Thêm 5 mL ethyl acetat vào dd
Na2CO3, lắc mạnh trong 5 phút Dịch chiết được chỉnh pH=4 bằng acid caetic băng Làm bay hơi đến khô ở
60℃, hòa cắn bằng 5 mL dd ACN
5%, lọc qua màng lọc 0,22 àm Làm bay hơi đến khô ở 60℃, hòan nguyên bằng 500 àL methanol
- Pha tĩnh: cột pha đảo C18 (250 mm × 4,6 mm × 5 μm)
- Tốc độ dòng: 1 mL/ phút
- Chạy chế độ đẳng dòng
- LOD= 0,04 mg/kg LOQ= 0,12 mg/kg
Chiết lỏng – lỏng Chiết 1g mẫu đã đồng nhất bằng 2 mL ethyl acetat, lắc xoáy 5 phút Thêm 2 mL Na2CO3 1,5%, lắc xoáy 1 phút
Thờm 20 àL acid acetic, lắc trong máy lắc quỹ đạo 250 vòng/phút trong
5 phút Để yên để tách pha, thu dịch
- Pha tĩnh: cột Kinetex XB-C18 (150 mm ì 4,6 mm ì 3,5 àm) (Phenomenex, Torrance, CA, USA)
- Pha động: CH3COONH4 0,02M: ACN (9:1, v/v)
8 chiết phía trên Dịch chiết được làm khô bằng khí nitơ ở nhiệt độ 50℃
Hoàn nguyên bằng CH3COONH4
0,02 M: ACN (9:1, v/v) Lọc qua màng lọc PTFE 0, 22 àm
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
Thức ăn trẻ em có thành phần từ táo
- 10 g mẫu được thêm 10 mL nước
- Thêm 25 mL ethyl acetat, lắc xoáy
10 phút Thu lớp dịch trên, thêm 9 mL
Na2CO3 1,5%, lắc mạnh Thêm 10 mL ethyl acetat vào lớp Na2CO3 ở phía dưới để chiết lần 2 Gộp dịch chiết 2 lần, khử nước bằng 4 g Na2SO4 khan
- Dịch chiết hữu cơ được làm bay hơi đến khô bằng thiết bị cô quay Hòa cặn bằng 2 mL chloroform
- Qua cột HLB (Waters Oasis cân bằng lipophilic):
+ Hoạt hóa: 1 mL MeOH, 1mL H2O
+ Nạp mẫu: nạp toàn bộ mẫu, tốc độ
+ Rửa tạp: 1 mL Na2CO3, 1mL acid acetic
+ Rửa giải: 2 mL ethyl acetat: n- hexan (3:2)
- Dịch rửa giải được làm khô bằng khí nitơ đến cắn
- Hoàn nguyên bằng 0,2 mL pha động, lọc qua màng cellulose 0,45 àm
- Pha tĩnh: Cột Gemini C18 110Å (250 mm ì 4,6 mm ì 3,0 àm)
- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
- LOD = 9,66ì10 -6 àg/mL LOQ = 2,93ì10 -5 àg/mL
- Xử lý đĩa Oasis MAX 96 giếng:
200 μL MeOH và 200 μL H2O, áp suất thường
- Pha tĩnh: Cột Acquity UPLC® HSS T3 (100 mm × 2,1 mm × 1,7 μm)
- 1 mL nước ép đã đồng nhất được thêm vào ống ly tâm 1,5 mL, ly tâm
10000 vòng/phút trong 5 phút Hút
200 μL dịch phía trên sang đĩa Oasis
0,8% trong nước và 100 μL nước, áp suất 6 psi
- Rửa giải: 200 μL MeOH, áp suất 6 psi trong 3 phút
- Dung dịch rửa giải được pha loãng với 200 μL nước để phân tích LC-
- Pha động: kênh A: H2O; kênh B: ACN
- Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút
- Chương trình gradient: Ban đầu với
10 % B, giữ trong 1 phút, sau đó tăng đến 60% B trong 2 phút, giữ trong 1 phút, cột được cân bằng trong 2 phút với 10 % B cho đến lần tiêm tiếp theo
- m/z: ion mẹ (153,0); ion con (108,9 và 80,9)
1.2.2 Một số phương pháp xác định Patulin ở Việt Nam
Bảng 1.3 Phương pháp xác định Patulin ở Việt Nam
Nền mẫu Phương pháp xử lý mẫu Phương pháp phân tích
Chiết lỏng-lỏng Chiết 20 mL mẫu nước trái cây bằng 20 ml ethyl acetat thu dịch chiết Chiết lần
2 bằng 20 mL ethyl acetat, gộp dịch chiết Thêm 4mL Na2CO3, lắc 30 giây, thu lấy lớp trên Lọc qua phễu chứa
Na2SO4 khan Dịch lọc cô quay chân không (V < 1 mL) Thổi khô bằng khí nitơ, thêm 1 mL nước, lọc qua màng lọc
- Pha tĩnh: Cột pha đảo C18 (150 mm ì 4,6 mm, 5àm)
- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àL
- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
Chiết lỏng – lỏng HPLC – UV
10 Táo và sản phẩm từ táo [2]
+ Nước ép táo đục: 20,0 mL thêm 150 àL dd enzym endogalacturonaza (hoạt độ 1400 U/g) Để qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc để 2 h ở 40 0 C, ly tâm 4500 v/p trong 5 phút
+ Puree tỏo: 10,0 g thờm 150 àL dd enzym endogalacturonaza (hoạt độ 1400
U/g) và 10 mL nước, lắc kỹ Để qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc để 2 h ở 40 0 C, ly tâm 4500 v/p trong 5 phút
- Chiết lỏng - lỏng: Thêm 20 ml etyl axetat, lắc trong 1 phút Thu lớp trên, chuyển phần nước vào lại phễu chiết và chiết 3 lần bằng 20 ml etyl axetat Gộp dịch chiết 3 lần, tráng bình nón bằng 5 ml etyl axetat mới và gộp nước rửa này vào dịch chiết etyl axetat trong phễu chiết Thêm 4 ml dd Na2CO3, lắc trong
30 giây Lọc lớp trên qua giấy lọc có chứa khoảng 15 g natri sulfat khan
Tráng 3 lần phễu chiết bằng 15 ml etyl axetat và cho qua natri sulfat vào bình cầu đáy tròn Thổi khô dung môi bằng khí Nitơ Hoàn nguyên bằng 1,0 mL
H2O (pH = 4), lọc qua màng lọc 0,2 àm
- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
+ Nước táo trong: 26 - 128 mg/l + Nước táo đục: 26 - 106 mg/l + Puree táo: 23 - 121 mg/kg.
Phương pháp LC- MS/MS
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC – MS (Liquid chromatography – mass spectrometry) hoạt động dựa trên nguyên tắc tách phân lập các chất trong hỗn hợp nhờ hệ thống sắc ký lỏng (LC) và phát hiện các chất dựa vào tỷ lệ khối lượng và điện tích của ion mẹ (m/z) của bộ phận khối phổ (MS/MS) [6]
Hình 1.2 Mô hình hệ thống LC-MS/MS 1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [4]
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng cách phân tách các ion phân tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa… các ion tạo thành được tách theo tỷ số m/z và được phát hiện tại detector Từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [6] Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm: nguồn ion hóa, bộ phận phân thích khối phổ, bộ phận phát hiện và bộ phận ghi và xử lý số liệu a Nguồn ion hóa
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn đến nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử Các kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ là ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization – ESI) và ion hóa ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APCI) Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật ion hóa ESI
Kỹ thuật ESI (Ion hóa phun điện) là một phương pháp ion hóa được sử dụng phổ biến trong phổ khối lượng, cho phép chuyển các ion từ dung dịch lỏng sang dạng khí Trong ESI, mẫu được dẫn vào vùng có trường điện tử mạnh, thường được duy trì ở hiệu điện thế trong khoảng từ 1 đến 5 kV Trường điện tử cao này tạo ra một điện trường phun, gây ra sự phân tán các giọt dung dịch mẫu thành các giọt nhỏ hơn Khi các giọt này bay trong trường điện tử, các ion hòa tan trong dung dịch sẽ bị loại bỏ khỏi bề mặt giọt do quá trình bay hơi dung môi, từ đó tạo thành các ion khí.
Kv Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới khối vào của thiết bị phân tích khối phổ Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi Có hai chế độ bắn phá: chế độ ion dương ESI (+) và ion âm ESI (-) Đối với chế độ ESI (+) ion được tạo thành thường là ion (M+H) + Còn với chế độ ESI (-), ion tạo thành thường là ion (M-H) - b Bộ phận phân tích khối phổ[6]
Các ion được đưa đến bộ phận phân tích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện bắn phá thêm để thu được các ion con Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phận phân tích tứ cực, bộ phận phân tích bẫy ion, bộ phận phân tích thời gian bay
Bộ tứ cực (Quandrupole) dựa trên nguyên tắc các ion có khối lượng khác nhau sẽ dao động khác nhau theo điện áp tổng hợp một chiều và xoay chiều đặt vào môi trường di chuyển của nó Những ion có tỷ số m/z phù hợp mới có thể đi qua bộ lọc này
Bộ tứ cực chập ba được sử dụng với ba bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 được sắp xếp như hình 1.3
Hình 1.3 Cấu tạo bộ tứ cực chập ba
Vai trò của từng bộ tứ cực:
Q1: Tách các ion, lựa chọn ra các tiền ion (ion mẹ) Những ion khác bị loại đi vì va đập vào các bản điện cực trái dấu
Q2: Ở điều kiện áp suất cao, các tiền ion bị phân ly do va chạm với khí trơ Nhờ va chạm mà năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con và được dẫn đến Q3
Q3: Tách các ion con thích hợp để chuyển tới detector c Bộ phận phát hiện ion (detector)
Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion dương tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng điện tích di chuyển
Bộ phát hiện electron là một trong những bộ phát hiện phổ biến nhất trong các hệ thống sắc ký khí, do có độ nhạy cao Trong quá trình phân tích, các ion sau khi đi qua bộ tứ cực (Q3) sẽ đập vào bề mặt của điốt cực phát, giải phóng các electron thứ cấp Tín hiệu do các electron thứ cấp tạo ra sẽ được thu nhận và khuếch đại, giúp cung cấp thông tin định tính và định lượng về các hợp chất có trong mẫu.
13 được khuếch đại và được ghi lại, tín hiệu này tỷ lệ thuận với lượng ion nên tỷ lệ với nồng độ chất phân tích ban đầu d Bộ phận ghi và xử lý số liệu
Tín hiệu điện tử từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số, phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu như: ghi phổ khối, so sánh với thư viện phổ, định lượng, …
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xây dựng quy trình phân tích bằng LC – MS/MS
3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích
Kỹ thuật FIA (the flow injection analysis): dung dịch chuẩn Patulin 1ppm được bơm trực tiếp vào máy MS/MS cùng với dòng pha động mà không qua cột sắc ký Thực hiện khảo sát bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) với chế độ bắn ion âm a Lựa chọn ion phân tử và ion sản phẩm
Chọn ion mẹ dạng (M-H)- rồi phân mảnh ion mẹ thu được các ion con Chọn ion con có cường độ cao nhất làm ion định lượng, các ion con có cường độ thấp hơn dùng để định tính Năng lượng va chạm (CE) được tối ưu tự động theo từng ion con dựa vào phần mềm thiết bị như bảng 3.1.
Bảng 3 1 Các điều kiện phân tích Patulin bằng ESI (-) – MS/MS
Chất phân tích Ion mẹ Ion con CE (eV) CXP (V) Ghi chú
109 -21 -15 Định tính b Tối ưu hóa các điều kiện MS/MS
Các thông số thiết bị tối ưu cho chất phân tích được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3 2 Các thông số tối ưu cho thiết bị MS
Thông số Ký hiệu Giá trị tối ưu ESI (-) Áp suất khí mang Curtain gas(CUR) 20 Psi Áp suất khí va chạm Collision gas (CAD) 8 Psi
Thế ion hóa Ionspray Voltage (IS) -4500 V
Nhiệt độ nguồn ion Temperature (TEM) 450 ℃ Áp suất khí nguồn 1 Ion source gas 1 (GS1) 50 Psi Áp suất khí nguồn 2 Ion source gas 2 (GS2) 50 Psi
Thế cổng vào Entrance Potential (EP) -9 V
Nhận xét: Từ 2 bảng trên xác định được điều kiện MS/MS để phân tích Patulin Kết quả khảo sát cho thấy ion mẹ ở dạng [ M-H] - có số khối nhỏ hơn khối lượng phân tử 1 đơn vị (m/z = M-1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất Do đó, chất phân tích được xác định bằng một ion mẹ và hai ion con dùng để định lượng và định tính Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS theo tiêu chuẩn của EC (2021/808) với số điểm nhận dạng (IP) là 5 (kỹ thuật tách LC – 1 điểm; 1 ion mẹ – 1 điểm và 2 ion con – mỗi ion 1,5 điểm) [19]
3.1.1.2 Điều kiện sắc ký lỏng a Khảo sát và lựa chọn cột sắc ký
Phõn tớch mẫu chuẩn Patulin nồng độ 0,1 àg/mL với cỏc cột sắc ký:
(1) Cột sắc ký Kinetex XB – C18 (150 mm ì 4,6 mm ì 3,5 àm) (Phenomenex)
(2) Cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm ì 2,1 mm ì 3,5 àm) (Waters)
(3) Cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm ì 3,0 mm ì 3,5 àm) (Waters)
Hình 3.1 Sắc ký đồ Patulin cột sắc ký
Quá trình sắc ký cho thấy cột (3) là lựa chọn tối ưu, với tín hiệu diện tích đỉnh cao nhất và độ nhọn tốt Do đó, cột Symmetry C18 (150 mm x 3,0 mm x 3,5 µm) của Waters được lựa chọn Tiếp theo, nghiên cứu tiến hành khảo sát và lựa chọn thành phần pha động phù hợp với hệ thống sắc ký.
Pha động trong LC-MS/MS ảnh hưởng đến hiệu quả tách, quá trình ion hóa và tín hiệu của các chất phân tích
Phõn tớch dung dịch chuẩn Patulin 1 àg/mL trong MeOH với cỏc hệ pha động:
(1) Kênh A: HCOOH 0,1% trong H2O; Kênh B: MeOH
(2) Kênh A: HCOOH 0,1% và HCOONH4 5 mM trong H2O; Kênh B: MeOH
(3) Kênh A: HCOOH 0,1% và HCOONH4 10 mM trong H2O; Kênh B: ACN
(4) Kênh A: CH3COONH4 40 mM trong H2O;
Kênh B: CH3COONH4 40 mM trong MeOH
(5) Kênh A: CH3COONH4 10 mM trong H2O;
Kênh B: CH3COONH4 10 mM trong MeOH
Với hệ pha động (5) phõn tớch dung dịch chuẩn Patulin 1 àg/mL trong MeOH và
Các hệ pha động trên được chạy theo chương trình gradient ở bảng 3.3 theo tài liệu tham khảo
Bảng 3 3 Chương trình gradient pha động
23 Kết quả khảo sát dung môi pha động được biểu diễn ở hình 3.2
Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát dung môi pha động
Các hệ pha động đều xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Tuy nhiên, pic của chất phân tích ở sắc ký đồ (1), (2) và (3) không tách được hoàn toàn, pic bị chẻ, nhiễu nền cao; Pic của chất phân tích ở sắc ký đồ (4) và (5) - MeOH bị đổ đầu, không cân xứng Sắc ký đồ (5) – CH3COOH 0,1 % có tín hiệu của chất phân tích cao hơn các sắc ký đồ còn lại, pic cân đối và rửa giải ra giữa khoảng thời gian phân tích
Vì vậy, lựa chọn hệ pha động kênh A: CH3COONH4 10 mM trong H2O; kênh B:
CH3COONH4 10 mM trong MeOH để tiến hành phân tích và dùng CH3COOH 0,1 % để pha chuẩn làm việc Patulin 1 àg/mL
Điều kiện sắc ký được lưạ chọn như sau:
- Pha tĩnh: Cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm ì 3,0 mm ì 3,5 àm)
- Pha động: Chạy theo chương trình gradient trong bảng 3.3 với kênh: A:
CH3COONH4 10 mM trong H2O; kênh B: CH3COONH4 10 mM trong MeOH
- Tốc độ dòng pha động: 0,4 mL/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àL
- Thời gian phân tích: 10 phút
3.1.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Mẫu phân tích là các mẫu thực phẩm chứa nhiều tạp chất, gây ảnh hưởng nhiều tới kết quả nên cần xử lý, chiết tách mẫu để loại tạp chất, tránh làm bẩn cột và detector, tăng khả năng phát hiện chất phân tích Trên cơ sở quy trình xử lý mẫu dự kiến (hình 2.1)., tiến hành phân tích mẫu thực dương tính với chất phân tích Thực hiện khảo sát ở các điều kiện khác nhau, mỗi điều kiện thực hiện lặp lại 3 lần
3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết
Chuẩn bị mẫu như quy trình xử lý mẫu dự kiến Ở bước 2, khảo sát các dung môi chiết: (1) Ethyl acetat và (2) Ethyl acetat: n-hexan (95:5, v/v) Phân tích trên mẫu thêm chuẩn Patulin nồng độ 0,1 àg/mL theo điều kiện sắc ký và khối phổ đó khảo sỏt mục 3.1.1 Kết quả khảo sát được trình bày ở hình 3.3
Hình 3.3 Biểu đồ khảo sát dung môi chiết
Từ kết quả khảo sát, đáp ứng của chất phân tích khi chiết bằng Ethyl acetat cao hơn khi chiết bằng Ethyl acetat: n-hexan (95:5, v/v) Do đó, dung môi chiết cho quy trình xử lý mẫu là Ethyl acetat
3.1.2.2 Khảo sát thể tích chiết
Chuẩn bị mẫu theo thông số kỹ thuật chuẩn Patulin nồng độ 0,1 µg/mL Ở bước 2, khảo sát thể tích dung môi chiết: tiến hành chiết xuất 2 lần với thể tích 20 mL và 1 lần với thể tích 50 mL Tiếp theo, phân tích mẫu bằng sắc ký và khối phổ theo các điều kiện đã khảo sát ở mục 3.1.1.
Kết quả khảo sát được trình bày ở hình 3.4
Ethyl acetat Ethylacetat : n-hexan (95:5, v/v) D iện tí ch pi c (x 10 5 )
Hình 3.4 Biểu đồ khảo sát thể tích chiết
Kết quả cho thấy đáp ứng của chất phân tích khi chiết 2 lần mỗi lần 20 mL cao hơn khi chiết 1 lần 50 mL Vì vậy, lựa chọn chiết 2 lần mỗi lần 20 mL ethyl acetat cho quy trình xử lý mẫu
3.1.2.3 Khảo sát điều kiện cô mẫu
Tiến hành xử lý mẫu thờm chuẩn Patulin nồng độ 0,1 àg/mL theo quy trỡnh xử lý mẫu dự kiến Ở bước 4, khảo sát điều kiện cô mẫu ở 2 điều kiện:
(1) Cô quay: Chuyển 20 mL dịch lọc vào bình cầu 100 mL, sử dụng thết bị cô quay chân không đến cạn
(2) Thổi khô Nitơ: Chuyển 20 mL dịch lọc vào ống ly tâm 50 mL, sử dụng thiết bị thổi khô bằng khí Nitơ
Phân tích mẫu theo điều kiện sắc ký và khối phổ đã khảo sát mục 3.1.1
Hình 3.5 Biểu đồ khảo sát điều kiện cô mẫu
Di ện tí ch pi c (x 10 5 )
Thể tích dung môi chiết
Cô quay Thổi khô Nitơ
D iện tí ch p ic (x 1 0 5 ) Điều kiện cô mẫu
Kết quả khảo sát cho thấy thiết bị thổi khô bằng khí N2 cung cấp đáp ứng của chất phân tích cao hơn so với thiết bị cô quay Do đó, thiết bị thổi khô bằng khí N2 được lựa chọn cho quy trình xử lý mẫu, đảm bảo hiệu quả và độ tin cậy trong quá trình phân tích.
3.1.2.4 Khảo sát dung môi hoàn nguyên
Chuẩn bị mẫu thờm chuẩn Patulin nồng độ 0,1 àg/mL như quy trỡnh xử lý mẫu dự kiến Ở bước 5, khảo sát dung môi hoàn nguyên: CH3COOH 0,1%/ H2O; CH3COOH 0,1%/
H2O: MeOH (1:1, v/v) và MeOH Phân tích mẫu theo điều kiện sắc ký và khối phổ đã khảo sát mục 3.1.1
Kết quả khảo sát được trình bày ở hình 3.6
Hình 3.6 Biểu đồ khảo sát dung môi hoàn nguyên
Kết quả khảo sát cho thấy đáp ứng của chất phân tích khi hoàn nguyên bằng dung môi
CH3COOH 0,1%/ H2O: MeOH (1:1, v/v) cao hơn khi hoàn nguyên bằng dung môi
CH3COOH 0,1%/ H2O và MeOH Do đó, chọn dung môi hoàn nguyên CH3COOH 0,1%/
H2O: MeOH (1:1, v/v) cho quy trình xử lý mẫu
Quy trình xử lý mẫu được lựa chọn Đồng nhất hóa mẫu:
- Mẫu dạng rắn: Xay nhỏ, trộn đều trước khi cân
- Mẫu dạng lỏng: Lắc đều trước khi cân hoặc hút
CH3COOH 0,1% CH3COOH 0,1% : MeOH
MeOH Di ện t íc h pi c (x1 0 5 )
Lắc xoáy 5 phút, siêu âm 15 phút Ly tâm 6000 v/p x 5 phút
Lắc xoáy 5 phút, siêu âm 15 phút
Ly tâm 6000 v/p x 5 phút Hút dịch phía trên vào ống ly tâm 50 mL
Lắc xoáy 1 phút, ly tâm 6000 v/p x 3 phút
Hút dịch phía trên lọc qua giấy lọc chứa Na2SO4 khan
Hút 20,00 mL dịch lọc Ống ly tâm 50 mL
Thổi khô bằng khí Nitơ
Hoàn nguyên bằng 1,00 mL CH3COOH 0,1%/ H2O: MeOH (1:1, v/v)
Lọc qua màng lọc 0,2 àm
Hình 3.7 Quy trình xử lý mẫu tối ưu
3.1.3 Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu lên tín hiệu của chất phân tích Đường chuẩn của Patulin trên nền dung môi và các nền mẫu với nồng độ từ 30 ppb,
50 ppb, 100 ppb, 200 ppb và 500 ppb tớnh trờn dịch (tương ứng với mức nồng độ 6 àg/kg,
10 àg/kg, 20 àg/kg, 40 àg/kg và 100 àg/kg tớnh trờn nền mẫu)
Cân chính xác khoảng 10,00 (g) mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL
Bảng 3.4 Kết quả phương trình đường chuẩn của Patulin trên các nền
Nền mẫu Phương trình đường chuẩn R 2 Dung môi y = 0,0044x + 0,0188 0,9997 Nền mẫu rắn y = 0,0076x - 0,044 0,9998 Nền mẫu lỏng y = 0,0094x + 0,2415 0,9994
Hình 3.8 Biểu đồ đường chuẩn trên nền dung môi và mẫu trắng của Patulin Ảnh hưởng của nền mẫu lên chất phân tích ở 2 nền mẫu:
Bảng 3.5 Kết quả đánh giá ảnh hưởng nền
Chất phân tích Dung môi Nền rắn Nền lỏng
Thông qua kết quả ta thấy ảnh hưởng nền vượt quá ± 20% theo AOAC, do đó nền mẫu có ảnh hưởng đến việc xác định hàm lượng chất phân tích Vậy nên sử dụng đường chuẩn pha trên nền mẫu trắng để tính toán kết quả phân tích.
Thẩm định phương pháp phân tích
3.2.1 Độ ổn định hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn Patulin 100 ppb tính trên dịch (tương ứng với nồng độ 20 àg/kg tớnh trờn nền mẫu) Phõn tớch cỏc mẫu theo điều kiện sắc ký và khối phổ (mục 3.1.1)
Kết quả diện tích pic và sắc ký đồ được trình bày ở phụ lục 3.1
Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ ổn định hệ thống
Diện tích pic Thời gian lưu (phút)
RSD của thời gian lưu và diện tích pic của chất phân tích đều < 2,0% nên theo AOAC hệ thống đạt độ ổn định để phân tích Patulin
Thực hiện phân tích các mẫu chuẩn Patulin có nồng độ 100 ppb, mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn ở mức nồng độ 100 ppb trên hai nền mẫu rắn và lỏng Mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn được xử lý theo quy trình xử lý mẫu tối ưu (mục 3.1.2) và được phân tích theo các điều kiện sắc ký và khối phổ như mục 3.1.1
Tỉ số ion (IR) và độ lệch (𝑅 𝑑𝑖𝑓𝑓 ) giữa tỉ lệ ion mẫu thêm chuẩn trên nền mẫu và mẫu chuẩn trong dung môi được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7 Bảng so sánh tỉ số ion
Dung môi Nền mẫu rắn Nền mẫu lỏng
Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn trên 2 nền mẫu (rắn và lỏng) được thể hiện ở hình 3.9 và 3.10
Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn Patulin và mẫu trắng thêm chuẩn trên nền mẫu rắn
Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn Patulin và mẫu trắng thêm chuẩn trên nền mẫu lỏng
Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu của chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu chuẩn Thời gian lưu của chất phân tích ở mẫu thêm chuẩn tương ứng với thời gian lưu của chất phân tích ở mẫu chuẩn
Chuẩn Trắng thêm chuẩn/ R Trắng/ R
Chất phân tích sau khi phân tích bằng kỹ thuật LC-MS/MS cho kết quả đáp ứng quy định của Hội đồng Châu Âu (2021/808/EU) Độ chênh lệch giữa các ion không quá 0,1 phút, điểm IP đạt 5 điểm, cho thấy phương pháp phân tích này có độ chính xác cao Tỉ số ion của hai ion con thu được ở mẫu thêm chuẩn cũng tương đương với tỉ số ion ở mẫu chuẩn, nằm trong giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn của Hội đồng Châu Âu.
Từ đó, phương pháp đã xây dựng có độ chọn lọc cao
3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn Patulin trên các nền mẫu trắng ở các mức nồng độ 30; 50; 100; 200; 500; 1000 và 2000 ppb trên dịch (tương ứng với các mức nồng độ 6; 10; 20; 40; 100; 200 và 400 àg/kg trờn nền mẫu) Phõn tớch cỏc mẫu theo điều kiện sắc ký và khối phổ (mục 3.1.1) Kết quả được trình bày trong bảng 3.8
Bảng 3.8 Kết quả phương trình đường chuẩn của Patulin trên các nền mẫu
Nồng độ (ppb) Nồng độ tìm lại
(ppb) Độ chệch (%) Yêu cầu AOAC
Phương trình hồi quy: y = 0,0094x + 0,3211;R 2 = 0,9996 Nhận xét: Phương trình đường chuẩn trên cả hai nền mẫu đầu có hệ số tương quan 0,99 ≤ R 2 ≤1 và độ chệch các điểm xây dựng đường chuẩn không quá 15% Điều này chứng tỏ chất phân tích trong khoảng nồng độ từ 30 ppb đến 2000 ppb tính trên dịch (tương ứng
32 với nồng độ từ 6 àg/kg đến 400 àg/kg tớnh trờn nền mẫu) cú sự phụ thuộc tuyến tớnh giữa diện tích pic của chất phân tích với nồng độ chất phân tích
3.2.4 Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện
Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn Patulin ở các mức nồng độ 10 ppb, 30 ppb, 50 ppb trờn dịch (tương ứng với cỏc mức nồng độ 2 àg/kg, 6 àg/kg và 10 àg/kg trờn nền mẫu) để xác định giá trị LOD và LOQ Chuẩn bị mẫu như quy trình xử lý mẫu tối ưu (mục 3.1.2) và phân tích các mẫu theo điều kiện sắc ký và khối phổ (mục 3.1.1) Kết quả được trình bày ở hình 3.11 và bảng 3.9
Hình 3.11 Sắc ký đồ giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của Patulin trên nền mẫu
Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của Patulin trên nền mẫu
Nền mẫu LOD (àg/kg) S/N LOQ (àg/kg) S/N
Vậy giới hạn phỏt hiện của phương phỏp LOD = 2 àg/kg và giới hạn định lượng của phương phỏp LOQ = 6 àg/kg
3.2.5.1 Độ đúng và độ lặp lại Để xác định độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp, thực hiện phân tích các mẫu thêm chuẩn Patulin trên nền mẫu trắng ở các mức nồng độ 30 ppb, 200 ppb và 1000 ppb trên dịch Chuẩn bị mẫu như quy trình xử lý mẫu tối ưu (mục 3.1.2) và phân tích các mẫu theo điều kiện sắc ký và khối phổ (mục 3.1.1) Mỗi mức nồng độ thực hiện phân tích 6 mẫu riêng biệt trên cả nền mẫu rắn và nền mẫu lỏng Kết quả được trình bày ở bảng 3.10
Bảng 3.10 Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại của Patulin trên nền mẫu
Nền mẫu rắn Nền mẫu lỏng Yêu cầu (AOAC)
Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%)
RSD (%) Độ thu hồi (%) RSD (%)
954 95,4 980 98,0 Độ thu hồi và RSD (%) nồng độ của Patulin trên cả hai nền mẫu đều nằm trong khoảng quy định theo tiêu chuẩn của AOAC
Do đó, phương pháp phân tích đạt yêu cầu về độ đúng và độ lặp lại
3.2.5.2 Độ chính xác trung gian
Tiến hành phân tích mẫu thêm chuẩn Patulin trên nền mẫu trắng ở mức nồng độ 200 ppb tính trên dịch Chuẩn bị mẫu như quy trình xử lý mẫu tối ưu (mục 3.1.2) và phân tích các mẫu theo điều kiện sắc ký và khối phổ (mục 3.1.1) Làm lặp lại 6 lần riêng biệt để đánh giá độ tái lặp nội bộ (khác ngày) Kết quả được trình bày ở bảng 3.11
Bảng 3.11 Kết quả độ chính xác trung gian của chất phân tích trên các nền mẫu
Nền mẫu rắn Nền mẫu lỏng
Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic của phương pháp phân tích HPLC-MS/MS đối với hai nền mẫu rắn và mẫu lỏng lần lượt là 2,3% và 6,1%, nằm trong giới hạn chấp nhận