Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích các hợp chất nhóm PCB trong các nền mẫu thủy hải sản, đất, nước… Tuy nhiên ở Việt Nam, số lượng nghiên cứu PCB còn hạn chế, đặc biệt
TỔNG QUAN
Tổng quan chung về PCB
PCB là một nhóm hợp chất nhân tạo, được tổng hợp thành công vào năm 1881 và được sản xuất thương mại vào năm 1929 Trong giai đoạn này, PCB được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp do ưu điểm cách điện tốt và không gây cháy nổ
Từ năm 1937, các nghiên cứu đã chỉ ra ảnh hưởng của PCB đối với sức khỏe con người cũng như khả năng tích tụ sinh học qua chuỗi thức ăn Các trường hợp ngộ độc tập thể và ô nhiễm PCB cho thấy mức độ nguy hại của PCB đến môi trường và con người
Năm 1979, Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (EPA) ban hành lệnh cấm sản xuất PCB theo Đạo luật kiểm soát hóa chất độc hại (TSCA) Năm 2001, PCB được liệt kê vào danh sách 22 chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy (POP) theo Công ước Stockholm Việt Nam đã phê chuẩn Công ước Stockholm vào năm 2006 và cam kết ngừng sử dụng PCB vào năm 2020, tiêu hủy hoàn toàn vào năm 2028.
Theo thống kê từ năm 1930 đến 1993, thế giới đã sản xuất 1,3 triệu tấn PCB Trong đó chỉ có 4% bị phân hủy, 31% tồn tại trong môi trường (đất liền và ven biển), phần còn lại tập trung chủ yếu ở ngành điện, là chất phụ gia trong dầu của các thiết bị điện như máy biến thế, tụ điện Trong các thiết bị này có thể chứa từ vài mg đến hàng chục nghìn mg PCB trên 1 kg dầu
PCB được sản xuất thương mại với nhiều tên gọi như:
- Aroclor, Pyranol, Pyroclor (Hoa Kỳ)
1.1.2 Công thức cấu tạo, tính chất hóa lý của PCB
PCB là tên gọi chung một nhóm hợp chất hữu cơ có công thức hóa học C12H10−xClx
(1 ≤ x ≤ 10).Công thức cấu tạo của PCB gồm một vòng biphenyl và một vài hoặc tất cả
10 nguyên tử hydro (gắn với nguyên tử carbon được đánh số 2 - 6 và 2’ - 6’) trong vòng được thay thế bởi nguyên tử chlor
Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của PCB
Hiện nay có hai hệ thống danh pháp được sử dụng để định danh PCB Một là hệ thống danh pháp IUPAC, dựa trên vị trí nguyên tử chlor gắn trên vòng (ví dụ 2, 3, 3', 4, 4', 5 - hexachlorobiphenyl)
Hệ thống danh pháp thứ hai được phát triển bởi Ballschmitter & Zell vào năm 1980 Cách gọi này đơn giản và được sử dụng phổ biến hơn danh pháp IUPAC Theo đó, các PCB được đánh số từ 1 đến 209 dựa vào số lượng tăng dần của nguyên tử chlor trong công thức [27] Ở trạng thái tinh khiết, PCB tồn tại ở dạng tinh thể nhưng PCB thương mại là hỗn hợp của nhiều cấu tử dạng lỏng hoặc sệt, không mùi, không vị, không màu hoặc màu vàng nhạt [31]
Các PCB có độ tan trong nước rất thấp (1,2 - 4,8 10 6 ng/L) và có hệ số phân bố octanol - nước cao (log Kow = 4,09 - 8,18) [5, 15] Vì vậy, PCB ít tan trong nước và dễ tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực như n-hexan, isooctan, n-heptan, aceton, dầu và chất béo Áp suất hóa hơi của các PCB tăng lên khi số lượng nguyên tử chlor trong phân tử nhiều hơn (9,77 × 10 -7 - 1,38 × 10 -3 mmHg) [14] Điều này đồng nghĩa với cấu tử có số nguyên tử chlor ít hơn sẽ dễ hóa hơi hơn
Bảng 1.1 Tính chất vật lý và hóa học của một số cấu tử PCB
PCB 77 PCB 81 PCB 105 PCB 118 PCB 126 PCB 138 PCB 153 PCB 169 PCB 180
Công thức phân tử C12H6Cl4 C12H6Cl4 C12H5Cl5 C12H5Cl5 C12H5Cl5 C12H4Cl6 C12H4Cl6 C12H4Cl6 C12H3Cl7
(20 mmHg) Độ tan trong nước (mg/L,
Tính chất đặc trưng của PCB là tính trơ, bền với nhiệt độ cao và khó bị phân hủy kể cả trong môi trường acid mạnh hay base mạnh Vì vậy, chúng tồn tại rất lâu trong môi trường tự nhiên [21]
Ngoài ra, PCB cũng có khả năng hấp phụ vào thủy tinh và một số vật liệu polyme như polyethylen, polypropylen, cao su… Một số nghiên cứu đã tiến hành đánh giá việc sử dụng vật liệu thủy tinh và polyme trong phòng thí nghiệm để bảo quản PCB, sau khi kiểm tra lại thì thấy rằng nồng độ PCB giảm rõ rệt sau vài ngày [10, 25] Tính chất này cần được chú ý trong việc phân tích các PCB trong phòng thí nghiệm do có thể xảy ra sự đánh giá thấp nồng độ PCB trong mẫu phân tích hơn so với thực tế
Cơ chế gây độc của PCB khác nhau phụ thuộc vào vị trí của nguyên tử chlor thay thế trong vòng biphenyl Các PCB không có hoặc chỉ có 1 nguyên tử chlor ở các vị trí
2, 2’,6, 6’ (non-ortho hoặc mono-ortho PCB) mang cấu trúc tương tự polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) và polychlorinated dibenzofurans (PCDFs) Các PCB này được gọi là PCB giống dioxin (dioxin-like PCB, DL-PCB) vì có thể gắn và hoạt hóa thụ thể aryl hydrocarbon (AhR) và gây ra độc tính tương tự dioxin [30]
Trong số 209 cấu tử PCB chỉ có 12 cấu tử thuộc nhóm DL-PCB, có hệ số độc tương đương (TEF) thấp (0,00003-0,1 lần so với dioxin độc nhất), nhưng vẫn được Trung tâm quốc tế nghiên cứu về ung thư (IARC) xếp loại là chất có thể gây ung thư ở người, thuộc nhóm 2A.
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của 12 DL-PCB
Các PCB còn lại có từ 2 nguyên tử chlor ở vị trí ortho trong vòng trở lên không có khả năng gắn với thụ thể AhR, do đó được gọi là PCB không giống dioxin (non-dioxin- like PCB, NDL-PCB) Nhóm PCB này cũng gây ra những độc tính nghiêm trọng nhưng ở ngưỡng nồng độ lớn hơn nhiều so với các DL-PCB Theo kết quả nghiên cứu của dự án “Đánh giá độc tính và mối nguy hiểm của NDL-PCB trong thực phẩm”, gọi tắt là ATHON của Ủy ban Châu Âu (EU) cho thấy các NDL-PCB có nhiều cơ chế khác nhau gây độc trên nhiều cơ quan như hệ thần kinh, nội tiết, miễn dịch và gan [11]
Hình 1.3 Công thức cấu tạo 6 NDL-PCB tồn dư phổ biến trong thực phẩm
Trên thế giới đã ghi nhận nhiều trường hợp nhiễm độc PCB, bao gồm cả ngộ độc tập thể Vào năm 1968, sự cố Yusho ở Nhật Bản đã có hơn 14000 người phơi nhiễm với PCB sau khi ăn dầu ăn chiết xuất từ gạo của hãng Kanemi Soko Dầu ăn sản xuất từ gạo này đã bị nhiễm PCB thông qua bộ phận trao đổi nhiệt của dây chuyền sản xuất Năm
1979, một vụ nhiễm độc trên diện rộng tương tự đã xảy ra tại Đài Loan khiến khoảng
PCB gây ngộ độc cho 2000 người với các triệu chứng như phát ban, đổi màu da và dị tật móng tay Thận kinh của người dân cũng chịu ảnh hưởng với các triệu chứng đau đầu, đau dây thần kinh tứ chi, giảm hoạt động dây thần kinh Đặc biệt, trẻ em sinh ra từ cha mẹ tiếp xúc với PCB chậm phát triển chiều cao và cân nặng, trí tuệ kém, rối loạn hành vi và tăng động.
Phương pháp phân tích PCB trong thực phẩm
1.2.1 Phương pháp chiết mẫu và làm sạch
Trong lịch sử nghiên cứu phân tích PCB, đã có hơn 10 phương pháp chiết mẫu khác nhau được phát triển Chiết soxhlet là phương pháp truyền thống thường được sử dụng Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp này để phân tích PCB trên nền mẫu cá và rong biển đều cho độ thu hồi tốt (tương ứng 65 - 130% và 80,34 - 98,73%) [9, 35] Tuy nhiên, phương pháp soxhlet yêu cầu thời gian chiết dài và lượng dung môi hữu cơ sử dụng lớn nên nhiều phương pháp khác đã được sử dụng với mục đích rút ngắn thời gian và thân thiện với môi trường hơn
Các phương pháp chiết hiện đại như chiết dưới áp suất cao (Pressurized liquid extraction), chiết có hỗ trợ vi sóng (Microwave assisted extraction), chiết có hỗ trợ sóng siêu âm (Ultrasound assisted extraction) đều đã được nghiên cứu và tối ưu giúp rút ngắn thời gian chiết, giảm thiểu lượng dung môi hữu cơ Các phương pháp này đều cho độ thu hồi tương tự hoặc tốt hơn so với phương pháp chiết Sohxlet [9, 28, 35]
Các phương pháp sử dụng nguyên lý hấp phụ trong phân tích PCB gồm chiết sử dụng khuấy từ, chiết pha rắn, chiết vi pha rắn và chiết pha rắn phân tán trong nền mẫu, sử dụng các chất hấp phụ chọn lọc như Florisil, C18, silica gel hoặc alumina Gần đây, phương pháp QuEChERs (nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, bền và an toàn) cũng được áp dụng để phân tích PCB trên nhiều nền mẫu.
10 thực phẩm như cá và sản phẩm từ sữa cũng cho kết quả độ thu hồi cao (tương ứng 72,8
Trong quá trình phân tích PCB trong thực phẩm, độ thu hồi có thể bị giảm do các lipid được chiết đồng thời, do đó cần thiết có bước làm sạch để loại lipid trong quá trình xử lý mẫu Có nhiều phương pháp làm sạch khác nhau và có thể được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp dựa trên tính chọn lọc và độ nhạy của kỹ thuật phân tích cuối cùng Các phương pháp làm sạch bằng cách không phân hủy lipid phổ biến là sắc ký thẩm thấu gel (GCP), sắc ký hấp phụ, chiết pha rắn phân tán (d-SPE) sử dụng chất hấp phụ như amin bậc hai (PSA), C18, than hoạt tính Ngoài ra, cũng có thể phân hủy lipid để loại bỏ bằng cách sử dụng phản ứng alkan hóa (phản ứng saponin hóa) hoặc oxy hóa khử nước bằng acid sulfuric [28]
Do tính chất dễ bay hơi nên sắc ký khí (GC) là kỹ thuật thường được sử dụng để xác định nồng độ PCB GC thường kết hợp với các loại detector như cộng kết điện tử (ECD) và khối phổ (MS) Trong những năm gần đây, do hàm lượng PCB trong môi trường ngày càng thấp nên các nhà phân tích có xu hướng sử dụng các thiết bị có độ nhạy tốt nhất để xác định PCB như là sắc ký khí độ phân giải cao kết hợp với detector khối phổ độ phân giải cao (HRGC/HRMS)
Một nghiên cứu đánh giá hàm lượng các POP trong đó có DL - PCB và indicator- PCB trên thực phẩm bảo vệ sức khỏe ở thị trường Tây Ban Nha đã sử dụng kỹ thuật phân tích HRGC/HRMS Kết quả hàm lượng các POP (DL-PCBs: 0,01 - 12,1 pg TEQ/g; indicator-PCB: 0,17 - 116 ng/g; PCDD/Fs: 0,04 - 2,4 pg TEQ/g và PBDE: 0,07 - 18,2 ng/g) ở mức trung bình-thấp so với báo cáo ghi nhận ở các quốc gia khác Hàm lượng POP trong sản phẩm từ dầu cá cao hơn rõ rệt so với dầu thực vật và các sản phẩm bổ sung khoáng chất Trong đó, sản phẩm có nguồn gốc từ dầu gan cá tuyết có nồng độ cao nhất, vượt quá giới hạn tối đa được thiết lập trong các quy định của Châu Âu [26] Trong số các kỹ thuật phân tích, sắc ký khí kết hợp khối phổ độ phân giải cao (GC- HRMS) đã được công nhận là phương pháp tốt nhất để phân tích khẳng định các POP Độ nhạy và độ đặc hiệu cao của HRMS đáp ứng yêu cầu xác định chất gây ô nhiễm ở mức độ siêu vết trong các nền mẫu phức tạp Tuy nhiên, những tiến bộ công nghệ gần đây trong máy khối phổ tứ cực (QqQ-MS) đã làm cho kỹ thuật này trở thành một giải pháp thay thế khả thi cho GC-HRMS, đặc biệt khi kết hợp liên tiếp hai lần khối phổ (MS/MS) để xác định chất phân tích ở mức vết [16] Năm 2017, Ủy ban Châu Âu (EC) đã chính thức công nhận việc sử dụng GC-MS/MS bên cạnh GC-HRMS để phân tích khẳng định PCB trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi [12]
Nhóm các nhà khoa học tại Phòng thí nghiệm khu vực Đông Nam, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ đã nghiên cứu xác định đồng thời hàm lượng 19 cấu tử
PCB bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ 2 lần (GC-MS/MS) trên nền mẫu cá Khoảng tuyến tính được xây dựng từ 0,5 - 100 ng/ml và hệ số tương quan nằm trong khoảng 0,995 - 0,998 Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là 0,5 ng/ml Nhóm nghiên cứu đã tiến hành đánh giá độ chụm và độ đúng thông qua độ lệch chuẩn tương đối và độ thu hồi của phương pháp Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối nằm trong khoảng 1,2 - 12,6% và độ thu hồi trong khoảng 72,8 - 96,3% [7]
Sử dụng kỹ thuật GC-MS/MS, các nhà nghiên cứu đánh giá được hàm lượng NDL-PCB trong sản phẩm sữa với giới hạn định lượng (LOQ) từ 0,180 - 0,360 ng/g chất béo, giới hạn phát hiện (LOD) từ 0,06 - 0,12 ng/g chất béo, độ thu hồi là 97,45 - 102,63%, và RSD là 6,33 - 8,86% Kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lượng NDL-PCB trong các mẫu sữa trung bình là 15,17 ± 3,44 ng/g chất béo, thấp hơn ngưỡng do EU (40 ng/g chất béo) quy định PCB 180 có hàm lượng trung bình cao nhất (9,98 ± 2,04 ng/g chất béo), trong khi PCB 28 có hàm lượng trung bình thấp nhất (0,09 ± 0,06 ng/g chất béo).
Tại Việt Nam, năm 2014, nhóm nghiên cứu tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã phát triển phương pháp xác định 6 NDL-PCB (PCB 28, 52, 101,
138, 153, 180) trong thực phẩm Phương pháp này dựa trên quá trình chiết lỏng-lỏng bằng dung môi hữu cơ, kết hợp một loạt các bước làm sạch bằng chiết pha acid và chiết pha rắn (SPE) sử dụng florisil để xử lý và phân tích bằng sắc ký khí (GC) với detector cộng kết điện tử (ECD) và khối phổ (MS) Tỷ lệ thu hồi trung bình riêng của các cấu tử là 80,3 - 109,2 % với độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) là 2,62 - 7,21 % ở các mức giới hạn dư lượng tối đa (MRL): MRL/2, MRL, 2MRL Giới hạn định lượng của phương pháp nằm trong khoảng 0,40 - 0,83 μg/kg được xác định bởi GC-ECD và trong khoảng 1,30 - 4,16 μg/kg bởi GC-MS Độ tuyến tính của phương pháp tốt với hệ số tương quan tuyến tính (R 2 ) là 0,996 Phương pháp được áp dụng để phân tích mẫu cá mua tại chợ trên địa bàn Hà Nội [2]
Năm 2023, nhóm nghiên cứu tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nghiên cứu xác định hàm lượng PCB trong mẫu thủy sản bằng phương pháp GC-MS/MS Phương pháp có độ tuyến tính tốt với hệ số tương quan R 2 0,9998 Độ thu hồi của 28 chất PCB và 7 chất nội chuẩn trong các nền mẫu dao động từ 62,3 - 88,1% và từ 75,5 - 91,9% Phương pháp đã được thẩm định và áp dụng để phân tích 10 mẫu cá biển, cho thấy hàm lượng 28 cấu tử PCB từ 17 - 851 (trung bình 230) ng/g chất béo Tổng lượng 6 indicator-PCB tính theo trọng lượng ướt (w/w) dao động từ 1,24 - 3,15 ng/g, thấp hơn mức tối đa khuyến nghị của Liên minh Châu Âu (75 ng/g) [29]
Bảng 1.4 Tổng hợp một số nghiên cứu phân tích PCB trong thực phẩm
Chất phân tích Quốc gia Phương pháp chiết mẫu
Kỹ thuật phân tích Điều kiện sắc ký Kết quả Tham khảo
18 cấu tử PCB trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe
HPLC sử dụng cột 2-(1-pyrenyl) ethyl silica
- Cột: DB-dioxin (60 m × 0,25 mm × 0,25 àm)
- Gradient nhiệt độ: bắt đầu 120 o C (giữ 3 phút), tăng 20 o C/phút đến
180 o C, và tăng 2 o C/phút đến 270 o C (giữ 19 phút)
19 cấu tử PCB trong cá Mỹ QuEChERS GC-
- Cột: HP-5 ms (15 m × 0,25 mm × 0,25 àm)
- Gradient nhiệt độ: bắt đầu 60 o C (giữ 1 phút, tăng 40 o C/phút đến
170 o C, tăng 10 o C/phút đến 310 o C (giữ 1,2 phút)
6 NDL-PCB trong sản phẩm từ sữa
- Cột: Rxi-5 MS (30 m × 0,25 mm ì 0,25 àm)
- Gradient nhiệt độ: bắt đầu 50 o C (giữ 1 phút), tăng 25 o C/phút lên
125 o C, và tăng 10 o C/phút đến 300 o C (giữ 3,5 phút)
6 NDL-PCB trong cá Việt Nam
Chiết lỏng-lỏng bằng dung môi hữu cơ, làm sạch bằng chiết pha acid và pha rắn (SPE)
- Cột: DB5 - MS (30m × 0,32mm × 0,25àm)
+ GC-ECD: Từ 60 o C (1 phút), tăng nhiệt độ 20 o C/phút đến 200 o C, tiếp tục tăng 2 o C/phút đến 260 o C (10 phút)
+ GC-MS: Từ 100 o C (1 phút), tăng
15 o C/ phút đến 200 o C, tiếp tục tăng
- LOQ: 0,40 - 0,83 μg/kg (GC-ECD) và 1,30 - 4,16 μg/kg (GC- MS)
28 cấu tử PCB trong cá Việt Nam Chiết hỗ trợ sóng siêu âm (UAE)
- Cột: DB-5 MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 àm)
- Gradient nhiệt độ: 100 o C giữ 1 phút, tăng lên 210 o C (15 độ C/phút), tăng lên 300 o C (10 o C/phút, giữ 15 phút)
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: 6 cấu tử NDL- PCB (PCB 28, 52, 101, 153, 138, 180) Đối tượng phân tích: các mẫu thực phẩm được mua trên thị trường Hà Nội
- Chuẩn PCB-Mix 1 (bao gồm PCB 28, 52, 101, 153, 138, 180) nồng độ 10 àg/mL trong Cyclohexan từ hãng LGC (Đức), số lô G1118106CY
- Nội chuẩn 13C12 LABELED PCB MIXTURE-A (bao gồm PCB 77, 81, 123,
126, 169, 180) nồng độ 1 àg/mL trong n-hexan từ hóng LGC (Đức), số lụ PR-25989
- Dung môi tiêu chuẩn phân tích sắc ký acetonitril (ACN), n-hexan (Merck, Đức)
- Magnesium sulfat (MgSO4) (Xilong, Trung Quốc)
- Trisodium citrat dehydrat (Fisher, Anh)
- Disodium hydrogen citrat sesquihydrat (Acros organics, Tây Ban Nha)
- Amin bậc hai (PSA), octadecyl silica (C18) (Aligent, Mỹ)
Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình giám định là những thiết bị, dụng cụ thông thường được trang bị tại phòng thí nghiệm của Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, đáp ứng các yêu cầu tiêu chuẩn về bảo đảm chất lượng kết quả.
Hệ thống GC-MS/MS (GC Trace 1310, MS/MS-TSQ 9000) sử dụng cột DB- 5MS (30 m ì 0,25 àm ì 0,25 àm), bộ tiờm mẫu tự động Triplus RSH Autosampler, tất cả từ hãng Thermo Scientific (USA)
Cân phân tích, chính xác đến 0,1 mg, Metter Toledo
Cân kỹ thuật, chính xác 0,01 g, Mettler Toledo
Máy ly tâm có thể đạt được tốc độ tối thiểu 6000 vòng/phút đối với ống ly tâm 50,0 mL, Mikro 200R, Hettich
Micropipet cú thể điều chỉnh được 1000 - 10 000 àL, 100 - 1000 àL, 20 - 200 àL, 10 - 100 àL, 2 - 20 àL
Ống ly tâm Falcon 15 mL, 50 mL
Vial thủy tinh chạy sắc ký
Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu đề ra, các nội dung cần thực hiện bao gồm:
- Khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định đồng thời 6 cấu tử NDL-PCB
Khảo sát điều kiện GC-MS/MS: khảo sát chương trình gradient nhiệt độ lò
Khảo sát điều kiện xử lý mẫu: o Khảo sát dung môi chiết o Khảo sát thành phần muối chiết o Khảo sát thành phần chất hấp phụ d-SPE
- Thẩm định phương pháp phân tích:
Đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp
Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
Đánh giá độ chụm của phương pháp phân tích
Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích
- Ứng dụng xác định hàm lượng của 6 cấu tử NDL-PCB trong một số mẫu thịt/ sản phẩm từ thịt, sữa/ sản phẩm từ sữa trên địa bàn Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) đã được sử dụng để xác định đồng thời 6 cấu tử NDL-PCB
Tiến hành khảo sát chương trình gradient nhiệt độ cột để tách các chất phân tích với thời gian lưu và độ phân giải phù hợp Các điều kiện khác của GC và điều kiện MS/MS được lựa chọn thông qua tham khảo các nghiên cứu đã công bố trước đây
Kết quả được tính toán dựa trên phần mềm phân tích của thiết bị
2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu
Tham khảo tài liệu xây dựng quy trình xử lý mẫu dự kiến theo phương pháp QuEChERS [7, 20, 33], khảo sát tối ưu quy trình xử lý mẫu dự kiến bằng cách khảo sát dung môi chiết, khảo sát thành phần muối chiết và khảo sát thành phần chất hấp phụ d- SPE
Việc khảo sát được tiến hành bằng cách chỉ thay đổi một điều kiện trong khi giữ nguyên các điều kiện khác, sau khi tìm được điều kiện tối ưu thì sử dụng điều kiện đó để khảo sát các điều kiện tiếp theo Kết quả khảo sát được tính toán và so sánh dựa trên độ thu hồi các chất phân tích
2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nền mẫu
Xây dựng đồng thời 2 đường chuẩn: đường chuẩn trên nền dung môi và đường chuẩn trên nền mẫu trắng ở cùng nồng độ
Xác định ảnh hưởng nền mẫu lên tín hiệu của chất phân tích bằng cách so sánh hệ số góc của 2 đường chuẩn
Nếu ME > 0: ảnh hưởng nền dương, nền mẫu gây tăng tín hiệu chất phân tích Nếu ME < 0: ảnh hưởng nền âm, nền mẫu gây giảm tín hiệu chất phân tích
2.3.4.1 Độ đặc hiệu Để xác định độ đặc hiệu đối với kỹ thuật GC-MS/MS có các cách thức sau:
- Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn và chất chuẩn cùng nồng độ Theo đó, mẫu trắng không được cho tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích Mẫu thêm chuẩn phải cho tín hiệu thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất chuẩn Chênh lệch thời gian lưu tỷ đối (tỷ số thời gian lưu của chất phân tích so với nội chuẩn) không được quá 0,5% (EU 2021/808)
Điểm nhận dạng (IP) là tổng điểm ion mẹ và ion con, theo quy định của EU 2021/808 Trong kỹ thuật GC-MS/MS, mỗi ion mẹ được tính 1 điểm và mỗi ion con được tính 1,5 điểm Tỷ lệ ion là phần trăm của tổng điểm IP so với tổng độ cao toàn bộ phổ khối Để đảm bảo độ tin cậy, điểm IP phải đạt tối thiểu 4 điểm.
Tỷ lệ ion là tỷ lệ của ion xác nhận và ion định lượng Tỷ lệ ion trên nền mẫu phân tích so với trên chuẩn không được vượt quá giới hạn trong Bảng 2.1
Bảng 2.1.Giới hạn sai lệch tối đa cho phép của tỷ lệ ion
Cường độ ion tương ứng (so với ion chính) GC-MS/MS
2.3.4.2 Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống nhằm đánh giá độ ổn định của toàn bộ hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp và nội chuẩn Độ phù hợp hệ thống được đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn của tương đối của tỷ lệ diện tích pic chất cần phân tích với diện tích pic nội chuẩn (RSDS/IS) và độ lệch chuẩn thời gian lưu (RSDthời gian lưu) ≤ 2,0%
2.3.4.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Xác định sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ cho đến khi không còn tuyến tính
Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Lựa chọn nền mẫu trắng phù hợp, xử lý mẫu theo quy trình để thu được dịch chiết cuối, sau đó sử dụng dung dịch này làm dung môi để pha dãy dung dịch chuẩn Nội chuẩn được thêm vào dung dịch chuẩn với nồng độ phù hợp và giống nhau
Vẽ đường chuẩn phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu chất chuẩn ngoại chia cho nội chuẩn (trục tung y) và tỷ lệ nồng độ ngoại chuẩn chia cho nội chuẩn (trục hoành x) Tính các hệ số hồi quy a,b trong phương trình y = ax + b và hệ số tương quan (R) Đường chuẩn được đánh giá qua hai tiêu chí:
- Hệ số tương quan R hoặc hệ số xác định R 2 phải đạt yêu cầu: 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R 2 ≤ 1
- Độ chênh lệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn được tính theo công thức: Δ = 𝐶𝑡−𝐶𝑐
𝐶𝑐 x 100 Trong đó: Δ là độ lệch chuẩn của từng điểm xây dựng đường chuẩn
Ct là nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn
Cc là nồng độ của các điểm chuẩn
Giá trị Δ không vượt quá ±15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận ±20%
2.3.4.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
LOD là nồng độ có thể phát hiện được với một mức đảm bảo đo hợp lý Đây chính là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu mà có thể định lượng được với kết quả có độ chính xác mong muốn bằng phương pháp đó
LOD, LOQ được xác định dựa vào tỷ lệ S/N Trong đó S là tín hiệu của chất phân tích, N là tín hiệu nhiễu của đường nền
LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 - 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10
LOD được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, có thể xác định LOD thông qua công thức:
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát, lựa chọn các điều kiện GC-MS/MS
3.1.1 Điều kiện sắc ký khí Để phân tích bằng sắc ký khí khối phổ hai lần cần khảo sát các điều kiện tách và xác định bằng MS/MS
Trong nghiên cứu này, cột sắc ký DB5-MS (30 m × 0,25 mm; 0,25 μm) của Agilent được sử dụng để phân tích PCB do tính phù hợp của nó Cột này có pha tĩnh có bản chất phân cực trung bình đến yếu, phù hợp với tính chất kém phân cực của các cấu tử nhóm PCB Loại cột này được sử dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam, cho khả năng phân lập và định danh PCB hiệu quả.
- Khí mang Heli, độ tinh khiết 99,99%, tốc độ dòng 1,2 mL/phút
- Chế độ tiêm mẫu: không chia dòng (splitless), nhiệt độ buồng tiêm mẫu 280 o C
- Thể tớch tiờm mẫu: 1 àL
- Chương trình gradient nhiệt độ được khảo sát nhằm mục đích tối ưu thời gian lưu và độ phân giải các pic chất phân tích
Tiến hành phân tích dung dịch hỗn hợp chất phân tích ngoại chuẩn và nội chuẩn nồng độ 100 ng/mL ở chế độ quét (full scan) với 2 chương trình gradient nhiệt độ:
Gradient 1: bắt đầu 100 o C (duy trì 1 phút), tăng lên 210 o C (15 o C/phút), tăng lên 300 o C (10 o C/phút, duy trì 15 phút), tổng thời gian 32 phút [29]
Gradient 2: bắt đầu 70 o C (duy trì 2 phút), tăng lên 300 o C (20 o C/phút, duy trì
8 phút), tổng thời gian 23 phút
Kết quả sắc ký đồ ion tổng (TIC) và pic sắc ký lấy theo ion mẹ của 6 cấu tử PCB 28,
52, 101, 153, 138, 180 và 4 chuẩn nội IS PCB 81, 123, 126, 180 được trình bày trong Hình 3.1, 3.2, 3.3 và 3.4
Hình 3.1 Sắc ký đồ TIC và sắc ký đồ ion mẹ của 6 PCB chạy theo gradient 1
Hình 3.2 Sắc ký đồ TIC và sắc ký đồ ion mẹ của 4 nội chuẩn PCB chạy theo gradient 1
Hình 3.3 Sắc ký đồ TIC và sắc ký đồ ion mẹ của 6 PCB chạy theo gradient 2
Hình 3.4 Sắc ký đồ TIC và sắc ký đồ ion mẹ của 4 chuẩn nội PCB chạy theo gradient 2
Nhận xét: Dựa vào sắc ký đồ trong Hình 3.1 và Hình 3.3 cho thấy các chất phân tích mục tiêu trong nghiên cứu đều phân tách tốt ở cả 2 chương trình gradient Ở chương trình gradient 1, 2 chất PCB 28, 52 có thời gian lưu sớm hơn ở chương trình gradient 2, nhưng 4 chất PCB 101, 153, 138, 180 có thời gian lưu lâu hơn so với chương trình gradient 2 Hơn nữa, tổng thời gian chạy máy phân tích của chương trình gradient 1 dài hơn gradient 2 Vì vậy để rút ngắn thời gian phân tích, chương trình gradient 2 được lựa chọn áp dụng trong nghiên cứu này
Trong nghiên cứu này, nguồn ion hóa EI với chế độ ion dương đã được sử dụng Để xác định thời gian lưu của các chất phân tích, sử dụng chế độ quét (full scan) trong khoảng 200 - 550 amu, với năng lượng ion hóa là 70 eV và so sánh phổ đồ khối phổ của các pic chất với phổ đồ chuẩn trong thư viện NIST (National Institute of Standards and Technology) của máy
Các ion được lựa chọn làm ion mẹ tiếp tục được bắn phá thành các ion sản phẩm, sử dụng chế độ SRM (Selected reaction monitoring) Với mỗi cấu tử PCB, lựa chọn hai ion mẹ khác nhau, mỗi ion mẹ được bắn phá để thu lấy một ion sản phẩm Ion sản phẩm có tín hiệu lớn và ổn định hơn được sử dụng để làm ion định lượng, ion còn lại được dùng để xác nhận Đối với các cấu tử PCB có cùng mảnh ion định lượng và xác nhận (ví dụ PCB 153 và PCB 138) thì xác định bằng thứ tự rửa giải tham khảo trong giấy chứng nhận của nhà xuất Thời gian lưu và các điều kiện phân tích được lựa chọn và tối ưu như ở Bảng 3.1
Bảng 3.1 Thời gian lưu và các điều kiện khối phổ sử dụng trong nghiên cứu
Thời gian lưu (phút) Ion mẹ (m/z) Ion sản phẩm (m/z) CE (eV) Ghi chú
Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Dựa vào tham khảo những nghiên cứu trước đây và điều kiện thực tế phòng thí nghiệm, quy trình xử lý mẫu dự kiến theo phương pháp QuEChERS được đề xuất ở Hình 3.3 Sau đó khảo sát các điều kiện gồm: dung môi chiết, thành phần muối chiết, thành phần chất hấp phụ d-SPE để tìm được quy trình tối ưu nhất
Khảo sát được thực hiện trên hai nền mẫu đại diện là sữa bột và thịt Để đánh giá hiệu suất thu hồi của quy trình, chuẩn ngoại với nồng độ 5 ng/g và nội chuẩn với nồng độ 0,5 ng/g được thêm vào mẫu trước khi tiến hành xử lý theo quy trình.
Hình 3.5 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến
3.2.1 Khảo sát dung môi chiết Đối với phương pháp QuESChERS, dung môi phổ biến được sử dụng là ACN bởi vì khả năng hòa tan nhiều chất với độ phân cực khác nhau Đây cũng là dung môi chủ yếu trong các nghiên cứu phân tích PCB mà sử dụng phương pháp QuESChERS và đều cho kết quả với độ thu hồi cao [7, 20, 33] Ngoài ra, các PCB có thể dễ hòa tan trong các dung môi hữu cơ kém phân cực như n-hexan Vì vậy, để chọn được dung môi chiết tốt nhất tiến hành khảo sát quy trình với 2 loại dung môi sau:
Kết quả khảo sát được thể hiện trong Hình 3.4 và Phụ lục 1.1
Cân 4 g mẫu vào ống nhựa 50 mL, chính xác đến 0,01g
Thêm 5 mL nước, lắc mạnh phân tán đều mẫu (mẫu lỏng không thêm nước)
Thêm 10,0 mL ACN, lắc xoáy 10 phút
Lắc xoáy 5 phút, ly tâm ≥ 3000 vòng/phút trong
Thu dịch phía trên vào ống ly tâm 15 mL
Chiết lại phần cặn với
10 phút, Ly tâm ≥ 3000 vòng/phút trong 5 phút
Thu dịch phía trên gộp chung Để đông lạnh ≤ -18 o C trong 30 phút - 2 giờ Để dung dịch về nhiệt độ phòng, Hút 12 mL dịch trong cho vào ống ly tâm
Ly tâm ≥ 3000 vòng/phút trong 5 phút
Hút 7,5 mL dịch trong vào ống nhựa 15 mL
Hình 3.6 Độ thu hồi của các PCB trong khảo sát dung môi chiết
Nhận xét: Kết quả đồ thị trong hình cho thấy độ thu hồi trên cả 2 nền sữa và thịt của các PCB là 40,8 - 69,5 % với dung môi n-hexan; 70,9 - 97,5% với dung môi ACN Điều này cho thấy dung môi ACN có khả năng chiết tốt hơn Mặc dù các PCB hòa tan trong n-hexan tốt hơn, tuy nhiên lượng lớn hơn các tạp chất không phân cực như lipid cũng được chiết đồng thời nên ảnh hưởng đến độ thu hồi các PCB Độ thu hồi các PCB trên nền sữa và nền thịt tương đương nhau và đồng đều trong khoảng 89,1 - 97,5 % đối với 5 PCB 28, 52, 101, 153, 138; ngoại trừ PCB 180 có độ thu hồi thấp hơn là 79,2 % trên nền sữa và 70,9 % trên nền thịt
Như vậy ACN là dung môi được lựa chọn cho những khảo sát tiếp theo
3.2.2 Khảo sát thành phần muối chiết
Hỗn hợp muối chiết có vai trò ổn định pH và tăng độ phân cực của pha nước trong quy trình chiết QuEChERS Hỗn hợp này bao gồm MgSO4 có vai trò loại nước trong dịch chiết và NaCl đóng vai trò tăng khả năng điện ly của dung dịch, giúp cho các chất được chiết vào dung môi chiết và tách ra khỏi pha nước tốt hơn Để đánh giá hiệu suất thu hồi của các PCB trong môi trường có pH khác nhau, tiến hành khảo sát quy trình với hai hỗn hợp muối sau:
Sữa-hexan Sữa-ACN Thịt-hexan Thịt-ACN Đ ộ th u hồ i ( %)
Khảo sát dung môi chiết
PCB28 PCB52 PCB101 PCB153 PCB138 PCB180
Muối chiết 1: 4,0 g MgSO4; 1,0 g NaCl; 1,0 g Trisodium citrat dihydrat; 0,5 g Disodium hydrogen citrat sesquihydrat
Kết quả khảo sát thể hiện trong Hình 3.4 và Phụ lục 1.2
Hình 3.7 Độ thu hồi của các PCB trong khảo sát muối chiết
Nhận xét: Kết quả trong đồ thị cho thấy trên cả hai nền sữa và thịt, độ thu hồi của các PCB đạt mức tương đương hoặc có tăng lên khi sử dụng hỗn hợp muối chiết không có đệm Như vậy hỗn hợp muối chiết không có đệm được lựa chọn để sử dụng trong các khảo sát tiếp theo
3.2.3 Khảo sát điều kiện đông lạnh và thành phần chất hấp phụ d-SPE
Chất hấp phụ có vai trò loại bỏ các chất chiết đồng thời với chất phân tích, giúp làm sạch nền mẫu, giảm ảnh hưởng của nền mẫu đến sự phát hiện chất phân tích của thiết bị Để loại bỏ tạp chất không phân cực khỏi dịch chiết như lipid, thành phần chất hấp phụ trong d-SPE thường có C18 là chất hấp phụ pha đảo kỵ nước Ngoài ra các lipid cũng có thể dễ dàng được loại bỏ khỏi dịch chiết khi để đông vón ở nhiệt độ dưới -18 o C
Do đó để tối ưu việc loại bỏ các tạp chất không phân cực trong dịch chiết, tiến hành khảo sát quy trình với các điều kiện sau:
Có để đông lạnh dịch chiết: nhiệt độ < -18°C trong 30 phút – 2 giờ o Hỗn hợp d-SPE 1: 1,8 g MgSO4; 1,0 g PSA o Hỗn hợp d-SPE 2: 1,8 g MgSO4; 1,0 g PSA; 0,5 g C18
Sữa-không đệm Sữa-đệm citrat Thịt-không đệm Thịt-đệm citrat Đ ộ th u hồ i ( %)
PCB28 PCB52 PCB101 PCB153 PCB138 PCB180
Không để đông lạnh dịch chiết: o Hỗn hợp d-SPE 2: 1,8 g MgSO4; 1,0 g PSA; 0,5 g C18 Kết quả khảo sát thể hiện trong Hình 3.5 và Phụ lục 1.3
Hình 3.8 Độ thu hồi của các PCB trong khảo sát điều kiện đông lạnh và thành phần chất hấp phụ d-SPE
Nhận xét: Kết quả cho thấy quy trình xử lý mẫu có để đông lạnh dịch chiết và không dùng chất hấp phụ C18 trong d-SPE cho độ thu hồi cao nhất Các chất đều có độ thu hồi trên 80,0% Trong khi đó, khi dùng chất hấp phụ C18 trong d-SPE, ở cả 2 quy trình có để đông lạnh và không để đông lạnh dịch chiết thì độ thu hồi các chất đều giảm Đặc
Sữa-đông lạnh-không C18 Sữa-đông lạnh-C18 Sữa-không đông lạnh-C18 Đ ộ thu hồ i ( %)
Khảo sát thành phần d-SPE trên nền sữa
PCB28 PCB52 PCB101 PCB153 PCB138 PCB180
Thịt-đông lạnh-không C18 Thịt-đông lạnh-C18 Thịt-không đông lạnh-C18 Đ ộ thu hồ i ( %)
Khảo sát thành phần d-SPE trên nền thịt
PCB28 PCB52 PCB101 PCB153 PCB138 PCB180
33 biệt đối với các PCB 153, 138, 180 là các chất ít phân cực hơn PCB 28, 52 thì độ thu hồi có xu hướng giảm nhiều hơn Như vậy, bởi các PCB cũng có bản chất kém phân cực nên đã bị hấp phụ vào C18 Do đó, quy trình có để đông lạnh dịch chiết và không dùng C18 trong d-SPE được lựa chọn cho khảo sát tiếp theo
3.2.4 Khảo sát khối lượng PSA trong d-SPE
PSA là chất hấp phụ amin bậc 1 và bậc 2 có thể loại bỏ chất phân cực như acid béo và acid hữu cơ Để tối ưu khả năng làm sạch các tạp chất phân cực của PSA, tiến hành khảo sát khối lượng PSA sử dụng trong d-SPE lần lượt là 0,75 g; 1,00 g và 1,25 g Kết quả khảo sát được trình bày trong Hình 3.7 và phụ lục 1.4
Hình 3.9 Độ thu hồi của các PCB trong khảo sát khối lượng PSA
Khảo sát khối lượng PSA trên nền sữa
PCB28 PCB52 PCB101 PCB153 PCB138 PCB180
Thịt-PSA-0,75g Thịt-PSA-1g Thịt-PSA-1,25g
Khảo sát khối lượng PSA trên nền thịt
PCB28 PCB52 PCB101 PCB153 PCB138 PCB180
Nhận xét: Theo kết quả khảo sát trong hình, độ thu hồi của các PCB khi dùng 0,75 g PSA cho độ thu hồi thấp nhất Khi dùng khối lượng 1,00 g PSA thì cho độ thu hồi các PCB đều cao > 80,0% Với khối lượng 1,25 g PSA thì nhìn chung độ thu hồi các PCB không có thay đổi nhiều so với khối lượng 1,0 g PSA trên cả hai nền mẫu Như vậy khi khối lượng PSA dưới 1,0 g thì do các tạp chất chưa được loại bỏ hoàn toàn nên làm giảm độ thu hồi của các chất phân tích Trong khảo sát này, khối lượng PSA được lựa chọn sử dụng là 1,0 g
Thông qua quá trình khảo sát, quy trình xử lý mẫu tối ưu áp dụng trong nghiên cứu được trình bày trong sơ đồ dưới đây
Hình 3.10 Quy trình xử lý mẫu tối ưu
Khảo sát ảnh hưởng nền mẫu
Trong sắc ký khối phổ, nền mẫu có ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích đặc biệt là khi mẫu không được xử lý tốt Quy trình QuEChERS có quá trình chiết đơn giản, không qua nhiều bước loại tạp nền nên khả năng bị ảnh hưởng bởi nền mẫu rất cao Để đánh giá ảnh hưởng nền, thực hiện so sánh hệ số góc của hai đường chuẩn xây dựng trên nền dung môi và trên nền mẫu trắng (mẫu trắng được chiết theo quy trình để Cân 4 g mẫu vào ống nhựa 50 mL, chính xác đến 0,01g
Thêm 5 mL nước, lắc mạnh phân tán đều mẫu (mẫu lỏng không thêm nước)
Thêm 10,0 mL ACN, lắc xoáy 10 phút
Lắc xoáy 5 phút, ly tâm ≥ 3000 vòng/phút trong 5 phút
Thu dịch phía trên vào ống ly tâm 15 mL
Chiết lại phần cặn với
10 phút, Ly tâm ≥ 3000 vòng/phút trong 5 phút
Thu dịch phía trên gộp chung. Để đông lạnh
30 phút - 2 giờ Để dung dịch về nhiệt độ phòng, Hút 12 mL dịch trong cho vào ống ly tâm
Ly tâm ≥ 3000 vòng/phút trong 5 phút
Hút 7,5 mL dịch trong vào ống nhựa 15 mL
35 thu lấy dịch chiết, sau đo pha chuẩn trên dịch chiết thu được) Đường chuẩn sử dụng gồm 5 điểm chuẩn có nồng độ là 3, 6, 10, 20 và 40 ng/mL Ảnh hưởng nền (ME) được tính theo công thức ở mục 2.3.3 Kết quả đánh giá ảnh hưởng nền trình bày trong Hình 3.9
Hình 3.11 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nền mẫu của phương pháp
Giá trị hiệu suất chiết xuất (%ME) biến động giữa các chất và nền mẫu Hầu hết các chất (%ME < 20,0%) đều thấp trên nền sữa và thịt Tuy nhiên, một số chất (%ME > 20,0%) như PCB 180, 101, 138 thể hiện sự khác biệt Do đó, xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu là kỹ thuật cần thiết để loại bỏ ảnh hưởng của nền.
Kỹ thuật dựng đường chuẩn trên nền mẫu: thêm chuẩn ngoại ở các nồng độ 1,5; 3; 5; 10; 20 ng/g và nội chuẩn nồng độ 0,5 ng/g vào mẫu sau khi cân, sau đó tiến hành xử lý mẫu theo quy trình Đường chuẩn dựng trên 2 nền mẫu thịt và sữa.
Thẩm định phương pháp
Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn trên nền mẫu thịt và chất chuẩn của
6 PCB 28, 52, 101, 153, 138, 180 ở cùng nồng độ 3 ng/mL Sắc ký đồ được thể hiện trong Hình 3.9, 3.10, 3.11 và 3.12
PCB 28 PCB 52 PCB 101 PCB 153 PCB 138 PCB 180
Khảo sát ảnh hưởng nền mẫu
Hình 3.12 Sắc ký đồ độ đặc hiệu của PCB 28 Trong đó: (1) - Mẫu trắng; (2) - Mẫu chuẩn trên nền dung môi;
Hình 3.13 Sắc ký đồ độ đặc hiệu của PCB 52 Trong đó: (1) - Mẫu trắng; (2) - Mẫu chuẩn trên nền dung môi;
Hình 3.14 Sắc ký đồ độ đặc hiệu của PCB 101 Trong đó: (1) - Mẫu trắng; (2) - Mẫu chuẩn trên nền dung môi;
Hình 3.15 Sắc ký đồ độ đặc hiệu của PCB 153, 138 Trong đó: (1) - Mẫu trắng; (2) - Mẫu chuẩn trên nền dung môi;
Hình 3.16 Sắc ký đồ độ đặc hiệu của PCB 180 Trong đó: (1) - Mẫu trắng; (2) - Mẫu chuẩn trên nền dung môi;
Các sắc ký đồ đáp ứng tiêu chuẩn của Hội đồng Châu Âu (EU 2021/808) khi thời gian lưu của mẫu thêm chuẩn chỉ chênh lệch không quá 2% so với mẫu chuẩn trên nền dung môi và không xuất hiện đỉnh tại thời gian lưu tương ứng trong mẫu trắng.
Tính điểm IP (điểm nhận dạng – identification point)
Tiến hành thực hiện phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp các PCB và nội chuẩn trên nền dung môi Kết quả được trình bày trong Bảng 3.2
Bảng 3.2 Bảng ion và số điểm IP
Chất phân tích và nội chuẩn
Ion sản phẩm (m/z) Điểm IP
Tất cả các chất đều có điểm IP ≥ 4, đáp ứng yêu cầu của Hội đồng châu Âu
Tiến hành phân tích mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn Kết quả được trình bày trong Bảng 3.3
Bảng 3.3 Bảng tỷ lệ ion của các PCB
Chất phân tích và nội chuẩn
Mẫu chuẩn % sai lệch cho phép
Tỷ lệ các ion trên mẫu thêm chuẩn của các PCB đều nằm trong khoảng cho phép
3.4.2 Độ phù hợp hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp và nội chuẩn ở nồng độ 3 ng/mL Kết quả cho thấy thời gian lưu các chất không thay đổi, tỷ lệ diện tích peak
SPCB/SIS được trình bày trong Bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả độ phù hợp hệ thống
Chất phân tích STT t R (phút) S PCB /S IS TB RSD (%)
Nhận xét: RSD (%) tỷ lệ diện tích peak của các PCB trong khoảng 0,83 - 1,42%, đều nhỏ hơn 2,0% Như vậy hệ thống GC-MS/MS phù hợp để tiến hành phân tích định lượng
3.4.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Thực hiện thêm chuẩn vào dịch chiết mẫu được xử lý như mẫu thực ở các mức nồng độ 3, 6, 10, 20, 40 ng/mL Xây dựng đường chuẩn phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích pic các PCB với nội chuẩn và nồng độ PCB Đường chuẩn được thiết lập thể hiện trong Hình 3.14 và Hình 3.15
Hình 3.17 Đường chuẩn các PCB trên nền mẫu sữa
Hình 3.18 Đường chuẩn các PCB trên nền mẫu thịt
Kết quả phương trình đường chuẩn, hệ số tương quan và độ chênh lệch Δ (%) tương ứng được trình bày ở Bảng 3.4
Bảng 3.4 Đường chuẩn các PCB dựng trên nền mẫu
Nền mẫu sữa Nền mẫu thịt Đường chuẩn Độ chênh lệch Δ (%) Đường chuẩn Độ chênh lệch Δ (%)
Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát, tỷ lệ SPCB/SIS và nồng độ các PCB có sự tương quan tuyến tính tốt với hệ số R 2 > 0,9990, độ chênh lệch Δ (%) đều nhỏ hơn 15%
3.4.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ 0,5 ng/g trên mẫu tương đương với
1 ng/mL trên dịch phân tích để xác định giá trị S/N
Sắc ký đồ xác định LOD được thể hiện trong Hình 3.16
Hình 3.19 Sắc ký đồ S/N của 6 PCB 28, 52, 101, 153, 138 và 180
Qua kết quả khảo sát, phòng thí nghiệm đề xuất LOD và LOQ của phương pháp đối với phân tích đồng thời 6 PCB tương ứng là 0,5 ng/g và 1,5 ng/g
3.4.5 Độ thu hồi, lặp lại
Thực hiện phân tích các mẫu thêm chuẩn ở các mức nồng độ 1,5; 3 và 15 ng/g tương ứng với các mức nồng độ trong dịch phân tích là 3, 6 và 30 ng/mL Mỗi mức nồng độ thực hiện phân tích 6 lần riêng biệt trên mỗi nền mẫu sữa và thịt
Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại được trình bày trong bảng dưới đây
Bảng 3.5 Độ thu hồi và lặp lại của các PCB trên nền sữa
Mức thêm chuẩn (ng/mL)
Nồng độ (ng/mL) Độ thu hồi (%) RSD (%)
Bảng 3.6 Độ thu hồi và lặp lại của các PCB trên nền thịt
Mức thêm chuẩn (ng/mL)
Nồng độ (ng/mL) Độ thu hồi (%) RSD (%)
Kết quả thu được ở Bảng 3.5 và Bảng 3.6 cho thấy hiệu suất thu hồi của 6 PCB được nghiên cứu tương đối cao (>70%) và RSD không quá 20% Điều này chứng tỏ phương pháp phân tích đã đáp ứng yêu cầu về độ đúng và lặp lại theo tiêu chuẩn của AOAC [23] Vì vậy, có thể áp dụng phương pháp này để phân tích mẫu thực tế.
Ứng dụng phân tích mẫu thực tế
Nghiên cứu tiến hành phân tích đồng thời 6 đồng phân PCB (28, 52, 101, 153, 138 và 180) trên 19 mẫu thịt/sản phẩm từ thịt và sữa/sản phẩm từ sữa thu thập tại Hà Nội Thông tin chi tiết về các mẫu được trình bày trong Bảng 2.4.
Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình tối ưu như trong Hình 3.8 Hàm lượng chất phân tích được tính toán theo công thức trong mục 2.3.5 Kết quả phân tích mẫu thực tế được thể hiện trong Bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả phân tích mẫu thực tế
Hàm lượng (ng/g) PCB 28 PCB 52 PCB 101 PCB 153 PCB 138 PCB 180
Kết quả phân tích cho thấy các mẫu đều âm tính với 6 chất phân tích trong nghiên cứu.
Bàn luận
Về phương pháp xử lý mẫu
Trong nghiên cứu này, phương pháp QuEChERS đã được khảo sát và tìm ra các điều kiện tối ưu để chiết đồng thời 6 PCB trên nền mẫu sữa và thịt So với các nghiên cứu trước đây ở Việt Nam thực hiện trên nền mẫu cá (tương đương về mức độ phức tạp thành phần trong nền) sử dụng các phương pháp phức tạp và tốn kém thì phương pháp QuEChERS có ưu điểm là đơn giản và giảm thiểu chi phí trong phân tích
Phương pháp sử dụng lượng ít dung môi (15 mL) và dung môi ACN cũng là dung môi cho hiệu quả tốt nhất trong nghiên cứu do không kéo theo nhiều tạp chất như lipid hoặc protein, muối nên dịch chiết mẫu sạch hơn Đối với muối chiết, các nghiên cứu cũng cho thấy, việc sử dụng đồng thời MgSO4 và NaCl với tỷ lệ 4:1 cho hiệu quả chiết tốt nhất [6] Trong nghiên cứu này, tỷ lệ MgSO4 và NaCl cũng được giữ cố định 4:1 Thêm vào đó, độ thu hồi của các PCB không bị ảnh hưởng bởi pH dịch chiết nên đệm citrat theo quy trình gốc đã được lược bỏ
Chiết phân tán pha rắn (d-SPE) là bước làm sạch tạo nên hiệu quả của phương pháp QuEChERS Trong đó, chất hấp phụ PSA đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm sạch Theo kết quả khảo sát, khi lượng PSA dưới 1,00 g thì độ thu hồi giảm đi, vì vậy khối lượng 1,00 g PSA đã được lựa chọn
Ngoài ra, để loại tạp chất kém phân cực như lipid mà không ảnh hưởng độ thu hồi các PCB, chất hấp phụ C18 không được sử dụng mà thay vào đó là làm đông lạnh dịch chiết và loại lipid trước khi làm sạch bằng d-SPE
Về kỹ thuật phân tích
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật GC-MS/MS được lựa chọn phù hợp với yêu cầu của
EU về phương pháp phân tích khẳng định PCB trong thực phẩm [12] Đây cũng là kỹ thuật có độ đặc hiệu và độ nhạy cao khi sử dụng chế độ SRM, rất thích hợp với việc định lượng các chất phân tích vi lượng như PCB trên nền mẫu thực phẩm phức tạp
Về thẩm định phương pháp
Phương pháp đã được thẩm định và đạt tất cả các tiêu chí theo hướng dẫn của AOAC về tính chọn lọc, độ phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ lặp lại và độ thu hồi của cả 6 NDL-PCB 28, 52, 101,153,