TỔNG QUAN
Tổng quan về feruloylmethan
Nhóm chất curcuminoid là hỗn hợp 3 chất gồm: curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin – thành phần quan trọng được phân lập từ củ nghệ (Curcuma longa L., họ gừng – Zingiberaceae) [5] Chúng là những hợp chất phenolic, hợp chất chiếm chủ yếu và được nghiên cứu nhiều nhất là curcumin (khoảng 77 %), sau đó là demethoxycurcumin (khoảng 17 %) và cuối cùng là bisdemethoxycurcumin (3 %) [11]
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của curcuminoid
Cấu tạo và một số tính chất vật lý của 3 chất có trong curcuminoid thể hiện trong bảng 1.1 [6]:
Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý của các curcuminoid
1-(4-hydroxyphenyl)- 7-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)hepta- 1,6-dien-3,5-dion
1,7-bis-(4- hydroxyphenyl)hepta- 1,6-dien-3,5-dion
Tinh thể hình kim, màu vàng
Tinh thể hình kim, màu vàng cam
Tinh thể hình kim, màu vàng cam tím
Nhiệt độ nóng chảy của curcuminoid: 172 - 178
* Sự điện ly theo pH [6], [7]:
- Ở môi trường pH < 1, dung dịch nước của curcumin (H3A) có màu đỏ và tồn tại ở dạng ion H4A +
- Ở khoảng pH = 1 - 7, curcumin rất ít tan trong nước Ở khoảng pH này, hầu hết các diferulylmethan ở dạng trung hòa H3A và dung dịch có màu vàng
- Ở pH > 7,5, dung dịch chuyển sang màu đỏ, curcumin tồn tại ở các dạng ion H2A,
HA 2- và A 3- lần lượt tương ứng với các giá trị pKa là 7,8; 8,5 và 9,0
Hình 1.2 Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch 1.1.2 Quá trình biến tính của curcumin
Curcumin tương đối ổn định ở pH acid, nhưng nhanh chóng bị phân hủy ở pH > 7 Sản phẩm phân hủy chính là acid ferulic và feruloylmethan, ngoài ra còn có các sản phẩm ngưng tụ [6]
Hình 1.3 Sự phân hủy curcuminoid trong môi trường kiềm
Dưới tác dụng của ánh sáng hoặc môi trường kiềm, curcumin phân hủy thành vanillin, acid vanillic, aldehyd ferulic, acid ferulic [7]
1.1.3 Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý của feruloylmethan
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của feruloylmethan
- Tên IUPAC: (E)-4-[4-(hydroxy)-3-(methoxyphenyl)]but-3-en-2-on
- Feruloylmethan là một acid hydroxycinnamic, là một sản phẩm tự nhiên được tìm thấy trong cây nghệ, là sản phẩm chuyển hóa của curcumin trong môi trường kiềm [33]
- Bột kết tinh màu vàng, mùi ngọt tính ấm, ít tan trong nước, tan vừa phải trong ethanol [33]
1.1.4 Các đặc tính dược lý của feruloylmethan
Các gốc oxy hóa tự do (ROS) được tạo ra trong qua trình hô hấp hiếu khí Mặc dù các hệ thống điều hòa gốc oxy hóa khử được bảo tồn, một phần ROS liên tục thoát ra khỏi chuỗi hô hấp tế bào diễn ra ở ty thể Lượng ROS này đủ để gây hại cho tế bào theo nhiều cách khác nhau bao gồm cả DNA đột biến [21], peroxy hóa lipid [20], suy giảm ATP [26] và chết theo chương trình Chất chống oxy hóa là chìa khóa để ngăn chặn phản ứng của ROS với các phân tử sinh học và có tiềm năng lớn trong việc chống lại sinh lý bệnh của nhiều bệnh bao gồm ung thư, bệnh tim, lão hóa và rối loạn thần kinh,
… Các nghiên cứu đã báo cáo rằng curcumin, feruloylmethan và một số dẫn xuất của curcumin có khả năng che chắn chống lại quá trình oxy hóa gây hại cho DNA bởi các oxy bị kích thích ở nồng độ thấp hơn các chất chống oxy hóa tự nhiên khác Kết quả cho thấy, curcumin có hiệu quả nhất và tiếp theo là feruloylmethan [23]
Feruloylmethan cho đặc tính chống oxy hóa bằng cơ chế ức chế quá trình peroxy hóa lipid trong mô hình màng Nghiên cứu cho thấy, feruloylmethan ức chế đáng kể Fe 2+ gây ra peroxid hóa lipid trong não chuột đồng [23]
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng feruloylmethan có tác dụng chống viêm đối với các bệnh liên quan Trong điều trị bệnh xơ phổi vô căn, feruloylmethan đã được nghiên cứu chống lại bệnh xơ phổi vô căn bằng cách sử dụng mô hình xơ phổi do bleomycin gây ra ở chuột Kết quả cho thấy feruloylmethan làm giảm mức độ tăng chỉ số phổi do bleomucin gây ra, thâm nhiễm tế bào viêm trong mô phổi [42]
Trong nghiên cứu về chữa lành vết loét bàn chân do tiểu đường, feruloylmethan làm giảm nồng độ malondialdehyd, TNF–α, IL–1β, và tăng nồng độ glucathione trong mô vết thương, feruloylmethan đã kích hoạt tín hiệu ERK1/2, JNK, p38, tăng biểu hiện HSP–27, SIRT–1, VEGF do đó tạo điều kiện thuận lợi cho sự di chuyển và tăng sinh của nguyên bào sợi, hình thành mạch và giảm viêm [16]
Các thành phần từ thực vật là một phần thiết yếu và quan trọng trong chế độ ăn uống thông thường của chúng ta để bảo vệ ảnh hưởng từ các chất gây đột biến Nhiều thành phần cụ thể là coumarin, curcuminoid từ các loài thực vật khác nhau đã được báo cáo là có đặc tính chống đột biến [35], [38], [43]
Các dẫn xuất của curcuminoid tổng hợp đã được báo cáo là có đặc tính chống đột biến [37], [19], [13] Các chất tương tự monocarbonyl của curcumin được khám phá nhiều hơn vì chúng có dược động học tốt hơn và các đặc tính dược lực học hơn curcumin [41],[45] Nghiên cứu của Motohashi Noriko và cộng sự đã đánh giá hoạt động chống khối u của feruloylmethan và các hợp chất liên quan bằng cách xác định tác dụng ức chế virus Epstein-Barr kích hoạt kháng nguyên sớm (EVB-EA) do TPA gây ra Kết quả cho thấy IC50 của feruloylmethan gần giống với curcumin [34]
Trong một nghiên cứu khác về tác dụng bảo vệ tế bào của feruloylmethan về chống độc tính cisplatin gây ra ở thận khỉ xanh Châu Phi Kết quả cho thấy feruloylmethan có thể ngăn chặn sự chết tế bào do cispaltin gây ra [23]
Một số nghiên cứu đã làm sáng tỏ cơ chế ức chế tăng trưởng tế bào trong ung thư ruột kết ở người của feruloylmethan Nghiên cứu đã chỉ ra rằng feruloylmethan ức chế tế bào tăng trưởng bằng cách tác động lên pha G2/M trong chu kỳ tế bào [23] Một điều đặc biệt là sự tích lũy ROS có liên qua đến với tác dụng ức chế tăng trưởng, do đó gợi ý các chất tương tự feruloylmethan là hóa trị liệu tiềm năng cho thuốc trị ung thư ruột kết [40]
1.1.4.4 Chống ung thư tuyến tiền liệt
Curcumin thể hiện các hoạt động sinh học hỗ trợ ứng dụng điều trị ung thư [12] Tuy nhiên, curcumin có những hạn chế về tác dụng dược lý của nó như độ hòa tan và sinh khả dụng kém [17] Và việc sử dụng chất tương tự curcumin có tiềm năng giải quyết những hạn chế này Feruloylmethan là đại diện cho cấu trúc hóa học tương tự một nửa khung cấu trúc của curcumin và có báo cáo đã chỉ ra rằng chất này có tác dụng chống ung thư in vitro [23]
Nghiên cứu của Mapoung Sariya và các cộng sự đã chỉ ra rằng feruloylmethan có thể ức chế sự tiến triển của ung thư tuyến tiền liệt Kết quả cho thấy feruloylmethan làm giảm sự tăng sinh tế bào của bệnh ung thư tuyến tiền liệt kháng cắt tinh hoàn (ung thu tuyến tiền liệt ngừng đáp ứng với liệu pháp hormon) ở chuột, nhờ gây ra sự ngừng chu kỳ tế bào ở pha G1 trong ống nghiệm [39] Và để biết được feruloylmethan có thể cải thiện những hạn chế của curcumin hay không, dược động học in vivo đã được xác định Kết quả feruloylmethan được phát hiện trong huyết thanh ở nồng độ cao hơn và duy trì đến 3 giờ sau khi tiêm vào phúc mạc, trong khi nồng độ curcumin giảm nhanh
7 chóng và biến mất trong vòng 1 giờ [39] Từ đây cho thấy tiềm năng lớn về việc sử dụng feruloylmethan cho các hoạt động sinh học thay thế curcumin
Gần đây, trong một nghiên cứu đánh giá đặc tính chống trầm cảm của feruloylmethan, các tác giả đã đánh giá quá trình peroxid hóa ở vùng vỏ não và tiểu não của chuột Kết quả thử nghiệm cho thấy feruloylmethan là một chất tự nhiên đáng chú ý cho sự phát triển của thuốc chống trầm cảm ít hoặc không có tác dụng phụ [18]
Nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả kháng nấm của feruloylmethan đối với
Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Fusarium oxysporum và Penicillium chrysogenum Kết quả cho thấy những loại nấm này dễ bị diệt bởi feruloylmethan Từ đây feruloylmethan thể hiện tiềm năng như một chất chống nấm hiệu quả với sự hiện diện của carbonyl không bão hòa và nhóm hệ thống liên hợp trên vòng thơm với các nhóm hydroxyl methoxyl và phenolic [24]
1.1.4.7 Khả năng dược lực học khác
Tổng quan về phương pháp HPLC
HPLC là một kỹ thuật tách các chất phân tích trong hỗn hợp, trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan
8 đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa chất phân tích qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [1],[2]
1.2.2 Các thông số đặc trưng trong quá trình sắc ký a Hệ số phân bố K
Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:
Trong đó CS là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và CM là nồng độ mol trong pha động Ái lực tương đối của chất tan với hai pha sẽ lượng giá hệ số K Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn [1] b Thời gian lưu
Thời gian lưu tR của một chất là khoảng thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại
Thời gian lưu là đại lượng để định tính 1 chất [1] c Hệ số dung lượng k’
Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích A qua cột Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố giữa 2 pha k ' = t R - t 0 t 0 Trong đó: tR là thời gian lưu của chất phân tích (phút) t0 là thời gian để pha động ra khỏi cột phân tích (phút)
Nếu hệ số k’ 1; thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 – 2 Nếu α quá lớn thời gian phân tích sẽ dài [1] e Độ phân giải Độ phân giải RS cho khả năng tách 2 chất A, B ra khỏi hỗn hợp
2(W A + W B ) Trong đó: (tR)A, (tR)B là thời gian lưu của hai chất A và B (phút)
WA, WB là độ rộng pic đo ở đáy pic A và B (phút) [1]
Hình 1.5 Cấu tạo máy HPLC [3]
Một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao về cơ bản đều có các bộ phận sau:
- Hệ thống cấp pha động sắc ký lỏng Pha động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và chạy qua detector [9]
- Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu
1.2.4 Một số phương pháp định lượng curcuminoid bằng HPLC
Bảng 1.2 Một số phương pháp định lượng curcuminoid Đối tượng phân tích Chuẩn bị mẫu Điều kiện sắc ký TLTK
Hòa tan dịch chiết trong ACN và sau đó pha loãng với 50% ACN
- Pha động: ACN - AcOH 2% (40:60, tt/tt)
- Tốc độ dòng: 2,0 ml/min
- Bước sóng phát hiện: 425 nm
Tinh bột nghệ và viên hoàn nghệ mật ong
Hòa tan bằng MeOH 70%, siêu âm 20 phút ở 60 0 C
- Cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 × 4,6 mm; 5àm)
- Pha động gồm ACN - AcOH 2%
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 420 nm
Mẫu bột nghệ và cao chiết nghệ
Chiết bằng phương pháp siêu âm với dung môi MeOH
- Pha động: ACN - acid formic 0,1%
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 425 nm
Chiết bằng phương pháp Soxhlet với dung môi hexan, hexan sau đó được thu hồi và cắn
- Cột Vydac RP-18 (250 x 4,6 mm; 5 àm)
- Pha động: ACN – acid trifluroacetic 0,1% (50:50, tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 420 nm
11 được tái hòa tan trong MeOH
Hòa tan bằng MeOH 70%, chiết siêu âm
- Pha động: ACN – MeOH – AcOH 2%
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 426 nm
Chiết bằng hexan sử dụng máy chiết Soxhlet trong
30 phút Loại bỏ dịch chiết, cặn được chiết lại bằng metanol trong 2h
- Cột Waters à-Bondapack (Waters Corp., Milford, MA) C18 (300 x 4,6 mm i.d)
- Pha động: hệ dung môi gradient:
- Bước sóng phát hiện: 425 nm
Nhận xét: Cấu trúc của feruloylmethan tương tự một nửa khung cấu trúc của curcuminoid nên nhóm nghiên cứu đã tham khảo và khảo sát phương pháp định lượng feruloylmethan theo phương pháp định lượng curucminoid Dựa trên những tài liệu tham khảo và dựa trên điều kiện thực tế, phương pháp định lượng feruloylmethan được xây dựng sử dụng cột C18 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 àm), pha động là hỗn hợp dung dịch acid acetic 1% và acetonitril (ACN) ở các thành phần và điều kiện rửa giải khác nhau, dung môi pha mẫu là MeOH.
Thẩm định phương pháp phân tích
Dựa trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại theo hướng dẫn của ICH [25] và AOAC [14]
1.3.1 Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất phân tích với sự có mặt của các thành phần có thể có mặt Thông thường, những chất này có thể bao gồm tạp chất, chất phân hủy, chất nền mẫu… [8]
12 Chứng minh phương pháp phân tích định lượng và định tính chất cần phân tích không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác trong mẫu
Một quy trình phân tích kém đặc hiệu có thể được hỗ trợ bằng một hoặc nhiều quy trình phân tích khác Đối với quy trình sắc ký, nên sử dụng sắc ký đồ đại diện để chứng minh tính đặc hiệu và các thành phần riêng lẻ phải được dán nhãn thích hợp Các cân nhắc tương tự nên được đưa ra cho các kỹ thuật phân tách khác
Sự phân tách quan trọng trong sắc ký cần được nghiên cứu ở mức độ thích hợp Đối với sự phân tách quan trọng, tính đặc hiệu có thể được chứng minh bằng độ phân giải của hai thành phần rửa giải gần nhau nhất [33]
1.3.2 Độ ổn định hệ thống
Thử nghiệm độ ổn định hệ thống là một phần không thể thiếu của nhiều quy trình phân tích Thử nghiệm dựa trên khái niệm rằng thiết bị, hoạt động phân tích và các mẫu phân tích tạo thành một hệ thống thích hợp có thể được đánh giá như vậy Các thông số kiểm tra tính phù hợp của hệ thống được thiết lập cho một quy trình cụ thể phụ thuộc vào loại quy trình được thẩm định [25]
1.3.3 Độ tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng xác định: Khoảng xác định của một phương pháp phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và thấp của chất phân tích trong mẫu thử (bao gồm cả nồng độ này) và phương pháp phân tích được chứng minh đáp ứng về độ chính xác, độ đúng và tuyến tính
Khoảng xác định được xây dựng dựa trên khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chụm và mục đích của nghiên cứu Độ tuyến tính nên được đánh giá trên phạm vi của quy trình phân tích, có thể được chứng minh trực tiếp trên dược chất (bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc) và/hoặc cân riêng hỗn hợp của các thành phần sản phẩm thuốc, sử dụng quy trình được đề xuất Độ tuyến tính nên được đánh giá qua biểu đồ tín hiệu như một hàm của nồng độ hoặc hàm lượng chất phân tích Nếu có mối quan hệ tuyến tính, kết quả thử nghiệm phải được đánh giá bằng các phương pháp thống kê thích hợp
Hệ số tương quan, hệ số chặn y, độ dốc của đường hồi quy phải được đưa ra, nên bao gồm biểu đồ dữ liệu Để thiết lập độ tuyến tính, nên sử dụng tối thiểu 5 nồng độ [25]
1.3.4 Độ đúng Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Độ đúng phải được thiết lập trong phạm vi quy định của quy trình phân tích
Một số phương pháp để xác định độ đúng:
- Áp dụng quy trình phân tích đối với các hỗn hợp tổng hợp của các thành phần sản phẩm thuốc đã được bổ sung một lượng đã biết dược chất cần phân tích;
- Trong trường hợp không thể lấy mẫu của tất cả các thành phần của sản phẩm thuốc, có thể chấp nhận thêm một lượng chất phân tích đã biết vào thành phẩm thuốc hoặc so sánh kết quả thu được từ quy trình thứ hai, được đặc trưng rõ ràng, độ đúng được nêu và/hoặc xác định
- Độ chính xác có thể được suy ra khi độ chụm, độ tuyến tính và độ đặc hiệu đã được thiết lập Độ đúng phải được đánh giá bằng cách sử dụng tối thiểu 9 phép thử trên tối thiểu 3 mức nồng độ bao trùm khoảng xác định [25]
1.3.5.1 Độ lặp lại Độ lặp lại thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện xác định Độ lặp lại nên được đánh giá bằng cách sử dụng: a) tối thiểu 9 phép thử trong khoảng xác định đối với quy trình (ví dụ: 3 nồng độ/3 lần lặp lại mỗi lần); hoặc b) tối thiểu 6 phép thử ở 100 % nồng độ thử [25]
1.3.5.2 Độ chính xác trung gian
Tiến hành như độ lặp lại nhưng thực hiện khác ngày
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Mẫu thử Đối tượng nghiên cứu là 18 mẫu sản phẩm biến tính curcuminoid được đặt tên mẫu từ M1 đến M18 được nghiên cứu bào chế tại Khoa Công Nghệ Hóa dược
Thông tin các mẫu thể hiện trong bảng 2.1 (Nguyên liệu 1 dự đoán NaHCO2, Nguyên liệu 2 dự đoán Tween 80)
Bảng 2.1 Thông tin các mẫu nguyên cứu
TT Thông tin mẫu Ghi chú/ điều kiện Ký hiệu
2 Mẫu 2 - 20h45 Nguyên liệu 1 và xúc tác tại 90 °C M2
3 Mẫu 3 - 20h55 Nguyên liệu 1 và xúc tác tại 120 °C M3
4 Mẫu 4 - 21h10 Nguyên liệu 1 và xúc tác tại 120 °C
Thêm Nguyên liệu 2 và curcuminoid M4
5 Mẫu 5 - 21h30 Mẫu 4 (Hệ tiền vi nhũ) tại 150 °C M5
6 Mẫu 6 - 22h00 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M6
7 Mẫu 7 - 22h30 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M7
8 Mẫu 8 - 23h00 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M8
9 Mẫu 9 - 23h30 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M9
10 Mẫu 10 - 00h00 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M10
11 Mẫu 11 - 01h00 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M11
12 Mẫu 12 - 02h00 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M12
13 Mẫu 13 - 03h00 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M13
14 Mẫu 14 - 04h00 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M14
15 Mẫu 15 - 05h00 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M15
16 Mẫu 16 - 06h00 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M16
17 Mẫu 17 - 07h00 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M17
18 Mẫu 83 - 12h00 Hệ tiền vi nhũ tại 150 °C M18
- Chuẩn đối chiếu: chất chuẩn feruloylmethan 98% với số lô CQX299, nhà sản xuất Bidepharmatech Ltd
- Chuẩn nguyên liệu curcuminoid 98 %, đơn vị OIC NEW
- Dung môi tinh khiết dùng cho HPLC: Methanol (J.T Baker), Acetonitril (Samchun), nước cất hai lần
- Hóa chất tinh khiết phân tích: Acid acetic băng 99,8% (Samchun)
- Hệ thống HPLC-DAD Shimadzu LC-40D XR (Nhật Bản) trang bị hệ thống bơm gradient áp suất thấp 4 kênh dung môi và detector PDA, phần mềm Labsolution
- Cột HPLC C18 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5àm)
- Cân phân tích Mettler Toledo XPE105 (d = 0,01 mg) (Mettler Toledo, Thụy Sỹ)
- Cân phân tích Mettler Toledo GF-244A (d = 0,0001 g) (Mettler Toledo, Thụy Sỹ)
- Máy siêu âm DAIHAN WUC – A22H (Daihan, Hàn Quốc)
- Tủ sấy Memmert ULM – 500 (Memmert, Đức)
- Tủ lạnh Haier HYC – 940 (Haier, Trung Quốc)
- Pipet chính xác 1 ml, 2 ml, 3 ml (Wertlab, Đức)
- Dụng cụ khác: cốc có mỏ, pipet Pasteur, bình định mức 10 ml, 20 ml, 25 ml, 50 ml (class A, Isolab, Đức), vial (Waters, Mỹ) …
Nội dung nghiên cứu
- Xây dựng phương pháp định lượng feruloylmethan trong sản phẩm biến tính curcuminoid bằng phương pháp HPLC
- Thẩm định quy trình phân tích theo các tiêu chí của AOAC và ICH: Độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại
- Ứng dụng phương pháp phân tích trên các mẫu sản phẩm biến tính curcuminoid.
Xây dựng phương pháp định lượng
2.3.1 Lựa chọn một số điều kiện sắc ký a Pha động
Tiến hành đánh giá thực nghiệm để lựa chọn thành phần, tỉ lệ pha động thích hợp dựa vào khả năng tách feruloylmethan, thời gian lưu và hình dáng pic feruloylmethan Các pha động được khảo sát là acetonitril và dung dịch acid acetic 1 % trong nước ở các tỉ lệ thể tích khác nhau
16 b Bước sóng lấy sắc ký đồ
Dựa trên phổ hấp thụ UV-Vis của feruloylmethan, lựa chọn bước sóng thích hợp để lấy sắc ký đồ (ưu tiên bước sóng cực đại hấp thụ hoặc bước sóng tại đó feruloylmethan có độ hấp thụ đủ lớn) c Một số điều kiện sắc ký không thay đổi
Pha tĩnh: cột C18 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 àm) d Một số điều kiện sắc ký khác
Một số điều kiện sắc ký khác được duy trì cố định như sau:
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Dựa trên yêu cầu về thẩm định phương pháp phân tích của ICH, tiến hành thẩm định các chỉ tiêu sau với mỗi phương pháp (bảng 2.2)
Bảng 2.2 Các tiêu chí cần thẩm định
Phương pháp Định tính feruloylmethan Định lượng feruloylmethan Đặc hiệu
Tuyến tính Độ lặp lại trong ngày và khác ngày Độ đúng
Với chỉ tiêu độ lặp lại và độ đúng, tùy thuộc vào hàm lượng đối tượng phân tích trong mẫu (tính theo % kl/kl hoặc kl/tt), giới hạn cho phép về RSD (%) cho độ lặp lại và tỷ lệ thu hồi (%) cho độ đúng được đánh giá theo khuyến cáo chung của AOAC International
2.3.2.1 Độ thích hợp hệ thống
Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn feruloylmethan có nồng độ ở nồng độ làm việc dự kiến Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic đáp ứng qua các lần tiêm sắc ký
- Mẫu dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 12,50 mg chuẩn feruloylmethan vào bình định mức 50 ml, hòa tan và định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol Lắc đều Thu được dung dịch chuẩn gốc cú nồng độ khoảng 250 àg/ml
- Mẫu dung dịch chuẩn làm việc: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10 ml, định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol Lắc đều Thu được dung dịch chuẩn làm việc cú nồng độ khoảng 25 àg/ml
- Tiêm 6 lần mẫu dung dịch chuẩn làm việc Ghi lại sắc ký đồ và các thông số thời gian lưu, diện tích của pic feruloylmethan thu được
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn feruloylmethan với thời gian lưu không quá 1,0 % và với diện tích pic không quá 2,0 %
Tiến hành: Tiến hành tiêm sắc ký các dung dịch dung môi MeOH, dung dịch chuẩn feruloylmethan, dung dịch chuẩn nguyên liệu curcuminoid, dung dịch thử, dung dịch placebo Ghi lại sắc ký đồ và các thông số thời gian lưu, diện tích của các pic thu được
Chuẩn bị các dung dịch như sau:
- Dung dịch dung môi: Dung dịch MeOH
- Dung dịch chuẩn feruloylmethan: Cân chính xác khoảng 12,50 mg chuẩn feruloylmethan vào bình định mức 50 ml, hòa tan và định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol Lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc feruloylmethan Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10 ml, định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol Lắc đều
- Dung dịch chuẩn nguyên liệu curcuminoid: Cân chính xác khoảng 12,50 mg chuẩn nguyên liệu curcuminoid, hòa tan và định mức vừa đủ đến vạch bằng bằng methanol Lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc curcuminoid Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10 ml, định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol Lắc đều
- Dung dịch thử M4: Cân chính xác khoảng 275,0 mg mẫu thử M4, cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, hòa tan Sau đó định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol Lắc đều
- Dung dịch thử M18: Cân chính xác khoảng 275,0 mg mẫu thử M18, cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, hòa tan Sau đó định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol Lắc đều
- Dung dịch placebo: Cân chính xác khoảng 275,0 mg mẫu thử M3, cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, hòa tan Sau đó định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol, lắc đều Lắc đều
- Thời gian lưu của feruloylmethan và curcuminoid trong dung dịch chuẩn, dung dịch thử phải tương đương nhau Thời gian lưu của pic feruloylmethan và curcuminoid trên sắc ký đồ dung dịch thử chênh lệch không quá 1,0 % so với thời gian lưu trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn
- Trên sắc ký đồ mẫu trắng hay mẫu placebo không được có pic trùng thời gian lưu với pic feruloylmethan trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Nếu có, đáp ứng pic phải ≤ 2,0 % so với đáp ứng pic của dung dịch chuẩn
- Chồng phổ của chất cần phân tích feruloylmethan trong dung dịch thử và chất chuẩn feruloylmethan trong dung dịch chuẩn cho hệ số match ≥ 0,999
- Nếu xuất hiện các pic tạp chất hoặc pic tá dược thì phải tách khỏi pic chất thử feruloylmethan (Rs ≥ 1,5)
- Độ tinh khiết của chất phân tích feruloylmethan trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn purity factor ≥ 0,999
Tiến hành: Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn feruloylmethan trong dung môi
MeOH cú nồng độ tăng dần từ 5,0 àg/ml – 37,5 àg/ml
Các dung dịch chuẩn được chuẩn bị như sau:
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng phương pháp định lượng feruloylmethan
3.1.1 Bước sóng lấy sắc ký đồ
Hình 3.1 Phổ UV – Vis của feruloylmethan
Nhận xét: Dựa vào phổ UV – Vis của feruloylmethan, bước sóng 336 nm được lựa chọn để lấy sắc ký đồ do tại bước sóng 336 nm, độ hấp thụ của feruloylmethan đạt cực đại
Hình 3.2 Phổ UV – Vis của curcuminoid
Nhận xét: Dựa vào phổ UV – Vis của curcuminoid, bước sóng 425 nm được lựa chọn để lấy sắc ký đồ do tại bước sóng 425 nm, độ hấp thụ của curcuminoid đạt cực đại
Trong nghiên cứu này, hỗn hợp ACN và dung dịch acid acetic 1% được chọn làm pha động, thành phần và chế độ rửa giải của pha động được khảo sát để cho phép tách riêng, định lượng feruloylmethan, đồng thời đảm bảo tách được hoàn toàn 3 thành phần chính curcuminoid đưa vào sản phẩm ban đầu để thực hiện quá trình biến tính nhằm theo dõi được về mặt định tính sự có mặt của curcuminoid trong các mẫu lấy ra tại các thời điểm khác nhau của quá trình biến tính curcuminoid a Chế độ rửa giải đẳng dòng
Khả năng phân tách riêng pic feruloylmethan được khảo sát sơ bộ ở chế độ rửa giải đẳng dòng với hỗn hợp ACN – dung dịch acid acetic 1% ở các tỷ lệ thể tích 60:40, 40:60, 28:72 trên mẫu M18 là mẫu thử của chế phẩm sau khi kết thúc quá trình biến tính curcuminoid
Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát ACN – acid acetic 1% (60:40, tt/tt)
(a) Mẫu thử M18 (b) Mẫu chuẩn feruloylmethan
Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát ACN – acid acetic 1% (40:60, tt/tt)
(a) Mẫu thử M18 (b) Mẫu chuẩn feruloylmethan
Hình 3.5 Sắc ký khảo sát ACN – acid acetic 1% (28:72, tt/tt) (a) Mẫu thử M18 (b) Mẫu chuẩn ferloylmethan
Nhận xét: Từ kết quả ở trên pha động ACN – acid acetic 1% tỉ lệ 60:40 (tt/tt) và tỉ lệ 40:60 (tt/tt) pic feruloylmethan đã không tách được hoàn toàn với các pic xung quanh, tỉ lệ 28:72 (tt/tt) cho pic feuloylmethan đã tách khỏi các pic xung quanh, pic đẹp cân đối với độ phân giải Rs lớn hơn 1,5 ở cả trong mẫu thử và mẫu chuẩn
Khả năng tách các pic của curcuminoid (gồm 3 pic chính) được khảo sát với hỗn hợp ACN – dung dịch acid acetic 1% ở chế độ rửa giải đẳng dòng tại các tỉ lệ thể tích 65:35, 50:50 trên mẫu nguyên liệu curcuminoid
Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu chuẩn nguyên liệu curcuminoid khảo sát ACN – acid acetic
(a) ACN – acid acetic 1% (50:50, tt/tt) (b) ACN – acid acetic 1% (65:35, tt/tt)
Nhận xét: Từ kết quả ở trên pha động ACN – acid acetic 1% tỉ lệ 65:35 (tt/tt) pic curcuminoid chưa tách ra được khỏi nhau, tỉ lệ 50:50 (tt/tt) cho các pic curcuminoid đã tách khỏi nhau và tách với các pic xung quanh, pic đẹp cân đối với độ phân giải Rs lớn hơn 1,5 Như vậy, để tách riêng 3 thành phần chính của curcuminoid cần pha động có tỷ lệ acid acetic 1% tối thiểu 50% (tt/tt) và với hỗn hợp ACN – acid acetic 1% độ lưu giữ của các curcuminoid lâu hơn đáng kể so với feruloylmethan
Từ kết quả này cho thấy để cho phép tách tốt feruloylmethan khỏi các thành phần khác của nền mẫu cũng như tách hoàn toàn 3 thành phần chính của curcuminoid, nếu chọn rửa giải đẳng dòng cần dùng pha động với tỷ lệ acid acetic 1% là 72% (tt/tt), khi
26 đó thời gian phân tích sẽ rất dài do các curcuminoid lưu giữ mạnh Để thu được kết quả phân tích tốt với thời gian phân tích hợp lý cần sử dụng rửa giải gradient b Khảo sát lựa chọn pha động phân tích mẫu
Từ kết quả khảo sát từng hoạt chất nghiên cứu tiến hành khảo sát chương trình gradient như sau Kết quả được thể hiện ở hình 3.7 và 3.8
Thời gian (min) Pha động A
Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo curcuminoid (a) Mẫu M4 (b) Mẫu chuẩn nguyên liệu curcuminoid
Hình 3.8 Sắc ký đồ khảo feruloylmethan
Nhận xét: Khảo sát chương trình gradient cho kết quả pic 2 hoạt chất feruloylmethan và curcuminoid cân đối, 3 pic của curcuminoid tách khỏi nhau và tách khỏi các pic phụ xung quanh với độ phân giải đạt yêu cầu Rs > 1,5 Vì vậy, chương trình
27 gradient được lựa chọn để phân tích feruloylmethan trong sản phẩm curcuminoid biến tính
Từ những kết quả khảo sát ở trên, ta có phương pháp định lượng feruloylmethan trong sản phẩm biến tính curcuminnoid như sau: Điều kiện sắc ký:
+ Cột sắc ký: cột C18 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5àm)
+ Ghi kết quả sắc ký bằng detector PDA, lấy sắc ký đồ ở bước sóng 336 nm để định lượng feruloylmethan, lấy sắc ký đồ ở bước sóng 425 nm để định tính sự có mặt của curcuminoid trong mẫu
+Pha động: acid acetic 1% (trong nước) : acetonitril với tỉ lệ theo bảng 3.1
+ Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 12,50 mg chuẩn feruloylmethan vào bình định mức 50 ml, hòa tan và định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol Lắc đều Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10 ml, định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol Lắc đều
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 275,0 mg mẫu thử M18, cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, hòa tan Sau đó định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol, lắc đều Lắc đều
Dung dịch đối chiếu curcuminoid: Cân chính xác khoảng 12,50 mg chuẩn nguyên liệu curcuminoid vào bình định mức 50 ml, hòa tan và định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol Lắc đều Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức vừa đủ đến vạch bằng methanol Lắc đều
Lọc dung dịch này qua màng lọc 0,45 àm Tiờm sắc ký
*Đánh giá kết quả: Định tính feruloylmethan : So sánh đáp ứng pic trên sắc ký đồ dung dịch thử ở cùng thời gian lưu với pic feruloylmethan trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn làm việc
Bàn luận
3.2.1 Điều kiện xử lý mẫu
Dung môi pha mẫu trong quy trình là MeOH, lựa chọn dung môi này do feruloylmethan là một acid hydroxycinnamic, khó tan trong nước và tan trong dung môi MeOH
Phương pháp định lượng feruloylmethan chưa có hướng dẫn cụ thể, dựa vào cấu trúc khung của feruloylmethan và thực tế mẫu được thêm vào curcuminoid, với mục đích xây dựng phương pháp định lượng feruloylmethan trong sản phẩm biến tính curcuminoid, khóa luận tốt nghiệp đã tham khảo các tài liệu về phương pháp định lượng curcuminoid và tiến hành khảo sát các điều kiện pha động và xây dựng chương trình chạy sắc ký trên hệ thống máy HPLC-DAD Shimadzu LC-40D XR (Nhật Bản) Lựa chọn một số điều kiện cố định: cột sắc ký C18 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 àm), nhiệt độ cột 30 0 C, thể tớch tiờm mẫu 20 àl, tốc độ dũng 1,2 ml/phỳt, bước súng phỏt hiện 336 nm
Pha động được khảo sát là hệ pha động ACN – acid acetic 1% trong nước với các tỉ lệ khác nhau Sau khi tiến hành khảo sát pha động ở các tỉ lệ khác nhau là 60:40 (tt/tt), 40:60 (tt/tt), 28:72 (tt/tt), kết quả cho thấy tỉ lệ pha động ACN – acid acetic 1% là 28:72 (tt/tt) cho pic hoạt chất cân xứng, tách được với các pic phụ khác với độ phân giải đạt yêu cầu Trong quá trình xây dựng, do thực tế mẫu được thêm vào curcuminoid và để theo dõi sự có mặt của curcminoid trong các mẫu nên khóa luận tốt nghiệp đã khảo sát chương trình gradient để tách 2 chất feruloylmethan và curcuminoid Kết quả với chương trình gradient được xây dựng, pic 2 hoạt chất feruloylmethan và curcuminoid cân xứng, tách được các pic phụ xung quanh với độ phân giải đạt yêu cầu
Do đó, chương trình gradient với hệ pha động ACN – acid acetic 1% trong nước được lựa chọn để định lượng feruloylmethan trong sản phẩm curcuminoid biến tính
3.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi xây dựng phương pháp, phương pháp được thẩm định theo hướng dẫn của ICH Q2 (R1) và AOAC International 2016 với các chỉ tiêu: Độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng và độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian)
Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu tốt với feruloylmethan Trong khoảng nồng độ từ 5 – 37,5 àg/ml, phương phỏp cú sự tương
38 quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic với hệ số tương quan r = 0,9999 Phương pháp cũng cho độ đúng thích hợp để định lượng feruloylmethan trong mẫu curcuminoid biến tính với độ thu hồi đạt yêu cầu Áp dụng quy trình định lượng và điều kiện sắc ký, kết quả cho thấy phương pháp phân tích feruloylmethan trong sản phẩm curcuminoid biến tính cho kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian đều đạt yêu cầu theo quy định của AOAC International 2016
3.2.4 Ứng dụng phương pháp phân tích
Phương pháp được ứng dụng phân tích các mẫu sản phẩm biến tính curcuminoid và kết quả thu được trên các sắc ký đồ cho thấy đã tách được hoàn toàn hoạt chất feruloylmethan trong tất cả các mẫu sản phẩm biến tính curcuminoid và thu được hàm lượng của feruloylmethan thực tế trong các mẫu Từ kết quả định lượng hàm lượng feruloylmethan thấy rắng feruloylmethan xuất hiện ngay trong mẫu M4 khi curcuminoid bắt đầu được thêm vào placebo, hàm lượng thay đổi dần qua các mẫu và ổn định từ mẫu M12 Tại mẫu M18 curcuminoid đã biến đổi hoàn toàn sang feruloylmethan do tại thời gian lưu của curcuminoid được xác định trong mẫu chuẩn đã không thấy xuất hiện pic curucminoid trong mẫu M18
Kết quả định tính cho thấy curcuminoid có mặt và biến đổi mạnh nhất trong 3 mẫu đầu M4, M5, M6 khi curcuminoid bắt đầu được thêm vào Và hàm lượng feruloylmethan cũng thay đổi rõ ràng nhất trong các mẫu này Thực tế do trong quá trình biến đổi xuất hiện nhiều chất trung gian xung quanh pic hoạt chất curcuminoid nên chưa thể tách được hoàn toàn curcuminoid trong các mẫu
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN
Qua thực nghiệm, khóa luận tốt nghiệp đã đạt được những mục tiêu đề ra và thu được các kết quả như sau:
1 Đã xây dựng phương pháp định lượng feruloylmethan trong sản phẩm biến tính curcuminoid bằng phương pháp HPLC với các điều kiện xử lý mẫu và sắc ký Đã thẩm định được phương pháp xây dựng theo hướng dẫn của ICH, AOAC và kết quả các chỉ tiêu đã đáp ứng các yêu cầu
2 Đã ứng dụng phương pháp phân tích trên các mẫu sản phấm biến tính curcuminoid ĐỀ XUẤT
Phương pháp định lượng feruloylmethan trong sản phẩm biến tính curcuminoid được xây dựng trong đề tài này có độ tin cậy cao, phù hợp với điều kiện các phòng thí nghiệm và cơ sở kiểm nghiệm Vì vậy chúng tôi kiến nghị tiếp tục triển khai và ứng dụng phương pháp này trong nghiên cứu và phát triển các sản phẩm về hoạt chất feruloylmethan, đánh giá trên các sản phẩm khác của hoạt chất này
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1 Trần Tử An (2012), "Hóa phân tích tập 2: Phân tích dụng cụ", NXB Y học, pp
2 Nguyễn Thị Kiều Anh (2022), "Ứng dụng sắc ký trong phân tích thuốc và dịch sinh học", pp 9-28
3 VCB, "HPLC là gì? Ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc.": https://vietnamcleanroom.com/vi/post/hplc-la-gi ung-dung-cua-hplc-trong- kiem-nghiem-thuoc-1455.htm
4 Cường Hà Chí (2021), "Khảo sát hàm lượng curcumin trong một số sản phẩm đang lưu hành ở Đắk Lắk bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao", Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Buôn Ma Thuột, pp
5 Nguyễn Thị Quế Chi (2004), "Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn của bột
Curcuminoid chiết xuất từ nghệ ( Rhizoma curcumae longae ) và dạng bào chế",
Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, pp
6 Bùi Vũ Dũng (2011), "Cải tiến phương pháp chiết xuất Curcuminoid từ nghệ vàng", Luận văn tốt nghiệp cao học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, pp
7 Lê Thi Hòa (2016), "Tổng hợp nano curcumin từ củ nghệ tươi", Đồ án tốt nghiệp, ngành Công nghệ kỹ thuật hóa dược, Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu, pp
8 Hoàng Thị Thùy Linh (2021), "Định lượng Astilbin trong chế phẩm dược liệu chứa Thổ phục linh bằng HPLC", Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học
Dược Hà Nội, Hà Nội, pp 11-20
9 Hội đồng Dược điển Việt Nam (2017), "Dược điển Việt Nam V", NXB Y học, pp
10 Nguyễn Hữu Tiến, Lê Thị Bảo Trâm, Nguyễn Thị Như Ngọc, et al (2018), "Định lượng curcumin trong tinh bột nghệ và viên hoàn nghệ mật ong bằng săc ký lỏng hiệu năng cao", Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế, 8, pp
11 Aggarwal Bharat B, Kumar Anushree, Aggarwal Manoj S, et al (2005),
"Curcumin derived from turmeric (Curcuma longa): a spice for all seasons",
Phytopharmaceuticals in cancer chemoprevention, 23, pp 351-387
12 Anand Preetha, Kunnumakkara Ajaikumar B, Newman Robert A, et al (2007),
"Bioavailability of curcumin: problems and promises", Molecular pharmaceutics, 4(6), pp 807-818
13 Anto Ruby John, Kuttan Girija, Babu KV Dinesh, et al (1996), "Anti-tumour and free radical scavenging activity of synthetic curcuminoids", International journal of pharmaceutics, 131(1), pp 1-7
14 AOAC INTERNATIONAL (2016), "Appendix F: Guidelines for Standard
15 B.-K Jadhav, K.-R Mahadik, Paradkar A.-R (2007), "Development and validation of improved reversed phase-HPLC method for simultaneous determination of curcumin, demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin",
16 Begum Farmiza, Manandhar Suman, Kumar Gautam, et al (2023),
"Dehydrozingerone promotes healing of diabetic foot ulcers: a molecular insight", Journal of Cell Communication Signaling, 17(3), pp 673-688
17 Christopher D Lao, Mack T Ruffin IV, Daniel Normolle, et al (2006), "Dose escalation of a curcuminoid formulation", BMC complementary alternative medicine, 6(1), pp 10
18 Débora M Martinez, Angelita Barcellos, Angela M Casaril, et al (2014),
"Antidepressant-like activity of dehydrozingerone: involvement of the serotonergic and noradrenergic systems", Pharmacology Biochemistry Behavior,
19 Dinkova-Kostova Albena T, Paul Talalay (1999), "Relation of structure of curcumin analogs to their potencies as inducers of Phase 2 detoxification enzymes", Carcinogenesis, 20(5), pp 911-914
20 El-Beltagi Hossam S, I Mohamed Heba (2013), "Reactive oxygen species, lipid peroxidation and antioxidative defense mechanism", Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 41(1), pp 44-57
21 Fuchs-Tarlovsky V., J Calderon-Cuevas (2014), "The role of the antioxidants in cancer onset and development", 273 - 285, pp
22 Guddadarangavvanahally K Jayaprakasha Lingamullu Jagan Mohan Rao,
Kunnumpurath K Sakariah (2002), "Improved HPLC method for the determination of curcumin, demethoxycurcumin, and bisdemethoxycurcumin",
Journal of agricultural food chemistry, 50(13), pp 3668-3672
23 Hampannavar Girish A, Karpoormath Rajshekhar, Palkar Mahesh B, et al
(2016), "An appraisal on recent medicinal perspective of curcumin degradant: Dehydrozingerone (DZG)", Bioorganic & Medicinal Chemistry, 24(4), pp 501-
24 I Rahath Kubra, Pushpa S Murthy, Rao L Jagan Mohan (2013), "In vitro antifungal activity of dehydrozingerone and its fungitoxic properties", Journal of
25 ICH (2005), "VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES: TEXT AND
26 Jae Ick Jeong, Young Woo Lee, Kim Yong Keun (2003), "Chemical hypoxia- induced cell death in human glioma cells: role of reactive oxygen species, ATP depletion, mitochondrial damage and Ca 2+", Neurochemical research, 28, pp 1201-1211
27 Julia Zhu, Katherine Z.Sanidad, Elvira Sukamtoha, et al (2017), "Potential roles of chemical degradation in the biological activities of curcumin", Food & function, 8(3), pp 907-914
28 K.Indira Priyadarsini, T.P.A Devasagayam, M.N.A Rao, et al (1999),
"Properties of phenoxyl radical of dehydrozingerone, a probable antioxidant",
29 L Shen, Ji HF (2012), "Low stability remedies the low bioavailability of curcumin", Trends in Molecular Medicine, 18(7), pp 363-364
30 Liu Yizhen MS, Dolence Julia, Ren Jun, et al (2008), "Inhibitory effect of dehydrozingerone on vascular smooth muscle cell function", Journal of cardiovascular pharmacology, 52(5), pp 422-429
31 Malleswara Rao Peram, Sunil S Jalalpure, Sumit A Joshi, et al (2017), "Single robust RP-HPLC analytical method for quantification of curcuminoids in commercial turmeric products, Ayurvedic medicines, and nanovesicular systems", Journal of Liquid Chromatography Related Technologies, 40(10), pp 487-498
32 Mallikarjuna C Rao, Arun T Sudheendra, Pawan G Nayak, et al (2011), "Effect of dehydrozingerone, a half analog of curcumin on dexamethasone-delayed wound healing in albino rats", Molecular cellular biochemistry, 355, pp 249-
33 National Center for Biotechnology Information (2023), "Dehydrozingerone": https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Dehydrozingerone
34 Noriko Motohashi, Chisako Yamagami, Harukuni Tokuda, et al (1998),
"Inhibitory effects of dehydrozingerone and related compounds on 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetate induced Epstein–Barr virus early antigen activation", Cancer letters, 134(1), pp 37-42
35 P Šmerák Z Polívková, H Šestáková, R Štětina, et al (2006), "Antimutagenic effect of curcumin and its effect on the immune response in mice", Czech journal of food sciences, 24(2), pp 72-83
36 Peter J Roughley, Whiting Donald A (1973), "Experiments in the biosynthesis of curcumin", Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, pp 2379-
37 R.S Ramsewak, D.L DeWitt, Nair M.G (2000), "Cytotoxicity, antioxidant and anti-inflammatory activities of curcumins I–III from Curcuma longa",
38 Ragunathan Irulappan, Natarajan Panneerselvam (2007), "Antimutagenic potential of curcumin on chromosomal aberrations in Allium cepa", Journal of
39 Sariya Mapoung, Shugo Suzuki, Satoshi Fuji, et al (2020), "Dehydrozingerone, a curcumin analog, as a potential anti-prostate cancer inhibitor in vitro and in vivo", Molecules, 25(12), pp 2737
40 Shingo Yogosawa, Yasumasa Yamada, Shusuke Yasuda, et al (2012),
"Dehydrozingerone, a structural analogue of curcumin, induces cell-cycle arrest at the G2/M phase and accumulates intracellular ROS in HT-29 human colon cancer cells", Journal of natural products, 75(12), pp 2088-2093
41 Song Yin, Xing Zheng, Xu Yao, et al (2013), "Synthesis and anticancer activity of mono-carbonyl analogues of curcumin", pp
42 Taslim B Shaikh, Madhusudhana Kuncha, Sai Balaji Andugulapati, et al (2023),
"Dehydrozingerone alleviates pulmonary fibrosis via inhibition of inflammation and epithelial-mesenchymal transition by regulating the Wnt/β-catenin pathway", European Journal of Pharmacology, 953, pp 175820
43 Toshihiro Ohta, Kazuko Watanabe, Masaaki Moriya, et al (1983), "Anti- mutagenic effects of coumarin and umbelliferone on mutagenesis induced by 4- nitroquinoline 1-oxide or UV irradiation in E coli", Mutation Research/Genetic
44 Wisut Wichitnithad, Nutthapon Jongaroonngamsang, Sunibhond Pummangura, et al (2009), "A simple isocratic HPLC method for the simultaneous determination of curcuminoids in commercial turmeric extracts", Phytochemical
45 Zhiguo Liu, Yusheng Sun, Luqing Ren, et al (2013), "Evaluation of a curcumin analog as an anti-cancer agent inducing ER stress-mediated apoptosis in non- small cell lung cancer cells", BMC cancer, 13, pp 1-9
46 Panahi Yunes, Rahimnia Ali‐Reza, Sharafi Mojtaba, et al (2014), "Curcuminoid treatment for knee osteoarthritis: A randomized double‐blind placebo‐controlled trial", Phytotherapy research, 28(11), pp 1625-1631
PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1 SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FERULOYLMETHAN TRONG SẢN PHẨM CURCUMINOID BIẾN TÍNH
Phụ lục 1a: Sắc ký đồ độ thích hợp hệ thống
Phụ lục 1b: Sắc ký đồ độ tuyến tính
Phụ lục 1c: Sắc ký đồ độ đúng
Phụ lục 1d: Sắc ký đồ độ chính xác
PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FERULOYLMETHAN TRONG SẢN PHẨM CURCUMINOID BIẾN TÍNH
PHỤ LỤC 1 SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FERULOYLMETHAN TRONG SẢN PHẨM CURCUMINOID BIẾN TÍNH
Phụ lục 1a: Sắc ký đồ độ thích hợp hệ thống
Phụ lục 1b: Sắc ký đồ độ tuyến tính
Phụ lục 1c: Sắc ký đồ độ đúng
Phụ lục 1d: Sắc ký đồ độ chính xác Độ lặp lại ngày 1: