Mục đích của luận án Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu là xây dựng quy trình phân tích Auramine O trong mẫu thực phẩm: măng, miến, dưa, phấn hoa, cá khô, mì tôm. Xây dựng quy trình phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm thịt khô và bim bim.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI PHẠM THỊ CHUYÊN PHÂN TÍCH AURAMINE O, SUDAN I, SUDAN II TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP RP-HPLC SỬ DỤNG VẬT LIỆU NANOSILICA ĐỂ XỬ LÝ MẪU Chun ngành: Hóa học phân tích Mã số: 9.44.01.18 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2022 Cơng trình hồn thành tại: Bộ mơn Hóa phân tích - Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đặng Xuân Thư Trường Đại học Sư phạm Hà Nội TS Nguyễn Bích Ngân Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Phản biện 1: PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS Huỳnh Văn Trung Viện Công nghệ Xạ Phản biện 3: PGS.TS Dương Thị Tú Anh Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi … … ngày … tháng… năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc Gia, Hà Nội - Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết lí đề tài Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc tế IARC xếp số chất màu tổng hợp vào nhóm chất gây ung thư như: chất Sudan, Auramine O, Rhodamine B, Ponceau 3R,… Tuy nhiên có nhiều sản phẩm thực phẩm thị trường bị phát sử dụng phẩm màu không phép dùng cho thực phẩm Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia phụ gia thực phẩm - phẩm màu QCVN 4-10:2010/BYT Thông tư số 21/2019/TT-BNNPTNT Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn “Hướng dẫn số điều luật chăn nuôi Thức ăn chăn ni”, có quy định rõ phụ lục V: Cấm sử dụng Auramine O (AO) dẫn xuất Auramine O thức ăn chăn nuôi, AO chất khơng phép có mặt thực phẩm Việt Nam Mặt khác thông tư 24/2019/TTBYT ban hành ngày 30 tháng năm 2019 quy định có 57 chất màu phép sử dụng thực phẩm không bao gồm Sudan AO Do đó, phương pháp phát AO chất Sudan lượng siêu vết thực phẩm cần thiết Trong hợp chất Sudan, Sudan I Sudan II có màu đỏ sáng đẹp mắt, sử dụng phổ biến thực phẩm Sudan III Sudan đề tài chọn hướng nghiên cứu hỗn hợp Sudan I Sudan II mẫu thực phẩm Hiện nay, Việt Nam có phương pháp chứng nhận để xác định Auramine O thực phẩm thức ăn chăn nuôi Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12267:2018 “Thực phẩm - xác định hàm lượng Auramine - phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS)”, chưa có phương pháp chứng nhận để xác định Sudan thực phẩm TCVN 12267:2018 áp dụng quy trình chiết tách AO từ mẫu thực phẩm khác dung môi hữu cơ, điều dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp độ xác chưa cao mẫu thực phẩm khác có mẫu phức tạp khơng giống nhau, đồng thời LC-MS/MS hệ thống thiết bị phức tạp đắt tiền, khơng phổ biến phịng thí nghiệm Ưu điểm phương pháp HPLC định lượng đồng thời chất màu tương tự nhau, phương pháp phân tích vận hành đơn giản, thiết bị sử dụng phổ biến, nhiên phân tích HPLC cần phải xử lý làm ảnh hưởng mẫu Việc sử dụng nanosilica từ vỏ trấu (RHNS) để hấp phụ chất màu Rhodamine B Xanh metylen dung dịch nước nghiên cứu giới, ưu điểm việc sử dụng RHNS so với kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) nguồn nguyên liệu nông nghiệp rẻ tiền trấu, bước thực nghiệm đơn giản khơng cần thiết bị phức tạp, sử dụng dung môi pha động HPLC để rửa giải chất màu cho hiệu suất hấp phụ- rửa giải cao Tuy nhiên chưa có nghiên cứu tiến hành hấp phụ chất màu AO Sudan từ dịch chiết mẫu thực phẩm Nhằm tìm kiếm giải pháp chiết, tách phù hợp với mẫu thực phẩm khác nhau, đồng thời xây dựng phương pháp định lượng chất màu nhân tạo độc hại hệ thống thiết bị đơn giản, phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi tiến hành đề tài “Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II thực phẩm phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu” Mục đích nội dung luận án Mục đích luận án: Xây dựng quy trình phân tích Auramine O mẫu thực phẩm: măng, miến, dưa, phấn hoa, cá khơ, mì tơm Xây dựng quy trình phân tích hỗn hợp Sudan I Sudan II mẫu thực phẩm thịt khô bim bim Nội dung nghiên cứu luận án: Đối với Auramine O: o Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định Auramine O phương pháp HPLC o Khảo sát điều kiện tối ưu chiết Auramine O từ mẫu thực phẩm phịng thí nghiệm o Nghiên cứu điều kiện hấp phụ Auramine O dung dịch lên Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu (kí hiệu RHNS) o Áp dụng quy trình nghiên cứu để xác định Auramine O mẫu thực tế Đối với hỗn hợp Sudan I Sudan II: o Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định đồng thời Sudan I Sudan II phương pháp HPLC o Khảo sát điều kiện tối ưu chiết Sudan I Sudan II từ mẫu thực phẩm phịng thí nghiệm o Nghiên cứu điều kiện hấp phụ của hỗn hợp Sudan I Sudan II dung dịch lên Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu o Áp dụng quy trình nghiên cứu để xác định Sudan I Sudan II mẫu thực tế Đối tượng, phạm vi nghiên cứu phương pháp nghiên cứu Đối tượng, phạm vi nghiên cứu - Các chất màu Sudan I, Sudan II mẫu thực phẩm: mẫu thịt khô, mẫu bim bim - Chất màu Auramine O mẫu: măng, miến, phấn hoa, dưa chua, cá khơ, mì tơm Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp chiết lỏng – lỏng mẫu thực phẩm dung môi hữu - Phương pháp hấp phụ chất màu nanosilica - Phương pháp phân tích HPLC định lượng chất màu, sử dụng detector mảng Diode Array (PDA) - Phương pháp phổ hấp phụ phân tử UV-Vis để xác định bước sóng hấp phụ cực đại dung dịch chất màu Luận án sử dụng phương pháp phân tích hóa lý đánh giá xác định đặc trưng vật liệu hấp phụ: phổ FTIR, SEM, EDX, BET,… Sử dụng phương pháp thống kê để xử lý kết quả, đánh giá số liệu thực nghiệm Ý nghĩa khoa học, thực tiễn đóng góp luận án - Việc kiểm tra chất màu độc hại trái phép thực phẩm với mẫu ngẫu nhiên phịng thí nghiệm nhỏ Việt Nam khả thi, với mục tiêu nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đơn giản RP-HPLC để đánh giá hàm lượng AO, Sudan I Sudan II số mẫu thực phẩm thị trường có ý nghĩa lớn - Luận án đưa quy trình chung để phân tích chất màu (Auramine O hỗn hợp Sudan I, Sudan II) mẫu thực phẩm Quy trình gồm giai đoạn xử lý mẫu phân tích định lượng mẫu phương pháp HPLC Giai đoạn xử lý mẫu thực theo cách với loại mẫu khác Cách 1: Chiết dung môi hữu Cách 2: Chiết dung môi hữu - Hấp phụ chất màu dịch chiết Nanosilia chế tạo từ vỏ trấu - Giải hấp phụ pha động HPLC Đây quy trình phân tích chất màu thực phẩm chưa đề xuất trước cơng trình nghiên cứu khoa học - Xử lý mẫu phương pháp chiết với dung môi hữu đánh giá phương pháp nhanh, đơn giản dễ thực chi phí thấp Một điểm ý nghĩa luận án đưa phương pháp chiết chất màu dung môi ethanol (chiết auramine O hỗn hợp ethanol: nước (v/v 70:30, chiết hỗn hợp Sudan I Sudan II ethanol tuyệt đối) Với lượng mẫu, thể tích dịch chiết, số lần chiết, nhiệt độ, thời gian chiết phù hợp, sử dụng dung môi chiết chứa dung môi ethanol cho hiệu suất chiết cao nhiều loại mẫu thực phẩm (trên 90%) mà đảm bảo yếu tố: không độc hại với người phân tích mơi trường, chi phí thấp, bước thực đơn giản chiết đồng thời nhiều loại mẫu - Sử dụng Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu để hấp phụ chất màu từ dịch chiết mẫu thực phẩm điểm luận án Đây bước quan trọng xử lý mẫu hướng tới "quy trình xanh" - Luận án đưa kết định lượng phân tích AO, Sudan I Sudan II nhiều mẫu thực phẩm khác nhau, số liệu có giá trị việc tham khảo lựa chọn loại thực phẩm an toàn người tiêu dùng Bố cục luận án ` Bố cục luận án gồm 147 trang: mở đầu trang; tổng quan 40 trang; thực nghiệm 27 trang; kết thảo luận 56 trang; kết luận trang Luận án có 56 hình 42 bảng; tài liệu tham khảo 11 trang với 13 tài liệu tiếng Việt 63 tài liệu tiếng Anh Ngồi cịn có Phụ lục với độ dài trang CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN Chương giới thiệu thông tin vấn đề thuộc phạm vi nghiên cứu luận án bao gồm: 1.1 Chất màu tổng hợp 1.2 Cơ chế liên kết chất màu với vật liệu 1.3 Auramine O 1.4 Các hợp chất Sudan 1.5 Một số vấn đề định lượng chất màu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao: gồm nội dung hệ số đối xứng peak, vấn đề peak, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ 1.6 Xử lý mẫu thực phẩm: gồm nội dung phân loại phương pháp xử lý mẫu, kỹ thuật chiết lỏng - lỏng ứng dụng xử lý mẫu, xu hướng áp dụng kỹ thuật chuẩn bị mẫu xanh 1.7 Vật liệu nanosilica ứng dụng hấp phụ chất màu: bao gồm nội dung đặc trưng vật lý, hóa học vật liệu, sở xử lý thống kê số liệu hấp phụ, ứng dụng vật liệu nanosilica chế tạo từ vỏ trấu hấp phụ làm giàu chất phân tích CHƯƠNG 2- THỰC NGHIỆM 2.1 Vật liệu, hóa chất, dụng cụ thiết bị 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1.Chuẩn bị mẫu giả 2.2.1.1 Mẫu phân tích Auramine O Măng tươi đào nguyên củ, bỏ phần cứng xơ, lấy lõi mềm rửa sạch, thái mỏng, ngâm qua nước muối pha lỗng, vớt, luộc chín, để nước, sau ngâm ngập dấm đến ngày, ngửi thấy măng có mùi chua đặc trưng vớt ra, cắt nhỏ, cân khối lượng ban đầu m1 (gam), thêm vào lượng Auramine O theo khối lượng định trước (mAO gam) Đem sấy đến khối lượng không đổi tủ sấy chân không cân khối lượng m2 gam, sau nghiền, rây mịn Với mẫu miến, loại miến dong làm thủ công Sơn La, kiểm sốt cơng đoạn chặt chẽ để khơng sử dụng chất màu chất tẩy trắng trình làm miến Lấy lượng miến đem sấy khơ đến khối lượng không đổi (ghi khối lượng mẫu ban đầu m1 gam), ngâm vào nước ấm đến mềm, trộn AO khối lượng định trước (mAO gam), đảo nghiền đến đồng mẫu, đem sấy khô đến khối lượng không đổi (m2 gam), nghiền vụn, rây mịn, thu bột mịn, tiếp tục sấy bột tủ sấy chân khơng khoảng giờ, sản phẩm đựng lọ kín, bảo quản tủ lạnh tối 2.2.1.2 Mẫu phân tích hỗn hợp Sudan I Sudan II Để xác định điều kiện tối ưu cho việc chiết xuất mẫu thực phẩm, hai mẫu thịt khô, ký hiệu A B, chuẩn bị Thịt lợn tươi mua từ siêu thị VinMart Hà Nội, có chứng nhận thịt lợn ni hữu Chỉ dùng phần thịt nạc (loại mỡ, da, gân), thái mỏng, băm xay nhỏ đến kích thước nhỏ mm Cho lượng thịt nạc xay nhỏ xấp xỉ vào hai cốc thủy tinh chịu nhiệt (kí hiệu A B), thêm 0,1g NaCl vào cốc Cốc A chứa mẫu thịt muối, cốc B chứa mẫu thịt, muối Sudan I, Sudan II Thêm vào cốc vài giọt ethanol trộn để hỗ trợ chất màu thẩm thấu vào thịt đảm bảo màu sắc phân bố lên thịt Các mẫu thịt lưu trữ kín tủ lạnh khoảng ngày để chất màu thấm kĩ vào thịt Sau đó, mẫu lại trộn sấy khô tủ sấy nhiệt độ 50°C ngày đêm Các mẫu thịt khô nghiền nhỏ máy rây qua rây kích thước lỗ 0,5 mm Cuối cùng, mẫu rây xong tiếp tục làm khô tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi (thời gian khoảng tiếng) 2.2.2 Nghiên cứu điều kiện tối ưu phân tích chất màu HPLC Các dung dịch chuẩn Auramine O trước đem đo HPLC pha đệm photphat (pH=3, thêm 0,2% triethylamine) trộn ACN (tỉ lệ thể tích 65:35) Các dung dịch chuẩn hỗn hợp Sudan I Sudan II trước đem đo HPLC pha pha động MeOH: H2O: ACN (v/v=77:3:20) Các nội dung khảo sát bao gồm: 2.2.2.1 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại 2.2.2.2 Khảo sát pha động tối ưu 2.2.2.3 Khảo sát tỉ lệ pha động 2.2.2.4 Khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn 2.2.3 Nghiên cứu điều kiện chiết 2.2.3.1 Các điều kiện chiết Auramine O * Đánh giá khả chiết hai phương pháp: chiết có hỗ trợ rung siêu âm chiết rung lắc * Lựa chọn dung mơi chiết AO: Có loại dung mơi chiết lựa chọn để khảo sát nêu bảng 2.3 Bảng 2.3 Các loại dung môi lựa chọn cho trình chiết AO Stt Thành phần Tỉ lệ Stt Thành phần v:v Tỉ lệ v:v ACN:H2O ACN 100% EtOH 100% MeOH:H2O 70:30 MeOH 100% EtOH:H2O 70:30 H2O 100% EtOH:H2O 50:50 (0,5%NH3) 70:30 * Khảo sát thời gian chiết: thời gian chiết khảo sát với mốc 10 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút, 200 phút 11 Hình 2.3: Quy trình xử lý mẫu Hình 2.4: Quy trình xử lý măng, miến, dưa muối chua, mẫu cá khô, bim bim, phấn thịt khơ hoa mì tơm (*) : Tùy thuộc vào chất cần phân tích AO hay hỗn hợp Sudan I Sudan II áp dụng điều kiện chiết tối ưu phù hợp Các mẫu lấy quầy hàng tươi, khô chợ Long Biên gồm: mẫu măng, mẫu miến, mẫu phấn hoa, mẫu cá khơ Ngồi ra, mẫu thực phẩm khác lấy chợ Xanh (quận Cầu Giấy, Hà Nội), chợ Cầu Diễn (Nam Từ Liêm, Hà Nội) chợ Trung Tâm (Thành phố Sơn La) Các bước xử lý mẫu sơ đồ hóa theo quy trình Hình 2.3 Hình 2.4 Có quy trình xử lý mẫu khác trình thí nghiệm với dịch chiết loại mẫu phấn hoa, cá khơ, bim bim, mì tơm đem pha loãng dịch chiết trực tiếp pha động tối ưu để phân tích HPLC có tượng tạo huyền phù, kết tủa gây tắc cột HPLC, nên so với sơ đồ (Hình 2.3) sơ đồ (Hình 2.4) cần xử lý thêm bước: + Bước 1: dung dịch sau chiết làm lạnh điều kiện tối kín, sau lọc hỗn hợp qua giấy lọc băng xanh (loại bỏ tạp chất lơ lửng lớp chất béo đóng bề mặt dịch chiết) 12 + Bước 2: phần dung dịch thu sau bước hấp phụ RHNS theo quy trình hấp phụ tối ưu nghiên cứu với chất chuẩn Dịch giải hấp sau pha lỗng hợp lý, lọc qua syringe 0,22 µm sau đem phân tích hệ thống HPLC CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Điều kiện tối ưu phân tích Auramine O HPLC Các thơng số phù hợp phép phân tích định lượng AO phương pháp HPLC tóm tắt Bảng 3.4 Bảng 3.4: Các điều kiện tối ưu phân tích AO HPLC Điều kiện phân tích Giá trị Loại cột C18-RP (150 mm ì 4,6 mm, 100, àm) Waters Nhit độ cột 40°C Thể tích tiêm mẫu 20 µL Bước sóng 432 nm Pha động PBS (pH=3; 0,2% triethylamine) : ACN Thành phần pha động 65:35 (v/v) Tốc độ pha động 1,0 mL/phút Phương trình đường chuẩn mơ tả phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ AO (µg/L): Y = (103,05 ± 0,96).X, với hệ số tương quan R2 = 0,9999 LOD=1,2 (µg/L); LOQ=3,9 (µg/L) Các giá trị phù hợp với sắc ký đồ mẫu chuẩn có nồng độ từ 10,0 g/L AO để xây dựng đường chuẩn 3.2 Điều kiện chiết Auramine O tối ưu từ mẫu thực phẩm Thực nghiệm cho thấy phương pháp chiết có sử dụng rung siêu âm cho hiệu suất thu hồi cao chiết dung mơi điều 13 kiện thường, phương pháp áp dụng tất mẫu chiết sau Hình 3.7: Sự thay đổi hiệu suất chiết AO trung bình theo dung mơi chiết Kết hiệu suất chiết khảo sát loại dung mơi chiết khác trình bày Hình 3.7 Sử dụng chuẩn Fisher để so sánh phương sai hai tập số liệu chiết hai dung môi MeOH:H2O (70:30 v/v) EtOH:H2O (70:30 v/v) thấy giá trị tTN nhỏ tLT nên chấp nhận hai giá trị trung bình hiệu suất chiết hai dung mơi khơng khác Vì vậy, dung mơi EtOH:H2O (70:30 v/v) chọn làm dung môi chiết cho phép phân tích sau tính chất độc hại dung môi nhà phân tích mơi trường Kết khảo sát tỉ lệ mẫu dung môi cho thấy MMT MIT khối lượng mẫu sử dụng để phân tích khoảng 0,1 gam/10 mL dung mơi chiết chấp nhận (hiệu suất chiết mẫu giả 95%) Các kết nghiên cứu điều kiện chiết tối ưu khác bao gồm: số lần chiết lần, lần sử dụng 5,00 mL hỗn hợp dung môi thời gian 30 phút/lần nhiệt độ chiết trì 60°C 14 Các kết xác định độ thu hồi AO mẫu MIG MAG cho thấy độ thu hồi phương pháp chiết đạt theo AOAC theo hội đồng Châu Âu (từ 80%÷110%), kết luận phương pháp chiết phù hợp để chiết AO từ mẫu Tuy nhiên, mở rộng phân tích loại mẫu thực tế khác ngồi mẫu măng mẫu miến, mẫu dưa chua bao gồm: mẫu mì tơm, cá khơ, phấn hoa Nhận thấy ứng với quy trình chiết phân tích HPLC trên, loại mẫu cho dịch chiết có tượng tạo huyền phù pha pha động HPLC gây tắc cột sắc ký Vì vậy, biện pháp sử dụng Nanosilica từ vỏ trấu để hấp phụ AO dịch chiết đề xuất, sau AO giải hấp phụ pha động định lượng HPLC 3.3 Các điều kiện tối ưu hấp phụ AO nanosilica chế tạo từ vỏ trấu Kết thực nghiệm biểu diễn Hình 3.9 cho thấy hiệu suất hấp phụ AO cao nồng độ chất điện li trơ KCl mM, KCl mM nồng độ tối ưu lựa chọn cho nghiên cứu hấp phụ Sự phụ thuộc hiệu suất hấp phụ AO vào pH dung dịch trình bày Hình 3.10 cho thấy giảm hiệu suất hấp phụ AO xảy rõ rệt pH dung dịch lớn 5,0 chứng tỏ môi trường acid thuận lợi cho hấp phụ AO RHNS đạt hiệu suất cao pH=4,0 Sự giảm nhẹ hiệu suất hấp phụ pH