vũ hương giang xây dựng phương pháp xác định brodifacoum trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ

Vì vậy để xác định một cách chính xác BDF trong máu nhằm phục vụ cho công tác giám định pháp y cũng như công tác điều trị, nghiên cứu thuốc giải độc một cách nhanh chóng, kịp thời, chúng

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ HƯƠNG GIANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH BRODIFACOUM TRONG MÁU BẰNG

SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HOÁ DƯỢC

HÀ NỘI – 2024

SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HOÁ DƯỢC

Người hướng dẫn:

1 TS Trần Nguyên Hà 2 TS Phạm Quốc Chinh

Nơi thực hiện:

1 Khoa Hoá phân tích và Kiểm nghiệm thuốc 2 Viện Pháp y Quốc gia

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Trần Nguyên

Hà và TS Phạm Quốc Chinh, những người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ

em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khoá luận này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Vũ Ngân Bình đã nhiệt tình giúp đỡ

và cho em những lời khuyên bổ ích

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới chị Phạm Thị Thu Hà và các cô chú, anh chị nghiên

cứu viên tại khoa Độc chất – Viện Pháp y Quốc gia trong thời gian qua đã luôn tạo

điều kiện tốt nhất cho em, cũng như động viên, hỗ trợ em trong quá trình học tập, nghiên cứu tại Viện để có thể hoàn thành được khoá luận này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô đã luôn quan tâm, giúp đỡ em và các bạn

trong lớp, trong trường đã đồng hành cùng em trong suốt những năm tháng học tập tại trường

Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người thân đã luôn ủng hộ và cổ vũ em cũng như chia sẻ và động viên trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận này

Do thời gian làm đề tài có hạn nên không thể tránh khỏi những thiếu xót nên em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô giáo và các bạn sinh viên

Hà Nội, ngày 1 tháng 6 năm 2024 Sinh viên

Vũ Hương Giang

1.2.1 Sơ lược về brodifacoum 3

1.2.2 Công thức cấu tạo và tính chất lý hoá 3

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 12

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi 12

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 12

2.2 Đối tượng nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Chuẩn bị mẫu 13

2.3.2 Khảo sát và tối ưu điều kiện phổ khối 13

2.3.3 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 13

2.3.4 Khảo sát quy trình xử lý và chiết xuất BDF trong máu 14

2.3.5 Thẩm định phương pháp phân tích BDF bằng LC-MS/MS 15

2.3.6 Áp dụng quy trình phân tích các mẫu thực tế 19

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20

3.1 Xây dựng được phương pháp xác định BDF trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ 20

3.1.1 Khảo sát phổ của BDF và nội chuẩn WF-D5 20

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng khối phổ 22

3.1.3 Khảo sát phương pháp chiết mẫu 25

3.1.4 Kết quả xây dựng phương pháp định lượng BDF trong máu bằng LC-MS/MS được xây dựng như sau 27

3.1.5 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng BDF trong máu 27

3.2 Ứng dụng quy trình được xây dựng để thực hiện giám định BDF trong máu tại Viện Pháp y Quốc gia 36

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Từ viết tắt Nghĩa tiếng việt

US - FDA United States – Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ GC-MS Gas Chromatography – Mass spectrometry Sắc kí khí khối phổ

HPLC High Performance Liqid Chromatography Sắc kí lỏng hiệu năng cao

LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry Sắc kí lỏng khối phổ LC-MS/MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry Sắc kí lỏng khối phổ 2

lần

QuEChERS method

Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe

Phương pháp chiết QuEChERS

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

Chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của brodifacoum 3

Hình 1.2 Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng khối phổ 7

Hình 3.1 Phổ khối SCAN lần 1 20

Hình 3.2 Phổ ion con của brodifacoum 21

Hình 3.3 Phổ ion mẹ của wafarin - d5 21

Hình 3.4 Phổ ion con của wafarin - d5 22

Hình 3.5 Sắc ký đồ của BDF và IS với hệ pha động ACN:Amoniformat 24

Hình 3.6 Sắc ký đồ của BDF và IS với hệ pha động methanol : ammoniformat 24

Hình 3.7 Sắc ký đồ của chất chuẩn brodifacoum và nội chuẩn ở tốc độ dòng 0.3 ml/phút 25

Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu được chiết xuất với dung môi ethyl acetat 26

Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn a Sắc ký đồ mẫu trắng; b Sắc ký đồ mẫu chuẩn; c Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn 28

Hình 3.10 Sắc ký đồ LOD và LOQ định lượng Brodifacum bằng LC-MS/MS a Sắc ký đồ xác định LOD b Sắc ký đồ xác định LOQ 29

Hình 3.11 Đường chuẩn phân tích brodifacoum trong máu 30

Hình 3.12 Sắc ký đồ đánh giá độ nhiễm chéo a Sắc ký đồ mẫu trắng; b Sắc ký đồ mẫu LLOQ 32

Hình 3.13 Sắc ký đồ xác nhận sự có mặt của BDF trong M2 37

Hình 3.14.Sắc ký đồ xác nhận sự có mặt của BDF trong M3 37

Hình 3.15 Sắc ký đồ xác nhận sự có mặt của BDF trong mẫu M5 38

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu xác định BDF trong máu 10

Bảng 3.1 Bảng tóm tắt điều kiện khối phổ phân tích BDF 22

Bảng 3.2 Khảo sát hệ pha động 23

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát dung môi chiết 26

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống LC-MS/MS 28

Bảng 3.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của brodifacoum 29

Bảng 3.6 Độ tuyến tính định lượng Brodifacoum trong máu 30

Bảng 3.7 Đáp ứng pic của mẫu LLOQ của BDF trong máu 31

Bảng 3.8 Kết quả phân tích độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu LQC 32

Bảng 3.9 Kết quả phân tích độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu MQC 33

Bảng 3.10.Kết quả phân tích độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu HQC 33

Bảng 3.11 Kết quả phân tích độ đúng - độ chính xác khác ngày 34

Bảng 3.12 Kết quả hiệu suất chiết BDF trong máu 35

Bảng 3.13 Độ ổn định cùa các chất sau 4 giờ, 7 ngày, 21 ngày và 3 chu kỳ rã - đông 36Bảng 3.14 Kết quả phân tích một số mãu thực……….36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, các loại thuốc diệt chuột (TDC), đặc biệt là TDC chống đông máu kéo dài, đối kháng vitamin K được sử dụng rất rộng rãi ở cả nông thôn cũng như thành thị với những mục đích khác nhau như bảo vệ nông nghiệp, diệt chuột trong gia đình, khu công nghiệp Tuy nhiên, trong thực tế, việc ngộ độc TDC do uống nhầm hay tự tử là tai nạn thường gặp trên thế giới cũng như Việt Nam.[13], [25], [21], [14]

Brodifacoum là TDC chống đông máu nhóm hydroxycoumarin thế hệ thứ hai BDF có cơ chế tác dụng tương tự như các TDC thế hệ trước: dicoumarol, wafarin nhưng có hiệu lực rất cao và thời gian tác dụng dài (thời gian bán thải từ 20 -130 ngày) [3] Biểu hiện lâm sàng thông thường khi ngộ độc BDF là chảy máu nên sử dụng vitamin K1 giải độc lâm sàng

Xác định BDF trong máu người phục vụ cho công tác giám định độc chất, đặc biệt trong các trường hợp ngộ độc TDC để có hướng xử trí kịp thời cũng như xác định nguyên nhân tử vong Cho đến nay, trên thế giới đã có rất nhiều các phương pháp khác nhau được sử dụng để phát hiện và định lượng BDF trong máu, nhưng ở Việt Nam chưa có tài liệu nào được công bố

Vì vậy để xác định một cách chính xác BDF trong máu nhằm phục vụ cho công tác giám định pháp y cũng như công tác điều trị, nghiên cứu thuốc giải độc một cách

nhanh chóng, kịp thời, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định brodifacoum trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ” với hai mục tiêu sau:

- Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định brodifacoum trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ

- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích brodifacoum trong máu một số

trường hợp nghi ngờ ngộ độc thuốc diệt chuột

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về thuốc diệt chuột chống đông máu

Từ lâu trên thế giới, việc kiểm soát các loài gặm nhấm ở các cơ sở công nghiệp, khu dân cư được thực hiện dưới nhiều hình thức bao gồm bẫy vật lý và kiểm soát bằng hoá học Trong đó việc kiểm soát hoá học được thực hiện bằng cách sử dụng các hợp chất kháng vitamin K, được viết tắt là AVK Vào cuối những năm 40 của thế kỷ XX, AVK lần đầu tiên được công bố thông qua việc phát triển các dẫn xuất của WAR và dicoumarin [7]

TDC chống đông máu hoạt động theo cơ chế ức chế enzyme carboxylase phụ thuộc vitamin K và do đó làm giảm khả năng tái hoạt động của vitamin K1, ảnh hưởng gián tiếp đến quá trình đông máu sinh lý [29]

TDC chống đông máu được chia thành 2 nhóm: hydroxycoumarin và indandion (chlorophacinon, diphacinon, pindon, và valon) Hydroxycoumarin được chia thành 2 thế hệ: thế hệ 1 (coumachlor, coumafuryl, coumatetralyl, và warfarin) và thế hệ 2 (brodifacoum, bromadiolon, difenacoum, difethialon và flocoumafen) [29] TDC chống đông máu thế hệ thứ 2 còn được gọi với các tên gọi khác nhau như: “Superwafarin”, “ Thuốc diệt chuột đơn liều”, “ Thuốc diệt chuột tác dụng kéo dài” Hiệu lực và thời gian tác dụng lớn hơn của TDC chống đông máu thế hệ thứ hai là do chúng : (i) ái lực với enzym khử hoá vitamin K-epoxide lớn hơn; (ii) tích tụ ở gan; và (iii) thời gian bán hủy rất dài do hòa tan tốt trong lipid và tuần hoàn gan ruột [31]

Những năm gần đây, TDC chứa superwafarin được sử dụng rộng rãi và phổ biến trên toàn thế giới, đã xảy ra rất nhiều trường hợp ngộ độc superwafarin Vì vậy một phương pháp phân tích có độ nhạy và độ chính xác cao để xác định TDC chống đông máu là hết sức quan trọng Việc phân tích các hợp chất superwafarin trong mẫu máu các trường hợp ngộ độc là phù hợp vì thời gian bán huỷ của các hợp chất này dài [19] Bên cạnh đó, trong các TDC chứa nhóm chất này, brodifacoum là hoạt chất được ghi nhận trong nhiều báo cáo là có khả năng gây độc cao nhất [17], [27], [6] Trên thực tế, BDF ngày nay được sử dụng rộng rãi ở cả công nghiệp và hộ gia đình dưới dạng bột hoặc viên nén rắn giống viên kẹo với màu sắc cực kỳ bắt mắt, dễ gây nhầm lẫn ở người già và trẻ nhỏ Do vậy, BDF đáng được quan tâm để xây dựng một phương pháp phân tích chính xác và có hiệu quả cao

1.2 Tổng quan về brodifacoum

1.2.1 Sơ lược về brodifacoum

Brodifacoum là TDC chống đông máu thế hệ thứ hai, là dẫn xuất của nhóm hydroxy-coumarin Theo Luật pháp của Cộng đồng châu Âu yêu cầu ghi nhãn cho các sản phẩm có chứa brodifacoum là rất độc hại với ký hiệu nguy hiểm T+ Ngoài ra, các khuyến nghị về vận chuyển hàng hóa của Liên Hợp Quốc đã phân loại brodifacoum trong nhóm 6.1 - là một chất độc (Số 3027) [24]

4-1.2.2 Công thức cấu tạo và tính chất lý hoá

- Công thức phân tử: C31H23BrO3

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của brodifacoum

- Danh pháp: hydroxychromen-4-one

3-[3-[4-(4-Bromophenyl)phenyl]-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-yl]-2 Khối lượng phân tử 523,4 g/mol[22]

- BDF ở dạng bột trắng mịn, không mùi Trong nước, ít tan trong nước( dưới 10 mg/L ở 20ºC, pH=7), tan tốt trong ethylacetat, ethanol, ít tan trong benzen Nhiệt độ nóng chảy ở khoảng 230 - 232ºC [22]

1.2.3 Dược động học của BDF

BDF được hấp thu qua đường tiêu hoá (dạ dày và ruột) sau đó được tích tụ trong các mô như não, gan, thận, tim, phổi với nồng độ cao nhất trong gan Nồng độ BDF trong huyết tương đạt tối đa sau 24 giờ và giảm dần trong 4 ngày tiếp theo Từ mô hình

invitro của chuyển hoá pha I và pha II cũng như thực hiện đo invivo trên mô, nước tiểu

và phân khi sử dụng BDF đã không đưa ra được bằng chứng về quá trình chuyển hoá của chất này BDF được thải trừ chủ yếu qua phân và có thời gian bán huỷ rất dài do tính ưa mỡ của BDF dẫn đến trải qua quá trình tuần hoàn gan ruột[11] Sản phẩm thải trừ chủ yếu dưới dạng hợp chất gốc còn hoạt tính

1.2.4 Độc tính của BDF

BDF có độc tính cao đối với động vật có vú và chim Các dấu hiệu và triệu chứng lâm sàng của ngộ độc cấp tính BDF ở người là chảy máu ở mức độ nhẹ, và bị rối loạn đông máu ở mức độ nặng Chảy máu nhẹ thường là chảy máu mũi hoặc nướu, ho ra máu, bầm máu, phân có máu, tiểu máu, đau bụng hoặc đau sườn, bầm tím hoặc tụ máu ở bụng, có thể chảy máu nặng dẫn tới sốc và tử vong Chảy máu bên trong và bên ngoài là những biểu hiện lâm sàng thường gặp nhất của nhiễm độc cấp tính gây ra bởi BDF, sau đó là nhịp tim nhanh, hạ huyết áp, suy đa cơ quan do mất máu và tưới máu không đủ [20]

Theo một số nghiên cứu về độc tính của BDF, LD50 của BDF trên chuột qua đường uống là 266 µg/kg [8], trên chó qua đường uống là 0,25 mg/kg và trên mèo qua đường uống là 25 mg/kg [26] Dữ liệu về độc tính của brodifacoum với động vật thực nghiệm cũng phản ánh độc tính cao của chất này với động vật có vú nói chung và con người nói riêng

1.3 Tổng quan về phương pháp chiết BDF trong máu

1.3.1 Xử lý mẫu

Trong quá trình phân tích các mẫu dịch sinh học như máu, huyết tương, việc xử lý mẫu là vô cùng quan trọng, ảnh hưởng đến hiệu quả của cả quá trình phân tích Các mẫu máu thường có rất nhiều tạp chất nên thành phần nền mẫu khá phức tạp Điều này gây ảnh hưởng tới độ nhạy, hiệu suất phân tích và tuổi thọ của các thiết bị phân tích, vì vậy mà xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein là cực kỳ cần thiết trước khi tiến hành phân tích BDF trên hệ thống sắc ký

Phương pháp loại protein thường kết hợp sử dụng các hoá chất như acid trichloroacetic, acid mạnh như HClO4 hoặc sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetonitril để gây kết tủa protein Sau đó kết hợp cùng với siêu âm và ly tâm để dễ dàng loại bỏ protein khỏi mẫu phân tích Protein kết tủa do sự thay đổi pH hoặc tính kỵ nước, làm thay đổi tương tác của protein với môi trường nước.[1]

1.3.2 Phương pháp chiết xuất:

Các kỹ thuật thường được sử dụng để chiết xuất mẫu trước khi phân tích là: chiết lỏng – lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE)

1.3.2.1 Chiết lỏng – lỏng (LLE)

Chiết lỏng - lỏng là phương pháp chiết dựa trên sự phân bố khác nhau của chất tan giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau thường một pha là nước và pha còn lại là dung môi hữu cơ không tan hoặc rất ít hòa tan trong nước Quá trình chiết là quá trình chuyển

chất tan từ pha nước vào pha hữu cơ được thực hiện qua bề mặt tiếp xúc giữa hai pha nhờ các tương tác hóa học giữa tác nhân chiết và chất cần chiết [1]

Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện chiết cần thiết Điều kiện chiết chất phân tích vào pha hữu cơ:

+ Dung môi chiết và dịch chiết là hai pha không được trộn lẫn, trong đó dung môi phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích;

BDF là một chất tan tốt trong dung môi hữu cơ như ethyl acetat, ethanol nên việc chiết trực tiếp BDF bằng LLE được nhiều tác giả sử dụng

1.3.2.2 Chiết pha rắn (SPE)

Nguyên tắc của kỹ thuật này cũng tương tự với kỹ thuật chiết lỏng lỏng, cũng liên quan đến việc phân tách dung dịch giữa hai pha Tuy nhiên thay vì phân tách giữa hai pha lỏng – lỏng như LLE thì chiết pha rắn tách chất phân tích giữa hai pha: pha rắn (chất hấp phụ) và pha lỏng (thường là dung môi và chất phân tích).[34]

Cơ chế của sự chiết pha rắn có thể có các bản chất theo các kiểu như sau:

- Theo cơ chế tương tác hấp phụ pha rắn- Theo cơ chế trao đổi ion (cation và anion) - Theo kiểu trao đổi tạo cặp ion

- Theo kiểu hợp chất liên hợp phân tử

- Kiểu chiết rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn

Kỹ thuật này có quy trình chiết bao gồm 4 bước chính: xử lý cột bằng dung môi hoặc dung dịch đệm, tách chất phân tích, loại tạp, rửa giải.[1]

Hiện nay chiết pha rắn đang được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực phân tích cho mục đích xác định cả các chất vô cơ và hữu cơ, các kim loại và phi kim do những ưu điểm sau:

+ Hiệu suất thu hồi cao

+ Cân bằng chiết đạt nhanh và có tính thuận nghịch

+ Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất + Thao tác đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt + Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích lớn

Nhiều nghiên cứu phân tích BDF trong dịch sinh học có sử dụng phương pháp SPE để chiết xuất và làm giàu BDF [30], [28] Cột SPE thường được sử dụng là cột HLB, C18, Bond Elut Certify II

1.4 Tổng quan sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)

Sắc ký lỏng - khối phổ (LC-MS) là một kỹ thuật phân tích kết hợp phân tách sắc ký có độ phân giải hiệu suất cao, độ nhạy và phát hiện phổ khối cụ thể Sự kết hợp giữa LC với MS là một sự phát triển quan trọng trong lịch sử sắc ký (những năm 1980) [15] LC-MS cho phép sử dụng các chế độ ion hóa (ESI, PI, quang hóa được hỗ trợ bằng laser (LAPI) và APCI), cho phép tách và ion hoá nhiều loại chất phân tích dễ bay hơi và không bay hơi, bao gồm peptid, protein và các chất không bền nhiệt [2]

Hệ thống LC-MS điển hình là sự kết hợp giữa HPLC với MS (nguồn ion hóa) Mẫu được phân tách bằng LC và các loại mẫu phân tích được phun vào nguồn ion áp suất khí quyển, nơi các chất chuyển thành ion ở pha khí Máy phân tích khối lượng sau đó được sử dụng để sắp xếp các ion theo khối lượng và khuếch đại tín hiệu được tạo ra từ mỗi ion Kết quả là phổ khối (biểu đồ tín hiệu ion như là một hàm của tỷ lệ khối lượng/điện tích) được tạo ra, được sử dụng để xác định bản chất nguyên tố của một mẫu, khối lượng của các hạt và phân tử, và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của phân tử [15] 1.4.1 Cấu tạo một máy sắc ký lỏng khối phổ

Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng gồm các phần chính: (1) Hệ thống cấp pha động, (2) bơm sắc ký lỏng, (3) bộ phận tiêm mẫu, (4) cột sắc ký

Cấu tạo hệ thống khối phổ gồm các phần chính: (1) bộ phần nạp mẫu, (2) bộ nguồn ion, (3) bộ phân tích khối, (4) dectector, (5) bộ phận xử lý dữ liệu Mẫu được đưa vào qua bộ phận nạp mẫu, các ion tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng qua bộ phận phân tích khối để tách các ion theo trị số m/z trước khi đến dectector [1]

Hình 1.2 Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng khối phổ 1.4.2 Sắc ký lỏng (LC)

Sắc ký lỏng là kỹ thuật tách trong đó pha động là chất lỏng , pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của các chất phân tích giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý.[1]

- Pha động: Pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi hoà tan vào nhau để có thể tách với độ phân giải phù hợp Trước khi sử dụng, cần lọc (màng lọc 0.45µm) và đuổi khí hoà tan trong pha động Khí hoà tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền Có thể loại khí hoà tan bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ như heli…[1]

- Cột và pha tĩnh: Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thuỷ tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30cm, đường kính trong khoảng 4-10mm

Chất nhồi cho cột sắc ký lỏng được chế tạo từ silica (silic dioxyd) bằng cách làm kết tụ các hạt silica để tạo ra các hạt có kích thước lớn hơn và đường kính đều nhau Các hạt silica gel hình thành thường được bao một lớp mỏng hữu cơ liên kết (hoá học hoặc vật lý) với bề mặt

Ngoài ra, còn có các chất nhồi khắc như nhôm oxyd, polyme xốp, nhựa trao đổi ion…, tuỳ thuộc vào loại hình sắc ký.[1]

1.4.3 Khối phổ (MS)

Đây là kĩ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector

Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10-3Pa đến 10-6Pa Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đổ hoặc phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất [1]

Nguồn ion hóa lý tưởng cho máy quang phổ khối sẽ mang lại hiệu suất ion hóa cao và độ ổn định cho các ion Trong nhiều năm qua, có rất nhiều nguồn ion hoá phổ biến được sử dụng trong máy LC-MS, có thể kể đến như: ion hoá bằng tia điện (electrospay ionization – ESI), ion hoá hoá học bằng áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemical ionization – APCI), va chạm electron ( electron impact -EI) và ion hoá hoá học (chemical ionization – CI)

- Ion hóa phun mù điện tử (ESI): Electrospray được tạo ra bằng cách tác dụng một điện trường mạnh vào chất lỏng đi qua qua ống mao dẫn có dòng chảy yếu Điều này tạo ra những giọt lớn tích điện sau đó bị bay hơi dung môi Tăng mật độ điện tích do sự bay hơi dung môi gây ra lực đẩy coulombic khắc phục sức căng bề mặt chất lỏng, dẫn đến giải phóng ion từ các giọt Đây là nguyên lý hình thành ion sử dụng kỹ thuật này

- Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI): Nguyên lý của kỹ thuật này liên quan đến việc phun khí dung pha động với khí nitơ và bay hơi bằng đun nóng đến nhiệt độ tương đối cao (trên 400°C) Đây là nguồn ion hoá được sử dụng phổ biến nhất trong LC-MS APCI được sử dụng để phân tích dược phẩm, môi trường, độc tính, lâm sàng và mẫu công nghiệp hóa chất/phòng thí nghiệm

- Ion hóa bằng giải hấp laser (MALDI): MALDI là một kỹ thuật ion hóa cho các chất có khối lượng phân tử lớn và không ổn định như peptid, protein, polyme, dendrimer, và fullerene Kỹ thuật này liên quan đến việc nhúng các chất phân tích trong một ma trận hấp thụ năng lượng ở bước sóng tia laser Laser cực tím nitơ (UV) (337 nm) được áp dụng trên chân không để tạo ra các ion chất phân tích [15]

1.4.4 Một số chế độ thu phổ [2]

- Thu tín hiệu toàn phổ (full – scan):

Khi thao tác với chế độ SCAN, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng để phát hiện hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ

- Thu tín hiệu chọn lọc ion (SIM):

Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc kí đồ theo thời gian Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy, tức tăng tỉ lệ tín hiệu (S) trên nhiễu đường nền (N)

- Thu tín hiệu chọn lọc hai lần:

Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS) Hai kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM

SRM (Selected Reaction Monitering): cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập một mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện

MRM (Multiple Reaction Monitering): cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ hai (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, thu được 2 (hoặc nhiều hơn 2) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ ba để đưa bào đầu dò để phát hiện

1.5 Tổng quan các nghiên cứu xác tại Việt Nam và trên thế giới xác định BDF trong máu

Một số nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật như HPLC, UHPLC, LC-MS đã được thực hiện để phân tích chính xác BDF trên rất nhiều nền mẫu sinh học

Các nghiên cứu xác định thuốc diệt chuột chống đông máu trong đó có BDF trên thế giới những năm gần đây được tổng hợp trong bảng 1.1

Ở Việt Nam hiện chưa có báo cáo nào về xác định BDF trong máu được công bố Qua bảng 1.1, có thể thấy các nghiên cứu đều có những đặc điểm sau:

- Hầu hết các phương pháp đều sử dụng chiết LLE để chiết BDF khỏi dịch sinh học, trong đó ethyl acetat hay được sử dụng và có độ thu hồi khá tốt (nghiên cứu [12] có độ thu hồi của các mẫu đều trên 80%; nghiên cứu [5] có độ thu hồi trên 70%) Ngoài ra thì nghiên cứu [28], [30] sử dụng phương pháp xử lý mẫu là chiết pha rắn với ưu điểm là độ sạch của mẫu sau khi chiết cao nhưng chi phí lại khá cao nên khó tiếp cận tại Việt Nam Nghiên cứu [30], [33] sử dụng phương pháp chiết là QuEChERS cũng cho độ thu hồi các mẫu trên 80%, thời gian chiết tương đối nhanh như LLE, tuy nhiên kinh phí sử dụng cho các ống chiết QuEChERS chưa tối ưu như LLE bằng các dung môi Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ sử dụng phương pháp xử lý mẫu là LLE

- Các phương pháp sắc ký phân tích BDF trong mẫu sinh học sử dụng detector khối phổ (MS/MS) và chế độ ESI âm, có độ nhạy phát hiện cao với LOD nằm trong khoảng từ 0,06-2 ng/ml Các nghiên cứu [30], [4] sử dụng detector huỳnh quang (FLD) có LOD cao hơn hẳn, ở mức 10 ng/ml Do đó việc sử dụng detector khối phổ luôn được ưu tiên sử dụng trong nhiều nghiên cứu

- Các nghiên cứu đều có khoảng tuyến tính khoảng 1 – 100 ng/ml

- Với pha tĩnh, việc sử dụng cột sắc ký C18 được nhiều tác giả sử dụng để phân tích BDF

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu xác định BDF trong máu

STT Nền mẫu

Kỹ thuật phân tích

Chất phân tích

Phương pháp xử lý mẫu

Phương pháp sắc ký Kết quả nghiên cứu BDF

FCF, BDF

Chiết lỏng – lỏng với ethyl acetat

Sử dụng cột C18 (150mm x 2,1mm, 5µm), pha động acetic acid -ammonium acetate /MeOH (12:88, v/v), tốc độ dòng 0,5 mL/phút

Khoảng tuyến tính 0,1-100 ng/mL, LOQ của BDF là 0,1 ng/mL

[12]

2 Máu người

ESI/ MS/ MS

LC-BMD, BDF

Chiết lỏng lỏng với ethylacetat

Cột C18 (5 µm, 50 mm x 2,1 mm), pha

ammonium acetat và methanol

Khoảng tuyến tính 0,5 – 100 ng/mL, LOD 0,2 ng/mL

[32]

3 Máu người

MS/MS

LC-BDF, BMD,

DFC, WAR, CTL, DFL, FCF, DPN, CPN

Máu chiết lỏng lỏng với ethyl acetat (pH=3)

LC-MS/MS cột C18 (100 mm × 2,1

mm, 1,7 μm), pha động amoni acetat

10 mM và methanol, tốc độ dòng 0,4 ml/phút Chế độ ESI âm

ng/mL, độ thu hồi 70-105%, khoảng tuyến tính 2-200 ng/mL

[5]

4 Máu người

UPLC – MS - MS

BDF, BMD, WAR, CC, CTL, DFC, P, DPN,

CFN

Chiết lỏng lỏng với acetonitril và 0.1% acid formic

Cột C18 (1,7 μm, 2,1 × 100 mm), pha

động acid formic, ammonium format

và acetonitril

Khoảng tuyến tính 1-2000 ng/mL, LOD 0,06 ng/mL,

ng/mL

[9]

5 Máu người

HPLC – MS/MS

BDF, BMD,

DFC, CC, WAR,

CTL

Loại protein bằng

acetonitril, sau đó chiết pha rắn bằng cột Bond-Elut Certify II

Cột C18 (150 mm × 2,1 mm, 5 μm),

pha động acid acetic 0,25% và methanol, tốc độ dòng 0,3 mL/phút,

ESI âm

LOD của BDF là 2 ng/mL

[28]

6 Máu và gan động vật

HPLC-FLD/ UV

BDF, DFC, BMD,

DFL, CPN, CF, P, WAR, DPN

SPE và QuEChERS

Cột C18 column (150 × 4,6 mm, 5µm), pha động tetrabutylamonium hydroxid 0,03 M và methanol

LOD 10 ng/mL máu và 10ng/g gan

[30]

động vật

HPLC - FLD

BMD, BDF, CC, CF, CTL, DFC, FCF, WAR

Chiết lỏng – lỏng với dichloromet

aceton( tỷ lệ 70:30)

Cột silica-based (250 × 4,6-mm, 5 µm), pha động là acid acetic 0,25% và methanol

LOD 13,9 µg/kg, LOQ 42,1 µg/kg

[4]

chuột

LC – MS - MS

BDF Chiết lỏng lỏng với aceton -dichloromthan(tỷ lệ 30:70)

Cột C18 (2,1 mm × 150 mm, 2,4 µm), pha động acetonitril và nước

Khoảng tuyến tính 1 - 50 ng/mL, LOD 0,1 ng/mL, LOQ 1 ng/mL

[10]

9 Huyết tương người

UHPLC/ MS - MS

BMD, DFC,

FCF, BDF, DFL

Kết tủa protein bằng methanol 10%/acetonitril

Cột C18 (50 x 2,1 mm, 1,8 µm), pha động: nước, acetonitril với 0,01% acid formic, nhiệt độ 50ºC

+ Cis-BDF:

ng/mL, LOQ 0.19ng/mL + Trans-BDF: LOD 0,16 ng/mL, LOQ 0,31 ng/mL

[23]

10 Máu và phủ tạng cừu

HPLC – MS/MS

13 chất là

thuốc diệt chuột

Phương pháp

QuEChERS

Cột biphenyl (100 × 3.0 mm, 2,6 μm),

ammonium acetat và methanol

Khoảng tuyến tính 1-100 ng/mL, LOD 0,5ng/mL, LOQ 1 ng/mL

[33]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi

- Chất chuẩn: Brodifacoum 10mg, 97% Lot: 20-GHZ-98-1, Toronto Research Chemicals Inc., Canada Hạn sử dụng: 27/2/2026

- Chất chuẩn nội: Warfarin-d5 1mg, 97%, Lot: 4-YMK-34-3, Toronto Research Chemicals Inc., Canada Hạn sử dụng: 27/9/2027

- Hóa chất dung môi: methanol (HPLC), acetonitril HPLC, diethylether, n-hexan, ethyl acetat, n -butanol, nước cất, acid acetic, acid trichloroacetic, acid formic, natri hydroxyd,…

- Các dụng cụ khác: cốc thuỷ tinh, ống đong, phễu, màng lọc 0,22µm…

2.2 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: BDF - Mẫu nghiên cứu

Mẫu máu trắng: Mẫu máu không nhiễm BDF của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương , số lô DM7.21260.A4 được sử dụng để khảo sát phương pháp

Mẫu máu của các bệnh nhân, nạn nhân nghi ngờ bị ngộ độc BDF được gửi đến giám định tại Viện Pháp y Quốc gia

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị mẫu

 Các dung dịch chuẩn:

- Dung dịch chuẩn gốc brodifacoum 100 µg/ml: Cân chính xác khoảng 1,004 mg chất chuẩn brodifacoum cho vào bình định mức 10 ml và bổ sung methanol đến vạch Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở 2 – 4 ºC

- Dung dịch chuẩn trung gian 1 µg/ml được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml trong dung môi methanol Dung dịch chỉ pha khi sử dụng

- Dãy dung dịch chuẩn làm việc 0,5 – 100 ng/ml được pha loãng từ dung dịch chuẩn trung gian 1µg/ml trong dung môi methanol hoặc nền mẫu trắng Các dung dịch chỉ pha khi sử dụng

 Các mẫu nhiễm:

Mẫu máu trắng 1 ml cho vào các ống riêng biệt Thêm vào các mẫu trắng lượng chuẩn và chuẩn nội cần thiết để tiến hành khảo sát

2.3.2 Khảo sát và tối ưu điều kiện phổ khối

❖ Khảo sát phổ khối của BDF và WF-D5:

Để tối ưu hoá điều kiện phân tích, tiêm trực tiếp các dung dịch chuẩn BDF và wafarin – d5 vào hệ thống khối phổ mà không đi qua cột với nguồn ion hoá phun điện tử ESI âm Thực hiện các kỹ thuật phân tích sau:

+ Kỹ thuật SCAN-SCAN (MS1 SCAN) xác định mảnh mẹ (ion phân tử)

+ Kỹ thuật SIM-SCAN (Product ion) tìm những ion con đặc trưng (mảnh mẹ và mảnh con)

❖ Tối ưu hóa điều kiện khối phổ:

Sau khi đã lựa chọn được các ion đặc trưng của ion mẹ, thực hiện chạy chế độ MRM và tiến hành tối ưu hóa lựa chọn các mức năng lượng bắn phá Mức năng lượng được lựa chọn cho tín hiệu ion con đặc trưng tốt nhất

2.3.3 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký

Sử dụng cột sắc ký pha đảo Poroshell 120 EC-C18 (2,7 µm, 4,6 x 100 mm) để tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký

Trong phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hưởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion âm, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như acid acetic, acid formic… Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành khảo sát các hỗn hợp dung môi để làm pha động như sau:

- ACN (A): Acid formic 0,1% trong nước (B) - Methanol (A): Acid formic 0,1% trong nước (B) - ACN (A): Ammoni fomat 10mM trong nước (B) - Methanol (A): Ammoni fomat 10mM trong nước (B) - ACN (A): Ammoni acetat 10mM trong nước (B) - Methanol (A): Ammoni acetat 10mM trong nước (B)

Lựa chọn được hệ pha động phù hợp để có thể vừa tách được các chất phân tích, vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi

Thời gian lưu và hình dạng của pic sắc ký phụ thuộc nhiều vào tốc độ dòng pha động Nếu tốc độ dòng pha động lớn, cũng có nghĩa thể tích pha động lớn, khả năng phân bố các chất trong pha động lớn Nếu là hỗn hợp nhiều chất sẽ ra nhanh và gây chồng lấp các pic Nhưng nếu tốc độ quá chậm thì chất phân tích bị giữ lại trong cột lâu, thời gian phân tích kéo dài, ảnh hưởng đến hình dạng của pic (pic bị kéo đuôi, tù), phân tích kém chính xác Vì vậy tiến hành khảo sát tốc độ dòng pha động ở các tốc độ dòng: 0,2 ml/phút, 0,3 ml/phút, 0,4 ml/phút, 0,5 ml/phút, 0,6 ml/phút, 0,7 ml/phút.

2.3.4 Khảo sát quy trình xử lý và chiết xuất BDF trong máu

Đối tượng mẫu phân tích trong đề tài này là máu có nền mẫu phức tạp Do đó cần có phương pháp tách chiết mẫu thích hợp để giảm ảnh hưởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện.

Chiết xuất: Sau khi tham khảo tài liệu, dựa trên cấu trúc, đặc điểm hóa học của các chất phân tích và các điều kiện thiết bị, hóa chất của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát chiết lỏng – lỏng với 5 dung môi chiết khác nhau trên nền mẫu trắng được thêm chuẩn ở nồng độ 50 ng/ml Phương pháp chiết có diện tích pic của chất được phân tích cao nhất được lựa chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

Tiến hành khảo sát một số môi trường chiết với các dung môi diethyl ether, ethyl acetat, n-hexan, cyclohexan, dichloromethan

Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tich pic mỗi lần khảo sát và đánh giá dựa trên tiêu chí như: hình dáng pic, đáp ứng tín hiệu,… từ đó lựa chọn dung môi chiết phù hợp để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

2.3.5 Thẩm định phương pháp phân tích BDF bằng LC-MS/MS

Thẩm định phương pháp phân tích là yêu cầu bắt buộc đối với các phương pháp phân tích nói chung và phương pháp xác định chất trong dịch sinh học nói riêng Khoá luận tiến hành thẩm định phương pháp phân tích BDF bằng LC-MS/MS theo quy định của US-FDA[3], EMA[35] về thẩm định độc chất trong dịch sinh học

2.3.5.1 Xác định tính phù hợp hệ thống sắc ký

Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn có hàm lượng nằm trong khoảng tuyến tính trong máu trắng và chuẩn nội Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký Độ thích hợp hệ thống đạt khi đáp ứng các yêu cầu sau:

- Pic cân đối

- Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) biểu thị chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu không lớn hơn 5,0 %

2.3.5.2 Xác định tính chọn lọc – độ đặc hiệu

Để đánh giá tính chọn lọc của phương pháp, thực hiện phân tích 6 mẫu trắng có nguồn gốc khác nhau, 6 mẫu trắng có nguồn gốc như trên được thêm chuẩn BDF ở nồng độ LLOQ dự kiến, IS và 6 mẫu dung dịch chuẩn BDF, IS trong MeOH So sánh phổ của các chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn Độ chọn lọc – đặc hiệu đạt khi đáp ứng các yêu cầu:

- Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn - Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của BDF, đáp ứng pic của từng mẫu trắng

không quá 20% so với đáp ứng pic của mẫu LLOQ tương ứng

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất chuẩn nội, đáp ứng pic ở mẫu trắng không quá 5% đáp ứng trung bình của chất chuẩn nội trong mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn

2.3.5.3 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện đươc nhưng chưa thể định lượng được

- Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử mà có thể định lượng và cho kết quả có độ đúng và độ chụm mong muốn

- Trong nghiên cứu này, LOD và LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N = Signal to noise ratio): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở

hàm lượng thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định S/N dựa vào phần mềm của thiết bị

- LOD là hàm lượng mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3) - LOQ là hàm lượng mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10) 2.3.5.4 Xác định đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn trên nền mẫu máu có nồng độ chất phân tích thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào hàm lượng Xác định sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào hàm lượng

Tiến hành xử lý và phân tích các mẫu chuẩn trong máu trắng có nồng độ BDF: 0,5; 5; 10; 25; 50; 75; 100 ng/ml được chuẩn bị như đã nêu trong mục 2.3.3.1 Ghi lại sắc ký đồ và tính tỷ lệ đáp ứng pic BDF/IS tại các nồng độ tương ứng

Đường chuẩn được đánh giá dựa trên: - Hệ số tương quan r ≥ 0,99

- Độ chệch của từng điểm chuẩn so với đường chuẩn: Không được vượt quá ±15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LLOQ có thể chấp nhận giới hạn 20% Tính giá trị độ chệch theo công thức sau:

∆i(%) = 𝐶𝑖−𝐶𝑐

𝐶𝑐 𝑥 100

Trong đó: ∆i(%): Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Ci: Nồng độ xác định được từ đường chuẩn của các điểm chuẩn Cc: Nồng độ lý thuyết của các điểm chuẩn

2.3.5.5 Xác định độ chính xác, độ đúng

Độ đúng – độ chính xác được thực hiện trên 3 mức nồng độ khác nhau: LQC, MQC, HQC Chuẩn bị đường chuẩn, các mẫu QC trong máu, mỗi nồng độ chuẩn bị 5 mẫu Trong cùng một ngày, tiến hành xử lý và phân tích sắc ký các mẫu QC song song với đường chuẩn Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic

Tiến hành xác định độ đúng – độ chính xác khác ngày trên các mẫu QC tương tự như trên

Cách xác định nồng độ, độ đúng, độ chính xác của các mẫu QC: - Độ đúng R (%) được tính theo công thức:

RSD (%) = s

x̅ ×100 với s = 2

(xi-x̅ )2

trong đó: xi: Hàm lượng tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

x̅: Hàm lượng trung bình tính được của n lần thử nghiệm n: Số lần thử nghiệm

s: Độ lệch chuẩn Yêu cầu:

- Độ đúng tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 85 đến 115 % nồng độ thực đã pha

- Độ chính xác có giá trị RSD% không quá 15% 2.3.5.6 Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Chuẩn bị 6 mẫu máu trắng có chưa BDF ở nồng độ LLOQ dự kiến và chất chuẩn nội và 1 đường chuẩn Tiến hành phân tích các mẫu đã chuẩn bị

Ghi lại sắc ký đồ và tính nồng độ của BDF trong mẫu dựa vào đường chuẩn được phân tích cùng ngày Tính độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ định lượng được ( tính từ đường chuẩn) với nồng độ thực, xác định giá trị RSD% của các mẫu

Mẫu được coi là không bị nhiễm chéo trong quá trình phân tích khi mẫu trắng không có đáp ứng pic tại thời điểm thời gian lưu của chất phân tích và chất chuẩn nội 2.3.5.8 Khảo sát hiệu suất chiết

Hiệu suất chiết thể hiện khả năng chiết BDF từ nền mẫu theo phương pháp được chọn

Tiến hành khảo sát hiệu suất chiết của BDF trong máu ở 3 nồng độ 1 ng/ml, 20 ng/ml, 80 ng/ml, mỗi nồng độ tiến hành 6 mẫu Song song chuẩn bị các mẫu chuẩn pha trong dung môi methanol có nồng độ tương ứng các mẫu kiểm tra Hiệu suất chiết được tính bằng tỷ lệ phần trăm tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích và chuẩn nội trong mẫu máu qua quá trình chiết suất với tỷ lệ diện tích pic của chất chuẩn và chuẩn nội không qua quá trình chiết xuất

Để đánh giá độ ổn định của BDF, tiến hành thêm hỗn hợp chuẩn vào mẫu trắng ở các nồng độ thấp và cao, mỗi nồng độ gồm 6 mẫu và bảo quản các mẫu trên ở các điều kiện nhất định Tiến hành phân tích các mẫu bảo quản trên theo quy trình đã xây dựng Với lô mẫu ban đầu tiến hành phân tích ngay khi mẫu được chuẩn bị xong So sánh hàm lượng của BDF trong các mẫu được phân tích ngay với các mẫu được bảo quản để đánh giá độ ổn định của chất phân tích qua trình bảo quản

Sai khác của hàm lượng BDF giữa mẫu được bảo quản và mẫu phân tích ngay được tính theo công thức:

Sai khác (%) = 𝐶−𝐶𝑜

𝐶𝑜 × 100% Trong đó:

C0 là nồng độ BDF tính được trong các mẫu được phân tích ngay

C là nồng độ BDF tính được trong các mẫu được bảo quản để đánh giá độ ổn định

Yêu cầu:

- Nồng độ chất phân tích qua sau các điều kiện bảo quản nhất định có độ sai khác so với nồng độ chất phân tích tại thời điểm ban đầu không quá 15%

- Giá trị RSD% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải không quá 15%

2.3.6 Áp dụng quy trình phân tích các mẫu thực tế

Mẫu được xử lý theo quy trình xử lý mẫu và được phân tích bằng phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng Mỗi mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần (n=3), tính kết quả trung bình Phương pháp định lượng là phương pháp đường chuẩn

Hàm lượng BDF trong mẫu máu (ng/ml) được tính dựa trên đường chuẩn và theo công thức:

HL =

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Xây dựng được phương pháp xác định BDF trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ

3.1.1 Khảo sát phổ của BDF và nội chuẩn WF-D5

3.1.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ xác định BDF

- Phân tích khối phổ trên thiết bị LC-MS/MS với chế độ phân tích khối 2 lần và kỹ thuật SCAN-SCAN Trên phổ đồ hình 3.1 của dung dịch chuẩn BDF, xuất hiện vạch phổ có cường độ lớn và độ ổn định với tỷ số m/z = 522,8 Tại chế độ ESI (-), mảnh phổ này phù hợp với công thức phân tử BDF (CTPT: C31H23BrO3, KLPT: 523,4 g/mol) cho một proton [BDF - H]-.

Hình 3.1 Phổ khối SCAN lần 1

- Phân mảnh ban đầu và khối phổ MS/MS của BDF

Sau khi phân mảnh ion mẹ, ion mẹ tiếp tục được bắn phá lần hai để thu được ion con, kết quả được thể hiện ở Hình 3.2

Trong số các ion con tạo thành (gồm các mảnh m/z = 142,7; 186,7; 218,8; 244,6), ion có tỷ số m/z = 218,8 có cường độ tín hiệu ổn định, lặp lại và đặc trưng cho quá trình phân mảnh BDF Do vậy cặp ion có m/z = 522,8 và 218,8 được lựa chọn cho các thử nghiệm tiếp theo

Hình 3.2 Phổ ion con của brodifacoum

3.1.1.2 Lựa chọn nội chuẩn

Chất được lựa chọn làm nội chuẩn cần có cấu trúc và tính chất vật lý gần giống với chất phân tích Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hoá lý của chất phân tích và các chất chuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm, chúng tôi khảo sát chất làm nội chuẩn là wafarin - d5 do chất này chỉ có 1 đồng vị Sau khi tiến hành ghi phổ khối một lần để thu được ion mẹ, ion mẹ được bắn phá lần hai để phát hiện các ion con Kết quả thu được ion mẹ và 2 ion con của wafarin – d5 lần lượt là 311,8; 254,9; 160,7 có phổ được thể hiện ở hình 3.3 và 3.4

Hình 3.3 Phổ ion mẹ của wafarin - d5

Hình 3.4 Phổ ion con của wafarin - d5

Sau khi lựa chọn được ion mẹ và ion con, tiến hành tối ưu hóa các điều kiện khối phổ để tín hiệu thu được cao và ổn định Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Bảng tóm tắt điều kiện khối phổ phân tích BDF

Thông số

Chất phân tích

Brodifacoum Wafarin – d5

Ghi chú Định lượng Xác nhận Định lượng Xác nhận

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng khối phổ

3.1.2.1 Khảo sát hệ pha động

Khảo sát chương trình pha động bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn BDF nồng độ 50 ng/ml, và nội chuẩn wafarin - d5 nồng độ 20 ng/ml trong methanol để tiến hành sắc ký Trong nghiên cứu này khảo sát trên 6 hệ pha động như ở mục 2.3.3 Kết quả khảo sát 6 hệ pha động được tổng hợp ở Bảng 3.2 và Phụ lục 1