Vì vậy để xác định một cách chính xác BDF trong máu nhằm phục vụ cho công tác giám định pháp y cũng như công tác điều trị, nghiên cứu thuốc giải độc một cách nhanh chóng, kịp thời, chúng
TỔNG QUAN
Tổng quan về thuốc diệt chuột chống đông máu
Từ lâu trên thế giới, việc kiểm soát các loài gặm nhấm ở các cơ sở công nghiệp, khu dân cư được thực hiện dưới nhiều hình thức bao gồm bẫy vật lý và kiểm soát bằng hoá học Trong đó việc kiểm soát hoá học được thực hiện bằng cách sử dụng các hợp chất kháng vitamin K, được viết tắt là AVK Vào cuối những năm 40 của thế kỷ XX, AVK lần đầu tiên được công bố thông qua việc phát triển các dẫn xuất của WAR và dicoumarin [7]
TDC chống đông máu hoạt động theo cơ chế ức chế enzyme carboxylase phụ thuộc vitamin K và do đó làm giảm khả năng tái hoạt động của vitamin K1, ảnh hưởng gián tiếp đến quá trình đông máu sinh lý [29]
TDC chống đông máu được chia thành 2 nhóm: hydroxycoumarin và indandion (chlorophacinon, diphacinon, pindon, và valon) Hydroxycoumarin được chia thành 2 thế hệ: thế hệ 1 (coumachlor, coumafuryl, coumatetralyl, và warfarin) và thế hệ 2 (brodifacoum, bromadiolon, difenacoum, difethialon và flocoumafen) [29] TDC chống đông máu thế hệ thứ 2 còn được gọi với các tên gọi khác nhau như: “Superwafarin”, “ Thuốc diệt chuột đơn liều”, “ Thuốc diệt chuột tác dụng kéo dài” Hiệu lực và thời gian tác dụng lớn hơn của TDC chống đông máu thế hệ thứ hai là do chúng : (i) ái lực với enzym khử hoá vitamin K-epoxide lớn hơn; (ii) tích tụ ở gan; và (iii) thời gian bán hủy rất dài do hòa tan tốt trong lipid và tuần hoàn gan ruột [31]
Những năm gần đây, TDC chứa superwafarin được sử dụng rộng rãi và phổ biến trên toàn thế giới, đã xảy ra rất nhiều trường hợp ngộ độc superwafarin Vì vậy một phương pháp phân tích có độ nhạy và độ chính xác cao để xác định TDC chống đông máu là hết sức quan trọng Việc phân tích các hợp chất superwafarin trong mẫu máu các trường hợp ngộ độc là phù hợp vì thời gian bán huỷ của các hợp chất này dài [19] Bên cạnh đó, trong các TDC chứa nhóm chất này, brodifacoum là hoạt chất được ghi nhận trong nhiều báo cáo là có khả năng gây độc cao nhất [17], [27], [6] Trên thực tế, BDF ngày nay được sử dụng rộng rãi ở cả công nghiệp và hộ gia đình dưới dạng bột hoặc viên nén rắn giống viên kẹo với màu sắc cực kỳ bắt mắt, dễ gây nhầm lẫn ở người già và trẻ nhỏ Do vậy, BDF đáng được quan tâm để xây dựng một phương pháp phân tích chính xác và có hiệu quả cao
Tổng quan về brodifacoum
Brodifacoum là TDC chống đông máu thế hệ thứ hai, là dẫn xuất của nhóm 4- hydroxy-coumarin Theo Luật pháp của Cộng đồng châu Âu yêu cầu ghi nhãn cho các sản phẩm có chứa brodifacoum là rất độc hại với ký hiệu nguy hiểm T+ Ngoài ra, các khuyến nghị về vận chuyển hàng hóa của Liên Hợp Quốc đã phân loại brodifacoum trong nhóm 6.1 - là một chất độc (Số 3027) [24]
1.2.2 Công thức cấu tạo và tính chất lý hoá
- Công thức phân tử: C31H23BrO3
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của brodifacoum
- Danh pháp: 3-[3-[4-(4-Bromophenyl)phenyl]-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-yl]-2- hydroxychromen-4-one
- Khối lượng phân tử 523,4 g/mol[22]
- BDF ở dạng bột trắng mịn, không mùi Trong nước, ít tan trong nước( dưới 10 mg/L ở 20ºC, pH=7), tan tốt trong ethylacetat, ethanol, ít tan trong benzen Nhiệt độ nóng chảy ở khoảng 230 - 232ºC [22]
1.2.3 Dược động học của BDF
BDF được hấp thu qua đường tiêu hoá (dạ dày và ruột) sau đó được tích tụ trong các mô như não, gan, thận, tim, phổi với nồng độ cao nhất trong gan Nồng độ BDF trong huyết tương đạt tối đa sau 24 giờ và giảm dần trong 4 ngày tiếp theo Từ mô hình invitro của chuyển hoá pha I và pha II cũng như thực hiện đo invivo trên mô, nước tiểu và phân khi sử dụng BDF đã không đưa ra được bằng chứng về quá trình chuyển hoá của chất này BDF được thải trừ chủ yếu qua phân và có thời gian bán huỷ rất dài do tính ưa mỡ của BDF dẫn đến trải qua quá trình tuần hoàn gan ruột[11] Sản phẩm thải trừ chủ yếu dưới dạng hợp chất gốc còn hoạt tính
BDF có độc tính cao đối với động vật có vú và chim Các dấu hiệu và triệu chứng lâm sàng của ngộ độc cấp tính BDF ở người là chảy máu ở mức độ nhẹ, và bị rối loạn đông máu ở mức độ nặng Chảy máu nhẹ thường là chảy máu mũi hoặc nướu, ho ra máu, bầm máu, phân có máu, tiểu máu, đau bụng hoặc đau sườn, bầm tím hoặc tụ máu ở bụng, có thể chảy máu nặng dẫn tới sốc và tử vong Chảy máu bên trong và bên ngoài là những biểu hiện lâm sàng thường gặp nhất của nhiễm độc cấp tính gây ra bởi BDF, sau đó là nhịp tim nhanh, hạ huyết áp, suy đa cơ quan do mất máu và tưới máu không đủ [20]
Theo một số nghiên cứu về độc tính của BDF, LD50 của BDF trên chuột qua đường uống là 266 àg/kg [8], trờn chú qua đường uống là 0,25 mg/kg và trờn mốo qua đường uống là 25 mg/kg [26] Dữ liệu về độc tính của brodifacoum với động vật thực nghiệm cũng phản ánh độc tính cao của chất này với động vật có vú nói chung và con người nói riêng.
Tổng quan về phương pháp chiết BDF trong máu
Trong quá trình phân tích các mẫu dịch sinh học như máu, huyết tương, việc xử lý mẫu là vô cùng quan trọng, ảnh hưởng đến hiệu quả của cả quá trình phân tích Các mẫu máu thường có rất nhiều tạp chất nên thành phần nền mẫu khá phức tạp Điều này gây ảnh hưởng tới độ nhạy, hiệu suất phân tích và tuổi thọ của các thiết bị phân tích, vì vậy mà xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein là cực kỳ cần thiết trước khi tiến hành phân tích BDF trên hệ thống sắc ký
Phương pháp loại protein thường kết hợp sử dụng các hoá chất như acid trichloroacetic, acid mạnh như HClO4 hoặc sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetonitril để gây kết tủa protein Sau đó kết hợp cùng với siêu âm và ly tâm để dễ dàng loại bỏ protein khỏi mẫu phân tích Protein kết tủa do sự thay đổi pH hoặc tính kỵ nước, làm thay đổi tương tác của protein với môi trường nước.[1]
Các kỹ thuật thường được sử dụng để chiết xuất mẫu trước khi phân tích là: chiết lỏng – lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE)
Chiết lỏng - lỏng là phương pháp chiết dựa trên sự phân bố khác nhau của chất tan giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau thường một pha là nước và pha còn lại là dung môi hữu cơ không tan hoặc rất ít hòa tan trong nước Quá trình chiết là quá trình chuyển
5 chất tan từ pha nước vào pha hữu cơ được thực hiện qua bề mặt tiếp xúc giữa hai pha nhờ các tương tác hóa học giữa tác nhân chiết và chất cần chiết [1] Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện chiết cần thiết Điều kiện chiết chất phân tích vào pha hữu cơ:
+ Dung môi chiết và dịch chiết là hai pha không được trộn lẫn, trong đó dung môi phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích;
+ Hệ số tách α càng khác 1 càng tốt
+ Cân bằng chiết đạt được nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng để giải chiết được tốt
+ Phải chọn được điều kiện chiết tối ưu bao gồm pH của dung dịch, nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia…
Phương pháp LLE có thể áp dụng cho các chất chất lỏng và rắn với những ưu điểm như các thiết bị đơn giản, hiện có rất nhiều dung môi tinh khiết với độ hòa tan và chọn lọc tốt, hòa tan mẫu thuận lợi và phù hợp với thiết bị sắc ký
BDF là một chất tan tốt trong dung môi hữu cơ như ethyl acetat, ethanol nên việc chiết trực tiếp BDF bằng LLE được nhiều tác giả sử dụng
Nguyên tắc của kỹ thuật này cũng tương tự với kỹ thuật chiết lỏng lỏng, cũng liên quan đến việc phân tách dung dịch giữa hai pha Tuy nhiên thay vì phân tách giữa hai pha lỏng – lỏng như LLE thì chiết pha rắn tách chất phân tích giữa hai pha: pha rắn (chất hấp phụ) và pha lỏng (thường là dung môi và chất phân tích).[34]
Cơ chế của sự chiết pha rắn có thể có các bản chất theo các kiểu như sau:
- Theo cơ chế tương tác hấp phụ pha rắn
- Theo cơ chế trao đổi ion (cation và anion)
- Theo kiểu trao đổi tạo cặp ion
- Theo kiểu hợp chất liên hợp phân tử
- Kiểu chiết rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn
Kỹ thuật này có quy trình chiết bao gồm 4 bước chính: xử lý cột bằng dung môi hoặc dung dịch đệm, tách chất phân tích, loại tạp, rửa giải.[1]
Hiện nay chiết pha rắn đang được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực phân tích cho mục đích xác định cả các chất vô cơ và hữu cơ, các kim loại và phi kim do những ưu điểm sau:
6 + Hiệu suất thu hồi cao
+ Cân bằng chiết đạt nhanh và có tính thuận nghịch
+ Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất
+ Thao tác đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt
+ Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích lớn
Nhiều nghiên cứu phân tích BDF trong dịch sinh học có sử dụng phương pháp SPE để chiết xuất và làm giàu BDF [30], [28] Cột SPE thường được sử dụng là cột HLB, C18, Bond Elut Certify II.
Tổng quan sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)
Sắc ký lỏng - khối phổ (LC-MS) là một kỹ thuật phân tích kết hợp phân tách sắc ký có độ phân giải hiệu suất cao, độ nhạy và phát hiện phổ khối cụ thể Sự kết hợp giữa
LC với MS là một sự phát triển quan trọng trong lịch sử sắc ký (những năm 1980) [15]
LC-MS cho phép sử dụng các chế độ ion hóa (ESI, PI, quang hóa được hỗ trợ bằng laser (LAPI) và APCI), cho phép tách và ion hoá nhiều loại chất phân tích dễ bay hơi và không bay hơi, bao gồm peptid, protein và các chất không bền nhiệt [2]
Hệ thống LC-MS điển hình là sự kết hợp giữa HPLC với MS (nguồn ion hóa) Mẫu được phân tách bằng LC và các loại mẫu phân tích được phun vào nguồn ion áp suất khí quyển, nơi các chất chuyển thành ion ở pha khí Máy phân tích khối lượng sau đó được sử dụng để sắp xếp các ion theo khối lượng và khuếch đại tín hiệu được tạo ra từ mỗi ion Kết quả là phổ khối (biểu đồ tín hiệu ion như là một hàm của tỷ lệ khối lượng/điện tích) được tạo ra, được sử dụng để xác định bản chất nguyên tố của một mẫu, khối lượng của các hạt và phân tử, và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của phân tử [15]
1.4.1 Cấu tạo một máy sắc ký lỏng khối phổ
Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng gồm các phần chính: (1) Hệ thống cấp pha động, (2) bơm sắc ký lỏng, (3) bộ phận tiêm mẫu, (4) cột sắc ký
Cấu tạo hệ thống khối phổ gồm các phần chính: (1) bộ phần nạp mẫu, (2) bộ nguồn ion, (3) bộ phân tích khối, (4) dectector, (5) bộ phận xử lý dữ liệu Mẫu được đưa vào qua bộ phận nạp mẫu, các ion tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng qua bộ phận phân tích khối để tách các ion theo trị số m/z trước khi đến dectector [1]
Hình 1.2 Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng khối phổ
Sắc ký lỏng là kỹ thuật tách trong đó pha động là chất lỏng , pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của các chất phân tích giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý.[1]
- Pha động: Pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi hoà tan vào nhau để cú thể tỏch với độ phõn giải phự hợp Trước khi sử dụng, cần lọc (màng lọc 0.45àm) và đuổi khí hoà tan trong pha động Khí hoà tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền Có thể loại khí hoà tan bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ như heli…[1]
- Cột và pha tĩnh: Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thuỷ tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30cm, đường kính trong khoảng 4- 10mm
Chất nhồi cho cột sắc ký lỏng được chế tạo từ silica (silic dioxyd) bằng cách làm kết tụ các hạt silica để tạo ra các hạt có kích thước lớn hơn và đường kính đều nhau Các hạt silica gel hình thành thường được bao một lớp mỏng hữu cơ liên kết (hoá học hoặc vật lý) với bề mặt
Ngoài ra, còn có các chất nhồi khắc như nhôm oxyd, polyme xốp, nhựa trao đổi ion…, tuỳ thuộc vào loại hình sắc ký.[1]
1.4.3 Khối phổ (MS) Đây là kĩ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector
8 Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10 -3 Pa đến 10 -6 Pa Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đổ hoặc phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất [1]
Nguồn ion hóa lý tưởng cho máy quang phổ khối sẽ mang lại hiệu suất ion hóa cao và độ ổn định cho các ion Trong nhiều năm qua, có rất nhiều nguồn ion hoá phổ biến được sử dụng trong máy LC-MS, có thể kể đến như: ion hoá bằng tia điện (electrospay ionization – ESI), ion hoá hoá học bằng áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemical ionization – APCI), va chạm electron ( electron impact -EI) và ion hoá hoá học (chemical ionization – CI)
- Ion hóa phun mù điện tử (ESI): Electrospray được tạo ra bằng cách tác dụng một điện trường mạnh vào chất lỏng đi qua qua ống mao dẫn có dòng chảy yếu Điều này tạo ra những giọt lớn tích điện sau đó bị bay hơi dung môi Tăng mật độ điện tích do sự bay hơi dung môi gây ra lực đẩy coulombic khắc phục sức căng bề mặt chất lỏng, dẫn đến giải phóng ion từ các giọt Đây là nguyên lý hình thành ion sử dụng kỹ thuật này
- Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI): Nguyên lý của kỹ thuật này liên quan đến việc phun khí dung pha động với khí nitơ và bay hơi bằng đun nóng đến nhiệt độ tương đối cao (trên 400°C) Đây là nguồn ion hoá được sử dụng phổ biến nhất trong LC-MS APCI được sử dụng để phân tích dược phẩm, môi trường, độc tính, lâm sàng và mẫu công nghiệp hóa chất/phòng thí nghiệm
- Ion hóa bằng giải hấp laser (MALDI): MALDI là một kỹ thuật ion hóa cho các chất có khối lượng phân tử lớn và không ổn định như peptid, protein, polyme, dendrimer, và fullerene Kỹ thuật này liên quan đến việc nhúng các chất phân tích trong một ma trận hấp thụ năng lượng ở bước sóng tia laser Laser cực tím nitơ (UV) (337 nm) được áp dụng trên chân không để tạo ra các ion chất phân tích [15]
1.4.4 Một số chế độ thu phổ [2]
- Thu tín hiệu toàn phổ (full – scan):
Khi thao tác với chế độ SCAN, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng để phát hiện hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ
- Thu tín hiệu chọn lọc ion (SIM):
Tổng quan các nghiên cứu xác tại Việt Nam và trên thế giới xác định BDF
Một số nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật như HPLC, UHPLC, LC-MS đã được thực hiện để phân tích chính xác BDF trên rất nhiều nền mẫu sinh học
Các nghiên cứu xác định thuốc diệt chuột chống đông máu trong đó có BDF trên thế giới những năm gần đây được tổng hợp trong bảng 1.1 Ở Việt Nam hiện chưa có báo cáo nào về xác định BDF trong máu được công bố
Qua bảng 1.1, có thể thấy các nghiên cứu đều có những đặc điểm sau:
- Hầu hết các phương pháp đều sử dụng chiết LLE để chiết BDF khỏi dịch sinh học, trong đó ethyl acetat hay được sử dụng và có độ thu hồi khá tốt (nghiên cứu [12] có độ thu hồi của các mẫu đều trên 80%; nghiên cứu [5] có độ thu hồi trên 70%) Ngoài ra thì nghiên cứu [28], [30] sử dụng phương pháp xử lý mẫu là chiết pha rắn với ưu điểm là độ sạch của mẫu sau khi chiết cao nhưng chi phí lại khá cao nên khó tiếp cận tại Việt Nam Nghiên cứu [30], [33] sử dụng phương pháp chiết là QuEChERS cũng cho độ thu hồi các mẫu trên 80%, thời gian chiết tương đối nhanh như LLE, tuy nhiên kinh phí sử dụng cho các ống chiết QuEChERS chưa tối ưu như LLE bằng các dung môi Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ sử dụng phương pháp xử lý mẫu là LLE
- Các phương pháp sắc ký phân tích BDF trong mẫu sinh học sử dụng detector khối phổ (MS/MS) và chế độ ESI âm, có độ nhạy phát hiện cao với LOD nằm trong khoảng từ 0,06-2 ng/ml Các nghiên cứu [30], [4] sử dụng detector huỳnh quang (FLD) có LOD cao hơn hẳn, ở mức 10 ng/ml Do đó việc sử dụng detector khối phổ luôn được ưu tiên sử dụng trong nhiều nghiên cứu
- Các nghiên cứu đều có khoảng tuyến tính khoảng 1 – 100 ng/ml
- Với pha tĩnh, việc sử dụng cột sắc ký C18 được nhiều tác giả sử dụng để phân tích BDF
Bảng 1.1 Một số nghiên cứu xác định BDF trong máu
Phương pháp xử lý mẫu
Phương pháp sắc ký Kết quả nghiên cứu BDF
Chiết lỏng – lỏng với ethyl acetat
Sử dụng cột C18 (150mm x 2,1mm, 5àm), pha động acetic acid - ammonium acetate /MeOH (12:88, v/v), tốc độ dòng 0,5 mL/phút
Khoảng tuyến tính 0,1-100 ng/mL, LOQ của BDF là 0,1 ng/mL
Chiết lỏng lỏng với ethylacetat
Cột C18 (5 àm, 50 mm x 2,1 mm), pha động 10mM ammonium acetat và methanol
Khoảng tuyến tính 0,5 – 100 ng/mL, LOD 0,2 ng/mL
BDF, BMD, DFC, WAR, CTL, DFL, FCF, DPN, CPN
Máu chiết lỏng lỏng với ethyl acetat (pH=3)
LC-MS/MS cột C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 μm), pha động amoni acetat
10 mM và methanol, tốc độ dòng 0,4 ml/phút Chế độ ESI âm
LOD 0,5 ng/mL, độ thu hồi 70-105%, khoảng tuyến tính 2-200 ng/mL
Chiết lỏng lỏng với acetonitril và 0.1% acid formic
Cột C18 (1,7 μm, 2,1 × 100 mm), pha động acid formic, ammonium format và acetonitril
Khoảng tuyến tính 1-2000 ng/mL, LOD 0,06 ng/mL,
Loại protein bằng acetonitril, sau đó chiết pha rắn bằng cột Bond-Elut Certify II
Cột C18 (150 mm × 2,1 mm, 5 μm), pha động acid acetic 0,25% và methanol, tốc độ dòng 0,3 mL/phút, ESI âm
LOD của BDF là 2 ng/mL
6 Máu và gan động vật
BDF, DFC, BMD, DFL, CPN,
Cột C18 column (150 × 4,6 mm, 5àm), pha động tetrabutylamonium hydroxid 0,03 M và methanol
LOD 10 ng/mL máu và 10ng/g gan
CF, CTL, DFC, FCF, WAR
Chiết lỏng – lỏng với dichloromet han – aceton( tỷ lệ 70:30)
Cột silica-based (250 × 4,6-mm, 5 àm), pha động là acid acetic 0,25% và methanol
LOD 13,9 àg/kg, LOQ 42,1 àg/kg
BDF Chiết lỏng lỏng với aceton - dichloromth an(tỷ lệ 30:70)
150 mm, 2,4 àm), pha động acetonitril và nước
Khoảng tuyến tính 1 - 50 ng/mL, LOD 0,1 ng/mL, LOQ 1 ng/mL
BMD, DFC, FCF, BDF, DFL
Kết tủa protein bằng methanol 10%/acetoni tril
Cột C18 (50 x 2,1 mm, 1,8 àm), pha động: nước, acetonitril với 0,01% acid formic, nhiệt độ 50ºC
LOD 0,1 ng/mL, LOQ 0.19ng/mL + Trans-BDF: LOD 0,16 ng/mL, LOQ 0,31 ng/mL
10 Máu và phủ tạng cừu
13 chất là thuốc diệt chuột
Cột biphenyl (100 × 3.0 mm, 2,6 μm), pha động ammonium acetat và methanol
Khoảng tuyến tính 1-100 ng/mL, LOD 0,5ng/mL, LOQ 1 ng/mL
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu thiết bị
2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi
- Chất chuẩn: Brodifacoum 10mg, 97% Lot: 20-GHZ-98-1, Toronto Research Chemicals Inc., Canada Hạn sử dụng: 27/2/2026
- Chất chuẩn nội: Warfarin-d5 1mg, 97%, Lot: 4-YMK-34-3, Toronto Research Chemicals Inc., Canada Hạn sử dụng: 27/9/2027
- Hóa chất dung môi: methanol (HPLC), acetonitril HPLC, diethylether, n-hexan, ethyl acetat, n -butanol, nước cất, acid acetic, acid trichloroacetic, acid formic, natri hydroxyd,…
- Máy sắc ký lỏng Agilent UHPLC 1290 infinity II kết nối khối phổ MS 6470 LC/TQ
- Cân phân tích Mettler AB240 (Thuỵ sĩ)
- Máy ly tâm EBA21 hãng Hettich (Đức)
- Máy lắc xoáy Vortex IKA Genius (Trung Quốc)
- Hệ thống làm khô bằng Nitơ Rapidvap Vertex (Đức)
- Hệ thống chiết pha rắn của Agilent (Mỹ)
- Cột sắc ký pha đảo Poroshell 120 EC-C18 (2,7 àm, 4,6 x 100 mm) và tiền cột
- Bình định mức dung tích: 5, 10, 25, 50, 100 ml
- Micro pipet điều chỉnh được thể tớch: 10-100àl, 100-1000 àl
- Ống ly tâm Teflon 10ml, có nắp kín
- Ống nghiệm thuỷ tinh 10ml, có nắp kín
- Lọ đựng mẫu loại 1,8ml
- Cỏc dụng cụ khỏc: cốc thuỷ tinh, ống đong, phễu, màng lọc 0,22àm…
Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: BDF
Mẫu máu trắng: Mẫu máu không nhiễm BDF của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương , số lô DM7.21260.A4 được sử dụng để khảo sát phương pháp
13 Mẫu máu của các bệnh nhân, nạn nhân nghi ngờ bị ngộ độc BDF được gửi đến giám định tại Viện Pháp y Quốc gia.
Phương pháp nghiên cứu
- Dung dịch chuẩn gốc brodifacoum 100 àg/ml: Cõn chớnh xỏc khoảng 1,004 mg chất chuẩn brodifacoum cho vào bình định mức 10 ml và bổ sung methanol đến vạch Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở 2 – 4 ºC
- Dung dịch chuẩn trung gian 1 àg/ml được pha loóng từ dung dịch chuẩn gốc
100 àg/ml trong dung mụi methanol Dung dịch chỉ pha khi sử dụng
- Dãy dung dịch chuẩn làm việc 0,5 – 100 ng/ml được pha loãng từ dung dịch chuẩn trung gian 1àg/ml trong dung mụi methanol hoặc nền mẫu trắng Cỏc dung dịch chỉ pha khi sử dụng
Mẫu máu trắng 1 ml cho vào các ống riêng biệt Thêm vào các mẫu trắng lượng chuẩn và chuẩn nội cần thiết để tiến hành khảo sát
2.3.2 Khảo sát và tối ưu điều kiện phổ khối
❖ Khảo sát phổ khối của BDF và WF-D5: Để tối ưu hoá điều kiện phân tích, tiêm trực tiếp các dung dịch chuẩn BDF và wafarin – d5 vào hệ thống khối phổ mà không đi qua cột với nguồn ion hoá phun điện tử ESI âm Thực hiện các kỹ thuật phân tích sau:
+ Kỹ thuật SCAN-SCAN (MS1 SCAN) xác định mảnh mẹ (ion phân tử)
+ Kỹ thuật SIM-SCAN (Product ion) tìm những ion con đặc trưng (mảnh mẹ và mảnh con)
❖ Tối ưu hóa điều kiện khối phổ:
Sau khi đã lựa chọn được các ion đặc trưng của ion mẹ, thực hiện chạy chế độ MRM và tiến hành tối ưu hóa lựa chọn các mức năng lượng bắn phá Mức năng lượng được lựa chọn cho tín hiệu ion con đặc trưng tốt nhất
2.3.3 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
Sử dụng cột sắc ký pha đảo Poroshell 120 EC-C18 (2,7 àm, 4,6 x 100 mm) để tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký
14 Trong phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hưởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion âm, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như acid acetic, acid formic… Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành khảo sát các hỗn hợp dung môi để làm pha động như sau:
- ACN (A): Acid formic 0,1% trong nước (B)
- Methanol (A): Acid formic 0,1% trong nước (B)
- ACN (A): Ammoni fomat 10mM trong nước (B)
- Methanol (A): Ammoni fomat 10mM trong nước (B)
- ACN (A): Ammoni acetat 10mM trong nước (B)
- Methanol (A): Ammoni acetat 10mM trong nước (B)
Lựa chọn được hệ pha động phù hợp để có thể vừa tách được các chất phân tích, vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi
Thời gian lưu và hình dạng của pic sắc ký phụ thuộc nhiều vào tốc độ dòng pha động Nếu tốc độ dòng pha động lớn, cũng có nghĩa thể tích pha động lớn, khả năng phân bố các chất trong pha động lớn Nếu là hỗn hợp nhiều chất sẽ ra nhanh và gây chồng lấp các pic Nhưng nếu tốc độ quá chậm thì chất phân tích bị giữ lại trong cột lâu, thời gian phân tích kéo dài, ảnh hưởng đến hình dạng của pic (pic bị kéo đuôi, tù), phân tích kém chính xác Vì vậy tiến hành khảo sát tốc độ dòng pha động ở các tốc độ dòng: 0,2 ml/phút, 0,3 ml/phút, 0,4 ml/phút, 0,5 ml/phút, 0,6 ml/phút, 0,7 ml/phút
2.3.4 Khảo sát quy trình xử lý và chiết xuất BDF trong máu Đối tượng mẫu phân tích trong đề tài này là máu có nền mẫu phức tạp Do đó cần có phương pháp tách chiết mẫu thích hợp để giảm ảnh hưởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện
Chiết xuất: Sau khi tham khảo tài liệu, dựa trên cấu trúc, đặc điểm hóa học của các chất phân tích và các điều kiện thiết bị, hóa chất của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát chiết lỏng – lỏng với 5 dung môi chiết khác nhau trên nền mẫu trắng được thêm chuẩn ở nồng độ 50 ng/ml Phương pháp chiết có diện tích pic của chất được phân tích cao nhất được lựa chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo
Tiến hành khảo sát một số môi trường chiết với các dung môi diethyl ether, ethyl acetat, n-hexan, cyclohexan, dichloromethan
Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tich pic mỗi lần khảo sát và đánh giá dựa trên tiêu chí như: hình dáng pic, đáp ứng tín hiệu,… từ đó lựa chọn dung môi chiết phù hợp để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo
2.3.5 Thẩm định phương pháp phân tích BDF bằng LC-MS/MS
Thẩm định phương pháp phân tích là yêu cầu bắt buộc đối với các phương pháp phân tích nói chung và phương pháp xác định chất trong dịch sinh học nói riêng Khoá luận tiến hành thẩm định phương pháp phân tích BDF bằng LC-MS/MS theo quy định của US-FDA[3], EMA[35] về thẩm định độc chất trong dịch sinh học
2.3.5.1 Xác định tính phù hợp hệ thống sắc ký
Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn có hàm lượng nằm trong khoảng tuyến tính trong máu trắng và chuẩn nội Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký Độ thích hợp hệ thống đạt khi đáp ứng các yêu cầu sau:
- Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) biểu thị chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu không lớn hơn 5,0 %
2.3.5.2 Xác định tính chọn lọc – độ đặc hiệu Để đánh giá tính chọn lọc của phương pháp, thực hiện phân tích 6 mẫu trắng có nguồn gốc khác nhau, 6 mẫu trắng có nguồn gốc như trên được thêm chuẩn BDF ở nồng độ LLOQ dự kiến, IS và 6 mẫu dung dịch chuẩn BDF, IS trong MeOH So sánh phổ của các chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn Độ chọn lọc – đặc hiệu đạt khi đáp ứng các yêu cầu:
- Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của BDF, đáp ứng pic của từng mẫu trắng không quá 20% so với đáp ứng pic của mẫu LLOQ tương ứng
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất chuẩn nội, đáp ứng pic ở mẫu trắng không quá 5% đáp ứng trung bình của chất chuẩn nội trong mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn
2.3.5.3 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
- Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện đươc nhưng chưa thể định lượng được
- Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử mà có thể định lượng và cho kết quả có độ đúng và độ chụm mong muốn
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
Xây dựng được phương pháp xác định BDF trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ
3.1.1 Khảo sát phổ của BDF và nội chuẩn WF-D5
3.1.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ xác định BDF
- Phân tích khối phổ trên thiết bị LC-MS/MS với chế độ phân tích khối 2 lần và kỹ thuật SCAN-SCAN Trên phổ đồ hình 3.1 của dung dịch chuẩn BDF, xuất hiện vạch phổ có cường độ lớn và độ ổn định với tỷ số m/z = 522,8 Tại chế độ ESI (-), mảnh phổ này phù hợp với công thức phân tử BDF (CTPT: C31H23BrO3, KLPT: 523,4 g/mol) cho một proton [BDF - H] -
Hình 3.1 Phổ khối SCAN lần 1
- Phân mảnh ban đầu và khối phổ MS/MS của BDF
Sau khi phân mảnh ion mẹ, ion mẹ tiếp tục được bắn phá lần hai để thu được ion con, kết quả được thể hiện ở Hình 3.2
Trong số các ion con tạo thành (gồm các mảnh m/z = 142,7; 186,7; 218,8; 244,6), ion có tỷ số m/z = 218,8 có cường độ tín hiệu ổn định, lặp lại và đặc trưng cho quá trình phân mảnh BDF Do vậy cặp ion có m/z = 522,8 và 218,8 được lựa chọn cho các thử nghiệm tiếp theo
Hình 3.2 Phổ ion con của brodifacoum
Chất được lựa chọn làm nội chuẩn cần có cấu trúc và tính chất vật lý gần giống với chất phân tích Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hoá lý của chất phân tích và các chất chuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm, chúng tôi khảo sát chất làm nội chuẩn là wafarin - d5 do chất này chỉ có 1 đồng vị Sau khi tiến hành ghi phổ khối một lần để thu được ion mẹ, ion mẹ được bắn phá lần hai để phát hiện các ion con Kết quả thu được ion mẹ và 2 ion con của wafarin – d5 lần lượt là 311,8; 254,9; 160,7 có phổ được thể hiện ở hình 3.3 và 3.4
Hình 3.3 Phổ ion mẹ của wafarin - d5
Hình 3.4 Phổ ion con của wafarin - d5
Sau khi lựa chọn được ion mẹ và ion con, tiến hành tối ưu hóa các điều kiện khối phổ để tín hiệu thu được cao và ổn định Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.1
Bảng 3.1 Bảng tóm tắt điều kiện khối phổ phân tích BDF
Chất phân tích Brodifacoum Wafarin – d5
Chế độ ion hoá ESI (-) ESI (-) Điện thế ion hoá (V) 4000 4000
Nhiệt độ hoá hơi (ºC) 300 300
Ghi chú Định lượng Xác nhận Định lượng Xác nhận
3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng khối phổ
3.1.2.1 Khảo sát hệ pha động
Khảo sát chương trình pha động bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn BDF nồng độ 50 ng/ml, và nội chuẩn wafarin - d5 nồng độ 20 ng/ml trong methanol để tiến hành sắc ký Trong nghiên cứu này khảo sát trên 6 hệ pha động như ở mục 2.3.3 Kết quả khảo sát 6 hệ pha động được tổng hợp ở Bảng 3.2 và Phụ lục 1
Bảng 3.2 Khảo sát hệ pha động
STT Thành phần pha động Nhận xét
Hệ 1 ACN : Acid formic 0,1% trong nước (95:5) Tín hiệu của chất phân tích cao, pic bị chẻ đôi
Hệ 2 Methanol : Acid formic 0,1% trong nước
Thời gian lưu dài, pic bị kéo đuôi
Hệ 3 ACN : Ammoni format 10mM trong nước
Tín hiệu chất phân tích cao, các pic BDF và wafarin – d5 hình dáng cân đối
Hệ 4 Methanol : Ammoni format 10mM trong nước (95:5)
Tín hiệu chất phân tích cao, chân pic doãng
Hệ 5 ACN : Ammoni acetat 10mM trong nước
Cường độ tín hiệu thấp, chân pic doãng
Hệ 6 Methanol : Ammoni acetat 10mM trong nước (95:5)
Cường độ tín hiệu cao nhưng chân pic doãng
Từ kết quả thu được, khi quan sát sắc ký đồ như hình 3.5 và 3.6 có thể thấy việc sử dụng hai hệ pha động ACN : Ammoni format 10mM trong nước và Methanol : Ammoni format 10mM trong nước là khả thi nhất do cường độ tín hiệu chất phân tích cao và hình dạng các pic cân đối Tuy nhiên khi sử dụng hệ pha động 4 lại cho thời gian phân tích kéo dài hơn và pic có hiện tượng doãng chân Do vậy để đảm bảo điều kiện về thời gian phân tích hợp lý và tín hiệu các chất phân tích lớn thì hệ pha động ACN (A): ammoni fomat 10mM trong nước (B) (tỷ lệ 95:5, tt/tt) được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo
Hình 3.5 Sắc ký đồ của BDF và IS với hệ pha động ACN:Amoniformat
Hình 3.6 Sắc ký đồ của BDF và IS với hệ pha động methanol : ammoniformat
3.1.2.2 Khảo sát tốc độ dòng
Tốc độ dòng được khảo sát ở các tốc độ 0.2 ml/phút, 0.3 ml/phút, 0.4 ml/phút, 0.5 ml/phút, 0.6 ml/phút, 0.7 ml/phút Kết quả khảo sát được thể hiện ở Hình 3.7 và Phụ lục
Hình 3.7 Sắc ký đồ của chất chuẩn brodifacoum và nội chuẩn ở tốc độ dòng 0.3 ml/phút
Nhận xét: Từ kết quả khảo sát cho thấy, ở tốc độ dòng 0.2 ml/phút, pic của chất phân tích bị kéo đuôi và cho thời gian phân tích kéo dài Khi tăng tốc độ dòng lên 0.4 ml/phút, 0.5 ml/phút, 0.6 ml/phút và 0.7 ml/phút thì tín hiệu của chất phân tích bị giảm xuống, áp suất cột tăng cao, đồng thời khi thời gian phân tích quá ngắn khi tăng tốc độ phân tích có thể dẫn tới hiện tượng dính pic Do vậy tốc độ dòng 0.3 mL/phút với thời gian phân tích phù hợp và tín hiệu chất phân tích cao được lựa chọn để khảo sát các bước tiếp theo
3.1.3 Khảo sát phương pháp chiết mẫu
Máu là một nền mẫu khá phức tạp, do vậy để tiến hành phân tích các chất trên hệ thống LC-MS, một phương pháp chiết phù hợp, tối ưu để làm giảm sự ảnh hưởng của nền mẫu, làm sạch mẫu và làm giàu chất phân tích là rất cần thiết
Tiến hành khảo sát phương pháp LLE ở môi trường acid với các dung môi diethyl ether, ethyl acetat, n-hexan, cyclohexan
Lấy chớnh xỏc 1 ml mẫu mỏu trắng cho vào ống ly tõm 10 ml, thờm 50 àl dung dịch chuẩn trung gian 1 àg/ml và 20 àl dung dịch chuẩn nội trung gian 1 àg/ml Tiến hành theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.4 với quy trình cụ thể như sau:
Hỳt chớnh xỏc 1,0 ml mẫu vào ống ly tõm 10 ml, thờm 20 àl HCl 1 M và 3ml dung môi chiết Lắc xoáy 5 phút Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, lấy lớp dung môi hữu cơ Dịch chiết được làm khụ bằng dũng khớ nitơ tới cắn Hũa tan cắn bằng 400 àl
26 methanol, lọc qua màng lọc 0,22 àm, tiến hành sắc ký Tiến hành lặp lại 3 lần quy trỡnh chiết này với mỗi dung môi khảo sát
Kết quả khảo sát được thể hiện ở Bảng 3.3 và Phụ lục 3
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát dung môi chiết
Diện tích pic trung bình (Abu.s)
Diện tích pic trung bình (Abu.s)
Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu được chiết xuất với dung môi ethyl acetat
Nhận xét: Qua quá trình khảo sát các dung môi chiết xuất và các cột chiết, có thể thấy có 2 dung môi là ethyl acetat và diethyl ether đều có khả năng chiết tốt: tín hiệu chất phân tích cao, thời gian lưu hợp lý Trong 2 dung môi hữu cơ thì ethyl acetat cho khả năng chiết tốt hơn diethyl ether với với đáp ứng của BDF và IS cao hơn, thời gian thổi khô dịch chiết nhanh và kỹ thuật chiết đơn giản; sắc ký đồ sau quá trình sắc ký cho
27 pic cân đối, đáp ứng của chất phân tích cao, kết quả thể hiện ở Hình 3.8 Do vậy, ethyl acetat được lựa chọn làm dung môi chiết BDF trong máu
3.1.4 Kết quả xây dựng phương pháp định lượng BDF trong máu bằng LC-MS/MS được xây dựng như sau
Từ các kết quả thực nghiệm đã nêu trên, phương pháp LC-MS/MS định lượng BDF trong máu người như sau:
➢ Quy trình tách chiết mẫu máu:
Hỳt chớnh xỏc 1 ml mẫu mỏu vào ống ly tõm 10 ml, thờm 20 àl dung dịch IS nồng độ 1,0 àg/ml và 20 àl HCl 1 M Thờm tiếp 3 ml dung mụi chiết, lắc xoỏy 5 phỳt Ly tõm
5000 vòng/phút trong 5 phút, lấy lớp dung môi hữu cơ Chiết 3 lần gộp dịch chiết và làm khụ bằng khớ nitơ tới cắn Hũa tan cắn bằng 400 àl methanol, lọc qua màng lọc 0,22 àm, tiến hành sắc ký
- Cột sắc ký: Poroshell 120 EC-C18 (2,7 àm, 4,6 x 100 mm) và tiền cột
- Pha động: ACN : Ammoni format 10 mM (95:5, tt/tt)
- Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 1 àl
- Nhiệt độ buồng mẫu: 25ºC
Chế độ ion hoá ESI (-), điện thế ion hoá 4000V, khí phun sương 40 psi, nhiệt độ hoá hơi 300 ºC, năng lương phân mảnh các ion con theo chế đô tự động
3.1.5 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng BDF trong máu
3.1.5.1 Độ phù hợp của hệ thống sắc ký
Ứng dụng quy trình được xây dựng để thực hiện giám định BDF trong máu tại Viện Pháp y Quốc gia
Áp dụng quy trình đã xây dựng để phân tích định lượng BDF trong 5 mẫu của những người nghi ngờ bị ngộ độc thuốc diệt chuột được gửi tới giám định tại Viện Pháp y Quốc gia Mỗi mẫu được tiến hành lặp lại 3 lần, nồng độ các chất phân tích được tính bằng trung bình các lần phân tích Kết quả phân tích xác định BDF trong máu được trình bày trong Bảng 3.14, sắc ký đồ phân tích được trình bày trong Hình 3.13, Hình 3.14 và Hình 3.15
Bảng 3.14 Kết quả phân tích một số mẫu máu thực
STT Mã hoá mẫu Tỷ lệ S pic BDF/IS Nồng độ BDF trung bình tính được
Hình 3.13 Sắc ký đồ xác nhận sự có mặt của BDF trong M2
Hình 3.14.Sắc ký đồ xác nhận sự có mặt của BDF trong M3
Hình 3.15 Sắc ký đồ xác nhận sự có mặt của BDF trong mẫu M5
Nhận xét: Từ kết quả phân tích 5 mẫu máu của 5 người nghi ngờ ngộ độc TDC được gửi về Viện Pháp y Quốc gia, cho thấy có 3 mẫu dương tính với BDF Nồng độ BDF phát hiện thấp nhất là 4,49 ng/ml và cao nhất là 114,96 ng/ml
Kết quả thực nghiệm cho thấy, phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng và thẩm định phù hợp để định lượng BDF trong máu của những người nghi bị ngộ độc thuốc diệt chuột nhóm superwarfarin Phương pháp có độ đặc hiệu, chọn lọc và độ đúng cao, thích hợp để xác định hàm lượng BDF trong máu.
Bàn luận
3.3.1 Về quy trình xử lý mẫu
Quá trình phân tích BDF trong dịch sinh học bằng hệ thống LC-MS/MS yêu cầu quá trình xử lý nền mẫu trước khi đưa vào hệ thống sắc ký Do vậy, việc xử lý nền mẫu phức tạp như máu bằng các biện pháp kết tủa protein, SPE hay LLE là điều cần thiết để loại bỏ tác nhân ảnh hưởng đến quá trình ion hoá BDF ở nguồn ESI
Có thể thấy xử lý mẫu bằng phương pháp SPE bằng cột C18 hay cột Certify II cho khả năng thu hồi hoạt chất cao, dịch chiết tương đối sạch tuy nhiên lại khó áp dụng tại Việt Nam do cần các trang thiết bị đắt tiền và tốn nhiều thời gian do quy trình thực hiện
39 khá phức tạp Phương pháp LLE với dung môi ethyl acetat cho khả năng thu hồi chất phân tích cao, thời gian xử lý mẫu ngắn, các bước xử lý mẫu đơn giản, dễ thực hiện và không cần các trang thiết bị phức tạp, phù hợp với hầu hết các phòng thí nghiệm Vì vậy mà trong nghiên cứu này phương pháp chiết LLE với dung môi ethyl acetat được lựa chọn.
So với kỹ thuật kết tủa protein bằng acetonitril và chiết pha rắn bằng cột Bond- Elut Certify II của Jason E Schaff [28], kỹ thuật trong khoá luận có độ thu hồi BDF và
IS nhỏ hơn, và việc sử dụng dung môi ethyl acetat giúp tiết kiệm chi phí hơn cột Certify
3.3.2 Về phương pháp phân tích và thẩm định BDF
Trong khoá luận, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật khối phổ 2 lần để định lượng BDF trong máu Phương pháp LC-MS/MS có tính đặc hiệu và chọn lọc cao, cho phép xác định sự có mặt của chất phân tích thông qua phổ khối của ion được bắn phá Do vậy BDF có thể dễ dàng được phát hiện và định lượng trong máu với độ nhạy cao khi có giá trị LOD thấp so với các nghiên cứu sử dụng detector huỳnh quang như nghiên cứu [30] của tác giả Daljit Vudathala và cộng sự hay nghiên cứu [4] của tác giả Antonio Armentano và cộng sự
Phương pháp phân tích LC-MS/MS nghiên cứu trong khoá luận đạt yêu cầu theo hướng dẫn của EMA, US - FDA và EC (2002) về thẩm định độc chất trong dịch sinh học Phương pháp có độ đúng và chính xác trong ngày và khác ngày nằm trong khoảng quy định từ 85 – 115% với giá trị RSD < 15%; đảm bảo độ ổn định ở các điều kiện khác nhau ( sau 4 giờ ở nhiệt độ phòng, 7 ngày ở - 20ºC, 21 ngày ở - 20ºC và sau 3 chu kỳ rã
- đông); khả năng thu hồi hoạt chất tốt từ 80,1 – 84,9% Đường chuẩn được xây dựng trên nền mẫu máu nhằm loại trừ ảnh hưởng nền mẫu, cho khoảng tuyến tính rộng 0,5 –
100 ng/ml từ đó dễ dàng ứng dụng để phát hiện và định lượng BDF trong mẫu máu người bị ngộ độc TDC Phương pháp có giới hạn phát hiện thấp với LOD chỉ 0,1 ng/ml cho phép xác định BDF trong lĩnh vực pháp y Trên thế giới cũng có một số nghiên cứu xác định BDF trong máu người nhưng hầu hết cho giới hạn phát hiện còn cao như ở nghiên cứu [28] của Jason E Schaff và cộng sự với LOD là 2 ng/ml hay nghiên cứu [5] của Sergei Bidny và cộng sự với LOD là 0,5 ng/ml Ở Việt Nam chưa có tài liệu nào công bố về việc xác định BDF trong máu người bằng kỹ thuật LC/MS/MS vì vậy việc xây dựng phương pháp phân tích BDF trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ góp phần không nhỏ trong công tác cấp cứu và giám định pháp y
3.3.3 Về kết quả phân tích mẫu thực tế
Kết quả thực nghiệm phân tích 5 mẫu máu của người nghi ngộ độc TDC được gửi tới Viện Pháp y Quốc gia, có 3 mẫu phát hiện có BDF Đặc biệt với những mẫu có nồng độ BDF trên ngưỡng an toàn (> 10 ng/ml máu) [16] có nguy cơ tử vong do đông máu nếu không được cấp cứu kịp thời Vì vậy, việc phát hiện kịp thời các trường hợp ngộ độc BDF khi ngộ độc TDC góp phần trong nghiên cứu và tìm ra thuốc giải chất này