đỗ thị hương xây dựng phương pháp xác định methadon trong máu và nước tiểu bằng gc ms

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ HƯƠNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH METHADON TRONG MÁU VÀ NƯỚC

TIỂU BẰNG GC-MS

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

TIỂU BẰNG GC-MS

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Trần Nguyên Hà 2 TS Phạm Quốc Chinh

Nơi thực hiện:

Khoa Độc chất – Viện Pháp Y Quốc gia

HÀ NỘI - 2024

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Phạm Quốc Chinh, cán bộ khoa Độc chất – Viện Pháp y Quốc gia, người đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết, chỉ bảo cho em trong suốt thời gian làm nghiên cứu trên Viện và hoàn thành khoá luận này

Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo khoa Độc chất - Viện Pháp y Quốc gia và Khoa Hoá Phân tích và Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ ở khoa Độc chất – Viện Pháp y Quốc gia đã nhiệt tình chỉ bảo em trong quá trình làm thí nghiệm

Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên và giúp đỡ em trong học tập và thời gian thực hiện đề tài này

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể tránh những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô giáo và các bạn sinh viên

Hà Nội, ngày 3 tháng 6 năm 2024

Sinh viên Đỗ Thị Hương

1.3.2 Phương pháp chiết lỏng-lỏng (LLE) 7

1.3.3 Phương pháp chiết pha rắn (SPE) 8

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 17

2.2.1 Hóa chất, thuốc thử 17

2.2.2 Thiết bị 17

2.3 Nội dung nghiên cứu 18

2.3.1 Xây dựng phương pháp xác định methadon 18

2.3.2 Ứng dụng phân tích methadon trong mẫu thực 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Chuẩn bị mẫu 18

2.4.2 Lựa chọn điều kiện sắc kí và chất chuẩn nội 19

2.4.3 Áp dụng phương pháp chiết LLE để xử lý mẫu 19

2.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích 20

2.5 Áp dụng quy trình để phân tích mẫu thực tế 22

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24

3.1 Xây dựng phương pháp xác định MTD trong dịch sinh học bằng GC-MS 24

3.1.1 Khảo sát phổ khối của methadon và chuẩn nội diphenylamin 24

3.1.2 Thiết lập chương trình GC-MS xác định methadon 27

3.2 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu 28

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết 28

3.3.5 Độ đúng và độ lặp lại của phương pháp 37

3.3.6 Đánh giá hiệu suất chiết 38

3.3.7 Độ ổn định 39

3.4 Áp dụng quy trình phân tích mẫu thực tế 40

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DLLME Phương pháp chiết vi lượng lỏng – lỏng phân tán (Dispersive

Liquid Liquid Micro-extraction)

EDDP 2-ethylidene-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine EMDP 2-ethyl-5-methyl-3,3-diphenylpyrrolin

FDA Cục quản lý thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and

Drug Administration) GC-FID Sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa (Gas

Chromatography -Flame Ionization Detector)GC-MS Sắc ký khí khối phổ (Gas Chromatography–Mass

Spectrometry) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography) HQC Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High Quality Control)

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng hai lần khối phổ (Liquid chromatography-mass spectrometry mass and Liquid chromatography-electrospray tandem mass)

LLE Chiết lỏng lỏng (Liquid-liquid extraction) LLOQ Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantitation) LOD Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation) LQC Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Low Quality Control)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu xác định methadon trên thế giới và Việt Nam 12

Bảng 3.1 Mảnh ion thành phần của các chất nghiên cứu 26

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát dung môi chiết 28

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của phương pháp 29

Bảng 3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của chất phân tích 33

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 35

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng và độ lặp lại của phương pháp 37

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát hiệu suất chiết methadon 38

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ ổn định của methadon sau 7 ngày và 21 ngày 39

Bảng 3.9 Kết quả phân tích mẫu thực tế bằng GC-MS 40

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của methadon 2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của methadon hydrochlorid 3

Hình 1.3 Sơ đồ quá trình chuyển hoá methadon 4

Hình 2.1 Máy sắc kí khí Agilent 8890 kết nối khối phổ MS 5977 17

Hình 3.1 Sắc đồ ion thành phần methadon 24

Hình 3.2 Phổ khối lượng của methadon 25

Hình 3.3 Sắc đồ ion thành phần diphenylamin 25

Hình 3.4 Phổ khối lượng của diphenylamin 26

Hình 3.5 Sắc đồ chế độ SIM với các ion định lượng của chất phân tích 27

Hình 3.6 Biểu đồ khảo sát dung môi chiết 28

Hình 3.7 Sắc kí đồ mẫu chuẩn và chuẩn nội 30

Hình 3.8 Sắc kí đồ mẫu nước tiểu trắng 31

Hình 3.9 Sắc kí đồ mẫu nước tiểu trắng thêm chuẩn và chuẩn nội 31

Hình 3.10 Sắc kí đồ mẫu máu trắng 32

Hình 3.11 Sắc kí đồ mẫu máu trắng thêm chuẩn và chuẩn nội 32

Hình 3.12 Sắc đồ xác định LOD trong máu 33

Hình 3.13 Sắc đồ xác định LOD trong nước tiểu 34

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa tỉ lệ diện tích pic Schuẩn/Schuẩn nội và nồng độ MTD trong nước tiểu 36

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa tỉ lệ diện tích pic Schuẩn/Schuẩn nội và nồng độ MTD trong máu 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Những năm qua, tệ nạn ma túy ở Việt Nam luôn tăng gây tác hại rất lớn đến kinh tế, chính trị, xã hội, hạnh phúc, làm suy thoái về đạo đức, lối sống, là nguyên nhân dẫn đến các loại tội phạm như trộm cắp, cướp của giết người, lừa đảo, cưỡng đoạt tài sản, gây rối trật tự công cộng…, đồng thời cũng là nguyên nhân chính dẫn đến đại dịch HIV của thế giới Trước tình hình người nghiện ma túy gia tăng, Đảng, Chính phủ đã có nhiều Chỉ thị, Nghị quyết, Chương trình Quốc gia về phòng chống ma túy, đã áp dụng nhiều biện pháp cai nghiện như: cai nghiện tại gia đình, tại cộng đồng, tại trung tâm cai nghiện bắt buộc [6] Đặc biệt điều trị thay thế bằng MTD là biện pháp cai nghiện có hiệu quả, được áp dụng rộng rãi trên thế giới có tác dụng cắt cơn nghiện, ổn định sức khỏe [35] Việc xác định phương pháp để phát hiện MTD trong cơ thể người rất quan trọng vì có thể giúp trong việc kiểm soát vấn đề ma túy trong cộng đồng, chẩn đoán, điều trị và theo dõi người sử dụng hoặc lạm dụng MTD, đặc biệt trong những trường hợp bị ngộ độc có thể gây ra các tác dụng phụ, nghiêm trọng hơn là tử vong do sử dụng nhầm lẫn hoặc do dùng quá liều [6] [35]

Trên thế giới, có những nghiên cứu xác định MTD trong dịch sinh học bằng các phương pháp phân tích khác nhau như sắc ký khí khối phổ (GC-MS), sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Trong khi đó, ở Việt Nam, việc nghiên cứu phương pháp xác định MTD trong dịch sinh học còn rất hạn chế [10] [12] [13] [14] [26] [36] Để phục vụ cho công tác giám định được đảm bảo tính chính xác, cũng như phục vụ cho công tác chăm sóc sức khoẻ, cấp cứu điều trị ngộ độc MTD, chúng tôi đặt vấn đề xác định MTD trong máu và nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp xác định MTD trong máu và nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ

2 Ứng dụng phương pháp trong phân tích các mẫu thực tế

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về methadon

1.1.1 Nguồn gốc

MTD được nghiên cứu vào đầu những năm 1930 tại phòng thí nghiệm của Hoechst AG bởi hai nhà khoa học người Đức là Gustav Ehrhart và Max Bockmuhl Mặc dù được tổng hợp vào những năm 1930, nhưng MTD lần đầu tiên được FDA Hoa Kỳ chấp thuận vào năm 1947 dưới dạng thuốc giảm đau với tên thương mại là “Dolophine” [16] Tuy nhiên, sau đó, các nhà nghiên cứu nhận ra khả năng gây nghiện của loại thuốc này và việc sử dụng MTD làm thuốc giảm đau không còn được ưa chuộng nữa Lần đầu tiên vào năm 1964 tại NewYork, Hoa Kỳ, bác sĩ Marie Nyswander và Vincent Dole đã sử

dụng thuốc MTD để điều trị cho người nghiện opioids [22] Kể từ đó, MTD được biết

đến nhiều nhất với công dụng điều trị cho người nghiện opioids Ngày nay, thuốc MTD đã được áp dụng điều trị nghiện opioids tại hơn 70 quốc gia trên thế giới như Mỹ, Anh, Pháp, Trung Quốc, Indonesia,…[35]

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu điều trị thay thế nghiện opioids bằng MTD đã được bắt đầu từ năm 1996 và đến năm 2008 đã triển khai điều trị cho người nghiện opioids bằng thuốc MTD tại Hải Phòng và thành phố Hồ Chí Minh Sau đó ngày càng mở rộng ra các tỉnh, thành phố trong cả nước [3]

MTD có trong danh mục các chất ma tuý của Công ước quốc tế năm 1961 về kiểm

soát ma tuý của Liên hợp quốc [34], đồng thời thuộc danh mục II Nghị định số

57/2022/NĐ-CP, ngày 25 tháng 8 năm 2022 của Chính Phủ [7] Đến năm 2005, MTD được Tổ chức Y tế thế giới đưa vào danh mục thuốc thiết yếu [21]

1.1.2 Công thức và danh pháp

MTD thường gặp dưới 2 dạng là dạng base và dạng muối hydroclorid MTD chứa một nguyên tử carbon bất đối C6 và tồn tại ở hai dạng đối hình: (S)-(+)-methadon và (R)-(-)-methadon [2]

❖ Methadon

- Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo củamethadon

- Tên khoa học: 6-dimethylamino-4,4-diphenylheptan-3-on - Công thức phân tử: C21H27NO

- Khối lượng phân tử: 309,445 - pKa: 9,2

- Dạng tinh thể màu trắng, vị đắng Tan nhiều trong ethanol, tan trong ether và glycerol, rất ít tan trong nước

- Điểm nóng chảy : 235°C

❖ Methadon hydrochlorid

- Công thức cấu tạo

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của methadon hydrochlorid

- Tên khoa học: 6-dimethylamino-4,4-diphenylheptan-3-on hydroclorid - Công thức phân tử: C21H27NO.HCl

- Khối lượng phân tử: 345,91 - pKa: 8,25

- Methadon hydrochlorid dạng bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng Tan trong nước, dễ tan trong ethanol 96 %, không tan trong ether

- Methadon hydrochlorid có điểm nóng chảy từ 233°C đến 236°C

1.1.3 Dược động học

Dược động học của MTD rất khác nhau ở mỗi người, do đó, sau khi dùng cùng một liều lượng, nồng độ thu được sẽ khác nhau đáng kể ở những đối tượng khác nhau Đường dùng: MTD thường được dùng dưới dạng muối hydrochlorid Có các dạng bào chế khác nhau dùng cho đường uống, dưới da,…

a Hấp thu

MTD có sinh khả dụng qua đường uống hơn 80%, so với 26% của morphin, nhưng sự khác biệt giữa các cá nhân dao động từ 41% đến 95% Sau khi uống, thuốc được hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa, với nồng độ có thể đo được trong huyết tương sau khi uống 30 phút, nhưng tác dụng cao nhất và nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được sau

khoảng 3-4 giờ, duy trì trong khoảng 1-6 giờ [28] Thời gian đạt nồng độ ổn định trong

máu khoảng 3-5 ngày sau mỗi lần thay đổi liều điều trị [9]

b Phân bố

MTD là thuốc thân lipid, MTD liên kết cao với protein huyết tương, đặc biệt là với glycoprotein axit alpha-1 (85%-90%), MTD cũng liên kết với albumin, các protein mô và huyết tương khác bao gồm cả lipoprotein Phần còn lại ở dạng tự do, tỷ lệ tự do trung

bình của MTD là khoảng 13% Sự gia tăng nồng độ glycoprotein axit alpha-1 trong

huyết tương có thể làm thay đổi tỷ lệ thuốc không liên kết (tức là dạng tự do) và thuốc liên kết, dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ thuốc liên kết với sự giảm nồng độ thuốc tự do tương ứng Sự thay đổi này có ý nghĩa lâm sàng đối với các loại thuốc có liên kết cao như MTD Trong trường hợp MTD, nồng độ thuốc tự do giảm sẽ gây ra các triệu chứng cai (thở nhanh, vã mồ hôi, ngáp, thèm ma túy,…) và cần phải điều chỉnh liều Khi MTD được giải phóng vào và lưu thông trong máu, MTD phân bố rộng rãi đến các mô như não, gan, thận, phổi và cơ,… Do tính thân lipid, MTD có thể tồn tại lâu trong gan và các mô khác MTD cũng qua được nhau thai và phân bố vào trong sữa mẹ [19] [23]

c Chuyển hoá

MTD được chuyển hóa chủ yếu ở gan nhờ enzyme cytochrome P450 (CYP), chủ yếu là CYP2B6, tiếp theo là CYP3A4, 2C19, 2D6 và ở mức độ thấp hơn là CYP2C18, 3A7, 2C8, 2C9, 3A5 và 1A2 MTD chủ yếu tạo thành các chất chuyển hóa pyrrolidin không có hoạt tính dược lý là 2-ethyliden-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidin (EDDP) và 2-ethyl-5-methyl-3,3-diphenylpyrrolin (EMDP) Trong đó CYP2C19, 3A7 và 2C8 ưu tiên chuyển hóa (R)-methadon, CYP2B6, 2D6 và 2C18 chủ yếu chuyển hóa (S)-methadon [37] [15]

Hình 1.3 Sơ đồ quá trình chuyển hoá methadon

Quá trình chuyển hoá MTD kết hợp hai quá trình N-demethyl hóa và quá trình vòng hóa của MTD MTD được N-demethyl hóa thành một hợp chất trung gian là normethadon, sau đó là quá trình vòng hoá để tạo thành EDDP Phản ứng N-demethyl hóa thứ hai xảy ra trên EDDP để tạo thành EMDP có thời gian bán hủy nằm trong khoảng từ 39,8 giờ đến 48 giờ Hai chất chuyển hóa này tiếp tục được chuyển hóa thành sản phẩm hydroxypyrrolidinic bằng quá trình hydroxyl hóa vòng thơm

Một con đường khác trong quá trình hình thành EMDP là quá trình khử demethadon qua trung gian CYP của normethadon để tạo thành dinormethadon, sau đó được chuyển hóa thành EMDP [11] [17]

N-d Thải trừ

Sự bài tiết MTD sau khi chuyển hóa sinh học thường xảy ra thông qua quá trình đào thải qua thận và phân Khoảng 20% đến 50% MTD được bài tiết qua nước tiểu dưới dạng MTD hoặc chất chuyển hóa của MTD và 10% đến 45% được bài tiết qua phân

dưới dạng chất chuyển hóa pyrrolidin [29] MTD được bài tiết qua quá trình lọc ở cầu

thận, được tái hấp thu ở ống thận Thời gian bán hủy dao động trong khoảng từ 13 đến

47 giờ với trung bình là 25 giờ [28] MTD là bazơ yếu dẫn đến sự bài tiết qua thận phụ

thuộc vào pH nước tiểu Nước tiểu có tính axit làm tăng bài tiết MTD (khoảng 35%) và giảm dần khi pH nước tiểu tăng MTD đi qua hàng rào nhau thai và bài tiết qua sữa MTD cũng được bài tiết qua nước bọt và mồ hôi [25]

1.1.4 Dược lực học

MTD là một opioid tổng hợp hoạt động như một chất chủ vận hoàn toàn ở thụ thể μ-opioid, các thụ thể này chủ yếu ở thần kinh trung ương MTD kích hoạt các thụ thể μ giúp loại bỏ các triệu chứng cai và giảm cảm giác thèm ma túy [31] [35] [37]

Hơn nữa, MTD là một chất đối kháng không cạnh tranh với thụ thể aspartate, MTD chất ức chế tái hấp thu serotonin và norepinephrin trong hệ thần kinh trung ương giảm sự nhạy cảm của thần kinh trung ương với các kích thích gây đau dẫn đến giảm hiện tượng tăng cảm giác đau và giảm cường độ đau, tăng khả năng nâng cao hiệu quả trong việc kiểm soát cơn đau thần kinh [18] [27] [31]

N-methyl-d-1.1.5 Tác dụng dược lý và độc tính

a Tác dụng dược lý:

MTD là dẫn chất tổng hợp của diphenylheptan chủ vận thụ thể µ-opioid, có tác dụng dược lý tương tự morphin như giảm đau, giảm ho, cầm tiêu chảy, gây lệ thuộc thuốc nhưng gây khoái cảm yếu MTD làm giảm hội chứng cai opioids, giảm lệ thuộc vào opioids nên được dùng để cắt cơn nghiện và xử trí phụ thuộc opioids, có thời gian bán huỷ dài hơn nên chỉ cần sử dụng một lần trong ngày là đủ để không xuất hiện hội chứng cai MTD cũng được áp dụng để điều trị giảm đau, ở liều giảm đau ngang nhau, MTD có thể gây ra ức chế hô hấp tương tự hoặc cao hơn morphin, MTD ít gây táo bón hơn morphin [38] [39]

b Độc tính :

Việc sử dụng MTD thường xuyên liên quan đến sự tăng khả năng dung nạp Khi đó, phải dùng liều lượng thuốc lớn hơn để đạt được hiệu quả tương tự Vì vậy liều dùng sẽ phụ thuộc vào từng đối tượng Liều dùng và lượng MTD gây quá liều phụ thuộc vào

nhiều yếu tố Yếu tố lớn nhất là đã từng sử dụng MTD hoặc opioids chưa Liều dùng dao động từ 20-100mg Các quy định hiện hành ở Hoa Kỳ không khuyến cáo sử dụng liều MTD lớn hơn 100 mg/ngày Đối với người lớn chưa sử dụng opioids, liều gây độc có thể chỉ ở mức 30-50 mg Liều gây độc cho trẻ có thể chỉ là 10 mg Trong khi đó đối với những người nghiện opioids, có thể dùng liều hơn 100 mg mỗi ngày mà không có bất kỳ tác dụng phụ nào rõ rệt Nồng độ trong máu sau khi dùng MTD dao động từ 30-750 ng/ml, ngưỡng nồng độ gây độc dao động từ 240-1000 ng/ml tuỳ từng đối tượng Nồng độ trong nước tiểu từ 100-13250ng/ml khi dùng liều từ 20mg-200mg [24]

Ở những bệnh nhân sử dụng MTD để điều trị cai nghiện, nếu ngừng thuốc đột ngột ở người bệnh điều trị dài hạn, có thể xuất hiện hội chứng cai thuốc hoặc co giật, vì vậy cần giảm liều từ từ

Tác dụng độc khi dùng quá liều chủ yếu là giảm tần số và biên độ thở, có thể tiến triển đến ngưng thở Các biến chứng khác (ví dụ phù phổi, thường phát triển trong vài phút đến vài giờ sau khi dùng quá liều) và tử vong chủ yếu do tình trạng thiếu oxy Đồng tử co nhỏ, mê sảng, tụt huyết áp, nhịp tim chậm, hạ nhiệt cơ thể, và bí tiểu có thể xảy ra Bệnh nhân được điều trị bằng naloxone nếu nghi ngờ quá liều [38] [39]

1.2 Chất chuẩn nội

Vì mẫu phân tích là dịch sinh học có nền mẫu phức tạp, nồng độ chất phân tích nhỏ, quá trình xử lý mẫu có thể làm mất mẫu, ảnh hưởng tới độ lặp lại của phép phân tích nên để hạn chế sự dao động này cũng như những dao động nhỏ của hệ thống sắc kí, việc sử dụng chất chuần nội là cần thiết Một số yêu cầu đặt ra đối với chất chuẩn nội:

- Trong cùng điều kiện sắc kí, chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thử

- Có cấu trúc hoá học tương tự chất thử - Phải có nồng độ xấp xỉ với nồng độ của chất thử - Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

1.3 Tổng quan về xử lý mẫu khi phân tích thuốc trong dịch sinh học

Chuẩn bị mẫu là một phần quan trọng của phương pháp phân tích Việc chuẩn bị mẫu tốt giúp giảm độ phức tạp của các mẫu sinh học, độ phức tạp của nền mẫu giảm sẽ có lợi cho cả độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp Đặc biệt nhu cầu phát hiện các chất phân tích có hàm lượng thấp trong phân tích các mẫu sinh học như máu hoặc nước tiểu có nền mẫu phức tạp và thường chứa một số thành phần nội sinh như protein, albumin, Phương pháp xử lý mẫu thường sử dụng và được ứng dụng rộng rãi đối với

các mẫu thử sinh học là kết tủa protein, chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn [15] [20]

1.3.1 Kết tủa protein

Kết tủa protein là phương pháp đơn giản và được sử dụng rộng rãi trong phân tích mẫu thử sinh học là huyết tương Phương pháp này được thực hiện bằng cách sử dụng dung môi hữu cơ (thường dùng acetonitril hoặc methanol) hoặc một acid (thường dùng acid percloric hoặc acid tricloacetic) Sau đó, mẫu chiết được ly tâm để tách protein, dịch nổi ở phía trên được lấy mang phân tích Thông thường dịch nổi được tiêm trực tiếp vào hệ thống sắc ký Đôi khi, dịch nổi được pha loãng với dung môi thích hợp (ví dụ như pha động sắc ký) khi nồng độ chất phân tích quá cao hoặc được cô đặc tới cắn và hoà tan lại trong một thể tích nhỏ hơn dung môi thích hợp nếu nồng độ chất phân tích thấp Kết tủa protein là phương pháp chuẩn bị mẫu phổ biến và nhanh chóng, dễ dàng tự động hoá Trong các mẫu thử không có protein có thể cho phép tiêm mẫu trực tiếp mà cần xử lý Tuy nhiên, các mẫu loại này nên pha loãng và lọc hoặc ly tâm để giảm hiệu ứng nền và loại bỏ các tiểu phân (nếu có) trước khi đưa vào hệ thống sắc ký [30][32]

1.3.2 Phương pháp chiết lỏng-lỏng (LLE)

Nguyên tắc : LLE dựa trên sự phân bố của các chất hoà tan giữa hai pha lỏng không trộn lẫn, một pha là nước, pha còn lại là dung môi hữu cơ không tan hoặc rất ít hoà tan trong nước (một pha là dung dịch chứa chất cần chiết, pha còn lại là dung môi chiết) được để trong dụng cụ chiết như phễu chiết, bình chiết [1]

Hệ số phân bố K được mô tả:

KD = [𝐴]𝑠

[𝐴]𝑛

[A]s : nồng độ chất A trong pha hữu cơ tại giai đoạn cân bằng [A]n: nồng độ chất A trong pha nước tại giai đoạn cân bằng K là hằng số ở nhiệt độ xác định, cho biết khả năng hoà tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng K càng lớn, quá trình chiết càng hiệu quả

Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện chiết cần thiết sau: - Dung môi chiết và dịch chiết là hai pha không được trộn lẫn, trong đó dung môi phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích

- Cân bằng chiết đạt được nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng để giải chiết được tốt

- Dung môi chiết chỉ chọn lọc một chất hay một nhóm chất nhất định Độ chọn lọc dựa vào tính chất của dung môi, tính chất của chất cần tách và điều kiện chiết (như pH môi trường)

- Phải chọn được điều kiện chiết tối ưu bao gồm pH của dung dịch Đặc tính hoá học của dược chất dùng làm thuốc thường có tính acid yếu hoặc base yếu Do đó, phải hiểu rõ tính chất của thuốc để lựa chọn phương pháp cũng như điều

kiện chiết phù hợp Dịch sinh học như máu, nước tiểu, có tỷ lệ nước lớn nên có thể coi dịch sinh học là môi trường nước Trong môi trường đó, dược chất thường tồn tại ở dạng cặp acid base liên hợp tức là một phần ở dạng phân tử và một phần ở dạng ion Tỷ lệ chất phân tích tồn tại dưới dạng phân tử và ion phụ thuộc vào pH mẫu thử, hằng số phân ly (ka hoặc kb) của chất phân tích Trong khi đó, đa số trường hợp thuốc ở dạng phân tử dễ tan trong dung môi hữu cơ hơn khi ở dạng ion, do đó cần điều chỉnh pH để chuyển dược chất ở dạng ion thành dạng phân tử để thu được hiệu suất chiết cao Khi chiết chất phân tích có tính acid yếu hoặc base yếu từ mẫu thử sinh học, thường thêm một lượng nhỏ acid hoặc base để điểu chỉnh pH mẫu thử về giá trị thích hợp

Hiệu suất chiết (R) thu được khi chiết chất phân tích vào dung môi hữu cơ được tính bằng công thức sau:

R = 1 – ( r

d+r )nTrong đó r là tỷ lệ thể tích của mẫu thử và thể tích dung môi chiết n là số lần chiết

d là hệ số phân bố được tính riêng đối với chất phân tích là acid yếu hoặc base yếu

Không phải chiết càng nhiều lần thì hiệu suất chiết càng cao, mà hiệu suất chiết sẽ tăng đến một mức nào đó sau đó dung dịch sẽ bão hoà Trong dịch sinh học, hàm lượng chất phân tích thường rất nhỏ, thể tích dung môi chiết sử dụng lớn nên thường chiết từ 2-3 lần là cho kết quả đạt yêu cầu

1.3.3 Phương pháp chiết pha rắn (SPE)

Nguyên tắc: Chiết pha rắn dựa trên việc lưu giữ chọn lọc và rửa giải tiếp theo các

chất phân tích khỏi pha rắn Mục đích chính của nguyên lý chiết pha rắn là giảm nhiễu nền mẫu và cải thiện độ nhạy phát hiện SPE dựa trên lý thuyết sắc ký pha lỏng-rắn, sử dụng sự hấp phụ chọn lọc và rửa giải chọn lọc để làm giàu, tách và tinh chế các mẫu [1] Kỹ thuật SPE dựa trên sự phân bố của các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn Trong đó, pha lỏng thường là nước hoặc dung môi hữu cơ, sẽ hoà tan chất cần phân tích Chất này sẽ được hấp phụ vào trong pha rắn (cột chiết) Sau đó chất cần phân tích sẽ được thu hồi chọn lọc ra khỏi cột chiết bằng dung môi rửa giải thích hợp Thông thường thể tích cần thiết để rửa giải hoàn toàn chất cần phân tích luôn nhỏ hơn rất nhiều so với thể tích của dung dịch mẫu ban đầu, vì thế mà mẫu được làm giàu

Theo bản chất của mỗi loại pha tĩnh, SPE được phân thành nhiều loại khác nhau bao gồm pha đảo, pha thuận, trao đổi ion (anion/cation)

+ Chiết pha thuận Nguyên liệu cho cột chiết pha rắn của pha thuận thường là cyano, amino diol, silicagel Trong đó, tương tác lưu giữ chất phân tích trên pha thuận- pha phân cực bắt

nguồn từ tương tác phân cực, đó là liên kết hydro, liên kết π-π hoặc tương tác lưỡng cực-lưỡng cực

+ Chiết pha đảo Nguyên liệu cho cột chiết pha rắn của pha đảo thường là dẫn chất của C18, C8, C2, cyclohexyl, phenyl Trong đó tương tác giữa chất phân tích và pha liên kết là lực Vanderwaals có năng lượng thấp, chất phân tích càng sơ nước càng có khuynh hướng nằm lại trên pha liên kết Quá trình rửa giải cũng đơn giản, chỉ cần một dung môi ít phân cực đủ để phá vỡ lực Vanderwalls, các dung môi thường dùng là methanol, acetonitrile, ethyl acetat

+ Trao đổi ion Nguyên liệu chiết pha rắn của trao đổi ion là nhựa trao đổi ion: Trao đổi cation mạnh: dẫn chất phenylsulfonic

Trao đổi anion mạnh: dẫn chất amon bậc 4

- Một số tiêu chí lựa chọn dung môi chiết

Các dung môi được lựa chọn để khảo sát trong thực tế cần đáp ứng một số tiêu chí như sau:

+ Dung môi không hòa tan trong nước + Dễ bay hơi

+ Dung môi ít độc, thông dụng, thường dùng trong các phòng thí nghiệm phân tích + Dung môi dễ tách pha khi chiết

+ Ngoài ra có thể xem xét thêm các yếu tố như an toàn cháy nổ, khả năng kích ứng khi tiếp xúc

1.4 Tổng quan về sắc kí khí khối phổ (GC-MS)

1.4.1 Khái niệm

Sắc ký khí (GC) là một phương pháp tách dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau, trong đó pha động là chất khí (khí mang) đi qua pha tĩnh chứa trong cột Sắc ký khí được áp dụng để tách những chất hoặc dẫn xuất của chúng mà có thể hóa hơi ở nhiệt độ phân tích [1] [5]

Khối phổ (MS) dựa trên việc đo trực tiếp tỷ số m/z, là tỷ số giữa khối lượng m và điện tích z của ion chất phân tích [1] [5]

Sắc ký khí ghép khối phổ là phương pháp kết hợp hai kỹ thuật GC và MS để tạo thành một phương pháp duy nhất là sắc kí khí khối phổ GC-MS, hai thiết bị này có khả năng bổ sung và hỗ trợ cho nhau trong quá trình phân tích, sắc ký khí tách các thành phần của một hỗn hợp và khối phổ phân tích đặc tính của từng thành phần riêng lẻ Bằng cách kết hợp hai kỹ thuật nhờ đó có thể phát huy được ưu điểm của cả hai phương pháp để ứng dụng trong khảo sát định tính và định lượng các chất [1]

1.4.2 Hệ thống GC-MS

Hệ thống sắc ký khí khối phổ gồm các bộ phận sau [1]: - Pha động: Khí mang đưa mẫu đi qua cột

- Pha tĩnh: Cột sắc kí đặt trong cột - Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột - Detector: Phát hiện chất phân tích trong mẫu - Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

a Hệ cấp pha động

Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận chuyển chất phân tích qua cột Khí mang thường là khí có phân tử lượng nhỏ, phải đảm bảo yêu cầu trơ về mặt hóa học, đảm bảo tinh khiết và phù hợp với từng loại detector Một số loại khí mang thường dùng như heli, nitơ, hydro, argon… Đi kèm với bình cấp khí mang còn có van giảm áp, đồng hồ kiểm tra lưu lượng khí

b Buồng tiêm mẫu

Mẫu phân tích lỏng hoặc khí được tiêm nhanh vào dòng pha động với một lượng vừa đủ bằng bơm tiêm nhỏ (microsyringe) hoặc van tiêm mẫu (sampling salve) Nếu tiêm mẫu dư thì pic sắc kí giãn rộng, độ phân giải kém Mẫu được tiêm qua đệm silicon chịu nhiệt vào buồng hoá hơi, buồng này được đốt nóng tới nhiệt độ thích hợp và nối với cột tách

Có nhiều kỹ thuật tiêm mẫu khác nhau Với cột mao quản thường dùng 3 kỹ thuật tiêm mẫu sau:

- Kỹ thuật tiêm chia dòng (split): chia dòng khí mang 1:10 đến 1:100 để giảm lượng mẫu vào cột (giảm 90% hoặc hơn) Thích hợp cho cột mao quản Độ nhạy của mẫu giảm vì chỉ một phần nhỏ vào cột

- Kỹ thuật không chia dòng (spitless): toàn bộ mẫu ngưng tụ ở đầu cột đã làm lạnh, sau đó tăng nhiệt độ làm bay hơi mẫu Độ nhạy tăng, phù hợp phân tích vết, nhưng có nguy cơ quá tải cột dẫn đến chồng pic ở thời gian đầu rửa giải

- Kỹ thuật tiêm thẳng vào cột (on-column): mẫu được ngưng tụ ở đầu cột sau đó làm bay hơi theo chương trình nhiệt độ Độ tái lặp tốt, tăng độ nhạy phù hợp phân tích vết, giảm phân huỷ mẫu do nhiệt Yêu cầu thời gian làm lạnh và nóng cột nên tăng thời gian phân tích

c Cột và lò cột

Chương trình nhiệt độ cột của sắc ký khí là thông số rất quan trọng cần kiểm soát chính xác và lò cột đảm bảo nhiệm vụ điều nhiệt này Trong sắc ký có hai loại cột: cột nhồi (packed column) và cột mao quản (capillary column) Ngày nay người ta sử dụng phổ biến cột mao quản do ưu điểm như cột mao quản cho độ phân giải cao hơn, thời gian phân tích ngắn hơn, độ nhạy tốt hơn so với cột nhồi

- Cột mao quản: + Nguyên liệu: silica nung chảy rất tinh khiết (tạp kim loại <1ppm) + Kích thước: dài 10-100m (cuộn tròn) Đường kính trong 0,1-0,7mm, có áo bảo vệ bằng polymid hoặc nhôm

+ Pha tĩnh: lớp chất lỏng dày 0,1-5µm bao mặt trong của cột hoặc chất mang bao pha tĩnh

+ Khí mang: heli hoặc hydro + Độ phân giải: phân tích nhiều thành phần: 100 chất hoặc hơn, nhất là với cột đường kính trong nhỏ hơn 0,2mm Chất tan được rửa giải ở nhiệt độ thấp hơn so với cột nhồi

- Cột nhồi: + Nguyên liệu: thủy tinh, thép không gỉ + Kích thước: dài 1-3m (cuộn tròn) Đường kính trong 2-3mm + Pha tĩnh: kích thước hạt 150-250µm, được bao lớp mỏng (0,05-1µm) + Khí mang: nitơ, heli

+ Độ phân giải: thấp, tốt nhất chỉ có thể tách được 20 thành phần - Pha tĩnh chủ yếu sử dụng là chất lỏng và được cố định trong cột cần đảm bảo yêu cầu sau:

+ Áp suất hơi thấp, tức là điểm sôi cao, ít nhất là cao hơn 100oC so với nhiệt độ vận hành cực đại của cột

+ Bền với nhiệt độ + Trơ về mặt hóa học Người ta đã nghiên cứu, lựa chọn nhiều chất làm pha tĩnh Một vấn đề quan trọng là pha tĩnh lỏng phải cho hệ số phân bố khác nhau với chất tan Điều này liên quan đến độ phân cực của pha tĩnh Thường phân ra 4 loại:

- Pha tĩnh phân cực thường có nhóm chức -CN, -CO, -OH - Pha tĩnh không phân cực thường là dẫn chất dialkyl siloxan, hydrocarbon bão hòa - Pha tĩnh rất phân cực như các polyol

- Pha tĩnh phân cực trung bình: các hợp chất ether, ceton, aldehyd Hiện nay có hai nhóm chất được dùng phổ biến để làm pha tĩnh cho sắc ký khí như: nhóm dẫn chất polydimethyl siloxan và nhóm polyethylen glycol

d Detector khối phổ

Detector khối phổ gồm có 5 bộ phận: + Bộ nạp mẫu: đưa mẫu vào máy, là đầu ra của máy GC nối với máy khối phổ + Bộ nguồn ion: ion hóa các nguyên tử, phân tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi + Bộ phân tích khối: tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc tách riêng nhờ tác dụng của từ trường và điện trường để đi đến detector

+ Detector: có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy

+ Bộ xử lý dữ liệu: tín hiệu từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, định lượng…

- Trình bày dữ liệu Khối phổ cho nhiều dạng dữ liệu Phổ biến nhất là phổ khối, trình bày trên hệ trục: cường độ tương đối-trị số m/z, cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và nhận dạng các chất

e Một số kỹ thuật MS

- Kỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN) Với một hỗn hợp nhiều chất sau khi được tách ra qua cột sắc ký khí và đưa vào detector khối phổ, detector sẽ ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ mỗi chất Ta có một sắc ký đồ toàn bộ ion TIC (Total Ion Chromatogram) và phổ khối được lấy toàn bộ các ion (FULL SCAN) FULL SCAN cho đầy đủ thông tin về chất phân tích hơn, tuy nhiên độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn [5]

- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected Ion Monitoring) Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc ký đồ theo thời gian Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy, tức tăng tỷ lệ tín hiệu (S) trên nhiễu đường nền (N) [5]

1.5 Một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới

Dưới đây là một số nghiên cứu về phương pháp xác định MTD trên thế giới và ở Việt Nam

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu xác định methadon trên thế giới và Việt Nam

STT Nền

mẫu

Phương pháp phân

tích

Phương pháp xử lý mẫu

Điều kiện

Tài liệu tham khảo Trên thế giới

tiểu, huyết tương

LC-MS/MS Kết tủa

protein bằng MeOH

Pha tĩnh: Cột Zorbax SB-C18

Pha động : hỗn hợp axetonitril và axit formic (45:55) trong điều kiện đẳng dòng,

Khoảng tuyến tính từ 10-

1000ng/ml trong huyết tương và 20 -2000 ng/ml

[14]

ở 45oC với tốc độ dòng 1 ml/phút

trong nước tiểu

nước tiểu

pháp SPE

Chất chuẩn nội: Loxapine Pha tĩnh: cột pha đảo C8 (150mm×4,6 mm; 5μm) Pha động: dung dịch đệm photphat pH 6,4 và axetonitril (50/50) Tốc độ dòng 1,6 ml/phút

Khoảng tuyến tính: 10 –1500 ng/ml trong cả hai nền mẫu LOD: 0,4ng/ml LOQ: 1ng/ml

Cột HP-5MS (5% phenyl - 95% dimethyl polysiloxane

30m x 0,25mm; 0,25µm)

Khí mang: heli Kĩ thuật tiêm mẫu: không chia dòng Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ cột ban đầu là 60oC được giữ trong 1 phút, sau đó tăng lên 280oC với tốc độ 20oC/phút và giữ trong 15 phút Dung môi chiết: Chloroform

LOD: 2,1 ng/ml LOQ: 7 ng/ml Khoảng tuyến tính: 7 đến 1000 ng/ml Hiệu suất chiết từ 81,3- 97,4%

[36]

tiểu, huyết tương

pháp SPE

Cột mao quản methyl siloxane HP-1(25m x 0,32 mm; 0,17 µm)

Khí mang: hydro Kĩ thuật tiêm mẫu : không chia dòng

Khoảng tuyến tính: 10-600ng/ml LOQ:

10ng/ml Hiệu suất chiết từ 85-

[13]

Chất nội chuẩn: methadone - d3 Chương trình nhiệt độ : nhiệt độ cột ban đầu là 80oC giữ trong 0,5 phút, sau đó tăng lên 280oC với tốc độ 20oC/phút và giữ trong 10 phút

107% trong nước tiểu, 90-105% trong huyết tương

tiểu

pháp DLLME

Pha tĩnh: cột Eurospher C18(250 mm x 4,6 mm; 5µm Pha động:

acetonitrile: dung dịch đệm photphat 0,05M pH 2,3 Chương trình gradient nồng độ Dung môi chiết: chloroform Dung môi phân tán: aceton

Khoảng tuyến tính: 0,5-100µg/l LOD: 9-25µg/l LOQ: 30-100µg/l

Cột mao quản HP-5 (30m x 0,32mm; 0,25 μm)

Kĩ thuật tiêm : không chia dòng

Chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ ban đầu 150oC giữ 1 phút, tăng lên 270oC với tốc độ 10oC/phút và giữ 10 phút Tổng thời gian phân tích là 23 phút

Khoảng tuyến tính: 0,0001mg/ml-0,02mg/ml LOD: 9,4μg/l LOQ: 30,3 μg/l

[10]

Dung môi chiết: Chloroform/Isopropanol tỷ lệ 9/1

Như vậy trên thế giới hiện nay đã sử dụng nhiều phương pháp để xác định MTD trong dịch sinh học, các phương pháp phân tích khác nhau như sắc ký khí khối phổ (GC-MS), sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS), sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC),…[21] Tuy nhiên, ở Việt Nam các công bố về xác định MTD trong dịch sinh học còn hạn chế

1.6 Các phương pháp xác định MTD

Các phương pháp cụ thể được lựa chọn phụ thuộc vào một số yếu tố như khối lượng công việc, chi phí và sự sẵn có của thiết bị đo đạc, độ nhạy, độ đặc hiệu và độ tin cậy

1.6.1 Sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)

Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS là một kỹ thuật phân tích hóa học hiện đại, kết hợp khả năng tách cấu tử của hỗn hợp bằng sắc ký lỏng (HPLC) với khả năng nhận danh và định lượng cấu tử bằng đầu dò khối phổ (MS) với độ đặc hiệu và độ nhạy cao LC-MS/MS hiện đang được coi là phương pháp lựa chọn tối ưu cho phân tích định lượng thuốc và các chất chuyển hoá của nó trong dịch sinh học Những lợi thế của việc sử dụng kỹ thuật này trong chế độ multiple reaction monitoring do độ nhạy, chọn lọc cao, tốc độ nhanh cho phép ứng dụng phương pháp mà yêu cầu rất ít hoặc không cần chuẩn bị mẫu với thời gian phân tích giảm thiểu Tuy nhiên, hiệu ứng nền mẫu có thể ảnh hưởng đáng kể đến quá trình phân tích LC-MS/MS

1.6.2 Sắc ký khí khối phổ (GC-MS)

Các phân tử thành phần của mẫu phân tích tách vào pha tĩnh theo hệ số phân tách giữa chúng với pha tĩnh và pha động Khi ở trong pha tĩnh chúng sẽ không đi qua cột và vì vậy chất có hệ số phân tách cao di chuyển chậm hơn qua cột so với những chất có hệ số phân tách thấp Nhiệt độ đóng một vai trò quan trọng trong tốc độ tách các chất phân tích trên GC, áp dụng cho các hợp chất ổn định và có thể dễ bay hơi tại nhiệt độ lên đến 350oC Khi các chất tách, mở cột để chúng chảy vào khối phổ hoặc vào một máy dò như detector ion hoá ngọn lửa (FID) và dò bắt điện tử (ECD) Phân tích bằng sắc ký khí kinh tế hơn, độ phân giải cao hơn, đặc biệt là GC-MS dễ kết nối với máy khối phổ hơn

- Áp dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ để phân tích methadon

Phương pháp sắc ký khí khối phổ ngày càng được sử dụng trong phân tích MTD Máy sắc ký khí tách MTD và đưa vào detector khối phổ, có khả năng định tính, định lượng MTD với độ nhạy và độ chính xác cao Với các ưu điểm của GC như: GC là phương pháp tách các cấu tử cho độ phân giải cao, sử dụng GC phân tích mẫu rất kinh

tế vì tốn ít dung môi, hóa chất, GC cho độ lặp lại của chỉ số thời gian lưu và diện tích pic cao, sử dụng lượng mẫu rất ít, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng nhỏ, phù hợp để phân tích lượng vết, việc sử dụng và bảo dưỡng GC không quá phức tạp Đối với kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS), hay sắc kí lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS) việc kết nối đơn thuần phần LC với MS sẽ làm cho pha lỏng hóa hơi, và lượng lớn khí được bơm vào hệ thống MS sẽ giảm độ chân không đến điểm mà tại đó những ion cần phân tích không thể đến được đầu dò Phương pháp GC-FID hạn chế trong việc phát hiện và định lượng mà không cung cấp thông tin cấu trúc Độ đặc hiệu thấp hơn so với GC-MS Ít phù hợp hơn để xác định các hợp chất chưa biết trong hỗn hợp phức tạp Trong khi đó GC-MS có giới hạn phát hiện thấp hơn, có thể tách và nhận dạng các hợp chất trong hỗn hợp, độ nhạy và độ chọn lọc cao để nhận dạng hợp chất Qua tham khảo các phương pháp phân tích và so sánh ưu, nhược điểm giữa các phương pháp, khả năng ứng dụng của phương pháp vào thực tế, chúng tôi thấy phương pháp sắc ký khí khối phổ có nhiều ưu điểm và có ứng dụng tốt trong phân tích MTD Vì vậy chọn phương pháp sắc ký khí khối phổ để xác định MTD trong mẫu dịch sinh học

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: + Đối tượng nghiên cứu là MTD - Mẫu nghiên cứu:

+ Mẫu dịch sinh học (máu và nước tiểu) không nhiễm MTD được sử dụng để khảo sát và xây dựng phương pháp được quy ước là mẫu nước tiểu trắng và mẫu máu trắng

+ Mẫu dịch sinh học của các bệnh nhân, nạn nhân nghi ngờ bị ngộ độc MTD (Mẫu máu sử dụng là mẫu máu toàn phần có chất chống đông là Ethylen Diamin Tetra Acetat)

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.2.1 Hóa chất, thuốc thử

- Chất chuẩn: + Methadon hydrochlorid, hàm lượng methadon 1mg/ml trong methanol, số lô: 0663291, hãng Cayman, Mỹ

+ Diphenylamin 5g, hàm lượng 99%, mã sản phẩm 242586-5G, hãng Sigma- Aldrich, Mỹ

- Hóa chất dung môi: Methanol, diethyl ether, natri hydroxyd, nước cất, n-hexan, ethyl acetat, dùng cho phân tích đều của Merck-Đức

2.2.2 Thiết bị

- Máy sắc ký khí Agilent 8890 kết nối khối phổ MS 5977

Hình 2.1 Máy sắc kí khí Agilent 8890 kết nối khối phổ MS 5977

- Cân phân tích Mettler AB240 (Thuỵ sĩ) - Máy lắc siêu âm, máy ly tâm, tủ sấy, hệ thống làm khô bằng khí nitơ - Bình nón, bình định mức, ống nghiệm, và các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết khác,…

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp xác định methadon

Xây dựng phương pháp xác định MTD trong máu và nước tiểu bằng GC-MS bao gồm các nội dung sau:

- Lựa chọn điều kiện sắc ký, lựa chọn chất chuẩn nội: đưa ra chương trình sắc ký khối phổ, chất chuẩn nội phù hợp

- Khảo sát lựa chọn dung môi chiết và đưa ra quy trình xử lý mẫu - Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của FDA (2022), bao gồm các nội dung: + Tính phù hợp hệ thống sắc ký

+ Tính chọn lọc – độ đặc hiệu + Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng + Độ tuyến tính

+ Độ đúng, độ chính xác + Khảo sát hiệu suất chiết + Độ ổn định

2.3.2 Ứng dụng phân tích methadon trong mẫu thực

Sử dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích MTD trong mẫu máu và nước tiểu của người nghi ngờ nhiễm MTD gửi đến giám định tại Khoa độc chất – Viện Pháp y Quốc gia

2.4 Phương pháp nghiên cứu

- Pha các dung dịch chuẩn

+ Dung dịch chuẩn nội DPA 1mg/ml: cân chính xác khoảng 25 mg diphenylamin, hòa tan trong 25 ml MeOH được dung dịch nồng độ khoảng 1mg/ml

+ Dung dịch chuẩn nội DPA 10µg/ml: lấy chính xác 100µl dung dịch chuẩn nội

DPA 1mg/ml vào bình định mức 10ml, thêm lượng MeOH vừa đủ, lắc đều

+ Dung dịch chuẩn nội DPA 1µg/ml: lấy chính xác 100µl dung dịch chuẩn nội

1mg/ml vào bình định mức 100ml, thêm lượng MeOH vừa đủ, lắc đều

+ Dung dịch chuẩn MTD 10µg/ml: lấy chính xác 100µl dung dịch chuẩn MTD

1mg/ml vào bình định mức 10ml, thêm lượng MeOH vừa đủ, lắc đều

+ Dung dịch chuẩn MTD 1µg/ml: lấy chính xác 100µl dung dịch chuẩn MTD 1mg/ml vào bình định mức 100ml, thêm lượng MeOH vừa đủ, lắc đều

- Các mẫu tự tạo Mẫu máu trắng 1,00 ml hoặc mẫu nước tiểu trắng 1,00 ml, cho vào các ống riêng biệt Thêm vào các mẫu trắng lượng MTD và DPA cần thiết để tiến hành khảo sát

2.4.2 Lựa chọn điều kiện sắc kí và chất chuẩn nội

- Lựa chọn điều kiện sắc kí

Dựa theo quy trình sắc ký khí khối phổ được ghi nhận trong tài liệu “Quy trình giám định pháp y” (2022) – Bộ Y Tế [4]

- Lựa chọn chất chuẩn nội

Dựa trên công thức hoá học của MTD, tham khảo các tài liệu và tính sẵn có của hoá chất thực tế, chất chuẩn nội được lựa chọn là diphenylamin

2.4.3 Áp dụng phương pháp chiết LLE để xử lý mẫu

Phương pháp xử lý mẫu thường sử dụng và được ứng dụng rộng rãi đối với các mẫu thử sinh học là kết tủa protein, chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn [15] [20] Phương pháp kết tủa protein có ưu điểm là đơn giản nhưng chỉ có protein được loại bỏ, các hợp chất nội sinh khác vẫn còn, do đó nền mẫu có thể ảnh hưởng tới quá trình phân tích Bên cạnh đó, tốn thời gian để làm khô, làm giàu mẫu Phương pháp SPE có nhiều ưu điểm như cho khả năng thu hồi các chất cao, dịch chiết tương đối sạch Tuy nhiên quá trình thực hiện mất nhiều thời gian, cần các trang thiết bị đắt tiền và giá thành cao Phương pháp LLE với các ưu điểm như thời gian xử lý mẫu ngắn, các bước xử lý mẫu đơn giản, dễ thực hiện và không cần các trang thiết bị phức tạp, có thể áp dụng với hầu hết các phòng thí nghiệm, đã được ứng dụng phổ biến và có hiệu quả trong lĩnh vực tách chiết và làm giầu các chất phân tích phục vụ cho việc xác định lượng vết trong mẫu [1] [25] [35] [36] Sau khi tham khảo tài liệu, dựa trên cấu trúc, đặc điểm hóa học của chất phân tích và khảo sát các điều kiện thiết bị, hóa chất, tiến hành khảo sát chiết thẳng bằng phương pháp LLE với các dung môi, hệ dung môi khác nhau Sau đó đánh giá khả năng thu hồi của các chất thông qua các quy trình chiết Trước khi chiết xuất tiến hành kiềm hoá bằng dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh đến pH thích hợp Vì MTD là một base yếu, nên việc kiềm hoá đến pH phù hợp sẽ chuyển dược chất ở dạng ion về dạng phân tử để thu được hiệu suất chiết cao

- Khảo sát dung môi chiết

Tiến hành khảo sát chiết MTD với các dung môi, hệ dung môi sau: ethyl acetat, dichlorometan, diethylete, n hexan và hỗn hợp dung môi (ethyl acetat:cyclohexan) tỷ lệ 1:7) Tiến hành làm thí nghiệm lặp lại 3 lần với mỗi dung môi và lấy kết quả trung bình

- Quy trình xử lý mẫu Sau khi khảo sát dung môi, lựa chọn được dung môi chiết phù hợp, đưa ra quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp chiết LLE

2.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích

a Tính phù hợp của hệ thống sắc ký

Kiểm tra tính phù hợp hệ thống là một phần không thể tách rời trong nhiều quy trình phân tích Đánh giá tính phù hợp của hệ thống là những phép thử nhằm đánh giá tính phù hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và mẫu thử để đảm bảo toàn bộ hệ thống

có hiệu năng phù hợp [8] [33]

- Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký Đánh giá dựa vào độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic của chất chuẩn MTD và chất chuẩn nội DPA, tỉ lệ diện tích pic của MTD và DPA [8] [33]

- Yêu cầu: độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) biểu thị chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu không lớn hơn 2%.(theo quy định của FDA

đối với phân tích thuốc trong dịch sinh học) [8] [33] b Tính chọn lọc và đặc hiệu

Tính chọn lọc (selectivity) của một phương pháp phân tích là khả năng phân biệt các chất trong mẫu thử dùng khi tách và định lượng hai hoặc nhiều thành phần trong một hỗn hợp của phương pháp đó [8] [33]

Tính đặc hiệu (specificity) của một phương pháp phân tích là khả năng xác định một cách chắc chắn sự có mặt chất phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất, chất chuyển hoá,… [8] [33]

Với đối tượng là MTD trong dịch sinh học có một nền mẫu phức tạp, mặc dù quá trình chiết giúp loại bỏ một số hợp chất nhưng việc khảo sát tính chọn lọc của phương pháp là điều cần thiết Để đảm bảo kết quả xác định chất phân tích là chính xác, không bị nhầm lẫn và không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác có trong mẫu

Tiến hành khảo sát tính chọn lọc dựa trên sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và chuẩn nội, mẫu chuẩn và chuẩn nội.Phương pháp sắc ký khí khối phổ là một trong những phương pháp có tính đặc hiệu cao Tính đặc hiệu thể hiện ở sự xuất hiện các mảnh khối đặc trưng của chất

Yêu cầu: Sắc kí đồ mẫu trắng phải không được cho tín hiệu của chất phân tích, trong khi mẫu trắng thêm chuẩn và chuẩn nội phải cho tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu trùng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn [8] [33]

c Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Giới hạn phát hiện (limit of detection – LOD) của một quy trình phân tích là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết có thể định lượng được [8] [33]

- Giới hạn định lượng (limit of quantitation – LOQ) của một qui trình phân tích là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác thích hợp [8] [33]

LOD và LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N = Signal to noise ratio) Phân tích mẫu thêm chuẩn ở hàm lượng thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định S/N dựa vào phần mềm của thiết bị LOD được coi là nồng độ chất phân tích mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3) LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần LOD [8] [33]

d Độ tuyến tính

Là đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của pic (diện tích hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học Xây dựng phương trình hồi quy y= ax + b và hệ số tương quan hồi qui r [8] [33]

Trong đó : y là tỷ số diện tích pic của chất phân tích MTD và chất chuẩn nội DPA a là hệ số góc

b là hệ số chắn Yêu cầu: đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan hồi quy ( r ) phải không nhỏ hơn 0,99 (r ≥ 0,99) [8] [33]

e Độ đúng, độ chính xác

Độ đúng của một quy trình phân tích biểu diễn sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận Độ đúng cần được thiết lập trong khoảng tuyến tính xác định của quy trình phân tích Khảo sát độ đúng thông qua độ thu hồi [7] [33]

Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất Mỗi quy trình luôn có những sai số ngẫu nhiên khiến cho kết quả sai lệch nhau Để kiểm soát được các sai số này người ta dùng độ chính xác, thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả đo [8] [33] Trong nghiên cứu này, lấy độ chính xác là độ lặp lại